Sunteți pe pagina 1din 133

Cuprins:

Cuvnt nainte (2004) 1. Elemente legate de controlul calitii n laboratorul de bacteriologie / microbiologie 2. Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie / microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie. 3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de microbiologie 4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de microbiologie 5. Schema general a diagnosticului microbiologic 6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n diagnosticul microbiologic direct 7. Preparate microscopice, frotiuri i principalele coloraii utilizate n microbiologie 8. Tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic 9. Medii de cultur 10. Tehnici de cultivare 11. Examinarea caracterelor de cultur, metabolice precum i a altor caractere fenotipice utile n identificarea microorganismelor 12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice ale bacteriilor i fungilor 15. Reacii antigen-anticorp utilizate n microbiologie 16. Reacii antigen-anticorp: reacia de precipitare 17. Reacii antigen-anticorp: reacia de aglutinare 18. Reacii antigen-anticorp: reacia de fixare a complementului 19. Reacii antigen-anticorp: reacia de neutralizare (seroneutralizare) 20. Reacii antigen-anticorp: reacii n care componentele sunt marcate 21. Testarea imunitii de tip celular 23. Introducere n diagnosticul de laborator microbiologic 24. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Staphylococcus 25. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Streptococcus 26. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pneumoniae 27. Diagnosticul de laborator n infeciile produse microorganisme din genul Neisseria 28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii. Coprocultura. 29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli. Urocultura. 30. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Shigella 31. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Salmonella. Hemocultura. 32. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Klebsiella 33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Proteus 34. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Yersinia 35. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Pseudomonas 36. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Vibrio 37. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Haemophilus 38. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Bordetella 39. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Brucella 40. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Corynebacterium diphtheriae 41. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Listeria 42. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Mycobacterium 43. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus anthracis 44. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Clostridium 45. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Treponema 46. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Leptospira

47. Diagnosticul 48. Diagnosticul Rickettsiaceae 49. Diagnosticul 50. Diagnosticul Mycoplasma 51. Diagnosticul

de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Borrelia de laborator n infeciile produse de microorganisme din familia de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Chlamydia de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Candida

Cuvnt nainte (2004)


Acest manual de lucrri practice apare la peste 2 decenii dup manualul publicat sub redacia dlui. prof. dr. Mrel Georgescu, la Bucureti. Cele mai multe dintre datele prezentate reprezint elemente de baz ale diagnosticului microbiologic n infeciile produse de bacterii sau levuri. Pornind de la noiuni privind controlul de calitate, conduita n laboratorul de microbiologie (inclusiv norme de protecia muncii), echipamentul i aparatura necesare n laborator, dezinfecia i sterilizarea am continuat cu schema general a diagnosticului microbiologic prezentnd n capitole separate principalele norme privind prelevarea i transportul produselor patologice, realizarea preparatelor microscopice, tehnica examenului microscopic, principalele medii de cultur utilizate i tehnicile cultivare mai frecvent folosite. n capitolele urmtoare am prezentat modalitile de identificare a tulpinilor bacteriene sau levurice prin metode fenotipice i genotipice, un capitol separat fiind dedicat studiului sensibilitii la medicamentele antimicrobiene. Dup discutarea reaciilor antigen-anticorp i o trecere n revist a principalelor produse biologice de uz uman am realizat trecerea ctre partea special n care sunt abordate modalitile diagnostice n infeciile produse de principalele microorganisme. Capitolul 52 realizeaz o sintez a noiunilor prezentate n manual n timp ce ultimul capitol prezint unele elemente privind importana diagnosticului microbiologic n cadrul sistemului de supraveghere al bolilor transmisibile, n Romnia. . Alte date suplimentare pot fi studiate i aprofundate de ctre cei interesai n o serie de manuale i tratate de specialitate din literatura medical romneasc i internaional. Dup opinia noastr (format n 14 ani de activitate teoretic i practic n care am colaborat cu studeni la medicin sau colegii medicale, medici rezideni sau specialiti, asisteni medicali etc), microbiologia reprezint una dintre materiile fa de care interesul trebuie s fie sensibil mai ridicat comparativ cu ceea ce percepem c se petrece n momentul actual. Microbiologia aduce uneltele necesare unui diagnostic de multe ori rapid i de cele mai multe ori foarte precis, de mare ajutor pacientului. Ateptm sugestiile cititorilor, n special pe cele critice, pentru a putea mbunti coninutul prezentului volum. Acestea pot fi transmise prin email la una dintre adresele: mircea_ioan_popa@yahoo.com sau dr.gabriela.popa@gmail.com .

1. Elemente legate de controlul calitii n laboratorul de bacteriologie / microbiologie


Cu toate c aceste noiuni nu par a fi de utilitate imediat, trebuie s avem n vedere faptul c ele sunt incluse ntr-unul dintre cele mai importante capitole ale activitii, n orice tip de laborator i nu numai n laboratorul de microbiologie. De fapt, cu ct sunt nelese mai de timpuriu, cu att pot fi mai utile n dezvoltarea viitoare a oricrui medic, care mai devreme sau mai trziu va trebui s neleag importana laboratorului clinic n general i respectiv a laboratorului de microbiologie n particular, n colaborare cu celelalte specialiti medicale. Am decis s introducem aceste elemente n primul capitol al manualului de lucrri practice. Considerm necesar parcurgerea acestor noiuni de ctre toi colegii implicai n diferitele activiti desfurate n sistemul sanitar. Recomandm citirea i altor materiale redactate pe aceast tem, din literatura medical romneasc sau internaional. n orice laborator, inclusiv n laboratorul de microbiologie al UMF Carol Davila, este necesar stabilirea unor responsabiliti. Chiar i n cazul n care activitatea practic se rezum la o serie de demonstraii i prezentarea unor anumite aspecte pentru tinerii aflai n stagiu, elementele legate de controlul calitii nu trebuie s fie ignorate. Atunci cnd este vorba de un laborator clinic de microbiologie, iar de rezultatele obinute poate depinde evoluia i uneori chiar viaa unui pacient, controlul intern de calitate intr n responsabilitatea efului de laborator, care trebuie s supervizeze (direct sau prin delegare de responsabilitate) toate activitile desfurate i s contrasemneze buletinele de analiz. 1. ntr-un sistem medical bine pus la punct, buletinele de analiz nesemnate, semnate indescifrabil, verificate numai de ctre personalul medical cu pregtire medie etc., trebuie s dispar i s fie nlocuite de buletine de analiz redactate dup toate rigorile, incluznd supervizarea menionat mai sus. 2. n fiecare laborator trebuie s existe i s fie accesibil oricrui membru al personalului de laborator un document scris, fie sub forma unui manual tehnic, fie sub forma unui dosar n care s fie incluse o serie de materiale, dup cum urmeaz: Un tabel nominal al personalului, date tehnice despre fiecare membru precum i date care s permit contactarea unei anume persoane n caz de necesitate Un regulament de ordine interioar, inclusiv normele de protecie a muncii i normele de securitate microbiologic, precum i descrierea sarcinilor fiecrui membru al personalului de laborator O list cuprinznd toate formularele utilizate n laborator precum i descrierea fiecrui formular n parte, inclusiv recomandri privind modul de completare al formularelor Un plan al laboratorului O list a analizelor care pot fi efectuate n laborator Tehnicile de identificare a microorganismelor izolate, pornind de la normele de recoltare, conservare i transport (pentru fiecare tip de produs n parte), testele utilizate, lista mediilor de cultur i a reactivilor utilizai, inclusiv modul de preparare al acestora. n mod ideal (pentru c deocamdat aceste recomandri nu sunt aplicate n toate laboratoarele din ara noastr) ar trebui ca manualul (dosarul tehnic) s fie revizuit i completat periodic i s includ normele metodologice redactate i transmise de ctre instituia care se ocup de coordonarea i controlul activitii desfurate n sistemul laboratoarelor de microbiologie din Romnia precum i actele normative (recomandri, ordine de ministru, ordonane de guvern, legi etc) aprute n legtur cu activitatea de laborator.

Cele menionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie, dar n parte, se pot aplica oricrui tip de laborator clinic. 3. n mod necesar, periodic, n cadrul laboratorului trebuie organizate scurte ntlniri care s permit schimbul de opinii ntre membrii personalului de laborator, prezentarea unor referate alctuite dup materiale de specialitate aprute n literatura naional sau internaional, discutarea unor aspecte legislative legate de activitatea de laborator etc. 4. O modalitate obiectiv a controlului intern de calitate este reprezentat de solicitarea (de ctre eful de laborator, care va efectua i verificarea rezultatelor) realizrii unor teste avnd la dispoziie probe oarbe, rezultatul corect fiind cunoscut numai de ctre cel care a pregtit proba respectiv i respectiv de ctre eful de laborator. 5. n protocolul de lucru, pentru fiecare test n parte, este notificat utilizarea unui control pozitiv i respectiv a unui control negativ (spre exemplu n cazul testului susceptibilitii la bacitracin, controlul pozitiv va fi reprezentat de o tulpin de Streptococcus pyogenes iar controlul negativ va fi reprezentat de o tulpin de Streptococcus agalactiae), astfel putndu-se valida rezultatele obinute. n mod complementar, controlul de calitate extern ar trebui s condiioneze autorizaia eliberat pentru funcionarea oricrui laborator de microbiologie clinic, att n sistemul public ct i n cel privat. Din punct de vedere operaional, fiecare laborator ar trebui s primeasc: un numr de cod, care este cunoscut de laboratorul respectiv i de ctre instituia care organizeaz controlul extern de calitate periodic, un numr de probe, al cror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteriologice, micologice i serologice) formulare standardizate pentru re-transmiterea rezultatelor obinute. ndeplinirea recomandrilor menionate mai sus va conduce implicit la protecia pacienilor, identificarea unor anumite erori, compararea rezultatelor la nivel naional, posibilitatea colaborrii la nivel internaional, realizarea unei standardizri n microbiologia clinic romneasc, creterea ncrederii tuturor partenerilor din sistemul sanitar. Identificarea unor modaliti de lucru necorespunztoare ar trebui s conduc la retragerea autorizaiei de funcionare cu reacordarea acesteia numai dup ndeplinirea tuturor criteriilor necesare unei activiti utile diagnosticului i care s nu pun n pericol sntatea sau viaa pacienilor. Controlul calitii la nivelul oricrui laborator va atinge eficiena maxim cu condiia unei colaborri ntre clinic i laborator. Sunt nc prea frecvente situaiile n care solicitarea unui examen de laborator este fcut fr responsabilitate, fr colegialitate i fr a avea suficient n vedere interesul pacientului. Att personalul medical din laborator ct i cel din clinic trebuie s acioneze n strns colaborare. Numai n acest caz rezultatele obinute pot fi corect interpretate, eventualele rezultate care par incorecte pot fi analizate i corelate cu situaia concret, particular a unui anume pacient, iar n cazul persistenei suspiciunii unei erori de laborator se poate solicita n cunotin de cauz repetarea unei analize sau se poate realiza prelevarea unui nou produs patologic sau a unei probe de snge pentru obinerea serului de cercetat. n vederea stabilirii unei bune colaborri trebuie s existe o comunicare permanent ntre colegii care i desfoar activitatea n clinic i n laborator. Trebuie s recunoatem c din pcate buna colaborare i comunicare ntre verigile sistemului de sntate reprezint nc un deziderat neatins n ara noastr, cu relativ puine excepii. Pornind de la buletinul de analiz i documentele tehnice care trebuie s fie disponibile att pentru laborator ct i pentru clinic, continund cu scrisorile metodologice care au devenit din ce n ce mai rare n ultimii 10-15 ani trebuie gsite cele mai bune soluii de comunicare colegial i tiinific. Este datoria managerului instituiei medicale ca, mpreun cu eful laboratorului i efii seciilor clinice, s faciliteze organizarea unor ntlniri periodice ntre colegi. Trebuie discutate i agreate n mod colegial criteriile care pot conduce, spre exemplu, la respingerea unor probe. Trebuie desfiinat modalitatea de lucru n care se accept pentru lucru n laborator orice prob, indiferent de modul n care a fost recoltat, transportat i indiferent dac este nsoit (sau nu) de un buletin care solicit o anumit examinare i care ar trebui s menioneze o serie de date strict necesare. n loc s fie prelucrate probe fr calitate, care nu au cum s conduc la realizarea unui diagnostic microbiologic corespunztor i util pacientului care prezint o infecie de etiologie probabil microbian, este de preferat ca aceste probe s fie respinse i s se solicite o nou recoltare, corespunztoare calitativ i cantitativ.

nainte de a ncheia aceast destul de sumar prezentare, dorim s subliniem nc o dat c aceste noiuni ar trebui cunoscute i aplicate deopotriv n sistemul public i privat. Controlul intern i extern de calitate trebuie s reprezinte o prioritate absolut pentru sistemul naional de sntate iar elementele legate de acesta ar trebui s fie cunoscute nc din perioada de pregtire de baz a oricrui medic, biolog sau asistent medical.

2. Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie / microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie.
inta activitii n laboratorul de bacteriologie / micologie ar putea fi definit foarte pe scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie urmat n cazul unui pacient care prezint o boal infecioas de etiologie bacterian / fungic. De fapt lucrurile sunt mult mai complicate, datele de laborator nu pot fi interpretate n lipsa unei pregtiri serioase att din punct de vedere teoretic ct i practic, n lipsa unei activiti susinute n perioada de pregtire care dureaz mai muli ani i de fapt continu toat viaa. Ceea ce trebuie s fie ns foarte clar nc de la nceput este c, fr respectarea unor principii, n condiiile efecturii sau interpretrii mecanice a unor teste etc., diagnosticul de laborator microbiologic corect devine imposibil. n vederea atingerii scopului, n laboratorul de bacteriologie se vor efectua tehnicile necesare: stabilirii prezenei sau dovedirii absenei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit substrat studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului, grupului, speciei, tipului (de la caz la caz) avnd la baz o serie de caractere ale bacteriilor, precum caracterele morfotinctoriale caracterele de cultur caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori care pot fi evideniai macroscopic, sinteza unor enzime, sinteza de bacteriocine, capacitatea de a fermenta un anumit substrat, capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unic surs de carbon etc) caracterele antigenice (utiliznd tehnici din domeniul imunologiei) caracterele de patogenitate sensibilitatea fa de bacteriofagi caractere legate de sinteza anumitor metabolii sau structuri moleculare identificabile spre ex. prin tehnici de cromatografie caracterele genetice etc stabilirii faptului c bacteria izolat este implicat n procesul infecios respectiv stabilirii sensibilitii la antibiotice i chimioterapice monitorizrii evoluiei sub tratament (dovedirea eficienei tratamentului antibacterian ales) identificrii contaminrii de laborator depistrii purttorilor de germeni etc. Chiar dac cele menionate mai sus par complicate, ele reprezint o simplificare n raport cu complexitatea activitii din laboratorul de bacteriologie. Pentru ndeplinirea obiectivelor, laboratorul de bacteriologie trebuie astfel conceput nct condiiile de lucru s fie optime. n plus, trebuie s avem n vedere c n momentul efecturii oricrei tehnici de laborator, este necesar s fie asigurat protecia personalului de laborator precum i prevenirea contaminrii probelor de lucru. Toate elementele necesare trebuie s apar scrise manualul tehnic menionat n cadrul capitolului precedent. Cldirea laboratorului de bacteriologie medical trebuie s asigure, pe ct posibil, prevenirea expunerii la praf, cureni de aer, s fie luminoas i n msura posibilitilor spaiile de lucru s fie orientate astfel nct s previn incidena direct a razelor solare (avnd n vedere efectul bactericid al radiaiilor UV; acest element este de maxim importan n laboratorul de mycobacteriologie).

Fiecare ncpere a laboratorului de bacteriologie trebuie s aib o destinaie precis iar planul laboratorului n ansamblu trebuie s prevad un anumit flux, pe ct posibil ntr-un sens unic n vederea prevenirii contaminrii preparatelor de laborator i respectiv prevenirea ntlnirii dintre materialele contaminate i materialele sterile. Laboratorul de bacteriologie medical include ncperi (spaii) n vederea desfurrii corespunztoare a urmtoarelor activiti: recepionarea probelor recoltate n afara laboratorului recoltarea probelor n laborator prelucrarea probelor n vederea cultivrii, identificrii bacteriilor implicate etiologic, prin diferitele tehnici bacteriologice realizarea diferitelor tehnici imunologice utile n diagnosticul bacteriologic sau imunologic pregtirea materialelor necesare n laborator sticlrie alte instrumente de laborator reactivi medii de cultur etc depozitarea materialelor necesare n laborator splarea materialelor nainte de sterilizare etc. n afar de cele menionate mai sus, n laboratorul de bacteriologie mai exist spaii destinate activitilor administrative (birouri), vestiare, grupuri sanitare etc. n cazul unor laboratoare specializate (de ex. studiul acizilor grai prin tehnici de cromatografie, studiul caracteristicilor bacteriene prin tehnici de biologie molecular etc.), exist anumite particulariti n planificarea i distribuirea spaiilor funcionale din laborator; elementele tehnice legate de aceste structuri sunt prezentate n diferite manuale tehnice care pot fi consultate de ctre cei interesai. ncperile, spaiile, mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi construite n aa fel nct s permit realizarea unei curenii i dezinfecii la cel mai nalt nivel; n cazul acestui tip de laboratoare se poate vorbi de necesitatea atingerii perfeciunii. Va fi acordat toat atenia pentru ca laboratorul s fie organizat n vederea realizrii scopului menionat mai sus prin tehnicile enumerate prevenirii contaminrii probelor de laborator prevenirii rspndirii germenilor n mediul ambiant prevenirii infeciilor de laborator. nainte de a ncheia prezentarea principalelor ncperi (spaii) din laboratorul de bacteriologie, dorim s menionm c: structura prezentat pentru laboratorul de bacteriologie nu difer n mod esenial de structura unui laborator de microbiologie n general n structura laboratorului este de dorit s fie incluse (n msura posibilitilor i n funcie de nivelul laboratorului, de exemplu n cazul unui laborator de spital universitar) spaii n care s se poat desfura activiti de nvmnt i pregtire teoretic i practic, spaii n care ar putea avea loc i diferite ntlniri tehnice ntre membrii personalului de laborator laboratorul trebuie s fie legat funcional de clinic. Datele privind funcionarea laboratoarelor care efectueaz analize medicale sunt incluse n Ordinul ministrului sntii nr. 119 / 2004, normativ aduce la zi Ordinul ministrului sntii i familiei nr. 609 / 2002, precedat de Ordinul ministrului sntii nr. 915 / 2000. Aceste acte normative trebuie revizuite i adaptate periodic. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie n laboratorul de microbiologie se lucreaz cu microorganisme potenial patogene sau dovedite a fi patogene, care se pot identifica n diferite produse patologice (ex. snge, materii fecale, urin etc) sau au fost izolate n culturi la nivelul laboratorului. Exist i posibilitate ca un anumit laborator s primeasc spre identificare culturi i izolate de la un laborator cu un nivel de competen inferior. Chiar dac activitatea se desfoar ntr-un laborator dedicat lucrrilor practice i demonstraiilor fcute sub supravegherea unui cadru didactic pentru studeni sau tineri medici rezideni, exist o serie de reguli care trebuie aplicate cu strictee n vederea eliminrii riscurilor de contaminare:

1. Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator. Tinerii medici sau viitori medici vor accede n laborator i vor participa la desfurarea lucrrilor practice numai dup audierea i nsuirea (dovedit prin semntura pe un proces verbal pregtit n acest sens) regulilor de protecie a muncii. 2. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial infectante. 3. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecie; halatul de protecie reprezint nivelul minim acceptat. Halatul trebuie s fie curat i corect ncheiat. n anumite situaii se va recomanda utilizarea mnuilor, ochelarilor, mtii, bonetei, orului, nclmintei de protecie. Se recomand ca echipamentul de protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior. 4. Nu se vor purta mnui de latex n momentul manipulrii becului Bunsen. 5. Mncatul i butul sunt interzise n sala de lucrri practice de microbiologie. Fumatul este interzis, conform legii, n orice instituie medical din Romnia i cu att mai mult nu este acceptat ntr-un laborator de microbiologie. 6. Se interzice aplicarea de cosmetice, lcuirea unghiilor, purtarea de unghii false, manipularea lentilelor de contact etc. 7. Este interzis introducerea n gur a oricrui obiect. 8. Pipetarea cu gura este strict interzis. n vederea pipetrii se vor utiliza dispozitive de pipetare adecvate. 9. Nu este permis depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine, geni, serviete, caiete etc). Se recomand ca hainele s fie lsate la garderob sau ntr-un spaiu special amenajat. 10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maxim precauie pentru evitarea rspndirii microorganismelor. Activitile se vor desfura n vecintatea becului Bunsen aprins. 11. nsmnrile se efectueaz la flacr. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor (tub, eprubet, flacon de sticl etc) utilizate, att la deschidere ct i la nchidere. 12. Ansa bacteriologic se va steriliza la rou, att bucla ct i firul ansei (iar portansa se va flamba) nainte i dup folosire. Atunci cnd s-a terminat lucrul cu ansa ncrcat cu produs patologic, n vederea sterilizrii bucla ansei va fi introdus iniial la baza flcrii unde temperatura este mai sczut, pentru a preveni mprocarea cu particule infecioase. Atunci cnd se lucreaz ntr-un laborator de analize se vor lua preacauii suplimentare. 13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect i complet nchise i cu o bucl cu diametrul mai mic de 3 milimetri pentru a se evita descrcarea spontan. Nu se vor face micri brute atunci cnd ansa este ncrcat cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample i se va menine un permanent control asupra micrilor efectuate n laboratorul de microbiologie. 14. Recomandm ca toate activitile care pot fi efectuate n laborator s fie nscrise i detaliate n manualul tehnic al laboratorului. nainte de nceperea oricrui test sau a oricrei manevre, trebuie s avem n minte toi paii pe care urmeaz s i facem (conform protocolului de lucru) astfel nct s avem un control mental permanent al fiecrei manevre pe care urmeaz s o executm. 15. Nu este permis fuga i nici mersul rapid prin laborator. 16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se vor decontamina la flacr, ci vor fi introduse (evitnd producerea de stropi potenial infectani) n flaconul cu dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie s depeasc nivelul pn la care a ajuns produsul contaminant), unde vor fi meninute pentru circa 24 ore (n funcie de substana dezinfectant utilizat). Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. Tot n amestecul dezinfectant vor fi introduse cu aceleai precauii lamele de sticl folosite. 17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptnd ansele bacteriologice, pipetele i lamele) se vor introduce la finalul activitii practice, cu precauie, ntr-un recipient (ex. o gleat din metal, cu capac) care va fi autoclavat. 18. Se va restrnge pe ct posibil utilizarea obiectelor ascuite, tietoare i neptoare. 19. Pentru ndeprtarea obiectelor ascuite de unic ntrebuinare recomandm utilizarea de cutii sigure n care acestea s fie colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate. 20. n cazul n care are loc accidental contaminarea unei suprafee cu produse patologice sau culturi, n cazul n care acest eveniment se datoreaz unui tnr medic sau viitor medic aflat n pregtire, n primul rnd trebuie anunat fr ntrziere asistentul responsabil cu pregtirea respectivei grupe de lucru. Se recomand acoperirea cu o pnz a suprafeei contaminate dup care se toarn o soluie dezinfectant care se va menine pe loc n funcie de recomandrile productorului, dar nu mai puin de 30 minute. Ulterior se poate trece (dup caz) la curirea locului. 21. La sfritului lucrului n laborator se vor spla minile cu ap i spun. 22. n afar de aceste msuri, se vor avea n vedere toate cele necesare evitrii oricrui risc care ar putea rezulta n urma utilizrii unor substane caustice, manipulrii diferitelor aparate electrice etc.

n ceea ce privete utilizarea cabinetelor de siguran biologic (hote, boxe, nie), vor fi prezentate unele noiuni n capitolul al 3-lea. Respectarea acestor norme de protecie este strict necesar. Trebuie s avem n vedere i faptul c recomandrile i directivele Uniunii Europene n domeniul biosecuritii au fost adoptate de ctre ara noastr.

3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de microbiologie


n diferitele ncperi (spaii) ale laboratorului de microbiologie putem ntlni o serie de echipamente, elemente de birotic, diferite aparate. Spre exemplu, n ncperea unde are loc recepionarea produselor patologice trebuie s existe registre sau un sistem computerizat de nregistrare a datelor (nregistrarea corect a datelor n sistemul sanitar trebuie s reprezinte o prioritate pentru oricare dintre unitile medicale indiferent de sistemul public sau privat), stative pentru tuburi, eprubete, flacoane etc, un incubator la 37C, un frigider etc. n locul unde se desfoar diagnosticul microbiologic trebuie s existe la ndemn anse bacteriologice, diferite pipete, pense, baghete de lemn, tampoane de diferite dimensiuni, becul Bunsen, microscopul, lupa, lame i lamele, truse de colorare, centrifuga, balana, baia de ap, un incubator, un frigider, plci Petri, eprubete, containere pentru materialul contaminat, cabinetul de siguran biologic etc. n cele ce urmeaz vor fi enumerate o parte dintre ustensilele i aparatele care se pot gsi n laboratorul de microbiologie. 1. Microscoape, lupe i truse de colorani: microscop optic (cmp luminos) alte tipuri de microscop, care pot fi utilizate n camer obscur (microscop cu fond ntunecat, microscop cu contrast de faz, microscop cu fluorescen) n situaii particulare de diagnostic truse pentru coloraii uzuale (albastru de metilen, Gram, Ziehl-Neelsen etc) i speciale lup de mn i lup stereoscopic (pentru studierea morfologiei coloniilor) 2. Cabinete de siguran biologic (incinte, boxe, nie): cabinetul de clas I, n care aerul curat antreneaz aerosolii produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n laborator ctre mediul exterior, printr-un filtru care reine majoritatea particulelor periculoase cabinetul de clas II, n care aerul curat ptrunde filtrat, este recirculat prin filtre astfel nct suprafaa de lucru vine n contact cu aer steril; n box nu se vor introduce surse de cldur cabinetul de clas III este complet nchis; medicul i introduce minile n zona de lucru prin mnui fixate etan la aparat; aerul este att admis ct i evacuat prin filtre 3. Termostate i bi de ap sau de nisip: termostate reglate la diferite temperaturi, n funcie de profilul laboratorului i a germenilor studiai (ex. 35-37C pentru bacterii, 28C pentru fungi etc) camere termostat bi de ap de diferite mrimi (ex. pentru decomplementarea serurilor la 56C) bi de nisip (ex. pentru coagularea unor medii de cultur / Loeffler etc) 4. Frigidere: frigidere de diferite dimensiuni, cu temperatura interioar de + 4C / este de preferat utilizarea unui frigider separat de congelator, deoarece frigiderul se deschide mai frecvent i aceasta va influena temperatura din compartimentul congelator camere frigorifice congelatoare de - 20C i de - 70C (pentru anumite laboratoare specializate) 5. Centrifugi i balane: n mod curent sunt utilizate centrifugi cu viteza de 3000 g, preferabil cu rotor orizontal (pentru diminuarea cantitii de aerosoli); n apropierea centrifugii se va plasa o balan, pentru echilibrarea tuburilor centrifugi cu viteze superioare, n laboratoare specializate (mycobacteriologie)

centrifugi cu viteze superioare i sistem de rcire (biologie molecular) balane tehnice (pentru medii de cultur, reactivi, soluii n volume mari) balane farmaceutice (pentru soluii de colorani, alte soluii n volume mici) balan analitic (pentru reactivi n cantiti foarte mici) balan electronic (pentru biologie molecular) 6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a esuturilor 7. Aparate pentru distilarea i demineralizarea apei 8. Aparate pentru stabilirea pH-ului 9. Fotometre sau colorimetre 10. Distribuitoare pentru medii de cultur 11. Aparate i dispozitive pentru sterilizare i dezinfecie: incinerator (de regul, n vederea incinerrii se ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil) etuv (pupinel, cuptor Pasteur) autoclav filtre de diferite tipuri lmpi cu UV etc 12. Containere pentru materialul contaminat: glei de metal cu capac saci din material plastic saci rezisteni la temperaturile atinse n autoclav borcane cu soluii dezinfectante etc 13. Inventar de sticlrie: eprubete de diferite dimensiuni (ex. 12 / 120 mm, 16 / 160 mm) tuburi de centrifug eav de sticl pentru confecionarea de pipete Pasteur pipete gradate de diferite dimensiuni baghete de sticl baloane flacoane (ex. Erlenmeyer) pahare (ex. Berzelius) exsicatoare cilindrii gradai de diferite dimensiuni plci Petri lame i lamele pentru microscopie etc 14. Inventar de material plastic i cauciuc: dispozitive adaptate la pipete pentru a elimina pipetarea cu gura tuburi de centrifug containere pentru produsele patologice plci Petri anse calibrate etc 15. Alte articole de laborator: trepiede, stelaje de lemn sau metal, couri de srm, site de azbest, becuri Bunsen, casolete, foarfeci, bisturie, pense, sonde, seringi, anse bacteriologice (cu bucl, anse-fir, din platin sau nichelin), tampoane diferite, tije cu tampon i alte instrumente pentru recoltarea produselor patologice, termometre etc. Fr a ncerca s menionm toate dispozitivele, echipamentele, aparatele ntlnite ntr-un laborator de microbiologie am considerat c aceast listare este util att pentru medicul sau biologul care lucreaz n laborator ct i pentru viitorul medic, indiferent de specialitate.

4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de microbiologie


Definiii de baz

Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi). Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice. Sterilizarea Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: 1. Metode de sterilizare prin cldur cldura uscat cldura umed 2. Metode de sterilizare prin filtrare 3. Metode de sterilizare utiliznd radiaiile 4. Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie. Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat: splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor curate, necontaminate autoclavare, splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor contaminate refolosibile Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus). Sterilizarea prin cldur uscat Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. 1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul. Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur. 2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie. Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or. n unele situaii timpul de sterilizare poate depi 60 de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari). Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. 3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu. Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, de multe ori sunt prevzute incineratoare n structura unitii sanitare respective. De regul, n vederea incinerrii se ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc.

Sterilizarea prin cldur umed Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. 1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii. Exist mai multe tipuri de autoclave: autoclave cu perete simplu verticale orizontale autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus. Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat. Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel: verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat) aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie conectm sursa de cldur deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice deschidem lent robinetul de vapori deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis atunci cnd temperatura ajunge la circa 80C putem scoate materialele sterilizate. Prin autoclavare putem steriliza diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. 2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin

nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100 C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 6575C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare. Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. Sterilizarea prin filtrare Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de infuzori). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm. n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte de nceperea filtrrii. Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters). Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc. Sterilizarea prin intermediul radiaiilor Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor duble etc. Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar. Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide. Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc). Antisepsia i Dezinfecia Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alternd structuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase, dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii. Clasificare n funcie de mecanismul de aciune a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu 1 , util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, soluie 3 % n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc) n concentraii corespunztoare etc. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de sodiu), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei, oxidului de etilen etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i

dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. n continuare vom prezenta pe scurt cteva dintre substanele dezinfectante, innd cont de faptul c nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante. Hipocloriii: soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore) concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate) au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute) efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor Derivaii fenolici: datorita toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore) concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%) au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV e inactivat de soluia 0.5%) efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material plastic Glutaraldehida: cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere meninute nchise Iodoforii: sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic) sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O): exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH) sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc) etilenoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea exploziei includ: 1. utilizarea etilenoxidului n camere speciale care permit meninerea unei presiuni negative 2. combinarea cu CO2 n camere de oel speciale 3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului. exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc) sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).

5. Schema general a diagnosticului microbiologic Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau micologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Aa cum am menionat, n continuare dorim s prezentm etapele principale ale diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structur pe care urmeaz s discutm, concret, diferite situaii n cadrul capitolelor care urmeaz. n anexe, atunci cnd vom discuta recoltarea i transportul produselor, vom sintetiza pentru unele dintre aceste produse situaiile posibile n momentul n care nu avem n fa un anumit gen sau o anumit specie ci produsul din care vom izola agentul etiologic, iniial presupus. 5. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, i anume: 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, prelevnd un anumit produs patologic n funcie de manifestarea clinic n cazul respectiv, de exemplu urin n cazul unei infecii urinare, materii fecale n cazul dizenteriei, sput n cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame n cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6). 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologic reprezint de multe ori o etap esenial, care poate orienta paii urmtori. Pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram. Este preferabil s avem ntotdeauna cel puin nc un frotiu (de rezerv), n special n cazul n care produsul patologic este preios (LCR, produs recoltat prin puncie-biopsie etc). n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic, iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai general, pentru stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena diferitelor celule (eventual modificate fa de normal, burate de microorganisme), prezena celulelor inflamatorii (dovada reactivitii organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu precauie, n contextul dat. Chiar dac examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i foarte util. Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate. Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel, cutndu-se n special prezena leucocitelor (dar i a unor structuri care pot da anumite informaii cu privire la funcionalitatea tractului digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n vederea aprecierii prezenei unor cilindrii leucocitari precum i a altor celule normale sau patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile n vederea unui diagnostic corect i util pentru pacient. n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att preparatele proaspete (ex. preparatul montat n soluie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India, nigrozin), precum i frotiurile colorate May-Grnwald-Giemsa sau Gram. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n funcie de situaie (mediile i condiiile de incubare se vor alege n funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l izolm; spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme strict anaerobe, n lipsa condiiilor anaerobe de cultivare este imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat obine colonii izolate (tehnica nsmnrii n poligon) i respectiv o cultur pur, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora Gram sau Ziehl-Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar (n cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus

spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi foarte utile spre exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma. d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc. e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substane cu rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist pneumococi, animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o cultur pur de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7). 5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice antibacteriene i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7). 5. 2. Diagnosticul de laborator imunologic Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau imunobiologic. n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) anticorpilor, n serul pacientului investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne bazm pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale, i anume: - exist anticorpi n serul pacientului investigat? - care este titrul anticorpilor? - cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei afeciuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul este deja n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o afeciune cronic (titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive). n vederea identificrii unei infecii acute, o variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului fa de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic purificat) sau la candidin reprezint exemple clasice, n acest sens. Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i

trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv n funcie de antigenul inoculat (i de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3). Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merit s fie nelese i aplicate corespunztor. Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase, aceste noiuni reprezint o baz obligatorie, care poate fi completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n domeniu dar i experiena personal dezvoltat att din punct de vedere teoretic ct i practic.

5. 3. Povestiri adevrate 1. Despre diagnostic i tratament n infeciile urinare Problema luat n discuie este a unei colege mai tinere, student ntr-un an mare la medicin, dar de fapt, ca i urmtoarea, poate fi considerat o problem care poate fi a unui sistem i nu a unui caz particular. n urm cu mai mult de un an, colega noastr primete diagnosticul de litiaz renal i recomandarea de eliminarea a calculilor prin litotripsie [manevr care const n mrunirea calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate n mod natural prin urin; accesul la calculi se face pe cale endoscopic i sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate s fie realizat cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanic), cu ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonic), prin unde de oc repetate (litotripsie electrohidraulic) sau cu ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executat, cu succes (conform protocolului operator). Dup 5 luni, n anul urmtor, semnele clinice i analizele de laborator (n special urocultura nsoit de testarea sensibilitii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecie urinar (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul medic primete norfloxacin, timp de 10 zile. Pentru c la 3 sptmni de la primul diagnostic simptomatologia persist, primete un nou tratament, de aceast dat cu amoxicilin + acid clavulanic. La ncheierea celui de al doilea tratament, simptomatologia persist i colega ni se adreseaz solicitnd un sfat, menionnd i c medicul urolog i-a recomandat s nceap un tratament cu cefuroxim (cefalosporin de generaia a II-a) i Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi s refac analizele. Tulpina de E. coli identificat la ultimul examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicin, gentamicin, rezisten la: amoxicilin i la amoxicilin + acid clavulanic i era intermediar la norfloxacin (cu alte cuvinte, putem remarca evoluia sub tratament a tulpinii, iniial sensibil la norfloxacin i amoxicilin + acid clavulanic, rezisten ctigat n trepte). La recomandarea noastr, colega se prezint din nou la un control echografic, conform cruia se pun n eviden elemente litiazice. Este cunoscut faptul c litiaza renal reprezint unul dintre factorii de risc pentru apariia i persistena ITU. Opinia noastr a fost ca, n acest caz, analizele de laborator s se realizeze n INCDMI Cantacuzino i pentru c era nc vacan iar reedina nu era n capital, colega noastr a respectat recomandarea n a doua jumtate a lunii septembrie. Din discuiile pe cale electronic am aflat c medicul urolog a afirmat c este vorba de o boal de tub renal i c n aceste condiii trebuie s evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastr era deja ngrijorat datorit rezistenei la tratament a infeciei cu E. coli. Dup administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizat la Bucureti n luna septembrie a fost steril, situaie conform cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor). Totui, dup circa 2-3 sptmni, semnele i simptomele revin i colega ni se adreseaz din nou, pentru un sfat, menionnd i rezultatele obinute la testarea sensibilitii la antibiotice pentru tulpina de E. coli (menionate mai sus) i cernd s i recomandm unul dintre antibioticele din list pentru a ncepe un nou tratament. Aa cum nici diagnosticul i prescrierea tratamentului la telefon nu reprezint un bun exemplu n medicin, nici utilizarea cii electronice nu poate s substituie examenul clinic i analizele de laborator. Avnd n minte aceste recomandri pe care le-am nvat, la rndul nostru, n vremea studeniei sau n timpul rezideniatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI Cantacuzino. Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega noastr (totui, rezultatul nu a fost surprinztor). Pentru c toat aceast discuie se purta, din nou, pe cale electronic (colega noastr se ntorsese n localitatea de reedin) i pentru c nu tiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, n primul rnd am solicitat aceast informaie. Aflnd att laboratorul ct i medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru

noi o certitudine c ultimul diagnostic este i el corect i, n context, existau dou posibiliti de prim intenie: infecie cu un alt germen din flora proprie, n condiiile litiazei renale; infecie dubl, att la nivel urinar ct i n alt sediu, care trebuie tratat simultan, urmnd ca situaia litiazei renale s fie rezolvat ulterior. Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelnd la unul dintre cei mai experimentai colegi, unul dintre puinii i adevraii profesori din catedra de microbiologie (ajuns / scos la pensie), n final a fost dovedit o dubl infecie, ITU i la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul infeciei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infeciei, dispariia semnelor i simptomelor i primirea mulumirilor de rigoare, prin email. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic i urmrile acestei lipse Un alt coleg mai tnr, de aceast dat n primii ani de studiu, a relatat dup momentul n care am discutat i rezolvat o situaie particular, medical, c n vremea copilriei a primit de foarte multe ori antibiotice, de regul n cadrul unei auto-medicaii stabilit n familie. Cele mai frecvente probleme, ca i la muli ali copii (dac nu chiar la toi) erau legate de nas-gt-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au repetat anual i de mai multe ori pe an pn spre vrsta de 13-14 ani. Se pare c un moment important a fost legat de o infecie de acelai tip, cu manifestri ceva mai serioase, care au determinat familia s se prezinte mpreun cu tnrul nostru la medicul de familie; acesta, analiznd automedicaia propus a concluzionat c respectivul medicament n cantitatea propus reprezenta un risc pentru pacient i n acest context, pacientul a neles c nu trebuie s mai accepte medicaia ca atare (chiar dac era minor, la acea dat). Totui, colegul nostru a concluzionat: oricum a fost suficient de mult timp s iau pastile aiurea. ns, toate aceste probleme s-au artat a fi minore, fa de ceea ce a urmat. ntr-o toamn, la nceput de liceu, ntr-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se pot petrece vinerea, n week-end, noaptea, la sfrit de program etc), tnrul coleg a revenit acas cu dureri foarte mari n zona articulaiei coxo-femurale, dup o lovitur aparent minor, n cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul c prima reacie acas a fost o baie fierbinte (dar realmente fierbinte). Dup 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult i copilul (avea totui numai 15 ani) nu s-a mai putut deplasa fr ajutorul unuia dintre prini sau a unui cadru metalic. Au nceput peripluri prin uniti sanitare, iniial la un spital cu profil de urgene copii, ulterior la un spital de urgen pentru aduli, la o secie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize. n timpul week-end-ului durerile s-au intensificat i a fost nregistrat febra (peste 38,5C); copilul nu mai putea pune pe pmnt membrul inferior drept. La recomandarea unor cunotine, familia s-a ndreptat iniial ctre cel de al treilea spital (cu profil de copii). La acest spital, n tot cursul dimineii respective, nimeni nu a gsit timpul necesar pentru a l consulta pe copil care menioneaz, din amintiri: nimeni nu s-a uitat la mine, eu m ineam de perei i mama alerga ..., motiv pentru care au plecat de la al treilea spital i s-au ndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil de aduli. Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaiei (tradus prin valorile nalte ale reactanilor de faz acut) i sugerarea unei infecii. Medicul a luat legtura cu un coleg de la un al patrulea spital (cu profil de copii), suspicionnd, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular. Din amintirile de copil am putea remarca ntre timp trecuser cam 5 zile, poate chiar o sptmn, urlam de durere cnd ncercam s merg, abia mai puteam s m dau jos din pat i daca eram ajutat urlam de durere pentru c nu mai suportam s fiu atins; devenise un chin s merg la baie pentru c oricum dura mult i acolo nu prea mai puteam s stau ... mi s-au fcut analize, radiografii; analizele indicau o infecie care cretea" n comparaie cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic. Medicii, dup un timp, au indicat tratament cu oxacilin, 12g / zi, iar ntre diagnosticele difereniale luate n discuie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoz osoas, reumatism i ... n cel mai bun caz, o infecie (copilul, actualul nostru coleg, i amintete c dup mult timp a aflat de la prini c a existat i suspiciunea de cancer, dar prinii au tiut acest lucru de la nceput; i i mai amintete i alte aspecte, pe care nu le putem discuta n materialul de fa). Dup circa 1 sptmn de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri n 30 de minute, ca s ajung la baie (noroc cu nite biei care stteau cu mine n salon i m ajutau). A primit n continuare

oxacilin 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare c s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la nceput i pn n timpul acestei internri), semnele de laborator (reactanii de faz acut) au nceput s stagneze sau s evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel i impotena funcional. La sfaturile unor prieteni, prinii au decis s transfere pacientul n al cincilea spital, cu profil de aduli, transfer care nu a fost realizat cu foarte mult uurin, dar, se pare c acest ultim transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poart i astzi un deosebit respect celor care s-au ocupat de el n clinica de ortopedie a spitalului, att efului de clinic dar i unui coleg, care la acea vreme era mai tnr i pe care avem plcerea s l cunoatem i noi. Datorit suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizat i o scintigrafie osoas (din fericire infirmnd respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecios a fost continuat iniial cu oxacilin 2g / zi n asociere cu gentamicin 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 sptmni, urmat de tratament cu oxacilin 2g / zi. Tnrul nostru coleg i mai amintete c, nainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost administrat intra-venos cnd am plecat de la ... deja artam ca un drogat; aveam pe mini foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ... iar n momentul n care a auzit pentru prima dat c a existat suspiciunea de cancer osos a slbit circa 4 kg n 2 zile. n final, pacientul a fost externat, vindecat, dup o lung perioad de suferin. Din discuia cu tnrul nostru coleg i din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo ncercare de diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care s fie transmis spre analiz (nainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de snge pentru hemoculturi. Nu putem meniona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tnrul coleg le-a acumulat pe parcursul acestei experiene de via. Totui, amintim o dorin exprimat de acesta de fiecare dat cnd trebuie s merg la spital, m rog s dau de un OM. 3. Despre unele teoreme din timpul facultii sau rezideniatului Foarte mult timp, la cursuri n timpul studeniei sau n timpul rezideniatului am fost nvai c IDR cu PPD (vezi i anexa nr. 3) nu are nici o valoare, n Romnia, pentru c toi copiii sunt vaccinai la natere, pentru c tuberculoza este endemic etc.; n aceste condiii toi cetenii romni au IDR pozitiv i o nou testare nu va aduce nici o informaie util. Am suspicionat de mult timp c aceast teorem nu are acoperire real. n ultimii doi ani, prin colaborare cu o serie de studeni entuziati (sigur, studiile trebuie continuate i este necesar realizarea unor observaii pe un lot semnificativ statistic), am nceput infirmarea acestor supoziii, transmise, din pcate, multor generaii de studeni, rezideni etc. Din cei peste 60 de studeni care au dorit s participe la studiu, n 40,9% dintre cazuri valoare citirii la 48 i 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri n timp ce n 19,7% valoarea induraiei a fost de peste 10 i pn la 22 milimetri. ntr-un caz, consultul cu medicul de specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrrii de hidrazid a acidului izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar pentru respectivul, mai tnr, coleg.

6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n diagnosticul microbiologic direct


n schema general a diagnosticului microbiologic direct, fie c diagnosticul se adreseaz unei infecii bacteriene, fie uneia fungice, recoltarea (prelevarea) i transportul produsului patologic reprezint o etap esenial. De altfel aceast afirmaie este perfect valabil i n diagnosticul virusologic sau parazitologic. Utilizm termenul de produs patologic n relativ exces, adic de regul recoltm un anumit produs care este potenial patologic; faptul c este patologic l vom dovedi (sau infirma) n cursul diagnosticului de laborator. Pentru a simplifica modul de exprimare, vom accepta utilizarea acestor termeni ca atare. Prelevarea i transportul produsului patologic (p.p.) efectuate corespunztor va permite realizarea etapelor urmtoare de diagnostic, culminnd cu stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a microorganismului implicat patogenic n infecia dovedit la un pacient anume (nu exist boli, ci bolnavi).

Reguli privind recoltarea produselor patologice


Se cunosc o serie de reguli care trebuie respectate cu strictee n cursul acestei etape:

este recomandabil ca recoltarea i stabilirea modalitii de transport a p.p. s fie fcut de medic sau sub ndrumarea unui medic de specialitate prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s fi primit antibiotice sau chimioterapice acest deziderat este ndeplit din ce n ce mai rar ceea ce creaz multe probleme n diagnosticul microbiologic contribuind i la selectarea microorganismelor rezistente la medicamentele antimicrobiene eforturile privind ndeplinirea lui trebuie s aparin att pacientului ct i medicilor implicai (medic de familie, medic de alt specialitate) chiar dac boala este grav iar tratamentul antibiotic pare urgent, trebuie reinut c pentru recoltarea p.p. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaa pacientului sunt necesare numai cteva minute; dup recoltarea p.p. se poate administra prima doz de antibiotic sau chimioterapic, ales empiric, pe criterii de probabilitate n cazul n care evoluia sub tratament antibiotic este nefavorabil, diagnosticul microbiologic va permite (ntre timp) izolarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice astfel nct schimbarea tratamentului se va putea face n mod riguros, tiinific alternativele sunt reprezentate de schimbarea tratamentului n mod mai puin raional sau chiar iraional, cu posibile urmri nefaste pentru pacient sau apelarea la cocteil-ul (asocieri) de antibiotice cu riscurile de rigoare n cazul n care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost nceput nainte de prezentarea la spital / laborator, n funcie de boala suspectat se pot recomanda urmtoarele abordri oprirea, dac este posibil, tratamentului pentru 24 - 48 ore, cu recoltarea p.p. i nceperea diagnosticului microbiologic recoltarea p.p. imediat nainte de urmtoarea doz de antibiotic ncercarea de antagonizare a efectului antibioticului, n mediul de cultur (ex. cu sulfat de magneziu n cazul n care s-au administrat tetracicline) diluarea inoculului (mai ales dac pacientul a primit un tratament bacteriostatic) n mediul de cultur fr antibiotic notificarea n formularul n care se solicit analiza de laborator i care nsoete p.p. precum i n buletinul de analiz, a tuturor datelor privitoare la tratamentul primit de ctre pacientul investigat recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai aproape de debutul bolii, dar trebuie ales momentul cel mai potrivit (optim), respectiv momentul n care este cea mai mare probabilitate ca agentul etiologic s se gseasc n produs n funcie de evoluia bolii (de ex. coprocultura n febra tifoid se va efectua dup prima sptmn de evoluie) n funcie de specificul fiziopatologic al bolii respective (de ex. se recomand efectuarea hemoculturii n accesul febril) produsul patologic din care estimm c vom putea izola agentul etiologic al bolii suspicionate va fi ales n funcie de maladie i va putea fi reprezentat spre exemplu de o secreie de la nivelul presupusei pori de intrare (ex. secreie nazal sau faringian n difterie, secreie genital n cazul unei boli veneriene etc) un produs de la nivelul cilor de rspndire n organism (ex. snge, esut recoltat prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici) un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex. urin n infeciile tractului urinar, materii fecale ntr-o boal diareic acut etc) un produs de la nivelul focarului infecios (ex. lichid cefalo-rahidian / LCR n meningit, sput n pneumonie etc) n vederea alegerii produsului care urmeaz a fi recoltat este necesar cunoaterea patogeniei, evoluiei i elementelor clinice legate de bolile infecioase, ceea ce este esenial n cazul practicrii cu adevrat a microbiologiei clinice periodicitatea cu care se realizeaz recoltarea de p.p. poate influena rezultatul n anumite cazuri, spre exemplu n suspicionarea unui sepsis (denumirea acceptat actual pentru septicemie) se recomand recoltarea a 23 probe de snge n 24 ore, pentru hemocultur n suspicionarea unei boli diareice acute se recomand recoltarea a cte unei probe de materii fecale, trei zile consecutiv, pentru coprocultur

n suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomand recoltarea a cte unei probe de sput, trei zile consecutiv etc ceea ce a fost prelevat i transmis pentru examinare trebuie s reprezinte cu adevrat p.p. (acel produs care conine cu mare probabililtate microorganismul infectant), spre exemplu n cazul n care este suspicionat diagnosticul de meningit i a fost recoltat LCR, n cazul n care meningita este de etiologie bacterian sau fungic, microorganismul implicat patogenic va putea fi identificat n cursul diagnosticului microbiologic n schimb, dac n cazul n care este suspicionat tuberculoza pulmonar se vor trimite spre examinare saliv sau secreii de la nivelul arborelului respirator superior n loc de sput, diagnosticul microbiologic este imposibil etc din p.p. se vor preleva i utiliza n cursul diagnosticului microbiologic poriunile cele mai reprezentative, respectiv acele poriuni n care sunt cele mai mari anse de identificare / vizualizare prin microscopie / cultivare i izolare a microorganismului infectant, spre exemplu n cazul recoltrii de materii fecale (suspiciune de boal diareic acut) se vor selecta poriunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente) este necesar s se recolteze o cantitate de p.p. suficient pentru efectuarea diagnosticului microbiologic (preparate proaspete, frotiuri, cultivri pe medii de cultur, inoculri la animale de experien, reluarea unor manevre n cazul c este necesar recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze n condiii stricte de asepsie, pentru prevenirea contaminrii celui care recolteaz, pentru prevenirea supra-infectrii pacientului i pentru prevenirea contaminrii p.p. se vor respecta precauiunile universale privind prevenirea contaminrii n unitile sanitare se va evita, pe ct posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparin florei microbiene normale (spre ex. prin tehnica de recoltare / vezi recoltarea urinei sau prin manevre invazive care unteaz cile naturale prin care sunt eliminate microorganismele / vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar) se vor utiliza instrumente sterile i recipiente (containere / recoltoare) sterile. Regulile prezentate mai sus reprezint elemente fundamentale n vederea obinerii unui diagnostic corect i, dup opinia noastr, trebuie cunoscute de orice persoan implicat n actul medical, inclusiv de studenii la medicin, chiar dac nu vor alege pentru viitor pregtirea n domeniul medicinei de laborator sau n domeniul bolilor infecioase. nainte de a ncheia aceast parte a capitolului privind normele privind recoltarea i transportul p.p. n diagnosticul microbiologic direct dorim s subliniem cteva aspecte care nu trebuie s fie neglijate, dup cum urmeaz: instrumentele pentru recoltare trebuie s fie nu numai sterile dar i adecvate, de ex. foarte frecvent este utilizat tamponul de vat, ns recoltarea cu tampon ar trebui s fie recomandat doar recoltrii i transportului p.p. = secreie de la suprafaa mucoaselor i tegumentelor cu leziuni vata poate conine substane inhibitoare pentru microorganisme cantitatea de p.p. recoltabil este mic microorganismele i leucocitele rmn n proporie mare pe vat i nu pot fi uor transferate pe frotiu, mediu de cultur pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu vat este contraindicat recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie nti curate (dar prin cltire s fie eliminate orice substane chimice cu posibil efect antimicrobian) i apoi sterilizate, preferabil prin autoclavare; nchiderea recipientelor trebuie s fie perfect, pentru a preveni orice contaminare pe parcursul transportului recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie marcate corespunztor n aa fel nct s nu fie posibil apariia unor confuzii; ceea ce se noteaz pe recipient trebuie s corespund cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei analize datele de identificare i alte date semnificatice vor fi trecute n urmtoarele documente registrul unitii sanitare / seciei / clinicii care solicit analiza respectiv (n cazul n care recoltarea produsului patologic se face n afara laboratorului) formularul prin care se solicit analiza microbiologic registrul de lucru al laboratorului formularul prin care se anun rezultatul analizei (buletinul de analiz) pentru simplificare, un singur formular poate include att partea corespunztoarea solicitrii analizei ct i buletinul de analiz microbiologic

o alt modalitate de simplificare ar putea fi reprezentat de nregistrarea electronic a datelor i utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor; exist doar cteva uniti sanitare n Romnia unde sunt utilizate aceste metode pentru reducerea cantitii de date i respectiv asigurarea confidenialitii, se recurge la numrul unic de identificare, un grup de cifre i litere care permit codificarea i asocierea a cte unui astfel de numr fiecrui pacient n parte cu toate c nregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicai n actul medical o simpl i inutil birocraie, aceast modalitate de apreciere este complet eronat; nregistrarea datelor i fluxul informaiilor n sistemul sanitar sunt extrem de importante i este necesar s fie depuse toate eforturile n vederea efecturii lor n mod corespunztor (din pcate orele de studiu dedicate acestor aspecte sunt mult prea reduse att pe parcursul studeniei ct i n cursul rezideniatului) elemente importante care trebuie notificate atunci cnd se solicit o analiz de laborator microbiologic pentru identificarea produsului patologic care urmeaz a fi prelucrat se vor nota numele, prenumele, vrsta pacientului (sau numrul unic de identificare), data i locul recoltrii (unitate sanitar, clinica, secia, salonul) pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modaliti pentru prelucrarea p.p. se vor nota diagnosticul prezumtiv, natura p.p., examenul solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a fost administrat respectivului pacient (antibiotic sau asociere de antibiotice, data nceperii administrrii, doze, durat) n acelai sens se vor nota data i ora recoltrii, data i ora recepionrii n laborator, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p. subliniem faptul c, cel mai adesea venim n contact cu formulare incomplete / completate indescifrabil / completate cu erori i chiar dac ar putea prea incredibil, formulri de genul nume X, prenume Y, prob Z, rugm toat bateria de analize sunt nc mult prea frecvente i ar trebui ca de fiecare dat s conduc la o discuie ferm cu expeditorul pn cnd asemenea comportamente vor fi eliminate, n beneficiul pacienilor.

Motive pentru care un p.p. ar putea fi respins de la analiza microbiologic


Respingerea p.p. ar trebui s reprezinte o excepie n activitatea unui laborator de analize medicale, dar exist anumite motive care pot conduce la aceast decizie. nainte de a prezenta cteva exemple n acest sens dorim s subliniem faptul c activitatea medical se desfoar ntr-un sistem n care exist mai multe verigi care trebuie s funcioneze perfect (fiecare n parte) iar ntre verigile sistemului ar trebui s existe o perfect colaborare. n vederea stabilirii diagnosticului i tratamentului corespunztor n cazul unui pacient care prezint o anumit boal transmisibil (infecioas) nu exist o subordonare ci o corelare a activitilor. Att laboratorul ct i clinica au de ndeplinit funcii foarte importante, uneori decisive pentru viaa pacientului. Pentru ca n situaiile limit funcionarea s fie perfect este necesar un continuu antrenament att din punct de vedere teoretic i tehnic dar i n ceea ce privete colaborarea dintre parteneri. Respingerea unui p.p. i solicitarea de ctre laborator a recoltrii unui nou p.p. de calitate, care s permit stabilirea diagnosticului microbiologic, trebuie nelese ca un gest normal atunci cnd anumite reguli de recoltare i transport sunt neglijate. n anumite situaii, chiar dac sunt sesizate diferite disfuncionaliti n ceea ce privete modul n care p.p. a fost recoltat i transportat ctre laborator, problemele pot fi rezolvate prin telefon sau o discuie direct, spre exemplu n vederea identificrii unui p.p. care a fost recepionat fr datele de identificare. ns, n cazul n care aceast discuie nu poate conduce la stabilirea identitii p.p., respectiva prob nu trebuie prelucrat n laborator. n cazul n care p.p. a fost identificat dar este necorespunztor din punct de vedere calitativ, prelucrarea acestuia ar trebui temporizat (p.p. meninut la +4C) pn n momentul n care se ia legtura cu medicul care a solicitat analiza i se analizeaz dac recoltarea ar putea fi repetat i urmat de trimiterea unui p.p.corespunztor. n cazul n care o nou recoltare este posibil primul p.p. se ndeprteaz i se va prelucra al doilea. n cazul n care nu este posibil o nou recoltare i se estimeaz c prelucrarea p.p. chiar necorespunztor poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat, se ncearc obinerea datelor care pot fi obinute (cu rezervele de rigoare care vor fi menionate n buletinul de analiz). Iat cteva motive de respingere a unui produs patologic: sput recoltat pe parcursul a 24 de ore sput care de fapt conine saliv i secreii din tractul respirator superior urin recoltat cu mai mult de 60 de minute n urm (care nu a fost meninut la +4C)

exsudat faringian, exsudat nazal, sput, urin, materii fecale etc pentru care se solicit izolarea i identificarea germenilor anaerobi produse patologice pentru care este evident contaminarea (de ex. datorit unui recipient de colectare necorespuztor) etc.

Transportul produselor patologice


n ceea ce privete transportul produselor patologice este semnificativ propoziia urmtoare: produsele patologice trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil. Fa de aceast recomandare cu caracter general, ar fi de discutat o serie de aspecte concrete. Transportul ct mai rapid / sau prelucrarea imediat a unui p.p. recoltat chiar la nivelul laboratorului sunt recomandate ferm datorit urmtoarelor considerente: este necesar meninerea condiiei iniiale a produsului patologic (coninut microbian, citologie etc) pentru a putea nregistra o imagine ct mai apropiat de ceea existent la nivelul procesului infecios diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime pentru supravieuire celelalte condiii necesare supravieuirii microorganismelor difer n funcie de fiecare grup de microorganisme n parte (pH, deshidratare, radiaii UV sau radiaii solare n general, prezena oxigenului, prezena substanelor antimicrobiene, fenomene de autoliz etc) microorganismele din flora asociat se pot multiplica n cursul transportului (de regul mai lesne dect microorganismele patogene) utilizarea mediilor de transport modific aspectul citologic al p.p. este necesar prevenirea contaminrii p.p. precum i prevenirea contaminrii mediului extern sau a personalului care asigur recoltarea, transportul i ulterior prelucrarea p.p. n anumite situaii (rezistena microorganismului n mediul exterior este deosebit de redus) se va recomanda recoltarea i prelucrarea p.p. la patul bolnavului sau, dac este posibil, pacientul va fi invitat n laborator pentru recoltare pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore (repetm propoziia de mai sus: p.p. trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil) n cazul n care timpul de transport al p.p. nu poate respecta ceea ce este indicat se poate recurge la conservarea acestuia dup cum urmeaz meninerea la temperatur sczut (container izoterm cu ghea la 0C sau frigider la +4C); de menionat c Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae etc nu rezist la aceste temperaturi utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc / vezi capitolul 9) adugarea de penicilin, streptomicin i cloramfenicol atunci cnd se urmrete izolarea unui fung (agenii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pot rezista mpachetate n hrtie steril i introduse ntr-o cutie Petri pn la 48 de ore fr s necesite adugarea de antibiotice) aspirarea p.p. lichid n sering, cu eliminarea rapid a bulelor de aer i nchiderea seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril n care introducem imediat acul (atenie la manevrarea acului de sering n condiiile recoltrii unui produs patologic uman / risc de nepare i transmiterea altor infecii ex. HIV) atunci cnd urmrim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieui n acest caz circa 30 de minute etc transportul ctre laborator se va realiza numai de ctre un curier instruit n acest scop n recipiente etane pe care se va lipi pictograma pentru risc microbiologic iar n cazul n care p.p. trebuie expediat prin pot se vor respecta normativele legale n vigoare precum i recomandrile speciale recunoscute la nivel internaional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World Health Organization (WHO), Center for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu meniunea c primele 2 pot fi obinute n mod gratuit.

Exemple de recoltare i transport pentru cteva produse patologice


1. Exsudate otice sau nazale pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin (preferabil lumina natural) utilizm tampoane cu vat obinuite uor umezite cu soluie salin fiziologic steril, ceva mai mici dect n cazul recoltrii exsudatului faringian un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct un tampon va fi utilizat pentru nsmnare pe medii de cultur n cazul suspicionrii difteriei se vor utiliza 3 tampoane tamponul trebuie ncrcat ct mai bine cu p.p. (l rotim relativ ferm pe suprafeele unde este prezent p.p.)

este de preferat utilizarea imediat a p.p. iar n cazul n care acest lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis ctre laborator n mediu de transport 2. Exsudatul faringian se recolteaz preferabil dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i fr s se fi splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii (iar dac aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim 4 ore) pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin i gtul n uoar extensie ne aezm puin lateral fa de pacient pentru a evita contaminarea cu picturi eliminate n cursul unui eventual acces de tuse (de preferin vom purta masc i ochelari) deprimm baza limbii cu ajutorul unui apstor de limb steril i n condiii de iluminare adecvat examinm faringele posterior, pilierii, amigdalele pentru a sesiza care sunt zonele inflamate (roii, cu depozite, ulceraii etc) i eventualele depozite purulente utilizm utilizm tampoane cu vat obinuite un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct un tampon va fi utilizat pentru nsmnare pe medii de cultur n cazul suspicionrii difteriei se vor utiliza 3 tampoane solicitm pacientului s pronune vocala A i printr-o micare de tergere, circular, ferm, recoltm secreia de la nivel faringian, amigdalian insistnd n zonele unde exist ulceraii, depozite (n cazul n care se remarc prezena unei false membrane o detam cu grij nspre periferie i recoltm secreia care exist sub aceast structur) trebuie s evitm atingerea bazei limbii sau a palatului moale este de preferat utilizarea imediat a p.p., sau n cel mult 1-3 ore; n cazul n care acest lucru nu este posibil, tamponul va fi trimis ctre laborator n mediu de transport 3. Sputa n diagnosticul microbiologic al infeciilor acute ale cilor respiratorii inferioare (IACRI) se pot examina prelevate care se pot contamina n cursul recoltrii cu flora bacterian normal: sput, tampon nazal / faringian, aspirat nazal / faringian, aspirat hipofaringian, produs recoltat prin bronhoscopie simpl etc i / sau prelevate care permit evitarea contaminrii orofaringiane: aspirat transtraheal, aspirat transtoracic, aspirat bronhoscopic prin cateter protejat cu canule telescopate / lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronic, biopsie pulmonar pe torace deschis, aspirat pleural, hemoculturi cu toate c este contaminat cu flora normal orofaringian, sputa reprezint produsul patologic recoltat cel mai frecvent, n majoritatea IACRI. Se pot obine probe calitativ corespunztoare n momentul n care pacientul se prezint n unitatea sanitar (este recomandabil s se recolteze prima sput eliminat matinal i n nici un caz sputa din 24 de ore). Pacientul trebuie s neleag diferena dintre "a expectora" i "a tui i scuipa". naintea prelevrii se recomand periajul simplu al dinilor, cltirea energic a gurii i gargara cu ap (sau cu soluie salin fiziologic) dac proba apare constituit n principal din saliv, trebuie s solicitm imediat pentru prelevarea unei noi probe care s permit ulterior definitivarea diagnosticului. n IACRI o prob mucopurulent n volum de 2-3 ml ar putea fi suficient. stimularea expectoraiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu soluie salin (3%) ofer, de regul, probe citologic nesatisfctoare (sputa indus ar putea fi util n izolarea Pneumocystis carinii). n cazul n care se presupune o infecie mycobacterian sau fungic este recomandat recoltarea i prelucrarea a 3 produse, n 3 zile consecutive. splarea sputei intens mucopurulente (n 3 bi succesive de soluie salin izoton) reduce contaminarea orofaringian fr a influena semnificativ concentraia bacteriei infectante prins n trama fibrinoas a probei. Fluidifierea (de ex. cu N-acetil-L-cistein) permite omogenizarea produselor patologice; se realizeaz n cteva minute. n cazul suspicionrii unei infecii fungice, probele fluide se concentreaz prin centrifugare 20 de minute la 3000 rot/min., apoi se examineaz sedimentul. Din probele bioptice se disec mici fragmente suspecte cu volume de circa 1 mm care sunt apoi examinate la stereomicroscop (mrire 30). esutul cazeos, fibros i grsimea ascund n mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu clarific preparatul fiind necesar disocierea i omogenizarea probei. produsele patologice recoltate pentru diagnosticul microbiologic trebuie transmise prompt ctre laborator (preferabil n maxim 1 or, acceptabil n 1-2 ore)

produsele recoltate ntr-un recoltor steril de 50-200 ml, cu capac care permite o nchidere etan, sunt etichetate i expediate imediat la laborator pentru a fi examinate. Nu exist modaliti optime de conservare a probelor. Meninerea la o temperatur de 4C previne multiplicarea contaminanilor, conserv unii patogeni, dar scade pn la anulare ansa de izolarea a altora (ex. H. influenzae, N. meningitidis). utilizarea unui mediu de transport perturb raportul dintre bacterii i reperele citologice ale probei, eseniale pentru apreciare calitii probei i interpretarea rezultatelor sputoculturii, dar n cazul n care se apreciaz c se va depi timpul de transport recomandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. n cazul n care se urmrete, spre exemplu, izolarea M. pneumoniae, cultivarea trebuie fcut ct mai rapid; produsul patologic poate fi conservat maxim 4 ore n lipsa unui mediu special i pn la maxim 24 de ore dac se utilizeaz mediul de transport pentru molicute. n cazul n care ar fi necesar o conservare prelungit, este necesar utilizarea unei temperaturi de 70C (n nici un caz temperatura congelatorului obinuit). 4. Puroiul exist numeroase condiii clinice n care apar supuraii (superficiale sau profunde) iar tehnica de recoltare variaz n funcie de originea puroiului (arsuri i plgi suprainfectate, abcese, flegmoane, fistule etc) este recomandat ca pentru recoltare s folosim tampoane cu vat sterile numai n cazul n care nu avem o alt soluie puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic, pipeta Pasteur, prin biopsiere, chiuretare sau, atunci cnd este vorba de colecii profunde, prin puncie i aspirare n special pentru situaiile n care vom recolta p.p. dintr-o colecie profund, colaborarea ntre clinic i laborator trebuie s fie foarte bun atunci cnd suspicionm o infecie cu microorganisme anaerobe sunt necesare pregtiri speciale i cel puin utilizarea seringii care se nchide cu dop (vezi mai sus); exist germeni anaeobi care pot fi distrui n cteva secunde de contact cu oxigenul transportul ctre laborator se va realiza utiliznd medii de transport sau containere speciale (pentru asigurarea anaerobiozei); p.p. trebuie s fie prelucrat n 1-2 ore 5. Materiile fecale (vezi capitolul 28) 6. Urina (vezi capitolul 29) 7. Sngele (vezi capitolul 31) 8. Lichidul cefalo-rahidian se recolteaz n cazul suspicionrii prezenei unui sindrom meningeal, dup examinarea fundului de ochi (verificm presiunea n artera central a retinei, semne de staz papilar) suspiciunea este ridicat de medicul de specialitate (boli infecioase, neurologie, medicin intern etc) iar recoltarea se va face la patul bolnavului de ctre medicul care are competena de a executa aceast manevr (ex. prin puncie lombar) tehnicile de asepsie trebuie s fie riguroase n toate situaiile, dar n cazul recoltrii LCR atenia trebuie s fie i mai sporit chiar dac acest manual de lucrri practice se adreseaz numai infeciilor bacteriene i fungice, trebuie s privim lucrurile n ansamblul lor i drept exemplu, s nu uitm c exist meningite infecioase i meningite neinfecioase iar meningitele infecioase pot fi fungice, bacteriene, parazitare, virale, prionice; n plus, pentru elucidarea etiologiei unei meningite este necesar efectuarea unor examinri biochimice adiacente celor citologice i microbiologice astfel nct este de dorit recoltarea (la adult) a unei cantiti de 5-10 ml LCR; recoltarea p.p. este invaziv i va trebui s fim n stare s executm toate testele necesare fr a solicita repetarea punciei lombare recomandm recoltarea LCR n 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al treilea tub se vor realiza testele biochimice i alte teste utile pentru a sugera etiologia); dac LCR este franc purulent, examenul microscopic direct se face fr centrifugare n mod ideal, LCR trebuie prelucrat imediat, cu alte cuvinte recoltarea i procesarea p.p. trebuie s nceap la patul bolnavului; recomandm ca pe lng trusa necesar manevrei de recoltare s avem la dispoziie o spirtier, stative pentru eprubete, medii de cultur diverse (agar-snge, Lwenstein, Sabouraud etc) dac LCR urmeaz a fi transportat, transportul trebuie s se fac ct mai rapid i la o temperatur apropiat de temperatura corpului uman (n nici un caz la +4C; att Haemophilus influenzae ct i Neisseria meningitidis, ageni etiologici recunoscui ai meningitelor bacteriene sunt distrui prin refrigerare) un al motiv n favoarea unui transport i o prelucrare foarte rapid a LCR este reprezentat de studiul citologic al p.p. i mai precis de numrarea leucocitelor polimorfonucleare care ncep s fie distruse n numr semnificativ nc din primele 30-60 minute dup recoltare

9. Secreii recoltate de la nivelul aparatului genital exist mai multe tipuri de secreii care ar putea fi recoltate n funcie de manifestarea clinic; n materialul de fa vom discuta doar o parte dintre acestea n cazul secreiei uretrale, la brbat recoltarea p.p. trebuie s se fac dimineaa, nainte de miciune, sau la cel puin 2 ore dup aceasta; n cazul n care pacientul nu se prezint dimineaa i nu este respectat condiia de mai sus iar dup 2 ore de la micionare secreia este n cantitate prea mic, i vom recomanda s consume ct mai puine lichide n restul zilei i s revin n dimineaa urmtoare, nainte de miciune sunt necesare tampoane de vat sterile (un tampon pentru examenul microscopic i al doilea pentru cultivare) sau, alternativ o ans bacteriologic steril; este recomandabil ca ansa s aib firul i bucla de platin (sau ar putea fi o ans bacteriologic de unic ntrebuinare) se observ penisul i meatul urinar precum i dac exist secreie uretral dac exist secreie uretral, aceasta este recoltat cu tamponul (sau cu ansa) n cazul n care nu se evideniaz secreie uretral n mod spontan, cu mna protejat de o mnu de latex, exprimm uretra utiliznd degetul mare i indexul i recoltm secreia care apare dac nici prin aceast manevr nu putem obine p.p. vom recurge la recoltarea intrauretral cu tamponul (sau cu ansa) n acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici, preferabil din alginat de calciu (sau dacron n suspiciunea unei infecii cu Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.); dup introducerea blnd, pe circa 2 centimetri lungime i rotirea intrauretral a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ 1 centimetru mai profund n suspiciunea de gonoree se recomand cultivarea imediat dup recoltare pe mediul de cultur nclzit la 37C; n cazul n care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi transmis laboratorului n mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.) n cazul secreiilor cervicale, la femei recoltarea se va face preferabil n primele 10 zile dup ciclul menstrual, pe masa ginecologic, dup introducerea valvelor ginecologice i examinarea vizual a vaginului i colului uterin dac se remarc o secreie purulent, cu ajutorul unor comprese sterile se ndeprteaz secreia de la nivelui colului extern folosim 3 tampoane sterile introduse i rotite uor 1-2 centimetri n colul uterin (2 dintre tampoane le vom utiliza pentru frotiuri Gram i Giemsa iar al treilea pentru cultivare procednd aa cum am menionat mai sus). 10. Diferite p.p. recoltate n suspiciunea unor infecii fungice n infeciile fungice, n funcie de localizare se pot recolta p.p. foarte variate spre exemplu, n micozele cutanate superficiale dup antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70) raclm tegumentul i utilizm pentru examinare scuamele produse att scuamele ct i alte structuri (fire de pr, fragmente de unghie etc) se mpacheteaz n hrtie steril care se introduce ntr-o cutie Petri i se trimite pentru prelucrare i examinare n laborator (n maxim 48 de ore) n micozele profunde, n funcie de localizare recoltm p.p. i l transmitem ctre laborator avnd grij s prevenim deshidratarea produsului se recomand prelucrarea i examinarea imediat (unii fungi sunt fragili; este de dorit s putem evalua situaia fungilor foarte aproape de momentul recoltrii pentru a putea nelege care a fost situaia in vitro) iar n caz contrar adugm penicilin, streptomicin i cloramfenicol pentru inhibarea multiplicrii bacteriene i meninem p.p. la +4C (supravieuirea la aceast temperatur depinde de fungul implicat i poate varia de la ore la 2 sptmni, aa cum se ntmpl n cazul unor fungi dimorfi). Aa cum am menionat, datele prezentate nu cuprind toate posibilitile i variantele. Am ncercat s dm doar cteva exemple care sunt orientative. Pentru cei interesai exist manuale dedicate exclusiv recoltrii i transportului produselor patologice, n microbiologie. Pentru trei dintre p.p. am ales o alt modalitate de prezentare. Recoltarea urinii, materiilor fecale i sngelui va fi discutat n partea special.

7. Preparate microscopice, frotiuri i principalele coloraii utilizate n microbiologie

Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici, de ordinul micronilor, astfel nct pentru examinarea lor este necesar o mrire de circa 1.000X, aa cum vom discuta i n capitolul urmtor. Exist diferite tehnici prin care se poate pune n eviden prezena unor microorganisme ns, de mare utilitate este examenul microscopic care se poate adresa unor preparate microscopice proaspete (umede, ntre lam i lamel) sau unor frotiuri fixate i colorate n funcie de suspiciunea diagnostic, p.p. examinat etc. n schema general de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic produsul patologic (etapa a 2-a) sau colonia aprut pe mediul de cultur (etapa a 4-a, punctul b, identificarea pe baza caracterelor morfotinctoriale). Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orientativ, ns, chiar din al doilea an de studiu ar fi bine ca viitorii medici s neleag, rein i ulterior s aplice cele nvate, indiferent de specialitatea pe care o vor urma.

Preparate microscopice proaspete (umede, native, ntre lam i lamel)


este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse urmtoarelor proceduri succesive (imersare n amestec sulfo-cromic cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%) lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz suplimentar prin flambare (trecere de cteva ori prin flacra becului Bunsen) depunem pe lam o pictur din produsul care urmeaz a fi studiat dac produsul patologic are consisten lichidian (ex. urin, sediment urinar, materii fecale, LCR, serozitate din ancru presupus sifilitic etc) va fi utilizat ca atare; pentru o mai bun vizualizare putem aduga albastru de metilen, lugol, tu de India, nigrozin etc dac cultura este realizat n mediu lichid (ex. pentru Leptospira spp.) se va utiliza ca atare dac vrem s studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format colonii pe un mediu solid vom descrca o ans din colonie ntr-o pictur de soluie salin fiziologic, ap distilat sau bulion dac p.p. este recoltat ntr-o suspiciune de micoz superficial, pe lama de microscop se va depune o pictur dintr-o soluie 10-20% KOH-glicerol n care se va descrca i dispersa p.p dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi (mucegaiuri) dintr-o colonie, pe lam se va depune o pictur de soluie lactofenol-albastru coton n care vom descrca un fragment din periferia coloniei respective acoperim pictura cu o lamel cel mai frecvent presm uor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer n cazul p.p. recoltat ntr-o suspiciune de micoz superficial, nclzim uor preparatul prin trecere cu grij, de 2-3 ori, pe deasupra flcrii becului Bunsen dac vrem s studiem aspectul fungilor filamentoi (mucegaiuri) dintr-o colonie, nu trebuie s micm sau s presm lamela n microscopia optic pe cmp luminos aezm preparatul pe platina microscopului i examinm iniial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul 20 sau 40 (nu folosim obiectivul de imersie); se pot folosi i alte tehnici microscopice.

Frotiuri (preparate microscopice fixate i colorate)


Structura peretelui microbian determin o anumit afinitate fa de colorani, ceea ce permite examinarea i diferenierea bacteriilor sau fungilor n frotiuri. frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice (recoltate de la om sau de la animale de experien) sau din cultura microbian (n mediu lichid sau solid) frotiul trebuie ntins n strat ct mai subire (preferabil n unistrat) este de preferat s folosim lame i lamele noi supuse urmtoarelor proceduri succesive (imersare n amestec sulfo-cromic cteva zile, splare, cltire, pstrare n alcool 50%) lamele se usuc (folosim o crp curat) apoi se degreseaz suplimentar prin flambare (trecere de cteva ori prin flacra becului Bunsen) Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten fluid sau din culturi microbiene realizate n mediu de cultur lichid dup ce am flambat lama, o aezm cu partea flambat n sus sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc prelevm aseptic p.p. / cultur i depunem produsul n centrul lamei

ntindem prin micri de dute-vino (de haurare) pe axul lung al lamei produsul prelevat, n strat ct mai subire, avnd grij s nu ne apropiem de marginile lamei / ntinderea se poate face i prin micri circulare, excentrice lsm lama s se usuce lng becul de gaz (nu grbim uscarea prin eventuale treceri ale frotiului prin flacr) n cazul n care avem n dotare un dispozitiv n care lama se poate aeza i usca la +70C, vom utiliza aceast metod fixm frotiul; exist metode chimice de fixare, ns cel mai frecvent folosim fixarea prin cldur, distrugnd n acelai timp i microorganismele (care prezint o afinitate tinctorial mai mare dect celulele vii) n acest scop, trecem frotiul prin flacr (aa cum am procedat i pentru flambarea lamei, nainte de executarea frotiului) ns de aceast dat partea pe care am ntins p.p. sau cultura este orientat n sus; ca o modalitate de control, atingem dosul minii cu lama flambat iar temperatura atins prin flambare nu trebuie s fie mai mare dect pe care o putem suporta frotiul fixat este gata pentru colorare Executarea frotiurilor din p.p. cu consisten solid sau din culturi microbiene realizate n mediu de cultur solid dup ce am flambat lama, o aezm cu partea flambat n sus cu ajutorul flaconului cu picurtor sau cu ansa bacteriologic sterilizat i rcit depunem n centrul lamei o pictur de soluie salin fiziologic sau ap distilat sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc prelevm aseptic p.p. / un fragment din colonie i depunem produsul n pictura de fluid de pe lam omogenizm foarte bine p.p. / fragmentul de colonie n pictura de fluid procedm ca mai sus pentru ntinderea, uscarea i fixarea frotiului Executarea amprentelor de organ / alte p.p. flambm lama cu partea flambat atingem suprafaa de seciune a organului respectiv lama se poate aplica i pe suprafaa de seciune a unor prelevate bioptice sau obinute prin necropsie procedm ca mai sus pentru uscarea i fixarea frotiului

Colorarea frotiurilor
Exist foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor. Dintre acestea vom prezenta doar cteva dintre coloraiile folosite mai frecvent. n vederea colorrii avem nevoie de o trus pentru colorare (stativ de colorare, colorani conform reetei de colorare, ap distilat sau ap curent pentru splare, stativ de uscare). Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraiile cu albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram i dup caz, Ziehl-Neelsen. n funcie de suspiciunea diagnostic i p.p. examinat se pot folosi i alte coloraii (de ex. coloraia Gimenez pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale infectate experimental sau coloraia cu albastru de toluidin pentru evidenierea Pneumocystis carinii). n cazul multora dintre coloraiile uzuale au fost realizate diferite modificri n funcie de experiena autorilor i scopul urmrit. De ex. coloraia cu A.M poate avea urmtoarele variante: albastru de metilen Lffler pentru cele mai multe coloraii simple sau ca un al doilea colorant n coloraia Ziehl-Neelsen albastru de metilen policrom pentru evidenierea Bacillus anthracis n p.p., pentru corynebacterii sau nlocuind coloraia de mai sus albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.p., cu o sensibilitate mai bun dect utilizarea A.M. Lffler etc. n cursul lucrrilor practice precum i n manualul de fa se va discuta numai cte o variant cu referire la principalele coloraii folosite n microbiologie. Cei interesai au la dispoziie pentru studiu un bogat material teoretic iar dup ncheierea antrenamentului personal n ceea ce privete realizarea de frotiuri i coloraii, fiecare va putea alege o variant, aplicabil n funcie de situaie. Pentru colorarea frotiurilor obinute din cultur vom folosi n special coloraiile Gram, Ziehl-Neelsen i alte coloraii specifice, dup caz (coloraii pentru cili, capsul, spori etc). Coloraia cu albastru de metilen acoperim frotiul cu soluie de albastru de metilen, pentru 3-4 minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime) splm cu ap distilat sau ap de la robinet

aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraia Giemsa fixarea frotiului nu se face la cald ci chimic, cu alcool metilic (de ex. timp de 1 minut) scurgem lama i ateptm evaporarea alcoolului metilic acoperim frotiul cu soluie May-Grnwald (diluat n pri egale cu tampon fosfat), pentru 3 minute nclinm lama i scurgem soluia colorant (care are i rol fixator) acoperim frotiul cu soluie Giemsa, pentru 10 minute splm cu tampon fosfat ateptm ca frotiul s se usuce i examinm cu un obiectiv intermediar; dac colorarea celulelor este mai slab dect cea ateptat acoperim din nou frotiul cu soluie Giemsa, nc 10 minute splm cu tampon fosfat aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraia Gram dilum ntr-un recipient fucsina (9 pri ap distilat / 1 parte fucsin) acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet (violet de genian din punct de vedere istoric), pentru 1-3 minute (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime) ndeprtm colorantul acoperim frotiul cu lugol (mordant, fixator) pentru 1-3 minute ndeprtm lugolul acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton (1 parte aceton / 3 pri alcool de 96) pentru un timp foarte scurt, 7-8 secunde splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet acoperim frotiul cu fucsina diluat 1/10 pentru 1 minut splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraia Ziehl-Neelsen Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool rezisteni (BAAR), solubiliznd peretele bacterian prin creterea temperaturii, facilitnd penetrarea colorantului. punem frotiul uscat i fixat pe un suport situat deasupra tviei de colorare acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat (filtrat extemporaneu) trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperit de fucsin, pn ncepe emiterea de vapori (nu atingem temperatura de fierbere). n cazul n care lama nu mai este acoperit complet cu fucsin, adugm colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioad n care repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn la emiterea de vapori. splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet adaugm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95), pentru 2-3 minute splm cu ap distilat sau ap de la robinet recolorm cu albastru de metilen, 1 minut splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraia Kinyoun Este o coloraie util n identificarea prezenei de BAAR, fr a utiliza nclzirea n cursul etapelor de colorare (coloraie la rece). acoperim lama complet cu o hrtie de filtru decupat n acest scop picurm soluie de fucsin fenicat Kinyoun pn cnd hrtia de filtru se mbib complet i ateptm 5 minute

ndeprtm hrtia de filtru splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet acoperim lama cu amestecul decolorant acid-alcool pentru circa 30 secunde; vrsm amestecul decolorant i repetm operaia pentru nc 30 secunde splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet acoperim frotiul cu albastru de metilen, pentru 1 minut (nu are rost s acoperim cu colorant lama n ntregime) splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraii fluorescente Exist mai multe variante, inclusiv coloraii n care se utilizeaz anticorpi marcai fluorescent. Vom prezenta n continuare coloraia fluorescent cu auramin O. Este o coloraie util n identificarea prezenei de BAAR (sensibilitate crescut). colorm cu soluie de auramin O (amestec de auramin O, alcool etilic, fenol, ap distilat), pentru 15 minute splm cu ap distilat decolorm cu amestec de acid-alcool, pentru 5 minute splm cu ap distilat contracolorm cu soluie de permanganat de potasiu, pentru 2 minute splm cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare (de preferat) sau grbim uscarea prin tamponare cu sugativ sau hrtie de filtru examinm la microscop, notm observaiile, interpretm Coloraia Gimenez Este o coloraie util n identificarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale infectate experimental sau n culturi precum i pentru identificarea incluziilor de Chlamydia trachomatis sau Chlamydia spp. acoperim lama cu xilol, pentru 5 minute ndeprtm xilolul acoperim lama cu alcool etilic (96), pentru 2-3 minute ndeprtm alcoolul acoperim frotiul cu soluia de fucsin fenicat preparat dup reeta Gimenez, pentru 1-2 minute, fucsina se picur pe frotiu printr-o plnie prevzut cu o hrtie de filtru splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet acoperim frotiul cu soluie de verde malachit, pentru 6-9 secunde splm insistent cu ap distilat sau ap de la robinet aezm frotiul n stativ pentru uscare examinm la microscop, notm observaiile, interpretm. n capitolul urmtor, dup prezentarea microscopului optic (n cmp luminos), vom enumera o serie de date privind structurile care pot fi observate.

8. Tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic


Microscopul este un instrument absolut necesar n vederea stabilirii unui diagnostic bacteriologic direct (exist tehnici de microscopie care pot fi utile i n diagnosticul microbiologic indirect). Exist mai multe categorii de microscoape. n mod uzual examenul microscopic utilizeaz microscopul optic (microscopia optic pe cmp luminos). n anumite situaii se poate recurge la microscopia cu fond negru, microscopia cu contrast de faz sau la microscopia cu fluorescen. n cazul utilizrii ultimelor trei tipuri de microscop este necesar o camer obscur. Microscopia electronic, microscopia protonic sau alte tehnici sofisticate de microscopie nu fac obiectul materialului de fa (aceste tehnici ar putea fi utilizate n cercetare, de ex. pentru a evidenia interrelaia dintre bacterie i bacteriofag).

Microscopul optic i microscopia optic pe cmp luminos

Microscopul optic este un instrument care permite observarea obiectelor mai mici dect cele care pot fi vzute cu ochiul liber (sau cu lupa). Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv i de lentile ocular. Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de celalalt prin microscop este:

unde l reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este indicele de refracie al mediului strbtut de radiaie ntre obiect i ocular iar u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai ndeprtate de ax care mai ptrund nc n obiectiv. Pentru a micora aceast distan i respectiv pentru a mbunti performanele microsopului exist mai multe metode dintre care vom meniona dou, utilizate i n studiul microbiologic: utilizarea unor radiaii cu lungime de und l ct mai mic (de ex. pentru radiaia ultraviolet se pot distinge obiecte cu dimensiuni de 0,15 mm) mediul transparent dintre obiect i obiectiv s aib un indice de refracie n ct mai mare (aa cum se procedeaz n cazul microscopului cu imersie). n microscopia optic pe cmp luminos lumina este transmis de-a lungul axului optic al instrumentului, prin preparat, n aceste condiii obinndu-se un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele, pentru a putea fi vzute, se disting pe fondul luminos fie prin opacitate, fie prin culoarea lor (n special dup utilizarea unor tehnici de colorare - a se revedea capitolul 7). Pot fi realizate i msurtori cu ajutorul micrometrelor (utile mai mult n diagnosticul parazitologic); micrometrele sunt plcue de sticl pe care sunt marcate scale fin divizate, de dimensiuni cunoscute, a cror imagine se poate suprapune peste imaginea obiectului de cercetat.

Prile componente ale microscopului optic


Microscopul optic are urmtoarele prile componente: 1. Piciorul microscopului, alctuit dintr-o mas metalic cu rol de susinere, pe care se sprijin platina microscopului. Pe platina microscopului se aeaza preparatul. Platina prezint un orificiu central care permite trecerea razelor luminoase i orificii laterale n care sunt prini cavalerii cu ajutorul crora preparatul este fixat pe platin. Cu ajutorul a 2 uruburi ce se gsesc sub platform, aceasta se poate deplasa pe 2 direcii perpendiculare. 2. Tubul microscopuluisusine ocularul i obiectivul. Tubul poate fi deplasat mai rapid i grosier cu ajutorul macrovizei i mai lent i fin cu ajutorul microvizei. La captul superior al tubului se pot pune oculare cu diverse puteri de mrire, care se pot schimba uor. Frecvent utilizm n microbiologie oculare cu puterea de mrire 10x. Obiectivul se monteaza n revolver, situat la captul inferior al tubului. Revolverul este un suport special care permite montarea mai multor obiective i inter-schimbarea lor prin rotire. Obiectivul este compus dintr-un sistem centrat de lentile aezate ntr-un tub metalic care se nurubeaz la revolver. Puterea separatoare a microscopului este determinat de puterea separatoare a obiectivului a crui putere de mrire este cu att mai mare cu ct distana focal a acestuia este mai mic. Exist obiective uscate (ex. 10x, 20x sau 40x) i cu imersie (ex. 90x sau 100x). Obiectivele uscate primesc fasciculul de lumin ce trece prin preparat direct prin aer, astfel c o parte din razele trimise de obiect ctre lentila concav se pierd prin fenomenul de reflexie total. Pierderea razelor de lumin datorit acestui fenomen se poate nltura prin interpunerea ntre lamel i obiectiv a unei picturi de ulei de cedru sau de alt lichid cu indice de refracie apropiat de cel al sticlei din care este fcut lentila frontal a obiectivului, aa cum se petrece n cazul obiectivelor cu imersie, foarte frecvent utilizate n microbiologie. 3. Dispozitivul de iluminare este format din oglind i condensator. Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul optic al microscopului; prezint o suprafa plan i una concav i este fixat pe un suport, n aa fel nct se poate roti n jurul a doua axe perpendiculare 4. Condensatorul care este format din 2-3 lentile cu ajutorul crora lumina reflectat de oglind este concentrat asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumin care cade pe condensator devine convergent. Pentru a obine o imagine clar, condesatorul se poate deplasa pe vertical pn cnd obiectul se gsete n focarul fasciculului convergent care iese din condensator. Razele de lumin, nainte de intrarea n condensator, trec printr-un suport de filtre i o diafragm iris (diafragm de apertur). Condensatorul contribuie n mod esenial la luminozitatea imaginii.

Examinarea folosind microscopul optic n cmp luminos

1. Examinarea unui preparat proaspt (ntre lam i lamel) Pe lam se depune o pictur din suspensia care urmeaz a fi examinat, se acoper cu o lamel, se aeaz pe platina microscopului i se fixeaz cu ajutorul cavalerilor. Condensatorul este cobort circa 1,5 cm sub platin, diafragmul este semi deschis iar obiectivul 40X este cobort pn deasupra lamelei (privind prin lateral). Privind prin oculare, rotim foarte ncet macroviza ridicnd uor tubul microscopului pn apare cmpul microscopic. Punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei i reglnd lumina prin modificarea fantei condensatorului. Se pot examina astfel: sedimentul urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu diaree, suspensii de bacterii care se presupune c sunt mobile, preparate umede realizate n cazul suspicionrii unei micoze cutanate superficiale etc sediment urinar / putem vizualiza: celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este foarte util preparat montat n soluie KOH / putem vizualiza: levuri (numr, form, dimensiuni), blastoconidii, atroconidii, pseudohife, microorganisme asociate preparat colorat cu tu de India (coloraie negativ) / putem vizualiza: levuri capsulate, nconjurate de un halou clar pe fondul ntunecat al preparatului, ex. Cryptococcus neoformans n cazul n care se urmrete mobilitatea microorganismelor, trebuie s putem deosebi micarea real de micarea brownian (oscilaie pe loc a particulelor); urmrim reperele aflate n vecintatea microorganismelor etc. 2. Examinarea unui preparat fixat i colorat Frotiul se aeaz pe platina microscopului i se fixeaz cu ajutorul cavalerilor. Centrm zona pe care dorim s o examinm. Procedm ca mai sus utiliznd obiectivul 40x; alegem cmpul pe care l vom examina ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. un cmp n care sesizm prezena leucocitelor). Ridicm tubul microscopului, punem o pictur de ulei de cedru pe lam, n zona pe care urmeaz s o examinm. Condensatorul este ridicat pn sub platina microscopului i are diafragmul deschis. Privind din lateral, folosim macroviza i coborm obiectivul cu imersie (90x sau 100x) pn atingem suprafaa lamei realiznd contactul i cu uleiul de cedru. Manevra trebuie realizat cu grij pentru a nu sparge frotiul. Privim prin oculare i rotim foarte ncet macroviza ridicnd foarte ncet tubul microscopic, pn prindem imaginea cmpului. Cu ajutorul microvizei punem la punct imaginea. Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic, prezena leucocitelor i dac acestea sunt modificate, prezena bacteriilor i dispunerea acestora (ex. intra sau extra-leucocitar), morfologia bacteriilor, morfologia unor parazii, morfologia levurilor, aspectul frotiurilor de snge etc frotiu colorat cu albastru de metilen (A.M.) / putem vizualiza: bacterii colorate n albastru nchis, n cazul bacteriilor capsulate, aceast structur va aprea ca un halou necolorat, celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul apare ntr-o culoare albastru mai nchis n timp ce citoplasma apare cu nuane de albastru; coloraia cu A.M. permite o mai bun difereniere a detaliilor structurale frotiu colorat Giemsa / putem vizualiza: hematii (roz-roii), polimorfonucleare neutrofile (citoplasm roz, granulaii brune, nucleu violaceu), polimorfonucleare eozinofile (citoplasm roz, granulaii brune, nucleu violaceu), limfocite i macrofage (citoplasm albastr, nucleu violaceu), bacterii colorate n violet, forme trofice de Pneumocystis carinii (nucleu rou, citoplasm albastr), Histoplasma capsulatum n citoplasma celulelor fagocitare (levuri colorate n rou), incluziuni de Chlamydia trachomatis (corpusculii reticulai apar albatri, corpusculii elementari apar roii) etc frotiu colorat Gram n cazul n care frotiul a fost realizat din cultur pur putem vizualiza microorganisme cu aceeai form, aceleai dimensiuni (excepie Proteus spp.), o anumit dispoziie, cu sau fr capsul (halou necolorat), gram pozitive (colorate n violet) sau gram negative (colorate n rou), levurile se coloreaz n violet n cazul n care frotiul a fost realizat din produs patologic putem vizualiza celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii pentru care nucleul i citoplasma apar n diverse nuane de rou, bacterii gram pozitive i / sau gram negative, fibrin i levuri care se coloreaz n violet etc frotiu colorat Ziehl-Neelsen sau Kinyoun / putem vizualiza: bacili de culoare roie, relativ fini (n cazul prezenei BAAR), alte bacterii (ne-AAR), celule diferite (n funcie de sediul recoltrii) i celule inflamatorii de

culoare albastr (toate structurile ne-AAR apar colorate albastru) etc; n cazul colorrii unui frotiu din cultur pur vom evidenia numai bacili de culoare roie.

ntreinerea microscopului
Dup terminarea examenului microscopic trebuie efectuate urmtoarele proceduri: nchidem sursa de lumin ridicm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului coborm condensatorul scoatem lama (sau lama i lamela) de pe platina microscopului preparatele proaspete le punem n borcanul cu amestec dezinfectant preparatele fixate (pe care urmeaz s le pstrm) se introduc ntr-un container cu xilol (1-2 minute) apoi, dup evaporarea xilolului se pun ntr-o cutie tergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hrtie moale, special, pentru a o cura de uleiul de cedru (periodic, vom terge lentila acestui obiectiv cu un tifon foarte curat mbibat n xilol) curm platina microscopului i lentila condensatorului cu tifon curat mbibat n xilol acoperim microscopul cu o hus de plastic sau pnz, pentru a-l feri de praf pentru a preveni efectul nedorit al multiplicrii unor fungi asupra sistemului optic, o recomandare ar fi meninerea microscopului ntr-un ambalaj de polietilen mpreun cu o substan desicant, spre exemplu silicagel.

Microscopul cu fond ntunecat (negru)


Pentru acest tip de examinare este utilizat un microscop optic obinuit la care se adapteaz o surs de lumin cu intensitate mare i un condensator cardioid (cu oglinzi sferice concentrice), cu posibiliti de diafragmare a luminii. Condensatorul pentru cmp ntunecat (fond negru) oprete accesul spre obiectiv al razelor de lumin directe iar obiectul este iluminat oblic. Astfel o parte dintre razele difractate i reflectate de obiectul iluminat oblic ptrund n obiectiv care apare luminos pe fondul ntunecat al cmpului. Pentru a evita reflexia total a razelor, nainte ca obiectul s fie luminat, acesta este imersat ntr-o pelicul de lichid (lichid de imersie cu indice de refracie mai ridicat, ex. glicerina). Lamele trebuie s aib grosimea de 1 milimetru (distana focal a condensatorului fiind 1,2 milimetri). Tehnica de examinare Dup centrarea diafragmei de cmp folosind obiectivul cu mrire 10x i condensatorul pentru cmp luminos, trebuie s nlocuim acest condensator cu condensatorul cardioid. Condensatorul cardioid este cu diafragma nchis. Ridicm condensatorul pn la nivelul platinei microscopului i punem pe lentila condensatorului o pictur de glicerin. Pregtim preparatul proaspt (ntre lam i lamel) i l plasm pe platina microscopului astfel nct s vin n contact cu glicerina de pe lentila condensatorului. Fixm preparatul cu ajutorul cavalerilor. Examinm iniial cu obiectivul 10x, apoi cu obiectivul 40x cobort pn aproape de suprafaa lamelei; punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei. Cnd obinem imaginea curgerii curentului de lichid tim c am prins cmpul microscopic. Utiliznd mai departe microviza punem la punct detaliile i apoi nregistrm ceea ce am examinat. Examinarea la microscopul cu fond negru este indicat n mod special pentru examinarea morfologiei i mobilitii pentru Treponema pallidum n serozitatea din ancrul sifilitic sau pentru Leptospira spp. n produs patologic (ex. urin) sau din medii de cultur. lichidul clar recoltat i ancrul sifilitic trebuie examinat n maxim 20 minute dup recoltare; putem vizualiza spirochete luminoase, fine, lungi, cu spire regulate, capete efilate, cu micri de nurubare, flexie, translaie, pe fond negru n preparatul proaspt care conine leptospire putem vizualiza filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexie, pe fond negru.

Microscopul cu contrast de faz


Pentru acest tip de examinare este necesar s avem n dotarea microscopului o serie de piese strict necesare, respectiv: un condensator special care include o serie de diafragme inelare, obiective de faz (de fapt obiective obinuite la care n planul focal superior a fost montat o plac de faz; obiectivele de faz sunt gravate cu Ph), oculare de centrare, lamp cu intensitate luminoas mare, filtru verde. Folosind microscopia cu contrast de faz este posibil observarea obiectelor transparente care prezint variaii de grosime sau variaii ale indicelui de refracie n structura lor. Sunt utilizate preparate microscopice proaspete.

Faptul c aceste preparate nu sunt fixate i colorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi alterate n cursul acestor procese. Se pot examina structuri citoplasmatice, morfologia celular, dar i structuri bacteriene sau fungice.

Microscopul cu fluorescen
Microscopul cu fluorescen trebuie s fie dotat cu urmtoarele piese speciale: sursa de radiaii (de ex. o lamp din sticl de cuar cu vapori de Hg care emite radiaii ultraviolete), setul de filtre (caloric, de excitaie, de baraj), condensatorul pentru fond ntunecat. Filtrele au urmtoarele roluri. Filtrul caloric absoarbe radiaiile calorice emise de lamp (sursa de radiaii emite att radiaii ultraviolete ct i radiaii luminoase i calorice). Filtrele de excitaie permit numai radiaiilor cu lungime de und mic (ex. ultraviolete) s accead ctre preparatul microscopic. Aceste radiaii reprezint radiaii de excitaie. Filtre de baraj sunt de fapt filtre de protecie pentru c nu permit trecerea radiaiilor de excitaie nocive s treac spre ocular i respectiv spre ochiul examinatorului, n timp ce lumina emis de fluorocromi trece i poate fi perceput. Filtrele de excitaie i de baraj sunt alese n funcie de fluorocromul utilizat. Condensatorul mrete contrastul imaginii mai bine dect un condensator obinuit. Pentru examinarea n fluorescen mai sunt necesare cteva elemente, respectiv obiectivele acromate (cu meniunea c obiectivul cu imersie trebuie s aib diafragm iris), utilizarea unui lichid de imersie care nu se usuc uor i lipsit de proprietatea de fluorescen (ex. glicerin tamponat neutr) i respectiv lame cu grosimea de 1 milimetru. Este preferabil utilizarea unui dispozitiv monocular.

Examinarea folosind microscopul cu fluorescen


Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu flurocromi (colorani fluoresceni). Fluorocromii sunt compui organici care, dup iradiere cu radiaii ultraviolete absorb radiaia excitant, intr n stare de excitaie iar atunci cnd revin n starea normal pierd energia acumulat emind radiaii luminoase. Dintre fluorocromi am putea aminti auramina O, rhodamina B, acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibil emis depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galben pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinaia de auramin O rhodamin B etc). Sunt de menionat n mod special acele substane care se pot lega covalent de anticorpi, marcnd astfel complexele antigen-anticorp care devin fluorescente. Atunci cnd marcajul se realizeaz cu izotiocianat de fluorescein lumina emis va avea culoare verde iar dac marcajul se realizeaz cu lisamin-rhodamin, lumina emis va avea culoare portocalie. Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescen vom meniona examinarea frotiurilor colorate fluorescent sau imunofluorescent n diagnosticul bacteriologic al tuberculozei sau al leprei. Alte exemple vor fi prezentate n cadrul capitolului 20.

9. Medii de cultur
Populaia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habiteaz ntr-un anumit biotop. Clona reprezint populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ. Tulpina = populaia microbian alcatuit din descendenii unei singure izolri n cultur pur. n funcie de temperatura de dezvoltare, microorganismele pot fi mezofile, psichrofile sau termofile. Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n imensa lor majoritate mezofile (au temperatura optim de dezvoltare cuprins ntre 30-37C). Pentru fungi, temperatura optim de dezvoltare este n jur de 28C. Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii trebuie ca dintr-un produs recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i se poat studia caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea este esenial i pentru determinarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmresc trei obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrui microorganism.

Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea microorganismelor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii se numesc medii de cultur. Totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur (bacterian, fungic etc). *** Exist o foarte mare varietate de medii de cultur. Mediile de cultur se pot clasifica dup mai multe criterii. n primul rnd, n funcie de coninutul n celule vii avem la dispoziie: 1. Medii necelulare (artificiale, medii de cultur) 2. Medii celulare (care includ celule vii) i anume animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule. Exist anumite microorganisme (ex. virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate dect pe substraturi care includ celule vii. Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii de cultur (necelulare, artificiale).

Gazdele vii (medii celulare)


Animalele de experien Fie n situaia microorganismelor care nu se dezvolt pe medii artificiale, fie n cazul n care se studiaz caracterele de patogenitate, se pot utiliza n funcie de specia microbian i scopul urmrit: oarecele alb, cobaiul, obolanul, hamsterul i iepurele. Pentru producerea de seruri imune sunt folosii cai. Animalele de laborator necesit condiii speciale de ntreinere iar biobaza trebuie s respecte o serie de norme care s garanteze calitatea acestor gazde vii. Astfel se explic costurile ridicate n ceea ce privete acest tip de medii. Avnd n vedere microorganismul inoculat, susceptibilitatea gazdei i scopul urmrit se pot inocula animale cu vrste diferite (embrioni, nou-nscui, animale tinere, aduli) pe ci diferite de inoculare (per cutanat, prin scarificare, subcutanat, instilare la nivelul anumitor mucoase, per os, intramuscular, intravenos, intratesticular etc). Aa cum, spre exemplu, virulena Mycobacterium tuberculosis scade pe msur de microorganismul este cultivat pe anumite medii de cultur (aspect dovedit i prin obinerea tulpinii vaccinale BCG de M. tuberculosis varianta bovis), n sens invers, este necesar uneori exacerbarea virulenei, prin pasaje repetate realizate pe gazde susceptibile. Alte exemple vor fi discutate n capitolele referitoare la Streptococcus pneumoniae, Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Treponema pallidum, Rickettsia spp., Chlamydia spp i Candida spp. Oul de gin embrionat Are avantajul unui pre mai sczut, este n mod normal steril (n condiiile producerii acestor gazde vii n uniti specializate), nu prezint factori antimicrobieni n perioada n care se realizeaz n mod obinuit inocularea (la 6-14 zile de incubaie). Oul de gin este nti examinat la ovoscop pentru evaluarea embrionului i prezenei unor eventuale modificri nedorite. n condiii de strict asepsie oul de gin embrionat se poate inocula intraembrionar (intramuscular, intracerebral etc), la nivelul membranei chorioalantoidian, n sacul alantoidian sau n sacul amniotic. Oul inoculat se introduce n incubator, la 37C n condiii de bun ventilaie a aerului i umiditate corespunztoare, pentru 1 sau mai multe zile. Se poate utiliza aceast metod pentru izolarea i identificarea tulpinilor rickettsiene (utiliznd metode imunologice, ex. reacia de microaglutinare). Culturi de celule Exist posibilitatea utilizrii unor culturi de organ sau a culturilor de celule dispersate. Acestea din urm se pot clasifica n culturi primare, tulpini celulare i linii celulare. Culturile primare deriv din dispersia enzimatic (de ex. cu tripsin-EDTA) a celulelor unui organ proaspt recoltat i pot fi meninute in vitro pentru 3-5 pasaje. Tulpinile celulare reprezint culturi cu un singur tip de celule (culturi omogene) i pot fi meninute in vitro pentru 50-60 pasaje. Liniile celulare continue (stabile) sunt populaii celulare care deriv din esut normal sau malign i pot fi subcultivate (respectnd indicaiile din protocol) n mod nelimitat. Au fost puse la punct foarte multe linii celulare spre exemplu: linii celulare derivate din rinichi de maimu (Vero, BSC-1, BGMK etc), oarece (McCoy), ovar de hamster (CHO) linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa), laringe (HEp-2)

linii celulare limfoblastoide (MT-4, H9 etc) etc.

Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa, McCoy, pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celular McCoy etc. Liniile celulare pot fi utile i n vederea studierii efectului unor exotoxine, spre exemplu n cazul toxinelor produse de E. coli O157:H7 i respectiv de Shigella shiga se poate utiliza linia celular Vero n timp ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae i E. coli entero-toxigen se poate utiliza linia celular CHO.

Medii artificiale (necelulare)


Mediile de cultur artificiale sunt mai ieftine, se pot prepara mai uor (folosind reete foarte asemntoare celor de buctrie sau alte variante despre care vom discuta pe scurt n continuare) i, fr a fi ideale, sunt cel mai frecvent utilizate n practicat microbiologic. Condiii impuse mediilor de cultur artificiale: - s fie sterile, - s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), - s aib un anumit pH (cel mai adesea ntre 7,2-7,6), - s aib o anumit presiune osmotic, - s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor - alte condiii. Clasificarea mediilor de cultur artificiale Mediile de cultur artificiale se pot clasifica dup o serie de criterii. dup starea de agregare, mediile de cultur artificiale pot fi: solide (agar / geloz, agar-snge, AABTL, ADCL, Bordet-Gengou, Chapman, Lffler, Lwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud, TCBS, TSI etc) lichide (ap peptonat alcalin, bulion Mueller-Hinton, bulion nutritiv, bulion-snge, bulion selenit, bulion tioglicolat, Middlebrook 7H9, O.C.S.T. etc) semisolide (Cary-Blair, MIU, Stuart etc) dup complexitatea ingredientelor, mediile pot fi: simple (agar, bulion simplu etc) complexe (agar-snge, geloz-chocolat, agar cu factori X i V, Bordet-Gengou, Mueller-Hinton etc) dup scopul urmrit mediile de cultur artificiale pot fi: de transport (ap peptonat alcalin, Cary-Blair, Stuart etc) de izolare (agar-snge, Bordet-Gengou, Lffler, Lwenstein, Sabouraud etc) de identificare (TSI, MIU, truse API etc) de conservare (agar nutritiv n coloan etc) dup coninutul n ap, mediile pot fi: cu umiditate obinuit medii uscate (deshidratate) n scopul conservrii medii speciale: elective (Lffler etc) selective (agar-snge azid de sodiu, BSA, Chapman, Mac Conkey, Tinsdale cu telurit de potasiu, medii cu antibiotice etc) de mbogire (ap peptonat alcalin, bulion selenit, O.C.S.T. etc) difereniale (AABTL, ADCL, agar-snge, MIU, TSI, TCBS etc) exist i alte criterii de clasificare. Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric). Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent). Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv. Mediul diferenial conine un indicator de pH i un anumit substrat (de exemplu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea pH-ului i a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. De

exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenierea bacteriilor lactozo-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella, Salmonella etc). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). Iniial, toate mediile de cultur erau preparate n laborator, din ingredientele stabilite conform reetei. Etapele generale pentru producerea unui mediu sunt asemntoare: cntrirea ingredientelor dizolvarea n ap distilat sau ap deionizat verificarea pH-ului i ajustarea la pH-ul corect filtrarea sterilizarea (de regul prin autoclavare) repartizarea n tuburi, flacoane etc. n momentul de fa foarte frecvent se recurge la cumprare de medii deshidratate, situaie n care este necesar doar adugarea apei distilate, demineralizate sau distilate i demineralizate (conform recomandrilor productorului), condiionarea i sterilizarea prin autoclavare sau metoda recomandat pentru mediul respectiv. Exist de asemenea medii gata pentru utilizare, condiionate n plci Petri sau tuburi. Indiferent de forma de condiionare a mediilor de cultur precum i indiferent de modul de procurare al acestora, laboratorul care le utilizeaz trebuie s le supun controlului de calitate. Spre exemplu, pentru a testa sterilitatea mediului agar-snge, incubm 2 plci la 37C timp de 48 de ore; nu trebuie s apar modificri macroscopice. Pentru a testa performana mediului (eficiena biologic) utilizm pe o alt plac, i pe cte o jumtate de plac, vom cultiva o tulpin de colecie de Streptococcus pyogenes i respectiv o tulpin de colecie Streptococcus pneumoniae; incubm placa Petri pentru 18-24 ore la 37C i apoi analizm dezvoltarea culturii, caracterele coloniilor i respectiv caracterele hemolizei produse. n general, mediile de cultur dup producere i pn n momentul utilizrii sunt conservate la adpost de lumina solar, +4C, n folie de plastic nchis ermetic. Mediile pentru anaerobi (bulion tioglicolat, alte medii) se pstreaz n dulapuri, la ntuneric i temperatura camerei. Descriere succint pentru unele medii mai frecvent folosite Agar-snge Include agar nutritiv baz care se dizolv la temperatur ridicat i prin agitare n ap distilat; autoclavm (15 minute la 121C) i apoi rcim pn la 50C. La aceast temperatur adaugm n proporie de 5% sngele defibrinat (snge de berbec, cal, bou sau de iepure; sngele de om ar putea fi utilizat numai dac nu exist o alt posibilitate, folosind de exemplu snge care a depit limita de valabilitate ntr-o banc de snge). Distribuim mediul n condiii aseptice, n plci Petri. Poate fi meninut la +4C pn la 4 sptmni. Agar-chocolat Procedm ca mai sus, pn la obinerea amestecului de agar-snge. Introducem flaconul cu mediu n baie de ap i meninem timp de 10 minute la 80C; astfel eritrocitele vor elibera factorii nutritivi necesari dezvoltrii unor bacterii mai pretenioase din punct de vedere nutritiv. Cnd temperatura revine la 50C turnm mediul n plci Petri. Se poate conserva la temperatura frigiderului pentru nu mai mult de 4 sptmni. Amies Include agar, tioglicolat de sodiu, crbune farmaceutic neutru (pentru a facilita supravieuirea microorganismelor fragile, de ex. Neisseria gonorrhoeae) i o soluie tamponat de sruri anorganice. Nu conine indicator redox. Este sterilizat prin autoclavare i poate fi meninut la +4C timp de 12 luni. Este un mediu de transport care limiteaz i multiplicarea unor eventuali coliformi de contaminare (ceea ce nu se realizeaz prin folosirea mediului Stuart). Ap peptonat alcalin Este un mediu utilizat pentru transportul probelor n care se suspecteaz prezena Vibrio cholerae. Include pepton i clorur de sodiu dizolvate prin nclzire n ap distilat, cu ajustarea pH-ului la o valoare de 8,6-9,0. Mediul este repartizat n tuburi. Sterilizm prin autoclavare (15 minute, 121C). Valabilitatea este de circa 6 luni (la temperatura de 4C). Bulion selenit Este un mediu de mbogire, utilizat pentru izolarea Salmonella spp. Include printre alte componente selenit acid de sodiu. Datorit riscurilor acest mediu nu va fi pregtit de femei nsrcinate iar cei care n produc vor avea grij s nu inhaleze sau nghit aceast substan. Sterilizarea mediului turnat n tuburi se face n baia de

ap la temperatura de fierbere i nu prin autoclavare. Se poate conserva la temperatura frigiderului timp de 6 luni. Cary-Blair Include agar, tioglicolat de sodiu i o soluie tamponat de sruri anorganice dizolvate (prin nclzire i agitare) n ap distilat. Este sterilizat prin autoclavare i poate fi conservat la temperatura frigiderului mai multe luni. Cary-Blair este un mediu de transport n special pentru germeni gram negativi. Lwenstein-Jensen Reprezint mediul clasic utilizat n mycobacteriologie. Include 3 componente principale: o soluie de sruri i amidon, soluia de verde malachit i omogenizatul de ou (proaspete i bine antiseptizate). Dup filtrare produsul se repartizeaz n tuburi (cu capac nurubat, innd cont de timpul lung de incubare, 2-8 sptmni). Mediul este coagulat n pant, la 85C i dup rcire se poate menine la temperatura frigiderului cteva luni, pn la utilizare. Mac Conkey Este un mediu slab selectivo-diferenial care include hidrolizat de gelatin, hidrolizat de cazein, lactoz, sruri biliare, clorur de sodiu, rou neutru (indicator de pH), cristal violet i agar, dizolvate n ap distilat i autoclavate timp de 15 minute la 121C. Poate fi meninut la +4C pn la 4 sptmni. Medii pentru anaerobi Exist mai multe tehnici pentru a asigura condiiile de anaerobioz. Relativ frecvent se utilizeaz montarea plcii Petri, care conine deja mediul de cultur rcit i nsmnat, rsturnat pe capacul propriu, pe care se gsete un plicule care conine amestec reductor (pirogalol, talc, carbonat de potasiu). Utilizm parafin nclzit pentru a etaneiza placa. Dup solidificarea parafinei, mediul de cultur este incubat n vederea obinerii coloniilor. Medii pentru fungi Vom discuta pe scurt doar un mediu mai frecvent utilizat, respectiv mediul Sabouraud. Acesta include glucoz, digestie pancreatic de cazein i agar care se dizolv prin uoar agitare, la cald, n ap distilat. Dup ajustarea pH-ului la 5,6 urmeaz fierberea i filtrarea mediului, la cald. Apoi are loc repartizarea n plci Petri sau n tuburi i acestea se autoclaveaz timp de 15 minute la 121C. nainte de utilizare, plcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului pentru circa 2 luni. De multe ori acest mediu devine selectiv prin adugare de antibiotice (cloramfenicol, gentamincin etc). Despre mediile multitest TSI (triple sugar iron) i MIU (mobilitate indol uree) vom discuta n cadrul capitolelor 12 i 28. Stuart Include agar, tioglicolat de sodiu, glicerofosfat de sodiu, clorur de calciu i albastru de metilen, dizolvate prin nclzire la temperatura de fierbere n ap distilat. Este sterilizat prin autoclavare i poate fi meninut la +4C timp de 2-3 luni. Este un mediu de transport universal; bacteriile pot supravieui 1-3 zile.

10. Tehnici de cultivare


Tehnicile de cultivare se folosesc pentru obinerea de colonii izolate prin nsmnarea produsului patologic pe medii solide i pentru repicarea coloniilor izolate n vederea obinerii de cultur pur, precum i n alte situaii. Pentru a corela noiunile pe care le vom prezenta cu ceea ce a fost prezentat n capitolele anterioare, facem urmtoarele meniuni: n capitolul 5 am discutat schema general a diagnosticului microbiologic acest diagnostic nu poate fi realizat n lipsa cunotinelor privind conduita n laborator i a normelor de protecie a muncii (capitolul 2) echipamentul i aparatura necesare (capitolul 3) dezinfecia i sterilizarea (capitolul 4). Toate acestea trebuie nelese n contextul unei activiti care s previn erorile, s realizeze protecia pacienilor, s permit compararea rezultatelor la nivel naional i internaional, s contribuie la realizarea unei standardizri n microbiologia clinic romneasc i s creasc ncrederea tuturor partenerilor din sistemul sanitar din ara noastr (capitolul 1).

Pornind de la aceste noiuni de baz, n capitolele urmtoare am discutat: prima etap a diagnosticului direct (bacteriologic sau micologic), n capitolul 6 utilizarea examenului microscopic n a doua i respectiv n a patra etap (de identificare) a diagnosticului direct (capitolele 7 i 8) substraturile pe care se poate realiza a treia i respectiv a patra etap (cteva dintre caracterele examinate), n capitolul 9. n capitolul de fa vom avea n vedere o parte dintre tehnicile indispensabile diagnosticului microbiologic n general, subliniind utilizarea acestora n a treia i a patra etap de diagnostic n capitolele urmtoare (11-13) vom prezenta o parte din elementele care definesc complexitatea etapei de identificare a microorganismelor iar n capitolul 14 vom discuta o parte dintre modalitile de stabilire a sensibilitii la antibiotice i chimioterapice (antibacteriene sau antifungice) cu ajutorul crora, dup ncheierea unui diagnostic corect microbiologic, putem stabili n mod tiinific tratamentul antimicrobian ce trebuie prescris unui anumit pacient care prezint o boal infecioas de etiologie bacterian sau fungic. Aa cum am menionat i n capitolul 9, tehnicile de cultivare urmresc trei obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru scopul propus prevenirea contaminrii produsului cercetat cu alte microorganisme i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrui microorganism. Este esenial s se neleag necesitatea obinerii coloniilor izolate precum i a culturilor pure n diagnosticul de laborator bacteriologic i micologic (direct). n cazul n care coloniile izolate reprezint o cultur pur (format din acelai tip de microorganism), aceasta va fi utilizat n vederea identificrii agentului etiologic (bacteria izolat de la un pacient cu o presupus boal infecioas) precum i la efectuarea antibiogramei n vederea stabilirii tratamentului intit (antibioticul la care bacteria izolat este sensibil). n situaia n care nu s-a reuit obinerea culturii pure, pornind de la coloniile obinute se vor face repicri pe medii de cultur neselective. Obinerea de colonii bacteriene izolate dintr-un produs patologic se poate realiza prin epuizarea inoculului pe mediile de cultur folosind: - ansa bacteriologic - pipeta Pasteur - tamponul de vat montat pe o tij - bagheta de sticl n form de L - alte tehnici de nsmnare. Ansa bacteriologic trebuie sterilizat nainte i dup fiecare utilizare a sa prin nclzirea pn la incandescen (la rou) a buclei i firului urmat de flambarea portansei, pe cnd celelalte ustensile pentru nsmnare vor fi sterilizate prin alte metode (vezi capitolul 4).

Obinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului cu ansa bacteriologic


nsmnarea n pentagon deschis a mediului solid aflat ntr-o plac Petri folosind ansa bacteriologic, pentru obinerea de colonii bacteriene izolate, pornind de la un produs patologic recoltat i transportat ctre laborator ntr-o eprubet / tub nchis cu dop de vat include urmtoarele etape: atenie: toate activitile se desfoar n stricta vecintate a becului de gaz ! atenie: pe suprafaa mediului de cultur poate exista lichid de condens care ar putea facilita contaminarea culturii bacteriene; este necesar ca placa Petri cu mediu de cultur pe care dorim s facem cultivarea s fie meninut n termostat, cu mediul n sus, ntredeschis, pentru evaporarea condensului ! se sterilizeaz ansa bacteriologic la flacra becului de gaz prin aducerea la incandescen a buclei i firului ansei urmat de flambarea portansei (trecere prin flacr de 2-3 ori) se noteaz pe placa cu mediu de cultur data inoculrii, numrul de identificare i tipul produsului (tipul produsului poate fi inclus printr-un simbol n numrul unic de identificare) se ia eprubeta cu produs patologic n mna stng (n cazul n care fiind dreptaci, ansa bacteriologic este inut n mna dreapt, ca un creion), se scoate dopul eprubetei utiliznd n acest scop degetele 4-5 de la mna dreapt atenie: s nu se scape dopul din mn = pericol de contaminare a mesei de lucru ! atenie: dopul nu trebuie strns n podul palmei = pericol de contaminare !

se flambeaz gura eprubetei (trecere prin flacr de 2-3 ori, imprimnd o uoar micare de rotire n ambele sensuri) se introduce ansa n eprubet fr s se ating gura sau pereii acesteia n partea superioar, se rcete bucla pe pereii eprubetei n vecintatea produsului patologic i se ncarc bucla ansei din profunzimea produsului patologic, recoltnd fragmente care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii implicate n procesul infecios (ex. poriuni cu aspect purulent) se scoate ansa fr sa atingem pereii sau gura eprubetei atenie: contaminarea pereilor eprubetei n poriunea n care se va monta dopul, va duce la contaminarea dopului i respectiv la o mare probabilitate de contaminarea a celui care va utiliza ulterior eprubeta / tubul cu produs patologic se flambeaz gura eprubetei se monteaz dopul la eprubet printr-o micare de rsucire ce are ca scop fixarea lui atenie: gura eprubetei poate fi fierbinte dup flambare ! atenie: n toat aceast perioad se contraindic efectuarea unor micri brute cu ansa ncrcat cu produs patologic; micrile brute i necontrolate pot determina contaminarea cu produs patologic a mesei de lucru, a mediului de lucru sau a celui care manipuleaz produsul patologic ! dup ce eprubeta a fost aezat n stativ, mna stng eliberat va lua o plac Petri pe care o va aeza pe mas cu capacul n jos i mediul n sus tot cu mna stng se va deschide placa iar cu ansa ncrcat cu produs patologic se vor trasa linii (striuri) aproximativ paralele ntre ele, ca un zig-zag (fr a se ridica ansa de pe mediul de cultur) reprezentnd o prim latur a unui pentagon deschis se nchide placa Petri ansa se sterilizeaz la flacr, portansa se flambeaz se rcete ansa (se poate ncerca rcirea ei prin atingere pe suprafaa mediului solid steril, nensmnat, lng peretele exterior al plcii Petri) fr s se mai ncarce ansa cu produs patologic se traseaz a doua latur a pentagonului intersectnd-o pe prima, tot ca linii paralele, dup care ansa se va steriliza din nou se va proceda la fel ca mai sus i pentru urmtoarele laturi avnd grij s nu se uneasc ultima latur cu prima latur n momentul interesectrii cu ansa a laturii precedente a poligonului, ansa este rencrcat cu microorganisme, dar n cantitate din ce n ce mai mic, pn ce se va ajunge la cteva celule microbiene izolate care, diseminate pe plac vor da natere la colonii microbiene izolate se introduce placa Petri pe care a fost realizat cultivarea n termostat, rsturnat (cu mediul n sus i capacul n jos), la temperatura optim multiplicrii microorganismului suspectat (pentru cele mai multe bacterii termostatul va fi reglat pentru o temperatur de 35-37C, pentru fungi la 28C) dup o perioad de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai multe dintre microorganismele studiate), pe prima latur se va obine cea mai important cantitate de cultur (cultur microbian confluent), pe urmtoarele laturi se va remarca scderea cantitativ a culturii iar cel puin pe ultima latur a pentagonului deschis se vor obine colonii izolate. Dac mediul de cultur pe care s-a realizat cultivarea n pentagon deschis este neselectiv, coloniile izolate obinute pot fi utilizate n etapele ulterioare (identificare prin diferite metode, testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice). n cazul n care cultura primar este obinut pe un mediu selectiv, este obligatorie repicarea coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi asociate cu microorganisme inhibate datorit selectivitii mediului, care nu se vd cu ochiul liber sau cu lupa i care se vor multiplica pe mediile de identificare fcnd imposibil interpretarea rezultatelor. Tehnica descris este o tehnic de baz i cu anumite modificri se poate utiliza i n alte situaii (spre exemplu atunci cnd produsul patologic este recoltat n alte tipuri de recipiente).

Alte tehnici de cultivare (nsmnare)


Am ales pentru o prezentare amnunit tehnica obinerii coloniilor izolate prin epuizarea inoculului cu ansa bacteriologic (nsmnarea n pentagon deschis) deoarece considerm c aceast reprezint o tehnic

esenial, care poate fi reinut nc din al doilea an de studiu). n continuare vom prezenta alte tehnici de cultivare, fr a epuiza toate variantele posibile. nsmnarea cu ansa calibrat se poate utiliza pentru urocultura i n alte scopuri n care aproximarea numrului de microorganisme dezvoltate pe mediul de cultur este util putem utiliza anse de platin sau anse de unic folosin pentru 0,01 sau pentru 0,001 ml / calibrul anselor de platin trebuie verificat n fiecare lun urina recoltat corespunztor (vezi capitolele 6 i 29) se omogenizeaz prin rsturnarea de cteva ori a recipientului de recoltare (nchis etan) respectnd regulile lucrului aseptic, nclinm recipientul de colectare n aa fel nct s putem s punem bucla ansei, paralel pe suprafaa urinei i s prelevm p.p. pe o plac Petri cu mediul de cultur se descarc urina n striu, pe unul dintre diametre; apoi epuizm inoculul pe toat suprafaa plcii n striuri perpendiculare pe striul de descrcare, cu micri de zig-zag dup incubare, n ziua urmtoare vom numra coloniile aprute i spre exemplu vom nmuli numrul de colonii cu 1000 dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml din motive economice putem s realizm nsmnarea n mod asemntor a urinei pe o jumtate sau chiar pe o ptrime de plac. nsmnarea cu tamponul sau cu bagheta de sticl n L aceste tehnici se pot folosi att pornind de la produs patologic (metod preferat n unele laboratoare) ct i de la colonii care sunt utilizate pentru obinerea de cultur pur nsmnarea cu tamponul poate fi folosit i pentru realizarea antibiogramei difuzimetrice vom prezenta n continuare varianta n care se utilizeaz tamponul pentru cultivarea unui produs patologic (exsudat faringian etc), presupunnd c suntem dreptaci notm pe placa cu mediu de cultur data inoculrii, numrul de identificare i tipul produsului (tipul produsului poate fi inclus printr-un simbol n numrul unic de identificare) nu vom mai nota aceast etap la prezentarea urmtoarelor tehnici dar menionm acum faptul c este obligatorie, de fiecare dat; alte lucruri cu importan general, menionate la tehnica obinerii coloniilor izolate prin epuizarea inocului cu ansa bacteriologic rmn valabile scoatem tamponul din tubul protector cu primele trei degete de la mna dreapt flambm gura tubului protector i l aezm pe un stativ cu mna stng lum o plac Petri (care nu mai prezint lichid de condens interior) pe care o aezm pe mas cu capacul n jos i mediul n sus tot cu mna stng deschidem placa iar cu dreapta descrcm tamponul ncrcat cu produs patologic (exist mai multe modaliti de descrcare a tamponului, dintre care vom prezenta dou) descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe o raz a plcii, urmnd ca s dispersm produsul cu o baghet de sticl n L, steril, pe toat suprafaa plcii descrcm tamponul prin rulare, pe toate feele pe un cadran al plcii, urmnd ca s dispersm produsul cu ansa bacteriologic n celelalte cadrane, ca n metoda pentagonului deschis (dup nsuirea tehnicii, pentru economie, se poate realiza cultivarea pe jumtatea unei plci). Tehnica diluiilor succesive n lichidul de condens al mediilor solide mediul de cultur este turnat n eprubete sau tuburi; utilizm mai multe eprubete prelevm cu ansa p.p. i l descrcm n pictura de lichid de condens al primului tub fr s ncrcm din nou ansa cu p.p. o descrcm n pictura de condens a celui de al doilea tub .a.m.d dup nsmnare, nclinm eprubetele pentru a sclda suprafaa mediului nclinat, cu pictura respectiv de lichid de condens, realiznd n acest mod dispersia microorganismelor din pictura de inocul, pe suprafaa mediului. Tehnica epuizrii ansei pe medii solide const n efectuarea unei serii de nsmnri cu ansa bacteriologic ncrcat o singur dat cu amestecul de microorganisme, ntr-un ir de eprubete cu geloz nclinat, fr a steriliza sau a rencrca ansa bacteriologic pe parcurs nsmnm pornind de la baza eprubetei, atingnd mediul i urcnd prin descrierea unor striuri n zigzag, pentru fiecare eprubet n parte realizm astfel o epuizare a coninutului ansei, n final, ajungnd s nsmnm numai cteva celule microbiene, din care vor aprea dup incubare colonii izolate. nsmnarea prin nepare a mediului turnat n tuburi sau eprubete

metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini considerate reprezentative, a tulpinilor de colecie, a tulpinilor de referin, pentru nsmnarea unor medii multitest (TSI, MIU etc) etc se prefer utilizarea unei anse fir, sau a unei anse cu o bucl mic (dup caz) n funcie de scopul urmrit exist anumite variante ale acestei tehnici, iar tuburile (eprubetele) utilizate au dimensiuni diferite i o cantitate de mediu care difer (respectnd protocolul de lucru corespunztor) spre exemplu n cazul nsmnrii mediului TSI se utilizeaz tuburi de dimensiuni mici, cantitatea de mediu utilizat pentru un tub fiind de 3 ml iniial se nsmneaz partea dreapt prin nepare, fr a se atinge baza tubului ulterior se nsmneaz partea nclinat prin realizarea unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa mediului. nsmnarea cu seringa produsele lichide (n special snge, pentru hemocultur dar i alte p.p.) se pot nsmna direct cu seringa cu care s-a fcut recoltarea nsmnarea cu pipeta (Pasteur sau pipeta gradat, dup caz) la deschiderea i nchiderea recipientelor flambm gura fiecruia n parte, aa cum am prezentat mai sus nainte de a folosi pipeta, dei sterilizat n prealabil, o vom flamba prin trecere pe toat lungimea prin flacr pentru a preleva p.p. din recipientul de transport precum i pentru nsmnare n mediul lichid sau solid, folosim un dispozitiv ct de simplu (este contraindicat aspirarea cu gura) dup ncheierea nsmnrii eliminm lichidul rmas eventual n pipet n flaconul cu amestec sulfocromic, introducem pipeta n amestecul sulfo-cromic i aspirm soluia dezinfectant pn aproape de dopul de vat al pipetei toate pipetrile se realizeaz cu ajutorul dispozitivului adaptat la pipet pipeta va fi meninut timp de 24 ore n amestecul sulfo-cromic. nsmnarea cu pipeta, prin inundare reprezint o variant a tehnicii prezentate mai sus se poate folosi pentru depunerea inoculului n vederea realizrii antibiogramei difuzimetrice, pentru verificarea sensibilitii la bacteriofag (lizotipie) etc dup ncrcarea pipetei cu cultura pur, inoculul se descarc pe suprafaa mediului solid din placa Petri, apoi se nclin n mod repetat placa pentru nsmnarea uniform a suprafeei mediului excesul de inocul se aspir cu pipeta Pasteur i se descarc n soluia dezinfectant placa se las apoi lng flacr pentru uscare, cu capacul ntredeschis. Tehnica diluiilor succesive n medii lichide poate fi folosit pentru diluare unor suspensii antigenice, seruri, fagi etc n acest scop folosim un ir de eprubete; n toate eprubetele repartizm cu aceeai pipet o cantitate constant soluie salin fiziologic (0,9 ml n fiecare eprubet) pipetele gradate sterile i mpachetate n hrtie se desfac n momentul utilizrii n modul urmtor: rupem hrtia chiar la mijlocul pipetei, printr-o micare de rsucire n sens opus a celor dou mini; tragem partea de hrtie care se termin cu un capt rsucit liber (corespunde poriunii superioare a pipetei), de care vom ine pipeta n timpul lucrului; scoatem a doua jumtate a hrtiei fr a atinge partea efilat a pipetei i astfel pipeta rmne steril pentru lucru cu o alt pipet prelevm 0,1 ml din cantitatea de suspensie microbian i introducem inoculul n prima eprubet; aspirm i eliminm lichidul din pipet de cteva ori pentru omogenizarea suspensiei; apoi punem pipeta se pune n amestec sulfocromic lum o nou pipet cu care aspirm 0,1 ml lichid din tubul 1 i introducem acest lichid n tubul 2, aa cum am menionat mai sus; schimbm pipeta i repetm manevra pn la ultimul tub; din ultimul tub scoatem 0,1 ml pe care i eliminm n amestecul dezinfectant Cteva tehnici de izolare speciale 1. Metode fizice nclzirea n baie de ap, timp de 10 minute la 80C a p.p. recoltat n mod corespunztor i suspensionat n bulion VF (mediu anaerob) din care se dorete izolarea unor germenii sporulai anaerobi 2. Metode chimice utilizarea mediilor selective sau a mediilor de mbogire

adugarea la 1 ml de p.p. recoltat n mod corespunztor (i suspensionat n bulion VF) a 1 ml de alcool etilic de 95 urmat de agitarea tubului timp de o or la temperatura camerei; produsul rezultat se nsmneaz pe medii anaerobe, pentru izolarea unor germeni sporulai 3. Metode biologice inocularea sputei n care se suspecteaz prezena S. pneumoniae la oarecele alb dup 1-4 zile de la inoculare, oarecele face o infecie septicemic cu pneumococ se poate izola o cultur pur de pneumococ din snge, cord, splin, ficat etc. Aplicarea acestor tehnici va fi discutat n capitolelor urmtoare, iar unele dintre tehnici vor putea fi executate sau prezentate demonstrativ n cadrul lucrrilor practice.

11. Examinarea caracterelor de cultur, metabolice precum i a altor caractere fenotipice utile n identificarea microorganismelor
n capitolul 5 am prezentat Schema general a diagnosticului de laborator microbiologic i pe aceast schem am ncercat s evolum, adugnd treptat noi date teoretice i practice. n acest capitol vom continua discutarea celei de a 4-a etape a diagnosticului direct (care include i verificarea din punct de vedere microscopic a coloniilor izolate), strict necesar pentru identificarea microorganismelor izolate de la pacienii cu boli transmisibile. Iniial vom relua cteva definiii i elemente teoretice urmnd ca mai departe s prezentm principalele caractere studiate n unele dintre sub-etapele acestui moment diagnostic, mai precis caracterele de cultur, cteva noiuni privind caracterele biochimice, metabolice, de patogenitate; n cursul lucrrilor practice se va discuta i despre alte caractere microbiene.

Definiii i alte aspecte teoretice


Colonia izolat Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul), aa cum a fost prezentat n capitolul 10. Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare asigurat n termostat (de regul 35-37C). Pentru bacteriile care necesit o atmosfer de 3-5% CO2 (carboxifile), plcile cultivate se vor pune n exsicator, mpreun cu o lumnare aprins. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz. O mare parte dintre fungi, n special levuri, au temperatura optim de dezvoltarea n jurul a 28-30C. Dezvoltarea microorganismelor pe medii de cultur poate permite evaluarea anumitor aspecte macroscopice sau microscopice (ex. coloniile produse de Mycoplasma spp.) care pot reprezenta, dup caz, modaliti de identificare sau de orientare n alegerea algoritmului de identificare. Caracterele de cultur includ: necesitile specifice n vederea cultivrii bacterii nepretenioase (care se pot cultiva pe medii simple ex. E. coli) bacterii pretenioase (care necesit medii complexe, mbogite sau / i adugarea n medii a unor factori de cretere ex. Haemophilus influenzae) bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis), aerobe facultativ anaerobe (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc), carboxifile (S. pneumoniae etc), microaerofile (Campylobacter spp., etc), strict anaerobe (Clostridium spp.) temperatura optim de cultivare (20-30C pentru Listeria monocytogenes, 42C pentru Campylobacter jejuni, 35-37C pentru majoritatea bacteriilor, 28-30 pentru unele levuri etc) intervalul de timp pentru apariia coloniilor izolate, n funcie de timpul de generaie 18-24 ore pentru majoritatea bacteriilor 24-48 ore pentru majoritatea fungilor sptmni pentru Mycobacterium tuberculosis etc aspectul, consistena i aderena coloniilor / culturii modificrile aprute pe mediu n vecintatea coloniilor / culturii etc.

Examinarea culturilor / coloniilor izolate este un proces foarte important, necesit cunoaterea teoriei, mult exerciiu, atenie i experien. Pentru a obine cele mai bune rezultate este necesar o bun iluminare (preferabil lumina natural) iar iluminarea mediului care urmeaz a fi citit se va face cel puin i n inciden oblic. Examinarea se poate face cu ochiul liber (cel puin iniial) dar ar trebui completat cu examinarea fcut cu ajutorul unei lupe sau a unui stereomicroscop pentru a putea nregistra toate aspectele importante i pentru a putea sesiza apariia coloniilor de dimensiuni mici sau foarte mici.

Aspectul culturilor pe medii lichide


Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Se accept c de obicei tulpinile care pe mediile solide formeaz colonii de tip S tulbur omogen mediul (majoritatea bacteriilor) n timp ce tulpinile care formeaz colonii de tip R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Variantele R pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). n urma dezvoltrii microorganismelor n medii de cultur lichide se mai pot remarca i pigmentogeneza (ex. Pseudomonas aeruginosa) sau utiliznd simul olfactiv se poate constata apariia unui miros caracteristic (ex. un miros de corn ars n cazul clostridiilor). Vom prezenta cteva exemple, menionnd c exist i variaii de la regul: mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.) mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (ex. S. pyogenes) mediul este clar, cu vl la suprafa (V. cholerae n ap peptonat alcalin) dezvoltarea culturii se realizeaz ca un inel aderent de pereii tubului, la suprafaa mediului (ex. E. coli) mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafa (ex. Bacillus subtilis) mediul este clar cu apariia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. anthracis) mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (M. tuberculosis).

Aspectul culturilor pe medii solide


Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz n funcie de microorganismul implicat, fr a permite diferenieri de specie definitive (dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor); n anumite cazuri sugereaz diagnosticul, dar ntotdeauna orienteaz spre alte testri necesare. Trebuie s examinm urmtoarele elemente: dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm aa cum se formeaz n cazul Staphylococcus spp., K. pneumoniae etc sau n cazul levurilor; medii, de circa 1-2 mm pentru multe dintre bacteriile studiate; mici, sub 1 mm, spre exemplu n cazul Streptococcus viridans, etc i foarte mici, care se pot examina cu ajutorul stereomicroscopului, aa cum se ntmpl n cazul Mycoplasma spp. sau Ureaplasma spp.) marginile (regulate, neregulate, ntregi, circulare, erodate, zimate, ondulate, lobate, filamentoase, acoperite cu miceliu pufos, invadnd mediul n valuri etc) forma (punctiform, circular, neregulat, dendritic, filamentoas, lenticular) relieful (plat, acuminat, convex, bombat, ombilicat, papilat) suprafaa (neted, umed, lucioas, mat, uscat, granular, rugoas, papilat, zbrcit, mucoid, pufoas etc) culoarea (pigmentate, pigmentarea este la nivelul coloniei sau al mediului, nepigmentate; acest caracter depinde de pigmenii produi sau / i de indicatori de culoare din mediu) opacitatea (transparente, semitransparente, opace) consistena, aderena la mediu (examinate de ex. cu ajutorul ansei bacteriologice) alte caractere, care vor fi prezentate n continuare. Tipuri de colonii Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, umed, margini circulare i adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate precum i levurile formeaz colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli, Candida albicans etc).

Colonia R (rough) este plat, mat, uscat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate (zimate). Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii B. anthracis, M. tuberculosis, C. diphteriae). Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, umed, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint capsul (exemplu Klebsiella pneumoniae). Aspecte particulare fenomenul de invazie, reprezint un caracter de identificare preliminar pentru Proteus spp., o bacterie foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde din aproape n aproape) pe toat suprafaa mediului; pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii izolate (adugm la mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc) fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii epidemiologice, n cazul n care tulpinile implicate aparin genului Proteus; dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac tulpinile nu sunt diferite va avea loc creterea n valuri fr demarcaie cu dezvoltarea unei pnze continue de cultur fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a unei tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea superioar a mediului de cultur apariia coloniilor n cap de meduz / coam de leu, aspect care poate fi caracteristic n cazul izolrii unei tulpini de Bacillus anthracis; coloniile sunt mari, alb-cenuii, de tip R, iar la periferia coloniei, cu ajutorul unei lupe, se pot observa prelungiri ondulate care au dus la denumirile menionate mai sus apariia coloniilor pufoase, spre exemplu pe mediul Sabouraud, la 28-30 C, dup circa 7 zile, coloniile de Coccidioides immitis dezvolt un miceliu aerian, devin pufoase, cresc i acoper n cteva zile suprafaa mediului; iniial albe, devin n timp galben-maronii; colonii pufoase pot aprea i n cursul dezvoltrii n anaerobioz a unei tulpini de Clostridium tetani etc.

Caractere metabolice
Exist numeroase teste care permit investigarea acestor caractere ale microorganismelor. n continuare vom prezenta doar cteva dintre aceste teste (vezi i capitolul 12 precum i diferite capitole din partea special). n capitolul 11 vom mai discuta i despre cteva dintre testele care evideniaz caractere de patogenitate ale bacteriilor sau fungilor. Este de remarcat faptul c unele dintre testele care vor fi discutate ar putea fi incluse att n grupul caracterelor metabolice ct i n grupul caracterelor de patogenitate (ex. hemoliza n cazul anumitor microorganisme, producerea unor enzime cu caracter de toxine etc). 1. Pigmentogeneza Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de cultivare. Poate reprezenta un element util pentru identificare (de exemplu pentru Pseudomonas aeruginosa sau pentru Staphylococcus spp.). Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi cromofore (pigmentul este legat n citoplasm); paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu pigmentul auriu la S. aureus, pigmentul galben-citrin la S. saprophyticus); cromopare (pigmentul albastru, sau galben-verzui, sau de alt culoare este difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). Fungii pot produce o serie de pigmeni, spre exemplu coloniile de Candida albicans au culoare alb. Mucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmeni (ex. Aspergillus deflectus colonii cenuii cu periferia roz sau cu pete galbene, Aspergillus flavus colonii galben verzui pn la verde nchis iar privite pe partea cealalt a plcii sunt roii-brune, Aspergillus fumigatus colonii iniial albe care devin albastre-verzui sau albastre iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate brun sau n alte culori, Aspergillus niger colonii iniial albe care devin brun negre pstrnd o culoare alb pe circumferin iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate n galben etc). 2. Producerea unor hemolizine Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizeaz hematiile din mediile de cultur cu snge. Hemoliza are diferite aspecte n funcie de mecanismul de aciune i specia de origine a hematiilor (cal, berbec, iepure etc). Cteva exemple de hemolizine:

1. a-hemolizina produce o liz incomplet a hematiilor, zona avnd o culoare verzuie (ex. Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae) 2. a-hemolizina produce liza hematiilor n 2 zone, n apropierea coloniei exist un halou de hemoliz incomplet nconjurat de o zon de hemoliz complet (ex. unele tulpini de Streptococcus spp.) 3. b-hemolizina produce liza complet a hematiilor, zona de hemoliz este clar (ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Haemophilus ducreyi) 4. b-hemolizina care produce o hemoliz de tip cald-rece (zone de hemoliz incomplet la 37C care, dup meninerea culturii la +4C timp de cteva ore, devine complet; ex. anumite tulpini de Staphylococcus aureus) 5. g-hemolizina produs de Staphylococcus spp. lizeaz de iepure, om, oaie, dar nu produce zone de hemoliz pe agar-snge; n cazul streptococilor, g-hemoliza indic absena hemolizei. 3. Producerea altor enzime catalaz (ex. Mycobacterium spp., Staphylococcus spp.) carbohidraze (evideniate pe medii difereniale, vezi capitolele 12 i 28-34) gelatinaz (cultura microbian lichefiaz gelatina, ex. Clostridium perfringens) lecitinaz (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.) nitrat-reductaz (ex. Mycobacterium spp.) oxidaz (ex. Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae) termonucleaz (ex. Staphylococcus aureus) etc. 4. Alte caractere metabolice aciunea reductoare (evideniat de ex. la C. diphteriae cultivat pe mediu cu telurit de K) sensibilitatea la diferite temperaturi tolerana la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplic la pH alcalin) tolerana la o anumit concentraie de NaCl (ex. Staphylococcus aureus) sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la bacitracin (ex. S. pyogenes) etc.

Caractere de patogenitate
Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n organismul gazd fenomene morbide, patogene, modificri locale, generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. Virulena reprezint gradul diferit de patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un atribut al tulpinii microbiene implicate. Caracterele de patogenitate pot fi evideniate in vitro sau in vivo. Teste efectuate in vitro examinarea aspectului coloniilor (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene n forma S, cu excepia bacililor antraxului, difteric i tuberculos); are aspect orientativ efectuarea anumitor teste biochimice / metabolice, cu aspect orientativ (examinarea pigmentogenezei, fermentarea manitei, testul coagulazei, testul fibrinolizei, producerea de hemolizite etc); dintre testele menionate este de luat n consideraie n primul rnd testul coagulazei evidenierea producerii unor toxine endotoxine (testul Limulus; prezena endotoxinei produce gelificarea unui lizat de Limulus polyphemus) exotoxine (testul ELEK / vezi capitolul 16, ELISA, efecte citopatice, testul producerii de lecitinaz, testul plcilor semi-neutralizate etc). Teste efectuate in vivo n acest scop se utilizeaz animale de laborator sensibile fa de infecia experimental cu diferite microorganisme sau fa de anumite toxine microbiene (ex. oareci albi, cobai, iepuri, pisici etc., n funcie de specia microbian pentru care se efectueaz testul / specia de animal cea mai sensibil i calea de inoculare cea mai potrivit). Animalele de laborator trebuie s fie sntoase, verificarea se face prin examinarea acestora nainte de efectuarea testrii, pe parcursul a 10-14 zile. Dup inoculare, animalele sunt marcate i inute sub observaie (ferite de orice contaminare); observaia este clinic urmrindu-se evoluia curbei febrile i apariia semnelor de boal. Pentru orice test se recomand utilizarea unui lot de animale pentru acelai tip de inoculare, ceea ce crete suplimentar costul acestui tip de testare. n continuare vom prezenta cteva exemple: identificarea Bacillus anthracis: pregtim o suspensie a tulpinii care urmeaz a fi testat n soluie salin fiziologic i injectm subcutanat, cte 0,2 ml pentru fiecare animal, la un lot de oareci albi; urmrim evoluia timp de 2-3 zile i efectum frotiuri din sngele recoltat prin puncionarea cordului sau amprente de splin testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae: obinem o cultur de 24 ore a tulpinii de identificat; inoculm subcutanat, n regiunea abdominal cte 2-5 ml de cultur pentru fiecare animal, la 2 loturi

de cobai (un lot neprotejat, al doilea lot protejat cu cte 1000 UI de ser antidifteric pentru fiecare animal); n cazul n care tulpina este toxigen, animalele neprotejate vor muri n 1-4 zile, cu semne de intoxicaie difteric (congestia capsulelor suprarenale, lichid seros, serofibrinos sau fibrinos n pleur, pericard, peritoneu i edem gelatinos la locul de inoculare) n timp ce animalele protejate nu prezint nici o reacie toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum: se obine supernatant dup centrifugarea unor produse patologice sau alimentelor incriminate i triturate la care se adaug antibiotice pentru a inhiba multiplicarea florei de asociaie; se va utiliza supernatant ca atare i supernatant dup meninere timp de 15 minute la 100C (i rcire) toxina botulinic fiind termolabil; se vor inocula 4 loturi de oareci (0,5 ml / oarece) sau cobai (1 ml / cobai) dup cum urmeaz supernatant ca atare supernatant inactivat 0,1 ml ser antitoxin A urmat la 30 minute de supernatant 0,1 ml ser antitoxin B urmat la 30 minute de supernatant spre exemplu, n cazul n care animalele din loturile 1 i 4 mor, iar animalele din loturile 2 i 3 supravieuiesc, n p.p. exist toxin botulinic de tip A identificarea infeciei pulmonare cu Streptoccus pneumoniae sau cu Klebsiella pneumoniae: realizm un amestec de sput i soluie salin fiziologic steril i inoculm subcutanat sau intraperitoneal cte 5 ml de p.p. pentru un animal, la un lot de oareci albi; prezena microorganismului va produce n 24-48 de ore o septicemie mortal; facem frotiuri i culturi din sngele recoltat prin puncie cardiac, lichid peritoneal i amprent de splin; pentru determinarea tipului capsular putem face reacia de umflare a capsulei (vezi capitolul 12) identificarea etiologiei stafilococice a unei toxi-infecii alimentare (producerea enterotoxinei): dup ce se obine n cultur tulpina de stafilococ (pornind de la materii fecale, lichid de vrstur, alimente) se repic n agar 0,5% i se incubeaz 48 ore n atmosfer de CO2; se filtreaz mediul iar lichidul obinut se menine la temperatura de fierbere timp de 30 minute (enterotoxina este termostabil); testul Dolman se face la pisoi de 23 luni la care se inoculeaz intraperitoneal 1-3 ml din filtratul rcit; dup 20-120 minute, n cazul prezenei enterotoxinei apare o stare de nelinite, agitaie urmate de diaree, vrsturi i somnolen; dup 1-2 zile animalele inoculate i revin cercetarea patogenitii unei tulpini de stafilococ se face la iepure, care este animalul de laborator cel mai sensibil la infecia experimental cu Staphylococcus aureus testarea patogenitii unor levuri (ex. Candida albicans): pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid separm sedimentul i realizm o suspensie 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic steril; inoculm n venele cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obinut i urmrim evoluia animalelor timp de 4-10 zile; dac este vorba de o tulpin de C. albicans patogen, animalele vor muri dup circa 1 sptmn (anatomopatologic vom putea evidenia abcese miliare renale, splenice, hepatice) etc.

12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice ale bacteriilor i fungilor
Exist numeroase teste utile n identificarea bacteriilor i fungilor, avnd la baz diferite proprieti biochimice ale acestora; cteva dintre teste vor fi prezentate n continuare. Aceste teste de identificare au o importan diferit la diferitele genuri i specii bacteriene i respectiv fungice i fac parte din etapa a patra a diagnosticului de laborator bacteriologic sau micologic. Schema de prezentare este ns asemntoare.

12. 1. Utilizarea unui carbohidrat ca unic surs de carbon Auxanograma


Principiu: Diferitele levuri prezint un anumit echipament enzimatic cu ajutorul cruia pot, spre exemplu, s utilizeze un anumit carbohidrat ca unic surs de carbon. Dezvoltarea unei levuri pe un mediu n care este inclus un singur carbohidrat demonstreaz utilizarea acestuia ca unic surs de carbon (asimilarea carbohidratului respectiv). n mod asemntor se poate testa capacitatea asimilrii unor substane azotate de ctre levuri.

Materiale necesare: cultura pur a levurii de identificat, pe pant de agar Sabouraud mediu pentru asimilarea carbonului de ctre levuri soluie de vitamine soluii 5% ale carbohidrailor (ex. glucoz, maltoz, zaharoz, lactoz, galactoz, trehaloz etc) n ap distilat, sterilizate prin filtrare rondele din hrtie de filtru, sterile (diametru 6 milimetri) Tehnica de lucru: Cultura fungic este suspensionat n 5 ml de ap distilat steril. Mediul de cultur pentru asimilarea carbonului este nclzit pn la topire i apoi rcit la 50C. ntr-un tub steril cu capacitatea de 30 ml introducem aseptic 20 ml de mediu, 2 ml soluie de vitamine i 0,25 ml din suspensia fungic (levuric) dup care amestecul este turnat ntr-o plac Petri steril i se ateapt solidificarea mediului mpreun cu celelalte componente. Depunem aseptic 5 rondele din hrtie de filtru, una n centru i 4 spre periferia fiecrui cadran al plcii i imediat, utiliznd o ans cu diametrul buclei de 3 mm, depunem pe fiecare dintre rondele ceea ce vom preleva din diferite (5) soluii de carbohidrai obligatoriu vom preleva din soluia de glucoz dac dorim s testm pentru 9 carbohidrai diferii avem nevoie de 2 plci Petri. Incubm la 28-30C pentru 24-48 ore, apoi urmrim apariia culturii n jurul rondelelor. Exist i alte modaliti tehnice n realizarea auxanogramei. Interpretare: trebuie s existe multiplicare levuric (cultur prezent) n jurul rondelei pe care am depus o ans din soluia 5% de glucoz; toate levurile pot folosi glucoza drept unic surs de C se noteaz dezvoltarea culturii n jurul rondelelor unde aceasta este evideniat i utiliznd rezultatele obinute, n contextul celorlalte date de laborator, se stabilete specia levuric Control de calitate: tulpina de referin de Cryptococcus laurentii tulpina de referin de Candida pseudotropicalis

12. 2. Testul sensibilitii la bacitracin


Principiu: Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciaz c dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puin de 1% sunt rezistente la bacitracin. Materiale necesare: colonii -hemolitice izolate pe geloz-snge microcomprimate de bacitracin cu 0,04 U i cu 0,1 U (i nu cu 10 U / microcomprimat) Tehnica de lucru: Se preleveaz 3-4 colonii -hemolitice i se nsmneaz n striuri foarte apropiate, suprapuse n 3 direcii, pe o jumtate de plac Petri cu geloz-snge (din motive de economie se poate utiliza i un sector de plac). Plasm n centrul ariei nsmnate un microcomprimat cu bacitracin i incubm pentru 18-24 ore la 35-37C. Interpretare: Testul este pozitiv (bacteria este sensibil la bacitracin) n cazul n care rezult o inhibiie a creterii bacteriene, indiferent de diametru, n jurul microcomprimatului cu 0,04 U bacitracin rezult o inhibiie a creterii bacteriene cu diametrul 11 mm, n jurul microcomprimatului cu 0,1 U bacitracin. Control de calitate: Martor pozitiv Streptococcus pyogenes Martor negativ Streptococcus agalactiae

12. 3. Testul bilolizei (Neufeld)


Principiu: Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulai sunt lizai n prezena bilei sau srurilor biliare (unele tulpini necapsulate nu sufer acest proces) prin activarea unei enzime autolitice. Materiale necesare: colonii izolate, a-hemolitice

soluie de dezoxicolat de sodiu 10% soluie salin izoton ap distilat Tehnica de lucru: Se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie pornind de la coloniile ahemolitice izolate. Turbiditatea suspensiei trebuie s fie asemntoare cu turbiditatea etalonului McFarland 0,5 sau 1. Repartizm cte 0,5 ml din suspensie n 2 eprubete de sticl. n primul tub adugm 0,5 ml dezoxicolat de sodiu iar n al doilea tub adugm 0,5 ml ap distilat. Incubm timp de 2 ore la 35-37C. Interpretare: Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate n prezena dezoxicolatului de sodiu i sunt pneumococi) dac suspensia s-a clarificat n tubul n care am adugat dezoxicolat i nu s-a clarificat n tubul n care am adugat ap distilat Testul este negativ dac ambele tuburi au rmas opace. Control de calitate: Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae Martor negativ Streptococcus viridans.

12. 4. Testul CAMP


Principiu: Streptococii de grup B produc o substan extracelular de natur proteic denumit factorul CAMP (dup iniialele cercettorilor care au pus la punct testul / Christie, Atkins, Munch-Petersen), care acioneaz sinergic cu b-lizina produs de unele tulpini de Staphylococcus aureus. Dac aceste 2 microorganisme sunt cultivate n 2 striuri perpendiculare (fr s se ating), acolo unde cele 2 striuri se nvecineaz, liza hematiilor (de berbec sau de bou) apare mrit, n form de vrf de sgeat. Materiale necesare: colonii de streptococi hemolitici sau nehemolitici (dac un anumit context sau anumite teste sugereaz prezena unui streptococ de grup B) plci Petri cu geloz snge de berbec sau de bou tulpina de S. aureus productoare de b-lizin (ATCC 25923) / alternativ am putea utiliza fii din hrtie de filtru impregnate cu b-lizin stafilococic ATCC = American Type Culture Collection tulpini de cercetat Tehnica de lucru: Inoculm n striu o tulpin de S. aureus productoare de b-lizin, pe unul din diametrele plcii cu agar-snge. Perpendicular pe acest striu vom inocula (fr s atingem striul de stafilococ) o tulpin CAMP pozitiv, o tulpin CAMP negativ i tulpini de cercetat. Incubm la 35-37C aerob pn a doua zi sau timp de 6 ore n atmosfer de 5-10% CO2. Interpretare: apariia unei zone de hemoliz lrgite, n vrf de sgeat (vrful spre tulpina de stafilococ) reprezint un test pozitiv (confirmat de martorul pozitiv) hemoliz nemodificat test negativ (confirmat de martorul negativ) Control de calitate: Martor pozitiv Streptococcus agalactiae Martor negativ Streptococcus pyogenes sau un streptococ de grup D

12. 5. Testul producerii de catalaz


Principiu: Catalaza descompune peroxidul de hidrogen n ap i oxigen.

12. 5. A. pentru mycobacterii


Materiale necesare: cultura pur a microorganismului care urmeaz a fi testat, pe mediu Lwenstein soluie de peroxid de hidrogen n Tween 80 i ap distilat Tehnica de lucru: Peste cultura bacterian se adaug 1 ml de soluie de peroxid de hidrogen i se las tubul la temperatura camerei.

Se msoar nlimea coloanei de bule de oxigen i se nregistreaz valoarea n mm. Interpretare: Acesta este un test semi-cantitativ, care ajut la diferenierea speciilor de mycobacterii n funcie de cantitatea de catalaz produs. n vederea unei diferenieri suplimentare, se poate utiliza testul termosensibilitii catalazei (Mycobacterium tuberculosis, spre exemplu, produce o catalaz termosensibil). Notificarea se poate face n modul urmtor peste 20 mm +++ 10-20 mm ++ 5-10 mm + < 5 mm Control de calitate: Martor pozitiv M. fortuitum Martor mai slab pozitiv (test semicantitativ) M. tuberculosis / n cazul testului pentru termosensibilitatea catalazei rezultatul va fi negativ dup nclzire 20 minute la 68C Martor negativ mediu neinoculat peste care se adaug soluie de peroxid de hidrogen

12. 5. B. pentru alte microorganisme (spre exemplu diferenierea stafilococilor de alte microorganisme)
Exist mai multe tehnici dintre care vom prezenta testul realizat pe o suspensie bacterian i respectiv testul catalazei prin suspensionarea culturii pe lam Materiale necesare: colonii izolate dezvoltate pe medii fr snge / n cazul n care urmeaz s testm o bacterie care s-a dezvoltat pe geloz-snge, deoarece pot aprea reacii fals pozitive datorit catalazei eritrocitare, urmeaz s prelevm cultura bacterian fr a atinge mediul de cultur; n acest sens urmeaz s utilizm o ans fir i s prelevm cultur din poriunea cea mai bombat a coloniei de identificat soluie de peroxid de hidrogen 3% ap distilat Tehnica de lucru: B1. Realizm o suspensie bacterian dens n 1-2 ml de ap distilat la care adugm 1-2 picturi de soluie de peroxid de hidrogen 3%. Observm imediat i dup trecerea a 5 minute apariia bulelor de oxigen. B2. Pe o lam de sticl punem o pictur din soluie de peroxid de hidrogen. Suspensionm cultura n pictura de H2O2 i urmrim timp de 30 de secunde apariia bulelor de oxigen. Interpretare: apariia bulelor de gaz semnific un test pozitiv, bacteria produce catalaz absena bulelor de gaz semnific un test negativ. Control de calitate: Martor pozitiv Staphylococcus aureus Martor negativ Streptococcus pyogenes

12. 6. Testul utilizrii citratului ca unic surs de carbon (Simmons)


Principiu: Unele dintre enterobacterii dein un echipament enzimatic care permite asimilarea i utilizarea citratului ca unic surs de carbon. Utiliznd un mediu care conine citrat i un indicator de pH, putem indentifica alcalinizarea mediului i respectiv acea enterobacterie care poate utiliza citratul ca unic surs de carbon. Materiale necesare: o suspensie relativ dens obinut din colonia (cultur pur) bacteriei pe care dorim s o identificm mediul care conine acid citric 0,2% (Simmons), turnat n pant n eprubete mici; n prezena indicatorului de pH i la pH neutru, mediul nensmnat are o culoare verde Tehnica de lucru: cu ajutorul unei anse, prelevm suspensie bacterian pe care o nsmnm ntr-un singur striu pe suprafaa mediului Simmons incubm la 37C i examinm dezvoltarea culturii i eventuala modificare a culorii mediului Interpretare:

apariia unei culturi bacteriene de-a lungul striului, nsoit de modificare culorii care devine albastr, semnific un test pozitiv = bacteria utilizeaz citratul ca unic surs de carbon n prezena unui tub fr dezvoltarea culturii, culoarea mediului fiind verde putem notifica un rezultat negativ Control de calitate: Martor pozitiv Klebsiella pneumoniae / Enterobacter cloacae Martor negativ Escherichia coli

12. 7. Testul coagulazei


Principiu: Stafilococii coagulazo pozitivi produc o enzim care activeaz coagularea plasmei. Exist 2 tipuri de coagulaz: coagulaza liber i coagulaza legat de peretele celular (clumping factor). Coagulaza liber acioneaz pe protrombin. Coagulaza legat acioneaz direct pe fibrinogenul plasmatic. Stafilococii coagulazo pozitivi sunt considerai Staphylococcus aureus. Materiale necesare: colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s fie testat plasm de iepure (de preferat) / n cazul n care plasma de iepure nu este disponibil se poate folosi plasm uman (cu sensibilitate mai mare la coagulaza produs de S. schleiferi i S. lugdunensis) lame, tuburi Tehnica de lucru: a. Testul coagulazei pe lam Verific prezena coagulazei legate. Pe lam se depune o pictur de ap distilat (nu soluie salin fiziologic). Suspensionm i omogenizm 1-2 colonii n pictura de ap distilat (suspensia trebuie s fie tulbure omogen). Ateptm circa 10 secunde i urmrim apariia unei eventuale autoaglutinri (caz n care nu putem interpreta rezultatul testului; trecem la efectuarea testului coagulrii n tub). Dac pictura rmne tulbure omogen, adugm 1 pictur de plasm i urmrim apariia coagulilor timp de 10-15 secunde. Alternativ se pot utiliza truse comerciale. Interpretare: apariia coagulilor n 10-15 secunde semnific un test pozitiv absena coagulilor semnific un test negativ / 5% din S. aureus dau reacii fals negative la testul pe lam, fiind necesar realizarea testului coagulazei n tub b. Testul coagulazei n tuburi Verific prezena coagulazei libere. Pipetm aseptic 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril. Prelevm o colonie i o descrcm n plasma din tub (alternativ putem nsmna o colonie de testat n 0,5 ml bulion glucozat, incubm 18-24 ore la 35-37C i vom amesteca plasma cu suspensia microbian rezultat dup cultivare). Incubm tubul timp de 4 ore la 35-37C (pentru unele tulpini reacia poate fi pozitiv chiar i mai repede de 4 ore). Rezultatul reaciei este examinat prin nclinarea tubului. Dac reacia este negativ la 4 ore, reincubm pn la 24 ore. Atenie, cheagul poate fi lizat destul de rapid dup momentul formrii (unele tulpini de S. aureus produc fibrinolizin). Din acest motiv, unii autori recomand examinare tubului test din 30 n 30 minute, n primele 4 ore. Interpretare: formarea unui cheag, semnific un rezultat pozitiv absena cheagului semnific un rezultat negativ Control de calitate: Martor pozitiv S. aureus Martor negativ S. epidermidis

12. 8. Testul filamentrii, pentru Candida albicans


Principiu: Dup cultivare n ser uman, ser bovin, ser de berbec etc timp de 2-4 ore, la 35-37C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filamente scurte (tubi germinativi). Materiale necesare: colonii izolate, n scopul identificrii ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser fetal de viel, serumalbumin bovin etc aplicatoare de lemn sau sterile pipete Pasteur cu vrful efilat, lame i lamele, tuburi mici

Tehnica de lucru: ntr-un tub de dimensiuni mici (ex. 12 / 75 mm) introducem aseptic 0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de ser. Cu un aplicator steril (ca un beiga) atingem colonia care trebuie identificat i apoi l introducem n tub. Incubm timp de 2-4 ore, la 35-37C. Realizm un preparat ntre lam i lamel i examinm la microscopul optic. Interpretare: prezena unor tubi germinativi cu un calibru mai ngust dar cu o lungime de 3-4 ori mai mare dect diametrul celulei de origine, care continu direct, fr nici o strangulare sau sept blastoconidia, semnific un test pozitiv absena aspectului menionat mai sus sau prezena unor pseudotubi germinativi care sunt delimitai printro strangulare i un sept de blastoconidie semnific un test negativ Control de calitate: Martor pozitiv C. albicans Martor negativ C. tropicalis

12. 9. A. Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)


Principiu: Mediul conine uree, triptofan, rou fenol (indicator de pH) i este condiionat n tuburi de dimensiuni mici. Geloza este moale permind mobilitatea microorganismului nsmnat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare mediului (culoarea vireaz de la galben la rou); producerea de indol din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich Materiale necesare: tuburi de dimensiuni mici cu mediul MIU hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs condiionat n sticlue de culoare brun colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur) ans fir etc Tehnica de lucru: Utilizm pentru nsmnare o ans fir. Prelevm din colonia izolat pe mediu neselectiv (dac pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie s prelevm cu grij, fr s atingem mediul de cultur) i nsmnm mediul prin nepare ncercnd s realizm o nsmnare n linie dreapt. Fixm de dop hrtiua indicator n aa fel nct s ajung deasupra coloanei de mediu, fr s l atingem. Incubm la 35-37C timp de 24 ore. n cazul n care nu are loc virarea culorii mediului, incubm pn la 48 de ore. Interpretare: din punctul de vedere al mobilitii opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare bacteria este imobil opacifierea este uniform n coloana de mediu bacteria este mobil din punctul de vedere al producerii ureazei culoarea coloanei rmne galben bacteria este ureazo negativ culoarea devine roie bacteria este ureazo pozitiv apariia unui inel de culoare roie la suprafaa mediului nu reprezint un test pozitiv din punctul de vedere al transformrii triptofanului n indol schimbarea culorii hrtiei la rou-violet bacteria este indol pozitiv culoarea hrtiei rmne alb bacteria este indol negativ alternativ, n lipsa hrtiuelor indicator se poate picura reactiv Ehrlich la suprafaa mediului i interpreta modificarea / lipsa modificrii culorii Control de calitate: Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ U+ I+ Martor negativ Shigella spp. M- U- I-

12. 9. B. Mediul multitest MILF (mobilitate indol lizin-decarboxilaz fenil-alanin-dezaminaz)


Principiu: Mediul conine o cantitate sczut de glucoz, pepton cu DL-triptofan, L-lizin, DL-fenil-alanin, bromcrezol purpur soluie 2% (indicator de pH) i este condiionat n tuburi de dimensiuni mici. Geloza este moale

permind mobilitatea microorganismului nsmnat. Producerea de indol din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich. Decarboxilarea lizinei va duce la alcalinizare mediului (n absena lizindecarboxilazei rezult o uoar acidifiere a mediului datorit fermentrii glucozei). Dezaminarea fenil-alaninei duce la apariia de acid fenil-piruvic i amoniac; adugnd clorur feric rezult o culoare verde. Materiale necesare: tuburi de dimensiuni mici cu mediul MILF hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi i reactiv Kovacs) sau reactiv Ehrlich / Kovacs condiionat n sticlue de culoare brun colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur) ans fir etc Tehnica de lucru: Tehnica de lucru este asemntoare cu cea expus la punctul 12. 9. A. Interpretare: din punctul de vedere al mobilitii opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare bacteria este imobil opacifierea este uniform n coloana de mediu bacteria este mobil din punctul de vedere al transformrii triptofanului n indol schimbarea culorii hrtiei la rou-violet bacteria este indol pozitiv culoarea hrtiei rmne alb bacteria este indol negativ din punctul de vedere al producerii lizin-decarboxilazei alcalinizarea coloanei traduce prezena enzimei acidifierea uoar a coloanei traduce absena enzimei din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezaminazei apariia unui inel de culoare verde la suprafaa mediului i la nivelul traiectului de nsmnare dup adugarea unei picturi de clorur feric 10% traduce prezena enzimei Control de calitate: Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ I+ FD-az+ LD-az Martor negativ Klebsiella pneumoniae M- I- FD-az- LD-az+

12. 10. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)


Principiu: Mediul este agarizat, condiionat n dou zone (n coloan la baz i n pant) i conine glucoz (n raport de 1/10 fa de celelalte zaharuri), lactoz, zaharoz, citrat feric i un indicator de pH (rou neutru). Partea dreapt (coloana) nu vine n contact cu aerul i ofer condiii relative de anaerobioz. Partea nclinat (panta) ofer condiii de multiplicare n aerobioz. Concentraia glucozei este mai mic, pentru ca fermentarea acestui zahar s poat fi detectat chiar dac este singurul zahar metabolizat. Dac o bacterie se dezvolt n partea dreapt vor fi eliberai aminoacizi, care n zona aerob vor fi decarboxilai oxidativ i vor modifica pH-ul spre alcalin. n cazul n care lactoza i / sau zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produs prin fermentarea glucozei (toate enterobacteriile fermenteaz glucoza) este suficient de mic pentru ca pH-ul de la nivelul pantei s revin rapid la neutru. n acelai timp, pH-ul rmne acid (i culoarea mediului rmne galben) la nivelul coloanei pentru c n condiii de relativ anaerobioz nu are loc decarboxilarea oxidativ. Dac zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid produs este suficient de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel s rmn acid i respectiv culoarea pantei s rmn galben. Prezena citratului feric, n cazul n care bacteria produce H2S duce la apariia unei culori negre (se formeaz sulfit feros). La nivelul coloanei se mai nregistreaz i producerea de gaz (de la apariia unor bule fine pe traseul de nsmnare, pn la fragmentarea sau ruperea coloanei). Materiale necesare: tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI colonii de identificat (colonii izolate, cultur pur) ans fir etc Tehnica de lucru: Utilizm pentru nsmnare o ans fir. Prelevm din colonia izolat pe mediu neselectiv (dac pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie s prelevm cu grij, fr s atingem mediul de cultur) i nsmnm

coloana prin nepare, apoi retragem ansa i atingnd suprafaa coloanei descriem un striu n zig-zag. Incubm la 35-37C timp de 24 ore. Interpretare: n ceea ce privete fermentarea glucozei culoarea coloanei este galben glucoza este fermentat culoarea coloanei rmne roie glucoza nu este fermentat (nu este enterobacterie) fermentarea glucozei poate fi sau nu nsoit de producere de gaz interpretarea se face similar pentru fermentarea lactozei / zaharozei, la nivelul pantei n cazul n care se produce H2S, remarcm apariia unei culori negre la nivelul coloanei alte elemente privind interpretarea acestor rezultate vor fi prezentate n capitolul 28 Control de calitate: Martor pentru pH acid la nivelul coloanei i pantei, fr producere de H2S E. coli Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei i producere de H2S Salmonella typhimurium este posibil i utilizarea altor tulpini martor.

12. 11. Testul producerii de niacin


Principiu: Mycobacteriile produc n timpul multiplicrii niacin (acid nicotinic) pe care o utilizeaz n sinteza NAD i NADP. Majoritatea mycobacteriilor posed o enzim care poate transforma niacina liber n acid nicotinic mono-nucleotid. Dac microorganismele nu prezint aceast enzim (ex. M. tuberculosis), n mediul de cultur se va acumula niacin. Niacina este solubil n ap i poate fi extras din mediu (de ex. n soluie salin fiziologic) iar n reacie cu bromura de cianogen (atenie la utilizare !) n prezena anilinei rezultnd un compus de culoare galben. Materiale necesare: soluie de anilin 4% (conservat n sticl de culoare brun la 2-8C) soluie de bromur de cianogen 10% (ar fi de preferat datorit riscurilor fii de hrtie indicator impregnate n soluie de bromur de cianogen, produse comercial) folosim culturi (realizate pe mediul Lwenstein-Jensen), n vrst de minim 3 sptmni Tehnica de lucru: Folosim o subcultur mycobacterian cu cretere confluent. Adugm cu ajutorul unei pipete Pasteur ap distilat steril sau soluie salin fiziologic. cu ajutorul pipetei Pasteur (sau cu ajutorul unei anse) raclm coloniile pentru a permite extracia niacinei din mediu. Tuburile rmn 1 or la temperatura camerei. Transferm cte 0,5 ml n fiecare dintre n tuburile de testare. Adugm succesiv 0,5 ml anilin 4% i respectiv 0,5 ml bromur de cianogen. Examinm dup 5 minute pentru a observa apariia culorii galbene n cazul reaciei pozitive. nainte de eliminare, vom neutraliza tuburile prin adugarea unui volum egal (aproximativ 3 ml) de NaOH 10 % n fiecare tub. Interpretare: apariia unei culori galbene, reprezint un test pozitiv absena culorii galbene, reprezint un test negativ Control de calitate: Martor pozitiv Mycobacterium tuberculosis Martor negativ Mycobacterium avium.

12. 12. Testul producerii de citocrom oxidaz


Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidaz, enzim care lipsete la bacteriile strict anaerobe. Aceast hemoprotein acioneaz i asupra unei substane, tetra-metil p-fenilendiamin rezultnd un compus de culoare purpurie Dintre bacteriile oxidazo-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii gram negativi) i Micrococcus spp. (dintre germenii gram pozitivi) Materiale necesare: soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1% conservat n sticl de culoare brun la temperatura frigiderului sau fii de hrtie indicator impregnat n reactiv (preparate comercial) hrtie de filtru ans cu fir de platin sau pipet Pasteur (cudat) colonii izolate dezvoltate pe agar-snge, agar-chocolat sau agar Mueller Hinton

Tehnica de lucru: Exist mai multe variante tehnice, dar vom discuta doar una dintre acestea. Punem ntr-o cutie Petri un fragment de hrtie de filtru pe care depunem 1-2 picturi de soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1%. Dup sterilizarea i rcirea ansei, prelevm dintr-o colonie izolat i descrcm cultura pe hrtia de filtru prin micri circulare de mic amplitudine. Urmrim apariia unei reacii de culoare n interval de 10 secunde Interpretare: apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde, reprezint un test pozitiv absena culorii purpurie, semnific un test negativ apariia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului, n principiu este vorba despre un rezultat negativ Control de calitate: Martor pozitiv Pseudomonas aeruginosa Martor negativ Escherichia coli

12. 13. Testul sensibilitii la optochin


Principiu: Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae) sunt sensibile la concentraii sczute (< 5 g/ml) de optochin (hidroclorid de etil-hidrocuprein). Unele tulpini ale altor streptoci care produc hemoliz viridans pot fi sensibile, dar la concentraii mai mari ale substanei active, n timp ce alte tulpini sunt rezistente. Materiale necesare: discuri cu optochin (5 g / disc), cu diametrul de 6 milimetri plci cu agar-snge tampoane sterile colonii -hemolitice izolate, care urmeaz a fi testate Tehnica de lucru: Prelevm cu un tampon steril de preferat 2-3 colonii i realizm o nsmnare pe jumtatea unei plci cu agarsnge, n aa fel nct s rezulte o cultur confluent (din motive de economie, nsmnarea s-ar putea realiza i pe o ptrime de plac Petri). Plasm un disc cu optochin n centrul zonei nsmnate i presm uor pentru ca discul s adere uniform. Incubm timp de 18-24 ore la 35-37C n atmosfer de 5% CO2. Interpretare: apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14 mm, semnific un test pozitiv absena inhibiiei n jurul discului semnific un test negativ interpretarea este diferit dac se folosesc discuri de optochin cu alte dimensiuni (ex. cu diametrul de 10 mm) Control de calitate: Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae Martor negativ Streptococcus viridans. Fr ndoial c aceste teste reprezint doar cteva exemple din multitudinea testelor utilizate n laboratorul de microbiologie. Numai n vederea identificrii diferitelor specii mycobacteriene se pot utiliza, spre exemplu, peste 130 de teste fenotipice. nelegerea lor din punct de vedere teoretic precum i utilizarea lor n mod practic sunt utile att pentru studeni, medicii rezideni aflai la debutul pregtirii n specialitatea de medicin de laborator, pentru viitorii medici din alte specialiti ct i pentru medicii i biologii implicai n diagnosticul de laborator la nivel clinic sau n interesul sntii publice. Avnd la baz noiunile teoretice nvate, diferitele exemple precum i manualele care prezint din punct de vedere practic diagnosticul microbiologic, fiecare dintre cei implicai va putea s aplice aceste elemente, deprinznd arta acestui diagnostic att de util n practica medical la nivel individual sau populaional. Ultimul test pe care l vom prezenta n finalul acestui capitol nu se bazeaz pe proprietile biochimice ci are la baz caracterele antigenice (structura antigenic) ale microorganismelor din specia Streptococcus pneumoniae. Datorit faptului c nu exist un capitol special al tehnicilor imunologice unde ar putea fi integrat, precum i datorit faptului c n paginile precedente am prezentat testul bilolizei i respectiv testul sensibilitii la optochin (ambele teste fiind necesare n diferenierea Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans) am decis s includem aici, acest test.

12. 14. Testul umflrii capsulei (Neufeld, Quellung test)


Principiu: Complexul antigen-anticorp format n urma cuplrii antigenului capsular pneumococic cu anticorpii anticapsulari are o refringen superioar mediului nconjurtor i apare, la examinarea cu microscopul optic, ca un halou clar dispus n jurul bacteriilor, halou care are dimensiuni mai mari dect haloul identificat prin microscopie (preparat colorat cu albastru de metilen) n lipsa serului anti-capsular. Materiale necesare: cultura unei bacterii care se presupune c aparine speciei S. pneumoniae se pot utiliza i produse patologice (ex. LCR) ser anti-capsular polivalent; seruri anti-capsulare monovalente (de tip) soluie de albastru de metilen (1%) soluie salin fiziologic lame i lamele microscop optic Tehnica de lucru: A. examinarea preparatului martor realizm o suspensie omogen opalescent din cultura bacterian n 0,5 ml soluie salin fiziologic i adaugm 0,5 ml soluie de albastru de metilen depunem o pictur din suspensie pe o lam de microscop, acoperim cu o lamel i examinm dimensiunea haloului care apare datorit prezenei capsulei B. examinarea preparatului test depunem pe o alt lam de microscop o pictur din suspensia bacterian i n stricta vecintate a acesteia depunem o pictur din serul polivalent anti-capsular amestecm prin micri circulare cele 2 picturi ateptm 10 minute (preparatul se menine n camer umed) Interpretare: identificarea unor coci colorai n albastru, dispui izolat sau n pereche, nconjurai de un halou clar, mai bine definit i de dimensiuni mai mari dect haloul vizualizat prin examinarea preparatului martor semnific un test pozitiv, respectiv prezena pneumococilor n cazul n care nu este sesizat nici o diferen ntre preparatul test i preparatul martor ne aflm n situaia unui test negativ dup identificarea unui test pozitiv fa de serul polivalent, putem utiliza seruri monovalente, specifice de tip pentru a indentifica tipul capsular testul umflrii capsulei se poate realiza i pornind pe produs patologic Control de calitate: Martor pozitiv tulpin capsulat de Streptococcus pneumoniae Martor negativ Streptococcus viridans.

15. Reacii antigen-anticorp utilizate n microbiologie

Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac


Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea determinantului antigenic (epitop) cu situsul de combinare al anticorpului (paratop). Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt: - complementaritatea structural dintre epitop i paratop (reacia este specific); complementaritatea presupune adaptarea conformaional a celor dou grupri, de tipul cheie n broasc - complementaritatea electrochimic a gruprilor care intr n reacie este o consecin a complementaritii structurale; pentru stabilizarea legturii intr n aciune fore intermoleculare, care sunt legturi necovalente, fore nespecifice cu valoare mic, spre exemplu legturi de hidrogen / energie de legare 3-7 kcal / mol fore electrostatice (coulombiene sau ionice) / energie de legare 5 kcal / mol legturi van der Waals / energia de legare 1-2 kcal / mol legturi hidrofobe.

Complementaritatea structural sau forele intermoleculare nu sunt, suficiente fiecare n parte, pentru a forma legturi stabile; este necesar ndeplinirea ambelor condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile. Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri (afinitatea i aviditatea anticorpilor). Afinitatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate msura prin dializa la echilibru. Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac care rezult din multivalena Ag. Cele mai multe Ag. posed mai mult dect un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe suprafa un numr mare de epitopi repetitivi. Ag. proteice au epitopi multipli, dar diferii. Antigenele multivalente leag un numr echivalent de molecule de anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop. Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici i msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui Ag i paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente.

Reacii ncruciate
n anumite cazuri pot avea loc reacii ncruciate; un Ag reacioneaz cu un Ac care a fost sintetizat fa de un alt Ag (aceste reacii pot aprea de ex. datorit faptului c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutineaz eritrocitele umane de grup A (cu specificitate antigenic conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun anti-Escherichia coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenic conferit de galactoz). Nu vom detalia aceste aspecte n materialul de fa.

Stadiile reaciilor antigen-anticorp


Interaciunea primar se datoreaz legrii efective a Ac de Ag i depinde n mod direct de cantitatea i afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune primar pot fi puse n eviden prin nefelometrie. n cazul tipurilor de reacii care vor fi discutate n capitolele urmtoare, interaciunea primar nu devine vizibil (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desprinde uor). In vivo aceste interaciuni sunt spre exemplu necesare i suficiente n vederea neutralizrii unor exotoxine circulante (difteric, botulinic etc), pentru inhibarea activitii unor bacterii sau virusuri, sau n declanarea unor reacii de hipersensibilitate (ex. n reacia de hipersensibilitate de tip I). Interaciunile secundare apar la circa 30 de minute dup interaciunile primare. Datorit faptului c Ag poate avea mai muli epitopi iar Ac are minim 2 paratopi complexele primare mici, solubile, interacioneaz ntre ele formnd complexe secundare, produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reea tridimensional, insolubil, mult mai stabil dect complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune secundar pot fi puse n eviden prin tehnici care vor fi enumerate n finalul acestui capitol i discutate n capitolele urmtoare. In vivo, manifestrile interaciunilor secundare sunt dependente de natura reactanilor i de condiiile de reacie. Interaciunile teriare definesc manifestrile in vivo ale reaciilor Ag-Ac i depind n special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interaciunile teriare pot conduce la un rezultat pozitiv (protecia gazdei) sau negativ (degradare tisular).

Tipuri de reacii Ag-Ac


n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, dup cum urmeaz: reacii de precipitare pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, precipitarea n inel Ascoli etc) reacii de aglutinare se pot folosi n diagnosticul bacteriologic (ex. reacia Huddleson) sau se pot folosi n diagnosticul serologic (ex. reacia Wright) reacia de fixare a complementului (RFC)

n diagnosticul serologic al sifilisului, leptospirozei etc n diagnosticul serologic al infeciilor virale etc reacii de seroneutralizare reacia ASLO (n diagnosticul serologic al infeciilor streptococice) diferite intradermoreacii cu mecanism imun umoral etc reacii n care componentele sunt marcate izotopic (radio immuno assay, RIA) enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA) fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

16. Reacii antigen-anticorp: reacia de precipitare


Reacia Ag-Ac de precipitare poate avea loc n mediu lichid sau solid i const n unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultnd complexe antigen-anticorp, care nu devin insolubile i stabile dect n cazul formrii unei reele tridimensionale, conform teoriei reelei care presupune: un Ag cel puin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac bivalent i condiii fizice favorabile precipitrii (ex. Ac puin glicozilai, de tip IgG cu 3% glucide, superiori Ac de tip IgM cu 10 % glucide). Reacia de precipitare este sensibil i specific n evidenierea prezenei Ag (pentru realizarea reelei Ag-Ac este necesar ca n reacie s intre o anumit cantitate de Ag i Ac, care s se gseasc ntr-un anumit raport / proporie, iar Ag care particip la formarea agregatelor sunt ntr-o cantitate proporional mai mic, n raport cu Ac). n cadrul cursului se discut diferitele situaii legate de prezon (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de echivalen (Ag i Ac se gsesc n totalitate n precipitat), exces relativ de Ag i respectiv postzon (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definit i noiunea de proporie optim.

Clasificarea reaciilor de precipitare


Reaciile de precipitare se pot clasifica dup cum urmeaz. Reacii de precipitare n mediu lichid Reacii de precipitare n amestec, reacii de floculare titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, n diagnosticul serologic al sifilisului Reacii de precipitare n inel reacia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc Reacii de precipitare n tub capilar determinarea prezenei proteinei C reactive determinarea prezenei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc Dozajul nefelometric etc Reacii de precipitare n mediu gelifiat Imunodifuzia radial simpl (ex. metoda Mancini) Difuzia dubl metoda Elek difuzia dubl radial (Ouchterlony) Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza Electroforeza urmat de imunofixare Electroimunodifuzia.

Reacii de precipitare n mediu lichid


Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii. Reacii de precipitare n amestec Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Spre exemplu pentru titrarea

toxinei difterice (Ramon) se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul toxin difteric anticorpi anti-toxin difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic anticorpi anti-toxin tetanic), raportul de echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa relativ uor tubul n care apare cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic). Dac spre exemplu precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf. n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici, cunoscnd titrul toxinei. Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar). Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojara n soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare.

Reacii de precipitare n mediu gelifiat


Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumit concentraie de agar n soluie de tampon veronal, n aa fel nct porii gelului s permit migrarea), va duce la vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini) Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia unui cerc de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen din prob. Pentru a obine un cerc de precipitare de mrime convenabil, concentraia Ac nglobai n gel trebuie s fie aleas n funcie de titrul acestora i de concentraia Ag care urmeaz a fi testat. Metoda permite determinareacantitativ a imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc. Sunt necesare plcue (de ex. cu diametrul de 5 cm) n care se toarn un gel care include Ac fa de structura a crei concentraie dorim s o determinm. Exist un cod al culorilor i spre exemplu, plcuele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraiei de IgG au culoare roie, pentru IgA culoarea este albastr, pentru siderofilin culoarea este portocalie etc. n gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat i un ser de referin n care se cunoate concentraia diferitelor componente (spre ex. cte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). nainte de pipetarea serurilor n godeuri se realizeaz diluarea acestora, diluia fiind pentru IgG, IgA i siderofilin i respectiv pentru IgM, complement C3 i alfa1-antitripsin. Diluia serului de referin se face n funcie de proteina care urmeaz a fi determinat. Cantitatea de ser introdus n fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru serul de referin i restul pentru serurile de cercetat). Dup 10 minute de meninere a plcuei pe masa de lucru aceasta se incubeaz la 37 C, cu stratul de gel poziionat n sus, timp de 48 ore pentru IgA i IgM i respectiv 24 de ore pentru celelalte componente. Citirea se realizeaz cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o rigl special pentru aceast analiz (demonstrat n cursul lucrrilor practice). Se va msura iniial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se

afl serul de referin iar rezultatul obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a fost diluat i astfel are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel ateptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz contrar este necesar o corecie (dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea obinut pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar rezultatele cu cele puse la dispoziie n tabele iar cifra obinut se nmulete cu diluia probei (spre ex. dac obinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli cu 4 pentru a obine rezultatul real). Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony) Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului iar distana parcurs de reactant ntr-un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina, proteina C reactiv, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi de degragare ai fibrinogenului etc. n micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezena exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de Ag fungice, spre exemplu n diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman. Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit pe parcursul unei zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer umed, la temperatura frigiderului, pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se perforeaz 3 grupe de godeuri, cte 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central i 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac spre exemplu dorim s determinm prezena proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile periferice, pipetm Ac antiCRP n godeul central i ser de referin cu CRP n godeurile 1 i 4. n celelalte godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm la 37 C, timp de 24 de ore, n camer umed (ntr-o cutie Petri putem pune o bucat de vat mbibat n soluie salin fiziologic, alturi de lama respectiv). Liniile de precipitare pot deveni vizibile dup 2-4 ore dar sunt mult mai clare dup 24 de ore. Pentru citire poate fi necesar o lup i o surs de lumin. ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori pozitivi) vor aprea linii (arcuri) de precipitare. n cazul n care de ex. n godeul 2 exist CRP, va aprea un arc de precipitare i ntre godeul central i godeul nr. 2. Este certificat prezena CRP n cazul n care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central i godeurile 1 i 2) sunt una n continuarea celeilalte (imagine de genunchi ndoit). Dubla difuzie Elek Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. n cazul n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin, complexele Ag-Ac vor da natere unor linii de precipitare. ntr-o cutie Petri turnm mediul Elek i dup ce mediul s-a ntrit, decupm un an pe unul din diametre. n anul respectiv pipetm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conine Ac anti-toxin difteric n concentraie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxin difteric vor difuza n mediu. Dup circa 2 ore nsmnm perpendicular pe anul cu Ac anti-toxin, de fiecare parte a anului, o tulpin de Corynebacterium diphteriae toxigen (martor pozitiv), o tulpin de Corynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) i tulpini de cercetat, cte un striu (de fiecare parte a anului) pentru fiecare tulpin. Incubm la 37 C pentru 48 ore, dar urmrim zilnic apariia culturii i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de nsmnare apare cultur bacterian. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaz n mediu. Unirea dintre Ag i Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipit, iar n mediu vor aprea linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin. n cazul n care apar linii de precipitare n unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat i anul cu Ac anti-toxin, respectiva tulpin este toxigen. Reacia va fi negativ pentru martorul negativ i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.

Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric
Electroforeza proteic n gel

Electroforeza proteic n gel este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor ntr-un strat de gel care este supus aciunii unui cmp electric se va realiza difereniat, pentru fiecare structur proteic n parte, n funcie de greutatea molecular i ncrctura electric a proteinelor. Pentru vizualizare este necesar fixarea, uscarea i colorarea liniilor de precipitare care corespund fraciunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o component monoclonal). Imunoelectroforeza Se asociaz electroforeza n gel cu imunodifuzia dubl (realizndu-se separarea prin electroforez a proteinelor n mediu gelozat, urmat de o imunodifuzie dubl utiliznd un antiser corespunztor). Reacia Ag-Ac se va vizualiza prin apariia unor arcuri de precipitare. Este o metod foarte util n studierea puritii unui Ag (sau Ac), ns n mod curent are indicaii didactice. Datorit faptului c n boala pneumococic prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat de ex. prin imunoelectroforez. Contraimunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza reprezint o dubl difuzie n care deplasarea unul fa de cellalt a Ag i Ac este accelerat de un cmp electric. Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% i se perforeaz 3 grupe de perechi de godeuri, fa n fa. Metoda poate fi utilizat pentru acele structuri antigenice care n cmp electric migreaz ctre anod. Lund n discuie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, n godeurile care vor fi poziionate spre catod (polul negativ) pipetm Ag iar n godeurile care vor fi poziionate spre anod (polul pozitiv) pipetm Ac cunoscui, specifici Ag pe care dorim s-l identificm. Reacia este mai rapid i mai sensibil dect dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactani unul ctre cellalt este amplificat de cmpul electric. Reacia (apariia unei linii de precipitare ntre godeuri, n cazul n care n godeul catodic se gsete Ag presupus) poate fi citit dup numai 30-90 minute n loc de 24 de ore aa cum se ntmpl n dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizat din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenei Ag HBs. Se poate utiliza pentru identificarea antigenelor capsulare n lichidul cefalorahidian la pacieni cu meningit acut (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae). Electroimunodifuzia Electroimunodifuzia are la baz electroforeza probelor care conin proteina-antigen, ntr-un strat de gel, care conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici (anti-protein antigen), rezultnd zone de precipitare n form de rachet sau conuri, a cror arie este direct proporional cu concentraia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare dect IDRS.

17. Reacii antigen-anticorp: reacia de aglutinare


n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

Cteva tipuri de aglutinare


Exist mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta n continuare, pe scurt, aglutinarea direct, aglutinarea indirect, inhibarea aglutinrii, aglutinarea n coloan i aglutinarea mediat de Ac antiimunoglobuline. Ulterior vom discuta reaciile de aglutinare utilizate n bacteriologie i micologie. Aglutinarea direct Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de ctre Ac specifici. Se poate utiliza n diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea enterobacteriilor (Shigella, Salmonella, E. coli etc) pe baza structurii antigenice, n diagnosticul serologic al unor boli infecioase (febr tifoid, bruceloz etc), pentru determinarea grupelor sanguine (ABO) etc. Aglutinarea indirect sau pasiv Este o reacie n care particule artificiale (globule roii formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt ncrcate in vitro cu Ag sau Ac i sunt aglutinate de ctre Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizeaz n principal pentru decelarea factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc.

Inhibarea aglutinrii Reacia const n inhibarea aglutinrii particulelor ncrcate cu Ag, dup ce n prealabil Ac reacioneaz cu Ag corespondent. Se utilizeaz de ex. pentru decelarea mioglobinei sau n diagnosticul imunologic al sarcinii. Aglutinarea n coloan Metoda permite o mai bun vizualizare a reaciei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea n care se introduc reactivii (situat superior) i o coloan situat inferior, plin cu microparticule de sticl. Dup introducerea hematiilor i a serului de cercetat i incubarea acestora, dispozitivul este centrifugat. n cazul unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei reacii negative, hematiile se depun n poriunea inferioar a coloanei. Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor aglutinate (prin apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului reumatoid (tehnica WaalerRose).

Utilizarea reaciei de aglutinare n microbiologie


Vom prezenta att exemple de utilizare a reaciei de aglutinare n diagnosticul direct ct i n diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul c n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) Ac necunoscui, n serul pacientului respectiv, utiliznd Ag cunoscute. n diagnosticul serologic, de regul, trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale: exist anticorpi n serul pacientului investigat? care este titrul anticorpilor? cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru? n acest scop vom realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infeciilor care pot fi diagnosticate astfel). n acest capitol vom discuta att reacii serologice calitative ct i reacii serologice cantitative.

Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul de laborator microbiologic direct


Tehnica de aglutinare se execut n a patra etap a diagnosticului de laborator, respectiv n etapa de identificare, pe baza caracerelor antigenice. n momentul aplicrii acestei reacii avem o serie de date pornind de la informaiile clinice, paraclinice, epidemiologice, s-a prelevat un anumit p.p., care s-a examinat din punct de vedere microscopic i a fost cultivat. Aa cum am menionat anterior, n vederea identificrii este necesar s avem colonii izolate, cultur pur. 1. Aglutinarea pe lam Spre exemplu, n cursul identificrii unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., Salmonella spp., E. coli etc), dup cultivarea p.p. pe medii selectivo-difereniale se obin colonii izolate i din poriunea superioar (bombat) a coloniilor izolate facem treceri pe medii multitest (ex. TSI, MIU). n ziua urmtoare, avem deja mai multe elemente pentru ncadrarea tulpinii izolate ntr-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacterian dezvoltat pe mediul TSI, putem face reacia de aglutinare. n nici un caz nu se vor utiliza pentru identificarea pe baz de caractere antigenice tulpini mai vechi de 18-24 ore. Pentru realizarea reaciei de aglutinare sunt necesare urmtoarele: cultura de identificat (colonii de tip S, de 1824 ore), soluie salin fiziologic, Ac cunoscui fa de Ag pe care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. Iniial, pe o lam de microscop curat i degresat punem la una dintre extremitile lamei o pictur de soluie salin fiziologic, n care suspendm un fragment din colonia de identificat n aa fel nct s obinem o suspensie omogen, opalescent. n cazul n care suspensia rmne omogen, putem trece la etapele urmtoare; n cazul n care pictura se limpezete i apar grunji, tulpina este ne-tipabil prin aceast metod (apare aglutinarea nespecific), ar putea fi vorba de o tulpin care provine dintr-o colonie de tip R. n urmtoarea etap, la cealalt extremitate a lamei, punem o pictur de ser cu Ac cunoscui, de ex. polivaleni i realizm o suspensie omogen, opalescent, a coloniei de identificat. nclinm lama de cteva ori, uor, n toate direciile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactani i unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru a forma reele de complexe Ag-Ac. n cazul reaciei pozitive (coresponden ntre Ac cunoscui i Ag pe care dorim s l identificm) pictura se limpezete i apar grunji de aglutinare. Este indicat s citim reacia pe fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber ns n cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi necesar s folosim o lup, un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme exist scheme care orienteaz etapele de urmat (tabelele i schemele respective se livreaz de ctre productori

mpreun cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care se fac reaciile de aglutinare, dup terminarea reaciilor se introduc n amestecul dezinfectant. n cadrul lucrrilor practice vor fi discutate aglutinrile pentru identificarea E. coli, Salmonella spp. pn la nivel de specie (conform clasificrii Kauffmann-White) i respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin aglutinare direct se mai pot identifica tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli entero-patogen, iar n cazul leptospirelor i unor rickettsii apariia aglutinrii trebuie verificat cu ajutorul microscopului. Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b, pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirect se pot identifica exotoxine n filtratul de cultur, streptococii de grup A-D, E. coli O:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la aglutinarea pe lam sau atunci cnd rezultatul unei aglutinri pe lam nu este suficient de clar. Vom avea la dispoziie cultura pur de identificat care se va prepara difereniat n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm. Spre exemplu, dac ncercm s identificm Ag de tip O iar bacteria ar putea s prezinte i Ag H sau Ag K (care ar putea inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menine 1-2 ore la 100C pentru inactivarea Ag de nveli, dup care se va trece la realizarea aglutinrii n tuburi (o procedur asemntoare poate fi necesar i n cazul tehnicii de aglutinare pe lam). Vom utiliza un ir de eprubete n care vom introduce Ac cunoscui, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluie salin fiziologic. n tuburile respective vom aduga o cantitate echivalent de suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom aduga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face difereniat, n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm (ex. 20 ore la 52C pentru identificarea Ag O). Reacia este pozitiv n cazul apariiei aglutinatelor (grunjoase - n cazul prezenei Ag O, floconoase n cazul prezenei Ag H etc). Reacia de aglutinare n tuburi permite i verificare titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.

Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic


n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de cercetat dar i stabilirea titrului. Totui exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative. 1. Aglutinarea pe lam Reaciile de aglutinare pe lam Huddleson (n diagnosticul brucelozei) i respectiv Kudicks-Steuer (n diagnosticul tifosului exantematic) au intrat n istoria medicinei. Prima dintre reacii o utilizm demonstrativ n cadrul lucrrilor practice, apariia aglutinatelor fiind clar iar tehnica de lucru foarte simpl. Sunt necesare urmtoarele materiale: lame de microscop curate, Ag brucelos inactivat (colorat n violet), ser de cercetat. Pe o lam de microscop depunem o pictur din soluia de Ag brucelos i n imediata vecintate a acesteia, o pictur de ser de cercetat. Cu colul unei alte lame amestecm i omogenizm cei 2 reactani. Prin micri de nclinare a lamei n toate direciile facilitm formarea complexelor Ag-Ac, n cazul n care n serul de pacient sunt prezeni Ac anti-Brucella spp. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor. Chiar i n perioada n care aceast se utiliza n diagnostic, o reacie pozitiv pe lam trebuia s fie confirmat prin aglutinare n tuburi. Tehnica de aglutinare indirect poate fi utilizat n diagnosticul serologic al infeciilor produse de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pasiv) etc. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi n diagnosticul serologic al brucelozei (reacia Wright), diagnosticul serologic al infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul serologic al febrei tifoide etc. Denumirea de reacie Widal pentru diagnosticul serologic al febrei tifoide a intrat n istoria medicinei. Lund n discuie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoid, sunt necesare urmtoarele: seruri recoltate (n dinamic) de la pacienii la care se suspicioneaz acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de ap cu temperatur reglabil, Ag cunoscute (Ag O i Ag H). Se va lucra cu 2 rnduri de eprubete, un rnd pentru detectarea prezenei i titrului Ac anti-O, al doilea pentru detectarea prezenei i titrului Ac anti-H (pentru persoanele n convalescen sau n cazul suspicionrii strii de purttor vom ncerca s identificm n serul de cercetat Ac i titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasiv).

Serul de cercetat, pentru fiecare rnd de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, n diluii binare. Dac amestecul de ser de cercetat i diluant va fi n cantitate de 0,5 ml, vom aduga o cantitate similar de Ag, cte 0,5 ml Ag O n primul rnd de tuburi i respectiv cte 0,5 ml Ag H n al doilea rnd de tuburi. Vom proceda n aa fel nct s obinem n primul tub o diluie de 1/20, n al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conine doar un amestec de tampon fosfat salin i soluie Ag (tub martor). Dup ce omogenizm coninutul tuburilor, vom incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52C urmat de 10 minute la temperatura camerei. Citirea se va realiza dup incubare, comparnd rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag. Pentru evidenierea reaciei vom agita uor tuburile. Aglutinarea H difer de aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, n timp ce aglutinatul H este mai floconos i uor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezint aglutinare vizibil permite stabilirea titrului reaciei. n capitolul 31 vom relua acest tip de diagnostic i vom discuta modalitile de interpretare.

18. Reacii antigen-anticorp: reacia de fixare a complementului


Sistemul complement Complementul reprezint un constituent foarte important al aprrii naturale i respectiv o component normal a serului. Sistemul complement (C) cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Sistemul C se poate activa pe trei ci, repectiv calea clasic, calea lectinic i calea altern. Activarea pe calea clasic este declanat n primul rnd de formarea complexelor imune (Ag-Ac) dar i de apariia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C reactiv cuplat cu anumii liganzi. Calea lectinic poate fi activat de microorganisme care prezint n structur grupuri manoz-terminale. Calea altern poate fi activat de bacterii, fungi, virusuri sau de celule tumorale etc. Sistemul C prezint numeroase activiti biologice fiind implicat n inflamaie (componentele C3a, C4a, C2b, C5a, complexul C5b7, C3e), n aprarea anti-infecioas (opsonizare, facilitarea fagocitozei, liza microorganismului implicat), n metabolismul complexelor imune, clearance-ul celulelor apoptotice sau n reglarea rspunsului imun. Cu toate c n mod obinuit are un rol benefic, sistemul C poate avea i efecte duntoare. Reacia de fixare a complementului (RFC) Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginat nc din anul 1901 de ctre Jules Bordet i s-a perfecionat destul de mult de-a lungul timpului. Aceast reacie este utilizat n peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificri, inclusiv introducerea micrometodelor RFC. Reacia de fixare a complementului se poate folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul serologic. Pentru c nu urmeaz s discutm pe larg prima variant, vom enumera doar cteva dintre exemple, RFC permind identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene, virale etc. n diagnosticul serologic, cea mai cunoscut metod rmne nc RFC Bordet-Wasserman, utilizat n diagnosticul serologic al sifilisului. Subliniem faptul c RFC este o metod laborioas, n care nu se admit erori tehnice, dar fiind executat corect este foarte exact, are o mare sensibilitate i specificitate. Este de asemenea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate. Principiu RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C, care se va activa pe calea clasic i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-antihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea Ci respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber. Materiale i reactivi necesari: serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obinute n dinamic

seruri de referin (martor pozitiv i negativ) Ag cunoscut (suspensie corpuscular sau soluie coloidal, dup caz) sistemul C obinut din ser proaspt sau conservat recoltat de la cobai sistemul hemolitic indicator format din hematii de berbec, soluie 4%, valabil timp de o sptmn la 4C ser hemolitic anti-hematii de berbec (obinut prin injectri repetate de hematii de oaie la iepurele de laborator, splate cu soluie salin fiziologic) titrat i conservat la 4C baie de ap cu temperatur reglabil plci cu godeuri, tuburi de hemoliz, pipete diferite etc. Tehnica de lucru: Aa cum am menionat, tehnica de lucru este laborioas i nu va fi prezentat n totalitate, n cele ce urmeaz. serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C propriu principial, RFC are loc n 2 etape n prima etap se pun n reacie C, serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C b.n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, Crmne liber n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); exist 2 posibiliti: a. C nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei toi reactivii utilizai trebuie standardizai, respectiv se vor realiza omogenizarea suspensiei de hematii cu eventual etalonare prin spectrofotometrie titrarea serului hemolitic titrarea C n prezena Ag titrarea bidimensional a Ag i a serului de referin n RFC final se va proceda astfel se dilueaz conform indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utilizai (serul hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referin, C) se repartizeaz n godeurile corespunztoare serurile de cercetat, Ag i C pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C, martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referin, martor sigur negativ) plcile se introduc pn a doua zi la 4C a doua zi, plcile se menin la 37 C timp de 30 minute se adaug n toate godeurile sistem hemolitic plcile se menin la 37C timp de 30 minute se pun plcile la 4C, pn la sedimentarea hematiilor exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt aceleai n RFC Bordet-Wasserman, metod calitativ, reacia se realizeaz n eprubete, 2 pentru reacia propriuzis (una cu ser diluat 1/8, celalt cu ser diluat 1/16, 2 pentru martori sigur pozitiv i sigur negativ i cte una pentru fiecare din ceilali martori, respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C, martor pentru serul hemolitic) Interpretare: Iniial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ sau calitativ); spre ex. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuie s fie hemoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, C i ser sigur negativ. n tuburile martor sigur pozitiv i martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie s fie hemoliz. n tuburile cu serul de cercetat, dac apare hemoliza, nseamn c nu exist Ac iar testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect rou, limpede). Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW s fie confirmat prin reacii specifice (vezi capitolul 45). Control de calitate: Cu privire la controlul de calitate am menionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacie. n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Mycoplasma pneumoniae,

Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc. n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C apar precoce n cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau recent.

19. Reacii antigen-anticorp: reacia de neutralizare (seroneutralizare)


La fel ca i RFC, n reacia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor. n cazul RSN, Ag are o anumit proprietate biologic (toxic, enzimatic) care poate fi blocat prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar n cazul n care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatic respectiv este acelai cu determinantul antigenic (epitop). Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n: diagnosticul microbiologic direct identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate (vezi cap. 44) testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi cap. 11) toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi cap. 11 i 45) diagnosticul serologic reacia ASLO (vezi i cap. 25) prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA; vezi i cap. 22) titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc) testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe. Reacia ASLO Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO. Materiale i reactivi necesari: ser de cercetat (sau seruri pereche, recoltate la interval de 2 sptmni) SLO liofilizat (standardizat de ctre productor) snge defibrinat de iepure / berbec soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3% eprubete, pipete gradate foarte curate baie de ap, centrifug etc Tehnica de lucru: Trebuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru, respectiv se omogenizeaz suspensia de hematii se ndeprteaz inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizm soluie de rivanol i suspensie de crbune activ, realizm o diluie de 1/10 a serului care se va menine 30 minute la 56C) se realizeaz diluiile de ser i se repartizeaz n tuburile de reacie (ser n diluii succesive) mpreun cu SLO (n cantitate constant, cte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu SLO reprezint prima etap a reaciei se agit tuburile pentru omogenizare i se menin timp de 15 minute la 37C urmeaz a doua etap a reaciei ASLO, respectiv adugarea suspensie de hematii (5%), cte 0,5 ml n fiecare tub se agit pentru omogenizare i se incubeaz timp de 45 minute la 37C

se centrifugheaz tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaii / minut) i se menin pn a doua zi la 4C (temperatura frigiderului). Interpretare: Pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Control de calitate: Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, n care se verific rezistena hematiilor i respectiv tubul martor pentru SLO n care se pun SLO i suspensia de hematii. Exist i posibilitatea de a realiza o micrometod ASLO, reacia efectundu-se n plci de material plastic cu godeuri. Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu anatoxina difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului, administrndu-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor reacii adverse (fa de componenta pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ la o administrare anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular n care s fie inclus toxina pertussis inactivat. Evaluarea eficacitii vaccinurilor Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate de autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic etc) n seruri prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c un copil este protejat (prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-anti toxin difteric este mai mare de 0,03 UAI / ml Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau nu protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinei au intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de ctre streptococul de grup A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilitii fa de difterie (toxina este elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat). ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare UAI = unitate anti-toxic internaional Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv) Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc. Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie.

20. Reacii antigen-anticorp: reacii n care componentele sunt marcate

Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume: 1. reacii de precipitare 2. reacii de aglutinare 3. reacia de fixare a complementului (RFC) 4. reacii de seroneutralizare. Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face: izotopic (radio immuno assay, RIA) enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA) fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc. Radioimunoanaliza (RIA) Posibilitatea utilizrii izotopilor radioactivi n medicin a condus la multe descoperiri importante n domeniu. Introducerea RIA, pentru determinarea cantitativ a prezenei unui mare numr de substane prezente n cantiti foarte mici n lichidele biologice, a constituit un real succes. RIA a fost i nc mai este utilizat n multe dintre specialitile medicale. Pentru marcarea Ag se pot utiliza 3H, 125I, 14C etc. Se introduc n reacie o cantitate cunoscut de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe care dorim s l dozm i Ac cunoscui cu specificitate fa de Ag. Se va realiza o competiie pentru cuplarea cu Ac ntre Ag marcat i Ag nemarcat radioactiv. Dup respectarea timpilor din protocolul de lucru se msoar radioactivitatea complexului Ag-Ac i aplicnd formule de calcul corespunztoare se poate afla cantitatea de Ag nemarcat. RIA este o tehnic obiectiv, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor cantiti foarte mici de Ag sau de haptene dar, datorit problemelor legislative, costului aparaturii i reactivilor, riscurilor implicate, este nlocuit din ce n ce mai mult cu tehnici de tip ELISA. Analiza imunoenzimatic (ELISA, EIA) Marcarea enzimatic a fost introdus pentru prima oar n histochimie, n 1966, dup 5 ani devenind un marker i n cazul reaciilor Ag-Ac. Prezena complexelor Ag-Ac va putea fi vizualizat i cuantificat deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu o enzim, iar dup adugarea n mediul de reacie a unui substrat cromogen specific enzimei marker, densitatea optic a mediului de reacie se va modifica iar valoarea densitii optice se poate nregistra. Reaciile imunoenzimatice pot avea lor n sistem omogen sau heterogen (activitatea markerului enzimatic nu este influenat de ctre reacia Ag-Ac). n continuare nu vom discuta dect despre al doilea tip de reacii, care sunt mai frecvent utilizate n microbiologie. Tehnicile ELISA pot fi utilizate att pentru identificarea Ag ct i pentru identificarea i / sau titrarea Ac. n general, reaciile imunoenzimatice se realizeaz n urmtoarea succesiune: primul reactiv (Ag sau Ac, n funcie de ceea dorim s determinm) este fixat pe un suport solid (foarte frecvent reprezentat de godeurile unor plci de plastic, dar pot fi i bile, tuburi etc); de regul aceast fixare se realizeaz de ctre companiile productoare adugm al doilea reactiv, cel necunoscut (Ac sau Ag) n cazul n care exist complementaritate structural i electrochimic ntre cei doi reactivi, are loc cuplarea i formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea reactivilor care nu au intrat n complex are loc o prim splare reactivul adugat n urmtoarea etap variaz n funcie de tipul de tehnic ELISA (n finalul acestui subcapitol vom prezenta pentru exemplificare una dintre variantele tehnice); de ex. se poate aduga un reactiv care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este la rndul lui cuplat cu enzima (conjugat enzimatic); n continuare are loc o nou splare pentru vizualizarea reaciei, adugm un substrat cromogen pe care enzima poate aciona i conduce la apariia unei culori care se poate vedea i cu ochiul liber, dar se citete cu ajutorului unui spectrofotometru valorile nregistrate pentru prob se compar cu valorile nregistrate pentru martorul pozitiv i martorul negativ, se aplic formula indicat de ctre productor, iar interpretarea se face aa cum este indicat n protocolul tehnic care nsoete trusa ELISA.

Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalin i peroxidaza. n cazul primei enzime, substratul cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul iar n cazul peroxidazei, substratul cromogen va fi o-fenilen-diamina n soluie de ap oxigenat. Prin tehnicile de tip ELISA se obine o specificitate bun sau foarte bun iar sensibilitatea este comparabil cu cea obinut n cazul RIA. Tehnica este obiectiv, a devenit automatizat, iar prin extinderea ofertei i creterea numrului celor care o utilizeaz preurile sunt competitive. Exist mai multe modaliti de clasificare pentru aceste tehnici, spre exemplu: n funcie de scopul urmrit, se poate determina prezena Ag n diferite produse patologice sau prezena Ac n ser, LCR, alte umori n funcie de tipul i ordinea reactivilor introdui n reacie tehnicile pot fi necompetitive sau de competiie (directe sau indirecte) n funcie de complexitatea tehnicii, putem discuta despre variantele clasice (aa cum a fost descris mai sus i respectiv aa cum urmeaz s fie prezentat n exemplul concret) i respectiv despre variantele simple / rapide. n anumite situaii, rezultatele obinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai specifice. n continuare vom prezenta succint etapele ELISA n cazul determinrii prezenei de Ac anti-mycobacterieni n ser. Nu exist nc o standardizare a diagnosticului serologic n tuberculoz (vezi cap. 42) dar aa cum urmeaz s discutm, pentru a pune diagnosticul unei infecii cu M. tuberculosis, toate datele care pot fi obinute sunt importante i trebuie analizate n context. Principiu: Anticorpii prezeni n serul de analizat se leag specific de Ag imobilizate pe microplci Koh-I-Nor Hardmuth. Complexul imun format, reacioneaz prin fragmentul Fc al imunoglobulinelor (n special IgG) cu conjugatul Protein A stafilococic - peroxidaza din hrean (SpA-HRPO) care este pus n evidena cu orto-fenilen-diamin HC1 (OPD). Reacia este cuantificat fotometric. Materiale i reactivi necesari: Plci sensibilizate (IC) Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7.2, 0.15M, Tween 20 0.05% casein Hammersten 0.5% i mertiolat de sodiu 0,1%. Se pstreaz la + 4oC. este utilizat pentru rehidratare i diluri. Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeai compoziie ca Tamponul 1 cu excepia caseinei Hammersten. este utilizat pentru splri. Tampon citrat (3) pH 5.0, pentru dizolvarea OPD Ortofenilen diamin (pastile de 9mg, cntrite de productor) Ser de cercetat Ser martor pozitiv (M+) Ser martor negativ (M-) Soluie concentrat de conjugat SpA-HRPO Perhidrol (30% H2O2) Tehnica de lucru n godeurile plcii sensibilizate (Institutul Cantacuzino) se introduc 100 ml Tampon 1 i se incubeaz 60 minute la 37oC. Placa se golete de coninut (automat sau prin rsturnare i scuturare pe un strat de hrtie de filtru). Probele de ser de analizat i serurile martor (M+ i M-) se dilueaz 1/25 n Tampon 1 (25 ml ser + 0.6 ml Tampon 1). Serurile se repartizeaz cte 100 ml n 3 godeuri paralele, notndu-se n caietul de lucru poziia serurilor. Incubm placa la 37o timp de 60 min, n atmosfera umed. Placa se spal de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori cu ap distilat, pentru nlturarea spumei. Pentru aceast operaie, nti se dilueaz Tamponul 2 concentrat prin amestecarea unui volum Tampon 2 cu 9 volume ap distilat. Conjugatul SpA - HRPO se dilueaz 1/500 n Tampon 1 (30 ml conjugat + 15 ml Tampon 1) i se repartizeaz cte 100 ml /godeu Se incubeaz 60 min la 37o n camer umed. Se nltur din godeuri conjugatul i se spal ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori cu ap distilat. Se prepar soluia de OPD prin adugarea a 15 ml Tampon 3 si 8 ml perhidrol, repartizndu-se cte 100 ml /godeu.

Se incubeaz la temperatura camerei, ferit de lumin direct, pna n momentul apariiei n godeul corespunztor serului M+ a unei culori galbene intense iar corespunztor serului M- lipsa apariiei culorii. Aceasta se realizeaz n circa 10-30 min. Analiza se face cu ajutorul unui fotometru (l = 450 nm) fr blocare cu acid. Interpretare: Rezultatele se exprim n Uniti Imuno Enzimatice (UIE) dupa relaia: (OD X - OD M- / OD M+ - OD M -) 100 * n care OD X reprezint densitatea optic a probei de analizat, OD M- este densitatea optic a serului martor negativ iar OD M+ densitatea optic a serului martor pozitiv. Valorile de pn la 10 UIE sunt considerate nesemnificative, dei pot indica un nceput de sintez de anticorpi, repetarea determinrii dup 1-2 luni, putnd indica o cretere a titrului. Indiferent de valoarea obinut rezultatele se vor interpreta n contextul clinic, epidemiologic i paraclinic, innd cont de rezultatele examenului microbiologic direct. Imunofluorescena (FIA, IF) Imunofluorescena poate fi utilizat att n diagnosticul microbiologic direct (pe p.p. recoltat de la bolnav sau pe cultura pur) ct i n diagnosticul serologic. Unul dintre reactivi (Ag, Ac sau Ac anti-Ac) este marcat fluorescent. Posibilitatea cuplrii stabile a Ac cu fluorocromi, fr alterarea specificitii Ac, a fost evideniat nc din anul 1942. Fluorocromii sunt compui organici care, dup iradiere cu radiaii ultraviolete absorb radiaia excitant, intr n stare de excitaie iar atunci cnd revin n starea normal pierd energia acumulat emind radiaii luminoase (vezi i cap. 8). Dintre fluorocromi am putea aminti auramina O, rhodamina B, acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibil emis depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galben pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinaia de auramin O rhodamin B etc). Tehnicile IF pot fi de tip direct sau de tip indirect. n cazul IF direct, Ag este necunoscut i se poate afla ntr-o cultur, etalat pe frotiu ca atare sau parazitnd anumite celule (ex. se poate utiliza o prob recoltat prin biopsie). Produsul care urmeaz a fi analizat este incubat n prezena Ac marcai fluorescent, cunoscui. Spre ex. n cazul frotiului colorat fluorescent, dup realizarea frotiului acoperim lama cu serul care conine Ac marcai fluorescent, incubm timp de 30 minute la 37 C, splm cu tampon fosfat salin i apoi cu ap distilat (pentru ndeprtarea Ac care nu au intrat n complexul Ag-Ac), ateptm s se usuce i examinm cu microscopul cu fluorescen. Putem identifica astfel Ag aparinnd speciilor Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii etc. Metoda este rapid i aplicabil pentru frotiuri din p.p. sau din cultur dar i n anatomia patologic sau n histochimie. Pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care conine Ac specifici, marcai fluorescent. IF indirect presupune realizarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut. Frotiul se acoper cu ser de cercetat i dup o incubaie de 30 minute la 37 C splm cu tampon fosfat salin i cu ap distilat pentru ndeprtarea reactivilor care nu au intrat n reacia Ag-Ac. Pe frotiu se pune un ser cu Ac anti-Ig de om, marcai fluorescent i se incubeaz timp de 30 minute la 37 C, se spal, se ateapt uscarea frotiului, urmnd examinarea la microscopul cu fluorescen. n situaia n care n serul de cercetat exist Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului Ag-Ac iar n etapa urmtoare, Ac anti-Ig de om se cupleaz pe complex i n mod indirect, prin fluorescen, identificm (i n unele variante tehnice putem titra) Ac. Metoda poate fi utilizat n diagnosticul serologic al infeciilor produse de Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Leptospira spp., Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii etc.

21. Testarea imunitii de tip celular


Exist o serie de metode utile pentru evaluarea rspunsului imun de tip celular (RIC). Evaluarea RIC este necesar att n situaia unor pacieni la care se suspicioneaz prezena unei stri de imuno-deficien, ct i n anumite boli transmisibile care se pot nsoi de modificri fiziopatologice a RIC. Datorit faptului c n momentul de fa au fost puse la punct variante terapeutice care pot influena n mod favorabil rspunsului imun, este necesar s avem la dispoziie modaliti de identificare a deficienelor imune. n vederea stabilirii unui astfel de diagnostic, cel mai frecvent pornim de la o suspiciune care poate fi clinic iar asocierea unei infecii cu ageni etiologici considerai oportuniti poate s reprezinte semnalul pentru

declanarea diferitelor investigaii. Spre exemplu, infeciile cu Pneumocystis carinii sau Cryptococcus neoformans pot trda o afectare a limfocitelor T, infeciile repetate, purulente cu Staphylococcus aureus, Pseudomonas cepacia, Serratia marcescens, Aspergillus spp. ar putea fi datorate unor suferine ale celulelor fagocitare etc. Avnd n vedere cele de mai sus, investigarea pacientului la care se suspicioneaz o imuno-deficien ar trebui s fie realizat prin urmtoarele activiti: Aplicarea anamnezei pe parcursul creia ar trebui s aflm date privind medicaia primit de respectivul pacient, momentul debutului suferinei respective, antecedentele heredo-colaterale, date privind vaccinrile efectuate (vezi i capitolul 22), date privind agenii etiologici izolai i identificai ulterior etc. Adeseori anamneza are o importan crucial. Examenul clinic, pornind de la cunoaterea nlimii i greutii pacientului investigat comparnd cu valorile considerate normale pentru vrsta respectiv, prezena unor semne clinice sugestive (la nivelul feei, dentiiei i evoluiei acesteia, la nivelul tegumentului i anexelor acestuia, la nivelul scheletului, organelor interne care pot fi examinate clinic etc) Examene de laborator (numrul elementelor figurate: hematii, granulocite, trombocite; formula leucocitar, aspectul pe frotiul realizat din sngele periferic, VSH etc) studiul mai aprofundat limfocitelor i subpopulaiilor limfocitare CD3+, CD4+, CD8+ etc (numr, procent) prin metode clasice i moderne (ex. flow-citometrie) studiul funciei subpopulaiilor limfocitare (prin metode clasice i moderne) determinarea numrului de celule formatoare de anticorpi fa de antigene timo-dependente (plaje hemolitice) studiul funciei celulelor fagocitare (aderare, inhibiia aderrii, inhibiia migrrii macrofagelor sau leucocitelor, deficiene la nivelul granulaiilor, deficiene n mieloperoxidaz, deficiene n NADPH oxidaz, eliberarea radicalilor de oxigen activi de ctre celulelor fagocitare nestimulate i / sau stimulate cu zimosan, lectine etc) evaluarea activitii citotoxice a celulelor NK i K (citotoxicitatea natural mediat celular, citotoxicitatea mediat celular anticorp-dependent / ADCC, citotoxicitatea specific fa de celule tumorale sau normale / prin eliberare de 51Cr, inducere de limfocite T Citotoxice in vitro prin culturi stimulate cu antigene tumorale i IL-2 etc) studii privind reactivitatea celulelor implicate n rspunsul imun de tip celular apreciat prin incorporarea de timidin tritiat de ctre limfocitele stimulate cu diveri mitogeni, lectine care se leag de membrana celular (fitohemaglutinin, concavalin A etc), substane care acioneaz direct fr a necesita existena unor componente membranare, diferite antigene (PPD, candidin etc), citokine (IL-2), celule allogenice etc studiul secreiei de citokine, modalitate indirect de apreciere a funciei celulelor implicate n rspunsul imun de tip celular etc Teste imunobiologice, prin tehnica intradermoreaciei (IDR), folosind antigene care stimuleaz rspunsul imun de tip celular (ntrziat); n literatura internaional este recomandat o baterie de antigene, patrucinci dintre antigenele menionate n continuare Candidin (antigen extras din Candida albicans, un extract apos realizat n diluie 1 / 10; antigenul este numit i Dermatophyton O) Coccioidin (antigen extras din Coccidioides immitis) care ns poate interfera cu testele serologice realizate pentru histoplasmoz Histoplasmin (antigen extras din Histoplasma capsulatum) care produce i o cretere a titrului anticorpilor fixatori de complement Antigenul extras din virusul urlian Fitohemaglutinin (mai rar folosit in vivo) Lizat din cultur de Staphylococcus aureus O combinaie ntre streptokinaz i streptodornaz Toxoid tetanic, cu concentraia de 10 limes floculans / ml (diluat) Toxoid difteric, cu concentraia de 30 limes floculans / ml (nediluat); pentru ultimele 2 antigene pot aprea reacii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate crea probleme importante n ceea ce privete evaluarea rspunsului imun de tip celular Tricofitin (extras din Trichophyton spp.) Tuberculin (derivat proteic purificat, PPD, extras din cultura de Mycobacterium tuberculosis). n cele ce urmeaz vom discuta despre IDR cu PPD.

Principiul metodei Tuberculina reprezint un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene, utilizat n mod curent pentru decelarea infeciei tuberculoase (TB), individual sau populaional. Acest extract se poate utiliza n cadrul unei baterii de teste IDR pentru evaluarea reactivitii din punct de vedere al rspunsului imun de tip celular (RIC). Dup ce o persoan dat se infecteaz cu mycobacterii, urmeaz sensibilizarea i proliferarea anumitor populaii de limfocite T (LT). Injectarea intradermic a tuberculinei stimuleaz LT i declaneaz o serie de evenimente ce conduc la un apariia unui RIC i a unor manifestri de hipersensibilitate de tip IV. Reaciile implic vasodilataie, edem i infiltrat cu limfocite, bazofile, monocite, neutrofile. LT antigenspecifice prolifereaz i elibereaz limfokine care mediaz acumularea local a diferitelor alte celule. Rspunsul maxim se constituie la circa 48 ore dup injectare. Aria induraiei (infiltratului celular) reflect hipersensibilitatea de tip ntrziat. Eritemul reprezint o reacie inflamatorie acut, cauzat de vasodilataia capilar iar apariia eritemului nu va fi interpretat drept o reacie pozitiv. Limfocitele sensibilizate ating un nivel adecvat pentru a conduce la apariia unui rspuns interpretabil dup 2-4 sptmni de la infecia iniial cu M. tuberculosis. Sensibilitatea poate persista mai muli ani, dar reactivitatea scade de regul o dat cu vrsta. Materiale i reactivi necesari Pornind de la tuberculina preparat de Koch (Old-tuberculin, 1891), n 1901 a fost realizat produsul New tuberculin, iar ulterior derivatul proteic purificat (PPD-S, preparat de Seibert n anul1941), adoptat ca Standard Internaional pentru PPD. Metoda de obinere a fost reprezentat de precipitarea proteinelor din filtratul mediului de cultur concentrat la cald, cu soluie 50% sulfat de amoniu. Unitatea internaional pentru PPD este definit drept activitatea biologic coninut n 0,000028 mg de PPD-S (0,00002 mg PPD + 0,000008 mg sruri). PPD-RT 23 reprezint lotul de tuberculin purificat n anul 1958 n Danemarca i asigur omogenitatea produsului antigenic folosit in studii epidemiologice n lumea ntreag. Din produsul realizat iniial se prepar diluiile necesare (etalonate) la care se adaug Tween 80 n scopul reducerii absorbiei pe peretele de sticl al fiolei. n mod uzual se utilizeaz 2 UI/doz, echivalentul a 5 UI PPD-S. n raport cu PPDRT23, n Romnia se utilizeaz PPD IC-65 produs de ctre INCDMI Cantacuzino. Tehnica de lucru n ara noastr se utilizeaz tehnica injectrii intradermice (Mantoux). controlm produsul biologic pe care urmeaz s l utilizm din punct de vedere al perioadei de eficacitate, conservrii n condiiile prevzute de ctre productor; utilizm numai seringi cu volumul de maxim 1 ml i cu diviziuni clar marcate, cel puin pentru fiecare 1/10 ml precum i ace pentru injecie intradermic, de unic ntrebuinare; agitm energic fiola pentru a omogeniza concentraia produsului biologic, tiut fiind c, n timpul unei conservri mai ndelungate, tuberculina tinde s se absoarb pe pereii de sticl ai fiolei; aspirm n sering o cantitate suficient de soluie pentru a putea elimina integral orice bul de aer aprut ntre piston i orificiul acului; poziionm acul astfel nct bizoul s fie aliniat diviziunilor seringii; antiseptizm cu alcool (minim 3 minute) o arie situat pe faa anterioar a antebraului stng, la unirea treimii medii cu cea superioar; cuprindem zona respectiv a antebraului n palm, ntinznd pielea ct mai uniform ntre extremitatea inferioar a eminentei tenare i hipotenare pe de o parte i cele patru degete strns lipite, pe de alt parte; ptrundem cu acul aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul n sus, pn acesta este situat n derm; eliberm tegumentul i fixm seringa presnd-o pe antebraul subiectului, avnd grij s nu se acopere diviziunile seringii pentru a putea urmrii cantitatea injectat; injectm strict 0,10 ml; dac injectarea s-a fcut strict intradermic apare o bul uor denivelat, cu margini relativ abrupte, cu aspect de coaj de portocal i diametru de 5-8 mm; n lipsa apariiei acestei bule (n cazul injectrii hipodermice sau cnd se pierde soluie ntre sering i acul incorect montat), este recomandat s se reia manevra cu mai mult atenie, repetnd injectarea la o distan de 3-5 cm sau la antebraul opus. La persoanele infectate anterior (sensibilizate), la locul injectrii apare o reacie constnd din eritem-edeminduraie ncepnd dup circa 6 ore i atingnd un nivel maxim dup circa 36-60 ore, care se retrage n urmtoare cteva zile. Pe locul reaciei poate persista o perioad ndelungat o zon de hiperpigmentaie. Citirea rezultatului Citirea rezultatului se face de regul dup 72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (este de preferat lumina natural). Recomandm o prim citire la 24 ore (pentru a surprinde o eventual

hipersensibilitate de tip umoral fa de antigenul inoculat care are structur proteic), o a doua citire la 48 ore i citirea final la 72 de ore. Identificm existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, care circumscrie zona n care am fcut inocularea. n cazul existenei unei astfel de reacii, apreciem tactil (prin micri repetate, atingnd zona respectiv) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei de infiltraie dermic (perceput ca fiind reliefat) corespunznd din punct de vedere histopatologic inflamaiei (edem, limfocite, macrofage, PMN) i care reprezint reacia nespecific i specific fa de antigenul injectat. Msurm diametrul maxim al zonei de infiltraie. Notm i semicantitativ intensitatea infiltraiei dermice ("tip Palmer"), semnificaia fiind urmtoarea: tip I, induraie ferm sau prezena unei flictene; tip II, induraie elastic; tip III, infiltraie depresibil; tip IV, fr infiltraie aparent. Citirea reaciei tuberculinice reprezint o evaluare subiectiv, existnd posibilitatea unor importante variaii inter- i intraindividuale din partea persoanelor care efectueaz lectura. Dubla citire "n orb" fr cunoaterea rezultatului celeilalte lecturi, poate reduce variaiile grosiere, cu condiia ca ambele persoane care citesc rezultatul s aib experien cu aceast tehnic. Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR cu PPD). n funcie de analizele statistice efectuate, exist cteva recomandri cu privire la interpretarea IDR cu PPD. Centrul de control i prevenire a bolilor Atlanta-Georgia (CDC) a modificat relativ recent clasificarea reactivitii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD dup cum urmeaz: 1. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este >5 mm n urmtoarele cazuri: persoane care au avut un contact recent cu un caz de TB; persoane cu semne radiologice de TB; persoane infectate cu HIV. 2. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este 10 mm n cazul persoanelor care nu intr in categoriile menionate mai sus dar au ali factori de risc, spre exemplu: persoane nscute n ri n care prevalena TB este crescut (din Asia, Africa, America Latin etc); persoane care folosesc droguri inoculate pe cale injectabil; persoane fr adpost sau care locuiesc n azile sau n instituii corecionale; persoane care prezint afeciuni care cresc riscul apariiei TB (silicoz, diabet zaharat, boli hematologice i ale sistemului reticuloendotelial, malnutriie) sau sunt tratate cu medicamente imunosupresive. 3. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este 15 mm n cazul altor situaii dect cele menionate mai sus NB. Persoanele infectate cu alte tipuri de mycobacterii pot prezenta reacii pozitive dup IDR cu PPD, ns de regul diametrul induraiei <10 mm, excepiile (diametru > 10mm) putnd apare n special la debutul infeciei. n ara noastr se consider drept pozitive reaciile atunci cnd diametrul este 9 mm. Aceast definiie convenional se bazeaz pe rezultatele unor testri efectuate pe eantioane semnificative statistic, la care analiza epidemiologic a distribuiei valorilor a artat c plasarea limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel mai bine cele 2 categorii (neinfectai i infectai) asigurnd cel mai sczut procent de rezultate fals pozitive i respectiv fals negative. Clasificarea indivizilor dintr-o populaie n negativi i pozitivi la testul tuberculinic servete la msurarea extinderii infeciei TB n acea populaie (prevalena infeciei) oferind un plus de informaie prin analiza separat pe grupe de vrst. Dac se repet determinarea prevalenei infeciei pe vrste la intervale definite de timp, dinamica prevalenei infeciei n fiecare cohort permite determinarea riscului anual de infecie, indicator fiabil al evoluiei endemiei tuberculoase. n ceea ce privete investigarea reactivitii din punctul de vedere al RIC pentru un anumit subiect, la care s-a utilizat o baterie de antigene, dac spre exemplu rezultatul este negativ pentru fiecare dintre cele 4-5 antigene folosite se poate presupune faptul c subiectul respectiv este anergic n ceea ce privete RIC i se recomand efectuarea unor investigaii suplimentare.

23. Introducere n diagnosticul de laborator microbiologic


n prima parte a manualului de lucrri practice am prezentat datele privind bazele diagnosticului n microbiologie, studiul microbiologic direct i respectiv evaluarea rspunsului gazdei fa de infecie. Avnd la

baz aceste cunotine, n capitolele urmtoare vom discuta pe rnd diagnosticul de laborator al infeciilor produse de principalele microorganisme studiate. Pentru fiecare dintre capitolele 24-52 vom utiliza schema de diagnostic prezentat n capitolul 5, schem pe structura creia am discutat de altfel i diferitele aspecte din partea general. Utilizarea n mod repetat a unei scheme clare permite o mai bun fixare a cunotinelor precum i atingerea obiectivului stabilit: reinerea unor principii de ctre studeni indiferent de specialitatea care va fi aleas ulterior sau de ctre medici. Microbiologia este, dup prerea noastr, o tiin cu foarte mare aplicabilitate practic. Elementele de baz ale microbiologiei sunt necesare i utile pentru toi cei implicai n sistemul sanitar; cunoaterea acestor elemente de baz ar putea preveni o serie de anomalii i erori care uneori sunt dezastruoase (aa cum s-a ntmplat de ex. ntr-o maternitate n care o serie de nou-nscui au decedat datorit unor infecii de spital). Dac n urm cu circa 30 de ani la nivel internaional a nceput s se considere (n mod eronat) c problemele legate de bolile infecioase sunt din ce n ce mai puin importante, eroare care a creat i creaz nc mari probleme n sntatea public la nivel internaional, n ultimii 5-6 ani (n special ncepnd cu anul 1998) s-a neles c bolilor transmisibile trebuie s li se reacorde importana cuvenit. Astfel, inclusiv la nivel european, au fost elaborate numeroase acte normative n acest domeniu iar fondurile alocate au sporit substanial, ncercnd s se amelioreze situaia creat datorit erorilor anterioare. i n ara noastr, preocuparea fa de sntatea public n general i fa de microbiologia n sntatea public n mod particular a crescut dup anul 1997. Activitatea desfurat n domeniul reformelor pentru sntatea public n Romnia este, din acest punct de vedere, destul de aproape de reforma care are loc restul Europei. Diferitele proiecte i programe iniiate n special n perioada 1997-2000 i gsesc i astzi concretizarea n aplicarea unor msuri cu mare importan la nivel naional: reabilitarea centrelor de referin pentru microbiologie, reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei, adaptarea la standarde internaionale a sistemului de diagnostic, prevenire i control pentru bolile cu transmitere sexual, meninerea la un nivel corespunztor a imunizrilor pentru a preveni bolile prevenibile prin vaccinare, includerea Romniei n sistemul de pregtire n scopul supravegherii bolilor transmisibile la nivel european etc. Din anul 1999 Romnia face parte (ca membru fondator) din Reeaua de supraveghere a bolilor transmisibile n Balcani. n anul 2000, a fost organizat una dintre cele mai importante ntlniri cu scopul armonizrii supravegherii bolilor infecioase n Europa (Consensus Meeting on Surveillance of Infectious Diseases, Grottaferrata, Italia, 7 aprile 2000). Prezentarea pe care unul dintre autorii prezentului volum a fcut-o cu acest prilej, discuiile care au urmat n ateliere de lucru, ntlnirile cu factori de decizie ai Organizaiei Mondiale a Sntii, iniiativa organizrii unei reele de supraveghere a bolilor transmisibile n rile din Europa Central i de Est (ntlnire plenar pe care am organizat-o n decembrie 2000, la Bucureti) au dus la construirea unui proiect de reform n domeniul supravegherii bolilor transmisibile cu sprijin european (PHARE) care a fost aprobat de asemenea n anul 2000 i este n curs de desfurare. Chiar dac reprezint o msur pentru prevenirea unor maladii virale (i nu bacteriene sau fungice) vom mai aminti dintre msuri luate n ultimii ani mbuntirea programului de vaccinare mpotriva infeciilor cu virusul hepatitei B, n anul 1999. Vaccinarea nou-nscuilor avea deja o vechime de 4 ani, dar n 1999 prin politica dus n domeniul sntii publice a fost inclus i vaccinarea copiilor din clasa a III-a, vaccinarea tuturor elevilor din anul I de la colile sanitare postliceale i respectiv a studenilor din anul I din facultile de medicin i stomatologie. Aceast politic va duce ca n numai civa ani, un mare numr de generaii de copii s fie vaccinate fa de o infecie care devenise endemic la nivelul anilor 90. Fiecare din aspectele menionate are o strns legtur att cu microbiologia ct i cu sntatea public i merit a fi cunoscute de ctre medicii i viitorii medici din sistemul sanitar romnesc. n bolile infecioase (transmisibile) diagnosticul are o importan considerabil, deoarece de stabilirea corect i precoce a diagnosticului depind att vindecarea bolnavului, ct i succesul msurilor preventive care trebuie iniiate ct mai rapid posibil. Spre exemplu, ignorarea primului caz al unei boli infecioase grave (ex. holer) poate avea consecine epidemiologice foarte importante. Cu toate c n primii de studiu este abordat n mod special partea microbiologic (bacteriologic, virusologic, parazitologic, micologic) a diagnosticului, este strict necesar s menionm c examenul clinic i pstreaz i astzi o deosebit valoare. n scopul diagnosticrii bolilor infecioase au fost puse la punct numeroase tehnici de laborator, metode paraclinice, precise i obiective, dar utilitatea lor este maxim atunci cnd rezultatele sunt interpretate n contextul clinic i epidemiologic. n diagnosticul bolilor transmisibile trebuie respectate o serie de reguli, dup cum urmeaz. 1. Obinerea datelor (clinice, paraclinice i de laborator) este urgent. Anamneza trebuie realizat cu rigurozitate. Aprecierea statusului imunologic poate fi esenial. Nici un element obinut prin examenul obiectiv

nu trebuie neglijat. 2. Datele obinute trebuie privite ca un tot unitar; nu pot fi absolutizate nici posibilitile clinice i nici cele ale laboratorului. 3. Este indispensabil s se stabileasc un diagnostic etiologic n toate maladiile infecioase, avnd n vedere importana tratamentului antimicrobian; 4. Folosirea corect a laboratorului constituie o alt regul important. Este necesar ca fiecare medic clinician s tie ce analiz s cear, ce produse se recolteaz de la bolnav, cnd i cum s le recolteze, cum s le expedieze ctre laborator. Pentru obinerea unor date corecte prin examenele de laborator, clinicianul va respecta cteva reguli: produsele se recolteaz nainte de administrarea tratamentului antimicrobian; se trimite laboratorului o cantitate suficient de produs pentru examinat; produsul patologic trimis trebuie s fie reprezentativ pentru boala respectiv (de exemplu, sput i nu saliv n infeciile respiratorii inferioare); produsul examinat nu trebuie contaminat cu ali germeni n cursul recoltrii sau al transportului (recoltare aseptic); expedierea ctre laborator se face n condiiile de conservare cerute pentru fiecare tip de produs patologic n parte; se solicit examinarea imediat a produselor transmise ctre laborator. 5. Trebuie s existe o colaborare strns i continu ntre clinician i specialistul de laborator. Este necesar o informare clinic a omului de laborator de ctre clinician pentru orientarea studiilor n laborator i pentru alegerea celor mai bune metode de identificare a agentului etiologic. n acelai timp, laboratorul trebuie s informeze clinicianul pe parcurs n legtur cu datele obinute. n cadrul examenelor de laborator, un loc prioritar este ocupat de diagnosticul microbiologic (bacteriologic, micologic i / sau imunologic), care va fi prezentat n continuare (vezi i capitolul 5). Foarte pe scurt vom discuta cteva date referitoare la alte examene paraclinice, utile n diagnosticul bolilor infecioase. Diagnosticul citologic const n punerea n eviden a unor aspecte celulare caracteristice, utiliznd un produs prelevat de la bolnav. Spre exemplu, citodiagnosticul revrsatelor pleurale i al LCR poate aduce date preioase pentru elucidarea etiologiei unei pleurezii i respectiv a unei meningite. Diagnosticul histologic implic biopsii (recoltate prin tehnic chirurgical) sau puncii-biopsii ale diferitelor organe (ficat, rinichi, plmn, ganglioni limfatici, fragmente vasculare, mucoas digestiv sau respiratorie) care permit punerea n eviden a unor modificri structurale caracteristice, determinate de aciunea agentului microbian. Dintre metodele de laborator nespecifice sunt utile n diagnosticul bolilor infecioase hemograma, leucograma (cu modificri caracteristice n unele boli), viteza de sedimentare a hematiilor, testele de disproteinemie, diferite teste enzimatice, determinarea prezenei proteinei C reactiv (beta-globulin care apare n ser n afeciuni inflamatorii, neoplazii i n procese necrotice), alte teste de inflamaie (reactani de faz acut) etc. Referitor la alte metode paraclinice vom aminti examenul radiologic care poate furniza date de valoare pentru bolile infecioase cu participare pulmonar (pneumonii virale, febr Q, tuse convulsiv, pneumonie pneumococic etc). n diagnosticul bolilor infecioase se mai pot folosi rectosigmoidoscopia, electroencefalografia, electrocardiografia, diferite determinri biochimice, examene oftalmologice, scintigrafia, ecografia, tomografia computerizat, tehnica de rezonan magnetic nuclear. Diagnosticul de laborator microbiologic (ex. bacteriologic) Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Schema general a diagnosticului de laborator microbiologic a fost discutat n capitolul 5 i va fi aplicat concret n capitolele care urmeaz. Pentru fiecare microorganism / diagnostic n parte, din lista p.p. posibil de utilizat, vom alege pentru prezentare cte unul singur, considerat reprezentativ. Principalele microorganisme pentru care se va studia diagnosticul microbiologic Bacteriile studiate pot fi grupate dup mai multe criterii, dar o variant util este cea n care avem n vedere structura peretelui bacterian i respectiv afinitatea acestuia fa de diferii colorani. Un prim grup important este cel care include cocii cu importan medical, gram pozitivi (stafilococi, streptococi, pneumococi etc) i respectiv gram negativi (meningococi i gonococi etc). Dintre bacteriile gram negative care au dimensiuni pe baza crora nu pot fi ncadrate drept coci sau bacili se afl parvobacteriile, cocobacilii gram negativi (Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella spp. etc). Bacilii gram pozitivi care vor fi discutai se pot grupa n bacili nesporulai (Corynebacterium diphteriae, Listeria spp. etc) i respectiv bacili gram pozitivi sporulai (Bacillus anthracis, Clostridium spp. etc). Bacilii gram negativi studiai aparin fie familiei enterobacteriilor (E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Yersinia spp. etc) fie sunt inclui n genuri separate precum Vibrio cholerae din genul Vibrio sau Pseudomonas aeruginosa din genul Pseudomonas. Microorganismele din genul Mycobacterium se pot colora (cu dificultate) prin metoda Gram, dar n mod caracteristic se coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen. Specia principal studiat este reprezentat de M. tuberculosis.

O serie de bacterii spiralate (ex. Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.) nu se coloreaz prin metoda Gram datorit structurii particulare a peretelui. Pot fi studiate microscopic fie n preparate proaspete (utiliznd tehnici microscopice speciale) fie utiliznd coloraii particulare (ex. impregnarea argentic). Pn n urm cu o perioad de timp microorganismele aparinnd genurilor Rickettsia, Chlamydia i Mycoplasma erau incluse n categoria virusurilor. Totui proprietile lor fundamentale fac s le studiem astzi ntre bacterii. n obiectul de studiu sunt ncadrai i fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici aparte. Noiunile legate de diagnosticul micologic sunt prezentate mai pe larg n tratatele de specialitate.

24. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Staphylococcus
Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazo-pozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluznd mai multe specii). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: Staphylococcus aureus; S. epidermidis; S. saprophyticus. S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce alte specii sunt nepatogene sau condiionat patogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus. Stafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i combinarea acestor mecanisme). Determinanii patogenitii la stafilococ includ produsele toxice i enzimatice. S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc. Toxiinfeciile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Stafilococii coagulazo-negativi (SCN) sunt implicai n infecii aprute dup manevre medicochirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecie grav produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, la care administrarea necontrolat a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal, pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitivi, cu diametrul de 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Stafilococii se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins

ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: Stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manito-pozitiv) i SCN (manitonegativ). Stafilococii aurii sunt catalazo-pozitivi (vezi 12.5.B). Se poate face i testul fosfatazei. Exist sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek etc). Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect). Caractere de patogenitate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi capitolul 12, punctul 12.7); pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i capitolul 11). Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la aciunea litic a bacteriofagilor a fost sistematizat pentru tulpinile de S. aureus ntr-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referin. Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotipia). S-au dezvoltat tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumente automatizate pentru evidenierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur (testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin) i pentru diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

25. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Streptococcus
Streptococii sunt coci sferici gram-pozitivi care formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Sunt larg rspndii n natur. Unii fac parte din flora uman normal; alii sunt asociai cu afeciuni umane importante datorate parial infeciei streptococice i parial rspunsului imun al gazdei. Nu s-a elaborat un sistem perfect pentru clasificarea tuturor streptococilor. Dintre speciile cu importan medical ar fi de amintit S. pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc. Enterococii aparineau grupului D, ns n momentul actual fac parte dintr-un gen separat, genul Enterococcus. Streptococii sunt imobili, nesporulai i pot avea sau nu capsul. n acest capitol vom discuta diagnosticul de laborator al infeciilor produse de Streptococcus pyogenes. Cei mai muli dintre streptococii care conin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Streptococii piogeni sunt beta-hemolitici (produc n mod caracteristic zone largi de hemoliz clar n jurul unor colonii de dimensiuni mici). De regul streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin. Streptococii sunt potenial implicai ntr-o mare varietate de boli. n principal streptococii piogeni pot deveni patogeni datorit multiplicrii i capacitii de invazivitate. Proprietile biologice ale microorganismelor infectante, natura rspunsului gazdei i poarta de intrare a infeciei au o mare influen asupra tabloului clinic. Infeciile streptococice ar putea fi grupate astfel: Boli invazive, n care putem include faringita, angina streptococic, erizipelul, diferite infecii n sfera ORL, pneumonia, impetigo streptococic, celulita, fasceita necrozant, febra puerperal, endocardita infecioas, sepsisul streptococic etc.

Boli produse de streptococi lizogenizai, n care putem include scarlatina i sindromul de oc toxic streptococic. Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) i glomerulonefrita acut poststreptococic (GNA). Diferii autori iau n considerare i alte entiti clinice. Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de streptococii piogeni vom alege faringita streptococic. n vederea confirmrii unei boli poststreptococice vom discuta reacia ASLO (vezi i capitolul 19). Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, n faringita streptococic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic, secreia purulent de la nivelul faringelui, trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i fr s se fi splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii, iar dac aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim 4 ore etc (vezi i capitolul 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, ns n nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare pn la cultivare (preferabil 1-2 ore). n cazul n care se estimeaz depirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul Stuart (vezi i capitolul 9). Chiar i n aceast situaie, nu ar trebui s treac mai mult de 24 de ore pn la prelucrarea p.p. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel faringian, prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitivi aezai separat, n perechi sau n lanuri, dar i a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol orientativ. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Streptococii piogeni sunt germeni pretenioi care nu se dezvolt pe medii de cultur obinuite. Mediul cel mai frecvent folosit este agar-snge, pe care cultura apare n n 18-48 ore, la 35-37C. n cazul n care nu remarcm apariia de colonii caracteristice dup 24 de ore, reincubm placa Petri pentru nc o zi. Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de b-hemoliz (zon clar de hemoliz, cu un diametru mult mai mare dect diametrul coloniei). n cursul nsmnrii, pe cel puin una dintre laturile poligonului descris trebuie s realizm i o nepare a mediului n aa fel nct inoculul s ajung mai n profunzime. Aceast manevr (exist i alte variante tehnice) este necesar pentru a permite activitatea hemolizinei O (aceast streptolizin este inactivat n prezena oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau natere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare i medii selective (de ex. agar-snge plus trimetoprim-sulfametoxazol). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1. Se divid ntr-un plan perpendicular pe axa lor lung i se pot dispune n lanuri. Lungimea lanurilor variaz i este condiionat de factori de mediu. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de bhemoliz sau colonii de tip M. Caractere biochimice: Streptococii piogeni produc hemoliz de tip beta. Prin testul PYR este identificat sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente exist i teste comerciale, rapide, pentru testul PYR). Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciaz c dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puin de 1% sunt rezistente la bacitracin (vezi capitolul 12). Streptococii piogeni sunt rezisteni la trimetoprim-sulfametoxazol. Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapid a polizaharidului specific de grup A al streptococilor piogeni n p.p., dup extracie chimic sau enzimatic (ex. cu pronaz). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirect (latexaglutinare), coaglutinarea sau ELISA.

Prin reacii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lam, sau precipitare se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip. S. pyogenes este mprit n serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 80) prin reacia de precipitare n tuburi capilare i T (28 serotipuri) prin reacia de aglutinare pe lam. Aceste testri se fac n centre de referin. Alte teste utilizate n identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea direct a streptococilor de grup A n exsudatul faringian. 5. Streptococii piogeni i menin sensibilitatea cunoscut la penicilin (au fost identificate n ultima perioad tulpini tolerante, care sunt inhibate dar nu distruse de ctre penicilin). Pentru pacienii alergici la betalactamine se poate alege pentru tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian i n acest caz antibiograma devine necesar. n general antibiograma se realizeaz n scop epidemiologic. Diagnosticul de laborator serologic Diagnosticul imunologic al infeciilor produse de streptococii b-hemolitici din grupul A ar putea consta din investigarea fie a rspunsului imun umoral (prezena i titrul anticorpilor, n cadrul diagnosticului serologic), fie a rspunsului imun de tip celular. n continuare nu vom discuta dect diagnosticul serologic, care are importan practic. Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stri de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice, evaluarea evoluiei clinice i eficacitii tratamentului. Diagnosticul serologic se realizeaz de obicei prin reacia ASLO, care identific titruri ale anticorpilor anti-streptolizin O (vezi i capitolul 19). Testarea se face n dinamic, pe seruri recoltate la interval de 7 10 zile. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict necesar realizarea controlului intern i extern de calitate. Exist teste serologice pentru determinarea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Titrul anticorpilor anti-streptodornaz este crescut la pacienii cu infecii tegumentare i trebuie investigat dac se suspicioneaz prezena unei glomerulonefrite acute. Se pot determina i anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasiv) sau anti-MAP (prin latex aglutinare).

26. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus

pneumoniae
Streptococcus pneumoniae se prezint sub form de coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo pe axul longitudinal, ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge determin a-hemoliz la fel ca Streptococcus viridans. Creterea lor este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 37C. Streptococcus pneumoniae poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate, conducnd la apariia unor variate infecii ale tractului respirator superior i inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar i alte infecii produse prin diseminare hematogen (ex. meningit, endocardit, care pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococic se nsoete de prezena edemului alveolar i a unui exsudat fibrinos, urmat de apariia de hematii i leucocite. Datorit faptului c poate face parte din flora microbian normal, exist o serie de probleme n ceea ce privete interpretarea semnificaiei prezenei pneumococilor n produse patologice care pot fi contaminate cu aceast flor (ex. sputa recoltat prin expectoraie). Una dintre marile probleme terapeutice decurgnd din dezvoltarea rezistenei la antibiotice o reprezint apariia pneumococilor rezisteni la penicilin i alte medicamente antibacteriene. Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de pneumococi vom alege drept entitate patologic reprezentativ pneumonia pneumococic. Diagnosticul pneumoniei pneumococice Diagnosticul pneumoniei pneumococice este clinic, radiologic iar din punct de vedere al stabilirii etiologiei este un diagnostic bacteriologic (direct). Diagnosticul de laborator microbiologic este numai bacteriologic (direct). 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de

vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, aspirat bronic sau traheal, exsudat faringian, secreii otice sau conjunctivale, lichid pleural, lichid pericardic, LCR, puroi, snge, material necroptic. n pneumonia pneumococic agentul etiologic poate fi izolat i prin hemocultur. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor grampozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai. Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i capitolul 52). n coloraia cu albastru de metilen, capsula poate aprea ca un halou n jurul pneumococilor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu sput), prin reacia de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pneumococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau de tip M, nconjurate de o zon de a-hemoliz (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 35-37C. n mediile de cultur lichide tulbur omogen mediul. Produsul patologic se poate inocula i la animale de laborator sensibile, respectiv la oareci albi. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai. Caractere de cultur: Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de ahemoliz (la fel ca Streptococcus viridans). Caractere biochimice: Glucoza reprezint principala surs de energie pentru pneumococi. Acetia elaboreaz enzime zaharolitice, proteolitice i lipolitice. Fermentarea inulinei reprezint un caracter biochimic important, util n diferenierea pneumococilor de s. viridans (exist tulpini de S. viridans care fermenteaz inulina). Se utilizeaz un mediu n care exist inulin i un indicator de pH. n cazul reaciei pozitive are loc o modificare de pH i respectiv modificarea culorii mediului. Pneumococii elaboreaz enzime autolitice. Autoliza este indus i accelerat de bil, sruri biliare, acizi biliari; testul este util n identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld; vezi capitolul 12, punctul 12.3). Sunt sensibili la optochin (etil-hidrocuprein), sensibilitatea la aceast substan fiind de asemenea util n identificare i diferenierea de Streptococcus viridans (vezi capitolul 12, punctul 12.13). Caractere antigenice: Cel mai important determinant antigenic i patogenic este capsula polizaharidic (antigenul K), ce protejeaz pneumococul fa de fagocitoz i permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este specific fiecrui serotip n parte. Pn n prezent au fost identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite, a cror structur a fost determinat pentru majoritatea serotipurilor. Au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente i monovalente, utile n identificarea pneumococilor cu ajutorul reaciei de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14). n acelai scop se poate utiliza i reacia de aglutinare. Datorit faptului c prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat prin reacii de latexaglutinare sau mai bine prin imunoelectroforez. Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi capitolul 11). Alte teste utile n identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice pentru identificarea ARNr. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice pe medii suplimentate cu snge defibrinat de oaie. Pentru verificarea sensibilitii / rezistenei la penicilin se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin (1 mg). n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

27. Diagnosticul de laborator n infeciile produse microorganisme din genul Neisseria


Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella. n genul Neisseria, speciile importante pentru patologia uman sunt Neisseria meningitidis (meningococul) i Neisseria gonorrhoeae (gonococul), dar se pot aminti i N. lactamica, N. sicca, N. subflava etc. n acest capitol vom discuta numai diagnosticul de laborator n infeciile produse de meningococ i gonococ. Neisseriile se prezint sub form de coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun. n funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri. Ambele microorganisme sunt oxidazo pozitive i au nevoie n vederea izolrii de utilizarea unor medii de cultur mbogite, necesitile nutritive fiind mai mari n cazul gonococului. Principial se pot multiplica pe mediul Mueller-Hinton (amintit i la antibiograma difuzimetric) dup ce izolarea din p.p. a fost realizat pe alte medii mbogite. Multiplicarea are loc la o temperatur de incubare de 35-37C i n condiiile unei atmosfere de 310 % CO2. Coloniile apar n 24-48 de ore, mai rapid n cazul meningococului. Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis poate face parte din flora microbian de la nivel oral, nazal sau faringian. Colonizarea poate persista sptmni sau luni de zile. Meningococul este un microorganism condiionat patogen care poate fi implicat n infecii respiratorii, dar este semnificativ de reinut faptul c prin invazivitate poate conduce la apariia unei bacteriemii n cursul creia complicaia principal este meningita meningococic. Meningococul reprezint una din primele trei cauze de meningit infecioas la aduli (alturi de Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae). Diagnosticul meningitei meningococice Diagnosticul meningitei meningococice pornete de la elementele clinice, eventual ntr-un anume context epidemiologic; din punct de vedere al stabilirii etiologiei este un diagnostic bacteriologic (direct). Diagnosticul de laborator n meningita meningococic diagnosticul este urgent (risc de evoluie cu sechele i / sau deces), de importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n stabilirea etiologiei. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). Aa cum am menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul citologic i biochimic (vezi i capitolul 6). LCR poate fi purulent. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Meningococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Meningococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloz-snge sau geloz-chocolat) pe care formeaz colonii de tip S sau de tip M. Este necesar o atmosfer de 3-5% CO2, la o temperatur de 37C.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Caractere de cultur: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm. Tulpinile ncapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariia unor colonii de tip M. Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu meningococul metabolizeaz att glucoza ct i maltoza. Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi i capitolul 12) Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek etc). Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 12 serotipuri. Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidic. Structura capsular permite subdivizarea speciei n 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y i W-135. Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 i respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei reactiviti ncruciate fa de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli. Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate n cultur. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Exist diferite tehnici (imunologice, electroforetice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centre de referin. Utilizarea PCR are o sensibilitate i specificitate de circa 91%; foarte util la pacienii pentru care s-a iniiat deja antibioticoterapia. 5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14). Neisseria gonorrhoeae Infeciile gonococice continu s reprezinte o problem important de sntate public. Dup ptrunderea n organismul receptiv, n funcie de calea de transmitere, gonococul se ataeaz de mucoase (genito-urinar, ocular, rectal, faringian etc) i produce local o supuraie acut. La brbai apare uretrita gonococic. La femei, gonoreea se localizeaz endocervical, dar se poate extinde la nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine. Dac mama are gonoree i nou-nscutul se nate pe cale natural, poate aprea oftalmia gonococic. Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguin (bacteriemie), cu apariia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc. Diagnosticul de laborator n gonoree Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct), cu etapele cunoscute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). La brbat se preleveaz secreia uretral (eventual pictura matinal) iar la femeie recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul colului uterin i glandelor Bartholin (vezi i capitolul 6). Secreiile au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultur potrivite i n atmosfer de CO2. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Chiar i n cazul utilizrii mediilor de transport (ex. mediul Amies plus crbune activat), acesta nu ar trebui s dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. n cazul n care nu exist nici o secreie, se poate utiliza urina care trebuie centrifugat i nsmnat imediat pe medii de cultur. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Gonococii sunt germeni foarte pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii

selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloz-snge sau geloz-chocolat cu diferite suplimente nutritive; se recomand utilizarea pulberii de hemoglobin i nu a sngelui proaspt). Este preferat cultivarea n dublu, pe medii selective i neselective; n cazul n care p.p. este reprezentat de secreie de la nivelul rectului sau de secreie faringian se vor folosi numai medii selective. Este necesar o atmosfer de 3-10% CO2, la o temperatur de 35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul c n aceeai plac pot aprea pn la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminat n cazul n care nu se dezvolt colonii, dup 72 de ore. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, eventual nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent. Caractere de cultur: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3). Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Gonococul metabolizeaz glucoza dar nu i maltoza. Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi i capitolul 12). Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv. Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc). Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus i Branhamella catarrhalis, n numai 4 ore. Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creaz probleme tehnice. Aceste testri se realizeaz n centre de referin. Prezena gonococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin coaglutinare (suspensie de S. aureus tip Cowan I stabilizat i sensibilizat cu Ac monoclonali antiprotein I din membrana extern a gonococilor) sau printr-o tehnic imunoenzimatic (cu Ac policlonali). Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscui, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenei directe. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.: Exist diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centrele de referin. Metodele biologiei moleculare au att o specificitate ct i o sensibilitate foarte bun; se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p. Sondele nucleotidice PCR LCR (Ligase Chain Reaction); aceast metod se poate utiliza pornind de la urin sau de la secreii vaginale i are un singur dezavantaj, costul ridicat. 5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC suplimentat nutritiv dar fr pulbere de hemoglobin). Au fost identificate tulpini rezistente la penicilin (fie datorit unui plasmid care codific o blactamaz de tipul TEM, fie datorit unor mutaii cromozomiale). Este necesar testarea producerii de blactamaz (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 14).

28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii. Coprocultura.


Familia Enterobacteriaceae cuprinde un important numr de genuri de microorganisme semnificative din punct de vedere medical (28) i numeroase specii (peste 100, n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului Salmonella n peste 2000 de specii). Dintre genurile incluse n aceast vast familie, vom aminti urmtoarele: Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Edwarsiella, Enterobacter, Morganella, Providencia i Serratia. n capitolele urmtoare vom discuta numai despre diagnosticul n infeciile produse de microorganismele aparinnd primelor 6 genuri enumerate. Enterobacteriile

sunt bacili gram negativi care nu se pot diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp., Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella, Yersinia, Klebsiella), nesporulai; unele specii prezint capsul (ex. Klebsiella pneumoniae). Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz, sunt oxidazo-negativi, catalazo-pozitivi, reduc nitraii. Formeaz colonii de tip S, R (n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau sunt lactozo negativi (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia). Pentru izolarea speciilor de enterobacterii putem folosi medii selective, difereniale i selectivo-difereniale. Exist medii cu selectivitate mai redus care inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive i permite dezvoltarea tuturor enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu sruri biliare n concentraie mic; se poate aduga i cristal violet), medii cu selectivitate medie care inhib multiplicarea enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul ADCL cu dezoxicolat, citrat i lactoz, mediul Shigella-Salmonella cu sruri biliare i verde briliant sau mediul XLD cu xiloz, lizin i dezoxicolat, preferat n multe dintre rile Uniunii Europene) i medii cu selectivitate nalt (ex. mediul Wilson-Blair cu verde briliant n concentraie crescut). Caracterele biochimice sunt eseniale pentru identificarea enterobacteriilor. Dup examinarea caracterelor de cultur (pe mediile selectivo-difereniale se poate identifica i comportamentul enterobacterian n ceea ce privete fermentarea lactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii potrivite (TSI, MIU / MILF, Simmons etc), n ziua urmtoare se pot examina diferite caractere biochimice (fermentarea zaharurilor, evidenierea unui anumit metabolit, metabolizarea unui anumit substrat, utilizarea citratului ca unic surs de carbon, identificarea unor enzime etc) sau alte caractere fenotipice (ex. motilitatea). n momentul de fa exist baterii de teste i sisteme comerciale care permit examinarea unei game extinse de caractere biochimice (ex. galeriile API). Dorim s menionm c pentru fiecare test fenotipic exist o serie de variaii care sunt prezentate procentual n tabele special dedicate. Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor antigenice folosind seruri cunoscute (preparate pe animale de laborator), cu ajutorul diferitelor reacii Ag-Ac (vezi i capitolele 15-20). Toate enterobacteriile dein Ag O. Enterobacteriile mobile dein Ag H. Enterobacteriile capsulate dein Ag K. Salmonella typhi prezint i Ag Vi, Yersinia pestis prezint Ag F1 etc. Infeciile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizenterie i sindroame asemntoare dizenteriei, sindroame asemntoare holerei, toxi-infecii alimentare etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sistemului nervos. Infeciile enterobacteriene pot avea i alte localizri sau pot fi generalizate (de ex. n febra tifoid, febrele paratifoide, pest). n majoritatea infeciilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic, direct. n febra tifoid diagnosticul poate fi att bacteriologic ct i imunologic (serologic). Datorit faptului c n multe dintre aceste infecii produsul patologic este reprezentat de ctre materiile fecale, n continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.

Coprocultura
n multe dintre infeciile produse de enterobacterii, care se manifest prin sindrom diareic, utilizm coprocultura. n cele ce urmeaz vom discuta coprocultura n general, nu numai din punctul de vedere al unei infecii enterobacteriene.

Boala diareic acut


Boala diareic acut (BDA) a fost i rmne o entitate patologic foarte rspndit la nivel mondial. Spre exemplu, n ara noastr n ultimii ani, numrul de cazuri de boli diareice acute a fost de 85.055 n anul 2000, 81.268 n anul 2001 i respectiv 97.317 n anul 2002, cu o inciden de 446,5 0/0000 n 2002. n aceeai perioad de timp, n fiecare an au decedat datorit BDA circa 100 de pacieni. Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune n 24 de ore iar scaunele au consistena diminuat (pn la emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a pn la 20-30 litri / zi n holer). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sanguinolent etc), culoare modificat, miros particular etc. De regul sindromul diareic asociaz i alte semne i simptome digestive (dureri abdominale, tenesme, grea, vrsturi etc) sau generale (febr, stare general alterat etc). Foarte important i obligatoriu de reinut este c BDA duce la pierderi de ap i electrolii iar intervenia cea mai important care trebuie avut n vedere este reechilibrarea hidroelectrolitic.

Ageni etiologici
Boala diareic acut poate fi de etiologie infecioas i neinfecioas. n continuare vom discuta pe scurt etiologia infecioas n general, nu numai cea bacterian sau fungic. Este de menionat c marea majoritate a BDA infecioase au etiologie viral. Etiologia bacterian include: Salmonella spp. Shigella spp. Escherichia coli (EPEC / enteropatogen, ETEC / enterotoxigen, EHEC / enterohemoragic, EIEC / enteroinvaziv, EAEC / enteroagregant, DAEC / aderent difuz) Klebsiella spp. alte enterobacterii (Yersinia enterocolitica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc) Vibrio cholerae i ali vibrioni ali bacili gram negativi (Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp. etc) Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens, Clostridium difficile Clostridium botulinum Staphylococcus aureus etc Etiologia fungic include: Candida albicans (la pacieni cu SIDA) etc Etiologia parazitar include: Giardia lamblia Entamoeba hystolitica i Entamoeba coli Trichinella spiralis Cryptosporidium parvum Strongyloides stercoralis etc Etiologia viral include: rotavirusurile virusurile Norwalk i asemntoare virusurilor Norwalk calicivirusurile astrovirusurile coronavirusurile enterovirusurile adenovirusurile etc. Gruparea agenilor etiologici n funcie de mecanismul patogenic Att din punct de vedere diagnostic ct i pentru tratament poate fi important elucidarea tipului de mecanism implicat. Astfel, BDA ar putea fi produse prin: mecanism neinflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel nu se evideniaz leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk, Cryptosporidium parvum etc) mecanism inflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite polimorfonucleare (ex. BDA produse de Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc) mecanism de penetrare, atunci cnd din punct de vedere microscopic n preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite mononucleare (ex. BDA sau sindrom diareic produs de Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica etc). Dup cum se poate remarca, simpla recoltare a produsului patologic urmat de realizarea unui preparat nativ (vezi capitolul 7) i examinarea microscopic a acestuia pot da informaii importante cu privire la etiologia probabil precum i atitudinea terapeutic de urmat. Este evident c ntr-o BDA pentru care agenii etiologici sunt virali sau mecanismul patogenic include aciunea unei toxine este contraindicat administrarea de antibiotice sau chimioterapice antibacteriene. Indicaiile coproculturii n bacteriologie

atunci cnd este suspicionat o infecie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipurile patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmonella spp. n special la pacieni cu vrste extreme sau imunodepresie dup circa 1 sptmn de la debutul febrei tifoide etc atunci cnd BDA prezint riscul extinderii la nivelul unei colectiviti (cree, grdinie, tabere, uniti de alimentaie public, staii de distribuie a apei potabile etc) atunci cnd BDA apare la pacieni care au fost tratai cu antibiotice iar sindromul diareic persist i dup ntreruperea antibioticoterapiei atunci cnd sindromul diareic persist mai mult de o sptmn sau are loc o recdere n scopul verificrii strii de sntate a persoanelor care lucreaz n uniti de alimentaie public (conform normativelor stabilite de ctre ministerul sntii) n scop de cercetare etc. Recoltarea i transportul materiilor fecale Se vor respecta recomandrile menionate n capitolul 6, n special faptul c recoltarea p.p. trebuie s se realizeze nainte de administrarea de medicamente antimicrobiene. Se pot recolta i examina: scaunul emis spontan reprezint produsul patologic utilizat cel mai frecvent. Defecaia are loc ntr-un recipient de carton sau ntr-un container din material plastic de unic ntrebuinare (care poate fi apoi decontaminat i eliminat fr probleme). n acelai timp efectum i examinarea macroscopic a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului. Utilizm pentru prelevare linguria recoltorului alegnd poriuni care permit cu o mai mare ans izolarea agentului patogen (fragmente mucopurulente, poriuni cu snge, flocoane riziforme etc) sau poriuni diferite dintr-un scaun n care nu se remarc aspectele menionate anterior. Prelevm o cantitate de aproximativ 1 gram pe care o suspensionm n mediul de transport (minim 2 ml n cazul scaunelor apoase). tamponul rectal este recomandat n cazul unei infecii cronice cu Shigella spp., atunci cnd suspicionm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se introduce cu blndee i se preleveaz secreiile de la nivelul mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi introducem. tamponul n mediul de transport. Pentru a putea nchide recoltorul, tiem n mod corespunztor tija tamponului. sonda Nelaton se poate utiliza atunci cnd urmrim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid. Introducem cu blndee sonda pn la nivelul dorit (circa 10-12 cm la copil i respectiv circa 15-20 cm la adult), adaptm la cellalt capt al sondei o sering i aspirm p.p.de la nivel sigmoidian. Introducem p.p. n mediul de transport. n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm un mediu de transport, transportul la rece (+4 C) sau transportul n mediu de transport meninut la 4 C. Cel mai frecvent utilizm mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). Acest mediu asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp de 2448 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie. Atunci cnd este suspicionat infecia cu V. cholerae, apa peptonat alcalin servete n acelai timp drept mediu de transport i mediu de mbogire. Examinarea materiilor fecale Materiile fecale sunt examinate macroscopic i microscopic. Din punct de vedere microscopic, de fiecare dat se vor realiza preparate native (ntre lam i lamel). Materiile fecale sunt suspensionate ntr-o pictur de lugol sau de albastru de metilen 1% iar preparatul se va examina iniial cu obiectivul 10, apoi cu obiectivul 40. Spre exemplu, evidenierea a peste 40 PMN / cmp, nsoite de macrofage i hematii, conduce la suspicionarea unei dizenterii bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile n suspicionarea diagnosticului de enterocolit cu Campylobacter spp. sau al colitei pseudomembranoase, post antibioticoterapie. Cultivarea materiilor fecale n mod obinuit, pentru cultivare vom utiliza 3 medii diferite, respectiv o eprubet cu bulion selenit acid de sodiu i 2 plci Petri, una cu mediu cu selectivitate sczut (ex. Mac Conkey) i alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selective sunt n acelai timp i medii difereniale. Alegem fragmente caracteristice din p.p. (mucus, puroi etc) i nsmnm 2-3 anse n mediul cu bulion selenit (mediu de mbogire n special pentru Salmonella spp.). Realizm o suspensie omogen n mediul lichid. Prelevm o ans (sau o pictur) din suspensie i o depunem pe mediul MacConkey. Modul de nsmnare difer de cel prezentat n capitolul 10. ntindem p.p. n striuri paralele pe o jumtate de plac, pn aproape de marginile plcii fr s le atingem. Fr s sterilizm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri i dispersm p.p. n alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumtate din mediul disponibil, pn aproape de marginile plcii fr s le atingem. Atingnd din nou ultimele 3-4 striuri, dispersm p.p. n mod similar pe mediul nc nensmnat. Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37 C.

n ziua urmtoare, pornind de la tubul cu bulion selenit nsmnm aa cum am menionat mai sus o plac cu MacConkey i o plac cu ADCL (sau XLD); incubm aceste plci timp de 18-24 de ore la 35-37 C. Examinm plcile nsmnate precedent n vederea selectrii coloniilor suspecte. Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roii, pot prezenta un halou opalescent, de regul sunt de tip S dar pot fi i de tip M. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt transparente, de regul sunt de tip S. Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate; pot aprea tardiv colonii de dimensiuni mai mici, roii, de tip S. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt semitransparente, de tip S; dac produc H2S centrul coloniei este de culoare neagr. De regul urmrim apariia coloniilor lactozo-negative, iar pentru etapele de identificare vom repica (fr a atinge mediul de cultur) 3 colonii n cazul n care pacientul este copil i 3-5 colonii n cazul n care pacientul este adult. n cazul n care nu exist colonii lactozo-negative, pentru identificare vom repica (fr s atingem mediul de cultur) 10 colonii la copil i respectiv 10 colonii la adult (dac se consider c identificarea este necesar, de ex. n izbucniri epidemice de BDA). Aadar, dup apariia coloniilor izolate pe mediile selectivo-difereniale trecem la identificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriale, de cultur (vezi capitolul 11), biochimice (vezi capitolele 11 i 12), antigenice (vezi capitolele 11-20, n special capitolul 17), de patogenitate, pe baza sensibilitii la bacteriofagi i eventual pe baza unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile n tratatele de specialitate sau recomandrile productorilor n cazul utilizrii unor sisteme comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza studiul sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metode difuzimetrice (antibiograma difuzimetric standardizat, comparativ, E test). Alte aspecte particulare urmeaz a fi prezentate n capitolele urmtoare.

29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia

coli. Urocultura.

Dup ce o serie de date sugerau asemnarea din punct de vedere molecular ntre speciile genurilor Escherichia i Salmonella, cunotinele actuale pledeaz pentru o grupare a speciilor din genurile Escherichia i Shigella. Cu toate acestea, vom prezenta n continuare separat diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele aparinnd genurilor clasice. Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol, etc) iar la nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt bacili gram negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactozo pozitivi. Specia tip este reprezentat de Escherichia coli. Cu toate c majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiionat patogene (fiind implicate n infecii oportuniste cu localizri n afara tractului digestiv, spre ex. peritonite, colecistite, infecii ale plgilor, endometrite, pneumonii etc) exist i anumite tulpini dotate cu caractere patogenice particulare. Dintre aceste tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei grupri mai importante: tipuri patogene implicate n boli diareice acute (BDA) E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat n apariia unei BDA apoase, persistent, cu mucus, n special la sugari E. coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul O157:H7, care elaboreaz dou citotoxine i este implicat n apariia unei BDA apoas, care poate deveni sever i se poate nsoi de o complicaie grav, sindromul hemolitic uremic E. coli enteroinvaziv (EIEC) care elaboreaz una sau mai multe enteroxine producnd un sindrom dizenteriform E. coli enteropatogen (EPEC) care determin diaree la copilul mic, uneori de gravitate maxim (ex. diaree malign la nou nscut) E. coli enterotoxigen (ETEC) care elaboreaz dou enterotoxine (termolabil i termostabil) i produce un sindrom holeriform E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoas, persistent, la copii n vrst de 1-5 ani tipuri (grupuri) patogene implicate n infecii ale tractului urinar (ITU) tipul patogen implicat n infecia meningeal la nou nscut. Indiferent de localizarea infeciei, diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv

1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea recolta i lichid de vrstur sau un anumit aliment incriminat. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre laborator aa cum am menionat n capitolul precedent. n continuare vom discuta diagnosticul unei infecii produs de EHEC (ex. O157:H7) dar, subliniem faptul c n practica medical, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale, putem izola orice microorganism implicat etiologic n BDA, dup caz. Materiile fecale pot avea aspect hemoragic iar la examinarea macroscopic a p.p. putem observa prezena unor lambouri de mucoas epitelial. Transportul se va realiza aa cum am menionat n capitolul nr. 28. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel; remarcm prezena hematiilor i leucocitelor PMN. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi capitolul nr. 28). n vederea izolrii EHEC, pe lng mediile menionate n capitolul precedent se recomand utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu fermenteaz sorbitolul (sau l fermenteaz tardiv). n acest sens, coloniile suspecte, repicate (fr a atinge mediul) n vederea identificrii vor fi necolorate, cu dimensiuni de 1-3 mm, de regul de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor avea o culoare roz). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi. Caractere de cultur: Produc colonii de tip Scu caracterele menionate mai sus. Caractere biochimice (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrului de referin; procesarea unor culturi n care este prezent EHEC necesit msuri suplimentare de siguran): Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermenteaz (sau fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H2S Pot produce indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili (dar exist i tulpini imobile) etc. Se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor: Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacii de aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza i seruri monovalente anti O157 i respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex aglutinare, latex aglutinare pasiv inversat (VET-RPLA), sau prin seroneutralizarea efectului citotoxic pe celule Vero Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolit hemoragic letal la purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero Teste de biologie molecular (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de la p.p. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol). 5. Antibiograma este recomandat de regul numai pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode difuzimetrice.

Urocultura
Tractul urinar este n mod normal necontaminat, n schimb uretra distal poate prezenta o flor microbian foarte variat, fiind contaminat cu microorganisme provenind din zona genital sau de la nivelul colonului. Dintre aceste microorganisme putem izola de la nivelul uretrei distale stafilococi coagulazo-negativi, E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., bacili difteromorfi, enterococi, streptococi, neisserii saprofite, Mycoplasma spp., Ureplasma spp. sau Fusobacterium spp. La acelai nivel ar putea fi identificate i tulpini de Candida spp., Clostridium spp., diferii coci gram pozitivi sau gram negativi anaerobi, lactobabili, mycobacterii netuberculoase, stafilococi aurii etc. Colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care n marea majoritate a cazurilor vom realiza urocultura cantitativ. Cu toate c indiferent de grija cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va fi contaminat, prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti formatoare de colonii n urina proaspt recoltat, din mijlocul jetului, putem s precizm dac pacientul are sau nu infecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci cnd se demonstreaz prezena a 105 bacterii / ml, aceasta indic o infecie a tractului urinar (ITU) n aproximativ 80% dintre cazuri n timp ce o valoare de 104 bacterii / ml indic ITU n mai puin de 30% dintre cazuri.

Datorit acestor rezultate, n practica medical se consider c ne aflm n situaia unei ITU atunci cnd numrul de bacterii / ml urin este 105 / ml. Cu toate acestea, dorim s subliniem c interpretarea rezultatului nu trebuie realizat mecanic i decizia final n ceea ce privete identificarea bacteriei, efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice i respectiv redactarea buletinului de analiz ar trebui s fie luat avnd n vedere aspectul macroscopic al urinii (ex. purulent), rezultatul examenului microscopic al sedimentului urinar (ex. prezena de PMN), numrul de uniti formatoare de colonii / ml urin i elemente clinice (ex. disurie, miciuni mai frecvente, febr), cu alte cuvinte colaborarea ntre clinic i laborator este esenial. Spre exemplu, n cazul unor elemente sugestive, chiar dac numrul de bacterii este de 104 / ml, putem lua decizia s repetm urocultura iar izolarea aceleiai bacterii poate indica prezena ITU. Pe de alt parte, izolarea a peste 104 uniti formatoare / ml n cazul stafilococilor sau levurilor este luat n considerare iar prezena n urin a Listeria monocytogenes la femeile nsrcinate sau prezena n urin a Salmonella typhi sunt semnificative indiferent de numrul UFC / ml. Pentru a sublinia nc o dat importana etapei de recoltare i transport a urinei amintim faptul c urina reprezint un foarte bun mediu de cultur pentru majoritatea bacteriilor care pot contamina p.p. iar o prob de urin care are iniial (n momentul recoltrii) 103 bacterii / ml, dup 2 ore la temperatura camerei va conine 105 bacterii / ml. Clasificarea ITU se poate face dup mai multe criterii. ITU joase includ cistita dar dup unii autori i uretrita, prostatita i epididimita. ITU nalte includ pielonefrita acut, necroza papilar (complicaie a pielonefritei acute sau care poate aprea n absena infeciei), abcesul renal sau pielonefrita cronic (dup unii autori). Invazia tractului urinar poate avea loc pe cale ascendent, limfatic sau hematogen. Exist o serie de factori care favorizeaz apariia ITU, dintre care amintim: obstruciile care duc la staz urinar (adenom sau carcinom de prostat, tumori de vecintate, stricturi uretrale sau ale colului vezical, compresiune uretral n timpul sarcinii, corpi strini, calculi urinari, cateterizare urinar etc), refluxul vezico-ureteral, ali factori funcionali. Microorganismele mai frecvent implicate n producerea unei infecii a tractului urinar sunt n ordine descresctoare E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Enterococcus faecalis, stafilococii coagulaz-negativi. Adenovirusurile pot determina cistite hemoragice la copii. Mai rar, n ordine descresctoare etiologia ITU poate fi reprezentat de Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus, streptococi b-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella morgani, Providencia rettgeri, P. stuartii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Candida albicans, Salmonella spp., Corynebacterium urealyticum. Cu privire la E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat n ITU, exist anumite grupuri uropatogene, spre ex. O1, O2, O7 etc. n mod cert, exist diferene n ceea ce privete etiologia ITU pe grupe de vrst, n funcie de sex sau la pacienii spitalizai n comparaie cu pacienii pentru care se solicit urocultura n ambulatoriu. Recoltarea i transportul produsului patologic n ITU se pot recolta urin, snge (ex. n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. n continuare vom discuta despre recoltarea i transportul urinei. n afar de recomandrile generale menionate anterio, trebuie s subliniem unele aspecte particulare n cazul n care nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat pentru recoltare 3-4 ore dup miciune Recoltarea se realizeaz dup splarea cu ap i spun a organelor genitale i a perineului; exist recomandri specifice pentru sexul feminin i masculin i respectiv pentru copilul mic Este preferabil ca recoltarea s aib loc ntr-un spaiu corespunztor n apropiere de laborator iar personalul medical trebuie s explice i eventual s asiste recoltarea Este contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aa cum am menionat mai sus); dup recoltare, n cazul n care urina nu este prelucrat imediat (sau n cel mult 30 de minute dup recoltare), p.p. trebuie meninut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4 C De regul se recolteaz urina din mijlocul jetului; dup splarea organelor genitale i a perineului, prin miciune se elimin circa 100 ml urin (ndeprtnd astfel o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) i abia apoi se recolteaz 20-50 ml (preferabil 50 ml) urin n recipientul steril, dup care miciunea continu Exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare uretral, cu riscurile respective). Examinarea macroscopic i microscopic a urinei

Realizm iniial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un anumit miros etc. n vederea examenului microscopic al urinei omogenizm urina prin rsturnare, de 2-3 ori. Punem o pictur de urin pe lam, acoperim cu o lamel i examinm cu microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de faz). n cazul n care identificm prezena a cel puin unei bacterii pe fiecare cmp, n fiecare dintre 5 cmpuri succesive, putem cu o bun aproximaie s considerm c avem o bacteriurie de 105 bacterii / ml. Alternativ se poate utiliza preparatul colorat Gram. Este necesar s apreciem concomitent i prezena piuriei (peste 10 leucocite / mm3 de urin). Au fost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei i bacteriuriei, spre exemplu testul Griess (detectarea nitriilor n urin), detectarea esterazei leucocitare, teste bioluminiscente etc. Piuria i bacteriuria trebuie interpretate n contextul clinic. Examenul sedimentului urinar permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este foarte util i trebuie realizat de fiecare dat.

Cultivarea urinei
n mod obinuit, pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. Din motive de economie am putea nsmna o jumtate de plac cu mediu MacConkey (fr cristal violet), o jumtate de plac cu geloz-snge i cte un sector de plac cu mediu agar telurit i respectiv agar cu eozin i albastru de metilen (EMB) n cazul n care examenul microscopic al urinei este pozitiv. Dac examenul microscopic este negativ, nsmnm doar o jumtate de plac Petri cu mediu MacConkey. O variant de nsmnare pentru mediile MacConkey i geloz-snge este utilizarea unei anse calibrate de 1 l cu ajutorul creia prelevm urin prin atingerea suprafeei p.p. dup omogenizare. nsmnm iniial un striu pe centrul jumtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. n final fr sterilizm ansa ntindem p.p n striuri paralele n unghi de 45 fa de striurile precedente. Dup o incubare de 18-24 ore la 35-37 C, nmulind cu 1000 numrul de UFC dezvoltate, putem aprecia care este numrul de bacterii / ml de urin. Frecvent este utilizat nsmnarea urinei dup diluare (ex. 1/100) cu ajutorul pipetei gradate. nsmnm de ex. pe o plac cu mediu MacConkey 0,1 ml de urin diluat 1/100, incubm n condiiile cunoscute i dup apariia coloniilor calculm numrul de bacterii / ml prin nmulirea numrului de UFC inversul diluie inversul volumului nsmnat. Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 105 / ml de urin confirm ITU la brbat sau la femeie (cu simptome caracteristice); n cazul c pacienta este asimtomatic, certificarea ITU este dat de izolarea aceleai bacterii n a doua prob de urin Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste 105 / ml de urin, impune repetarea recoltrii i nsmnrii; n cazul n care rezultatul este similar i pentru a doua prob de urin este posibil ITU mixt (n caz contrar este o foarte probabil contaminare) Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile pentru fiecare n parte depesc 105 / ml de urin, impune repetarea analizei; extrem de probabil este vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp n urm i meninut la temperatura camerei i nu la frigider Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 104 / ml de urin conduce la recomandarea repetrii analizei (exist i unele excepii, n care rezultatul este considerat pozitiv, spre ex. pentru levuri n concentraie de peste 104 / ml de urin, stafilococii coagulazo-negativi n concentraie de peste 5104 / ml de urin etc) Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie de 103 / ml de urin reprezint o urocultur negativ Dorim s subliniem din nou c rezultatul microbiologic trebuie s fie analizat n contextul clinic i corelat cu rezultatul microscopiei iar n cazul anumitor bacterii (ex. Salmonella typhi) rezultatul este pozitiv indiferent de concentraia UFC / ml de urin. n cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolat se identific (pe baza caracterelor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, alte caractere) i se testeaz sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metoda difuzimetric (vezi capitolul 14). Exist o serie de ncercri pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea unor tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginat n Institutul de boli infecioase Matei Bal (prof. Florin Cruntu), metoda Uriline etc. Spre exemplu ultima dintre metode utilizeaz o lam de plastic acoperit pe ambele pri cu mediu de cultur, protejat ntr-un tub de plastic.

Principiu: Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar) are culoare verde i permite numrarea coloniilor bacteriene (indirect a numrului de UFC / ml urin) i identificarea prezumtiv. Concentraia sczut de electrolii inhib invazia Proteus spp. Mediul MacConkey fr cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare roz; inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive. Tehnica de lucru: Deurubm capacul i extragem lama fr s atingem suprafaa agarului. Imersm lama n proba de urin recoltat (dac urina nu este suficient cantitativ, repartizm p.p. pe cele 2 pri ale lamei cu ajutorul unei pipete Pasteur). ndeprtm excesul de urin pe o hrtie de filtru curat i punem la loc n dispozitiv lama nsmnat. Incubm n poziie dreapt, timp de 18-24 ore la 35-37C. A doua zi citim rezultatele, comparnd numrul de colonii aprute pe mediul CLED cu modelul productorului. Interpretare: n cazul n care numrul de UFC / ml este mai mare de 105 realizm teste suplimentare pentru identificare i respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost prezentate anterior. Control de calitate: Pregtim o suspensie bacterian n soluie salin fiziologic steril cu 105-106 bacterii pe ml din fiecare dintre tulpinile de referin Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Proteus mirabilis ATCC 12453 Inoculm suspensiile astfel pregtite pe suprafaa mediilor de cultur Uriline, iar dup 18-24 ore incubare citim i interpretm rezultatele Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul CLED. Fermentarea lactozei este indicat de prezena culorii galbene n jurul coloniilor dezvoltate. Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED i colonii roz pe MacConkey. Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastr; pe Mac Conkey apar colonii incolore.

30. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Shigella
Genul Shigella ar trebui s fac parte conform studiilor de biologie molecular dintr-un gen care include i Escherichia spp., genul Escherichia-Shigella. Cu toate acestea, n momentul actual este acceptat tratarea separat a celor dou genuri nrudite. Pe baza structurii antigenice au fost difereniate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella dysenteriae (13 serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza n sub-serotipuri), S. boydii (18 serotipuri) i S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R i S). Genul Shigella include bacili gram negativi, imobili, cu dimensiuni de 0,5-0,8 / 2-3, nesporulai, necapsulai, aerobi facultativ anaerobi, glucozo pozitivi fr producere de gaz oxidazo negativi, lactozo negativi. Subgrupele se pot diferenia de ex. pe baza fermentrii manitei (subgrupul A este manito negativ). Cresc pe medii simple i produc colonii de tip S n 24 de ore. Microorganismele din genul Shigella sunt patogene prin multiplicare i invazivitate. n cazul serotipului 1 din subgrupul A (Sh. shiga) este implicat i toxigeneza. Exotoxina shiga afecteaz att intestinul ct i sistemul nervos central (putnd conduce la apariia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea strii de contien, pn la com). Fa de animalele de experien are efect letal. Infeciile cu Shigella spp. sunt de regul limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate aprea dup ingestia a numai 10-100 de bacterii, care se localizeaz, se multiplic i invadeaz epiteliul intestinal (pot aprea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului terminal, abcese care evolueaz spre ulceraie, necroz, hemoragie). Dup o perioad de incubaie de circa 2-5 zile, n cazul unei dizenterii tipice apar brusc febr, diaree apoas, dureri abdominale intense. Ulterior se elimin scaune foarte numeroase (20-40 / zi), nefecaloide, cu mucus, puroi i snge, nsoite de colici intestinale i tenesme rectale. Starea general se nrutete (mai grav n cazul unei infecii produse de Sh. shiga). n lipsa tratamentului corespunztor (n special n lipsa reechilibrrii hidro-electrolitice) evoluia poate fi fatal. n afar de dizenterie, Shigella spp. poate produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios.

Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) i trebuie fcut de urgen datorit implicaiilor posibile ale unei dizenterii. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat de materii fecale, dar s-ar putea recolta i lichid de vrstur. La nceputul bolii este mai uor s izolm bacteria patogen, deoarece iniial se elimin circa 103-109 bacterii / gram de materii fecale. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale pot fi n cantitate mic, coninnd mucus, puroi i snge (uneori sngele nu este vizibil macroscopic). Recomandm recoltarea i cultivarea n special a fragmentelor care conin mucus, puroi i snge. Transportul trebuie s fie realizat rapid, dar este preferabil nsmnarea la patul bolnavului. Dac aceast recomandare nu poate fi urmat, recomandm folosirea unui mediu de transport, mediul bacteriostatic Cary-Blair. O alt variant de recoltare posibil (de ex. n cazuri atipice sau pentru controlul strii de purttor) este reprezentat de utilizarea sondei Nelaton introdus n colonul sigmoid (10-15 cm la copil sau 15-20 cm la adult) aspirnd p.p. cu ajutorul unei seringi. Materiile fecale se vor suspensiona n soluie cloruro-sodic sau n mediul Cary-Blair. Exist i posibilitatea de a recolta p.p. atunci cnd se presupune diagnosticul dizenteriei bacteriene prin rectosigmoidoscopie. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel (nu efectum frotiuri din acest tip de produsul patologic, n cazul n care suspectm o infecie cu Shigella spp.). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu obiectivul 40. Evidenierea a numeroase PMN vine n sprijinul stabilirii mecanismului bolii diareice, iar un procent de peste 75% PMN nsoit de prezena hematiilor este sugestiv pentru dizenteria bacterian. Anumii autori recomand utilizarea imunofluorescenei directe; examenul este costisitor n special datorit existenei numeroaselor serotipuri. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Se vor utiliza mediile de cultur recomandate, prezentate n capitolul 28. Shigella se dezvolt pe mediile slab i moderat selective i nu se multiplic pe mediile nalt selective. n cazul apariiei unor colonii lactozo negative, repicm 3-5 colonii izolate pe mediile multitest (TSI, MIU, MILF) sau procedm conform protocolului de lucru pentru galeriile tip API. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,8m / 2-3m Caractere de cultur: produc colonii de tip S, lactozo negative, semitransparente, cu diametrul de 1-2 mm pe MacConkey sau ADCL (S. sonnei poate produce colonii care devin roz deoarece poate fermenta tardiv, lactoza) i roii pe XLD Caractere biochimice: se pot investiga analiznd rezultatele obinute pe mediile multitest sau pe galeriile API; caracterele biochimice sunt utile i n diferenierea subgrupelor genului microorganismele din genul Shigella sunt glucozo pozitive, fr producere de gaz, lactozo negative, nu produc H2S, imobile, ureaz negative, indol negative pot fi necesare teste biochimice suplimentare Caractere antigenice: se utilizeaz seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune specifice de tip, prin reacii de aglutinare pe lam, conform unor scheme stabilite n cazul n care o tulpin izolat are un comportament biochimic sugestiv dar reacia de aglutinare este negativ, trebuie s realizm o suspensie (destul de dens) din respectiva tulpin, pe care o meninem timp de 30-60 minute la o temperatur de 100C i ulterior repetm reacia de aglutinare Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin; schemele de lizotipie au fost utilizate n special pentru S. flexneri 2a i S. sonnei Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: teste biochimice suplimentare (biotipie) bacteriocinotipie (ex. pentru S. sonnei) rezistotipie (tipare prin patern-ul rezistenei la antibiotice), util n scop epidemiologic testul Sereny (producerea cheratoconjunctivitei la cobai); repicm colonia suspect pe geloz nclinat iar dup 8 ore, introducem o ans de cultur sub pleoapa unui cobai; dup 12-24 ore n cazul unei reacii pozitive apare congestie conjunctival, secreie purulent i opacifiere a corneei cu accentuarea acestor fenomene i evoluie spre cheratoconjunctivit (testul poate fi pozitiv i n cazul unor tulpini de Escherichia coli)

tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic, ribotipia, sondele ADN etc). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene dar i pentru stabilirea tratamentului antimicrobian corespunztor.

31. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Salmonella. Hemocultura.
Exist mai multe clasificri pentru microorganismele care aparin genului Salmonella. Una dintre clasificrile acceptate (Ewing) grupeaz genul n 3 specii i anume S. typhi (patogen doar pentru om), S. cholerae suis (patogen la porc, ocazional i la om) i S. enterica (produce boli diareice la om i la animal, cu aproximativ 2000 de serotipuri). Este nc bine cunoscut schema de identificare serologic (Kaufmann-White) care submparte genul Salmonella n grupe care includ foarte multe specii, spre ex. grupul A (S. paratyphi A), grupul B (S. paratyphi B, S. typhimurium), grupul C (S. paratyphi C), grupul D (S. typhi, S. enteritidis) etc. Genul Salmonella include bacili gram negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili peritrichi (cu excepia S. galinarum pullorum), necapsulai, nesporulai, glucozo-fermentativi (cu producere de gaz cu excepia S. typhi), nu fermenteaz lactoza, produc H2S (exist i excepii) i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Infeciile produse de microorganismele care aparin genului Salmonella se pot mpri n salmoneloze minore (enterocolite, toxiinfecii alimentare) i salmoneloze majore (febra tifoid, febre enterale). Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecia alimentar de tip infecios) apare dup ingestia a 105-108 salmonele. Febra tifoid (febra enteral) poate aprea dup ingerarea a circa 103 salmonele. Febra tifoid este o boal grav care n lipsa tratamentului poate conduce la deces. S. typhi trece prin i printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale, se multiplic activ n submucoas i este fagocitat de macrofage unde supravieuiete i continu s se multiplice. Microorganismele trec apoi n ganglionii mezenterici, n canalul toracic i conduc la apariia unei prime bacteriemii urmat de invadarea altor organe i formaiuni limfatice. Multiplicarea important, n special la nivelul organelor cu sistem reticulo-endotelial bine reprezentat (ficat, splin), este urmat de o a doua bacteriemie masiv i de eliminarea prin bil i / sau urin. La sfritul primei sptmni de boal, S. typhi se elimin din foliculii intestinali i prin bil n materiile fecale, excreia prelungindu-se mult timp n convalescen. Pot aprea angiocolit, colecistit; bolnavul poate deveni purttor (ex. la nivelul veziculei biliare) dup vindecare. n cazul afeciunilor strict digestive, diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct. n cazul afeciunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic i / sau serologic. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv Diagnosticul bacteriologic (direct) cuprinde etapele cunoscute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de materiile fecale dar am putea recolta i lichid de vrstur, un anumit aliment incriminat etc. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre laborator aa cum am menionat n capitolul 28. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel; putem remarca prezena granulocitelor mononucleare. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care urmeaz a fi identificat (vezi capitolele 9-10 i 28). Pentru izolarea i identificarea agentului patogen p.p. este nsmnat pe un mediu lichid de mbogire (bulion selenit) i pe dou medii gelozate selectivo-difereniale (MacConkey i ADCL / XLD). Dup o incubare de 18-24 ore la 35-37 C, pe mediile solide pot aprea colonii bacteriene suspecte (lactozo-negative) din care obinem cultura pur n scopul identificrii i stabilirii sensibilitii la antibiotice. Pentru a crete ansa depistrii agentului cauzal, cultura de 18-24 ore n bulion selenit va fi trecut pe mediile solide (pe MacConkey i ADCL / XLD). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic izolat n cultur pur se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, lactozo-negative, cu diametrul de 1-3 mm (necolorate i semitransparente pe MacConkey; necolorate dar cu centrul negru pe ADCL; roii, semitransparente, cu centrul negru pe XLD). n

cazul n care a fost folosit i mediul Wilson Blair (foarte selectiv, care nu include lactoz) coloniile sunt negre, cu margini neregulate i halou metalic. Caractere biochimice i de mobilitate: Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-negativi, produc H2S, (exis i excepii) i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Nu produc indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili, produc lizindecarboxilaz i ornitindecarboxilaz etc. Pentru punerea n eviden a caracterelor biochimice se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test (API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante). Caractere antigenice: se utilizeaz seruri imune specifice, n scheme care folosesc iniial Ac anti-O i ulterior, n funcie de rezultatul obinut, Ac anti-H, prin reacii de aglutinare pe lam conform schemei Kauffmann-White (exist tabele i scheme care trebuie respectate); n cazul n care o tulpin izolat are un comportament biochimic sugestiv dar reacia de aglutinare este negativ, trebuie s realizm o suspensie (destul de dens) din respectiva tulpin, pe care o meninem timp de 30-60 minute la o temperatur de 100C i ulterior repetm reacia de aglutinare. Alte teste ce pot fi realizate n scopul identificrii germenilor, de regul la nivelul centrului de referin scheme suplimentare pentru testarea caracterelor antigenice (serotipie) teste suplimentare biochimice (biotipie) teste privind sensibilitatea la bacteriofagi specifici (lizotipie) teste de biologie molecular (determinarea profilului plasmidic, ribotipia, studiul unor secvene specifice la nivel cromozomial etc). 5. Antibiograma este recomandat de regul numai n cazul pacienilor cu vrste extreme sau pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz prin metode difuzimetrice. Diagnosticul de laborator microbiologic n febrele enterale este bacteriologic i / sau serologic. Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea i identificarea S. typhi n p.p. Diagnosticul bacteriologic, direct respect etapele cunoscute ale acestui tip de diagnostic, cu anumite particulariti. Multe din aspecte au fost prezentate anterior. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat n prima sptmn de snge, ulterior putem recolta materii fecale, urin, lichid biliar, mduv hematogen etc. Hemocultura va fi discutat n cele ce urmeaz. n cazul n care p.p. este reprezentat de materii fecale, respectm ceea ce am prezentat mai sus, cu o serie de sublinieri: - Sunt n studiu metode de identificare a prezenei S. typhi, direct n p.p. (ex. materii fecale) prin latexaglutinare i PCR - Coloniile de S. typhi pot s nu prezinte centrul de culoare neagr pe ADCL sau XLD. - S. typhi n general nu produce gaz din glucoz iar H2S poate fi produs n cantiti mici i tardiv; nu folosete citratul ca unic surs de carbon i este ornitindecarboxilaz negativ. - Pentru identificarea Ag O poate fi necesar o inactivare prealabil (termic, folosind o substan acid sau aceton). Pentru identificarea Ag H poate fi necesar inactivarea cu formaldehid. Prezena Ag Vi poate crea probleme n ceea ce privete identificarea Ag O. - Dei lizotipia este o metod laborioas, de multe ori se dovedete superioar din punctul de vedere al rezultatelor obinute n comparaie inclusiv cu metode ale biologiei moleculare. - Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice este recomandat pentru fiecare tulpin de S. typhi izolat. Diagnosticul serologic Unii autori consider c nici unul dintre testele utilizabile n diagnosticul serologic nu este suficient de specific, sensibil i rapid. Diagnosticul serologic se realizeaz respectnd principiile generale ale acestui tip de diagnostic. Reacia Widal a fost imaginat n finalul secolului al IX-lea i standardizat la mijlocul secolului XX. Serodiagnosticul Widal, folosind culturi vii de S. typhi nu se mai practic astzi. Cea mai cunoscut metod utilizabil actual este analiza seric cantitativ, realizat tot prin tehnica aglutinrii n tuburi. Utilizm serii separate de tuburi, cte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit, serul de cercetat fiind diluat corespunztor protocolului de lucru. Atunci cnd presupunem o febr tifoid sau paratifoid utilizm spre ex. 6 serii de tuburi, cu Ag cunoscute i inactivate, pentru a evidenia Ac anti-O (TO S. typhi, AO S. paratyphi A, BO S. paratyphi B), i anti-H (d S. typhi, a S. paratyphi A, b S. paratyphi B). Dup realizarea diluiilor,

incubm tuburile pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52 C urmat de 10 minute la temperatura camerei iar tuburile pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52 C urmat de 10 minute la temperatura camerei i citim reacia. Un titru de 1/250 n cazul Ac anti-O i respectiv 1/2500 n cazul Ac anti-H ar putea fi sugestiv. Creterea de 4 ori a titrului, la 2 determinri succesive (interval de 7-10 zile) poate confirma suspiciunea de diagnostic. La persoanele vaccinate n antecedente diagnosticul serologic nu poate fi utilizat (rezultatele nu sunt interpretabile) i este strict necesar izolarea n culturi a S. typhi. Att n cazul bolnavilor, dar mai ales n cazul convalescenilor i purttorilor a fost recomandat reacia de aglutinare n tuburi pentru identificarea prezenei i titrului Ac anti-Vi. Se consider c un titru de peste 1/40 poate fi considerat sugestiv.

Hemocultura
Arborele circulator este n mod normal steril. Bacteriemia / fungemia reprezint prezena tranzitorie i de regul intermitent a bacteriilor / fungilor n torentul circulator. O bacteriemie / fungemie se poate nsoi de creterea temperaturii i / sau frison precum i de alte semne sau simptoame. Dintre situaiile care pot conduce la apariia unei bacteriemii putem aminti: realizarea unei extracii dentare, periajul mai energic al dinilor folosind o periu neadecvat (prea dur) precum i multe acte medicale sau medico-chirurgicale invazive realizate la diferite niveluri anatomice (cateterisme etc). Bacteriemia / fungemia nsoesc infeciile generalizate cu bacterii / fungi. Exist o mare varietate de microorganisme capabile s produc infecii generalizate (bacterii aerobe i anaerobe, fungi, virusuri, parazii). Trebuie ns menionat c, destul de frecvent, o hemocultur pozitiv nu indic de fapt agentul etiologic al infeciei ci o contaminare survenit pe parcursul diagnosticului microbiologic. Dintre agenii contaminani ntlnii mai frecvent putem aminti: Staphylococcus epidermidis, S. hominis, Micrococcus luteus, Corynebacterium spp., Brevibacterium epidermidis, Propionebacterium acnes, Acinetobacter calcoaceticus, streptococii non-hemolitici etc. Este important utilizarea noiunilor de microbiologie clinic care trebuie foarte bine cunoscute de ctre medicul microbiolog n colaborare cu restul membrilor echipei complexe, pentru stabilirea n mod corespunztor a etiologiei infecioase i atitudinii de urmat. Avnd n vedere cele menionate mai sus, dorim s subliniem i alte dou dintre aspectele importante de care trebuie s se in seama n realizarea unei hemoculturi: momentul recoltrii sngelui volumul de snge recoltat. Cu privire la primul aspect este de reinut c ntotdeauna se recomand recoltarea a minim 2 probe de snge, ns cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de snge, n momente diferite, pe parcursul a 24 de ore. n anumite cazuri (de ex. n endocardita bacterian subacut), bacteriemia fiind continu, sunt suficiente 2 hemoculturi / 24 ore. Pe de alt parte, n cazul n care presupunem c agentul etiologic poate face parte din flora normal vom recolta minim 3 probe pentru hemocultur. n cele ce urmeaz o s listm cteva din exemplele posibile, n ceea ce privete momentul recoltrii sngelui i numrul de hemoculturi recomandate: endocardit acut recoltm 3 hemoculturi din 3 sedii diferite, pe parcursul a 1-2 ore endocardit subacut recoltm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi i mai sus) la un interval mai mare de 15 minute sepsis recoltm 3 hemoculturi din sedii diferite, pe parcursul a 10 minute (ideal ar fi, pentru toate cazurile menionate, s recoltm sngele cu circa 30 minute nainte de vrful febril, acest moment ar coincide cu cea mai mare concentraie de microorganisme n torentul circulator, dar acest moment este dificil de precizat) febr de origine necunoscut recoltm 2-3 hemoculturi, din sedii diferite, la un interval de timp de 4560 minute etc. n ceea ce privete al doilea aspect, avnd n vedere faptul c de regul n cursul bacteriemiilor / fungemiilor numrul de uniti formatoare de colonii / ml de snge este destul de redus, trebuie s recoltm un volum de snge adecvat (pentru fiecare hemocultur n parte). Astfel, vom recolta circa 20 ml de snge n cazul adulilor i 1-5 ml de snge n cazul nou-nscuilor, sugarilor i copiilor mici (deoarece numrul de UFC / ml poate fi de circa 3 ori mai mare la aceste grupe de vrst). Atunci cnd este necesar realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui set de hemoculturi) este necesar s ne gndim i la urmtoarele aspecte: cel mai adesea hemoculturile trebuie realizate n urgen

sngele, fiind un produs biologic n mod normal steril, vom izola cel mai adesea un singur agent infecios (dar exist i posibilitatea unor asocieri) dintre agenii etiologici cu semnificaie clinic izolai mai frecvent prin hemocultur, n ordine descrescnd a frecvenei putem aminti: Staphylococcus aureus, diferite enterobacterii, Pseudomonas aeruginosa, streptococi hemolitici (inclusiv pneumococul), enterococi, Haemophilus influenzae (tip b), Neisseria meningitidis, germeni anaerobi (Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringens etc), stafilococi coagulazo-negativi, Listeria monocytogenes, Leptospira spp., Brucella spp., Candida spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus spp. etc exist anumite particulariti n ceea ce privete etiologia infeciilor generalizate n funcie de vrsta pacienilor, poarta de intrare posibil, focarul infecios principal, starea din punctul de vedere al aprrii (specifice i nespecifice) a gazdei respective etc n snge exist o serie de factori antimicrobieni a cror aciune trebuie pe ct posibil diminuat (aceasta se realizeaz pe de o parte prin diluarea 1 / 10 a sngelui cultivat n raport cu volumul mediului de cultur dar exist i o serie de substane chimice care pot fi utilizate n acelai scop, spre ex. polianetol sulfonatul de sodiu are att efect anticoagulant ct i de neutralizare a unor factori antimicrobieni) mediile de cultur i condiiile de incubare trebuie ales n aa fel nct s permit dezvoltarea agenilor etiologici probabili asigurarea calitii mediilor de cultur va include att controlul sterilitii fiecrui lot ct i controlul eficienei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referin, de colecie). Pentru recoltarea sngelui trebuie respectate condiiile impuse recoltrii oricrui tip de p.p. Subliniem ns importana respectrii cu strictee a regulilor de prelevare aseptic i respectiv a recoltrii sngelui nainte de administrarea oricrui tratament antimicrobian. Orict de urgent ar fi considerat c trebuie nceput terapia se poate temporiza pn se realizeaz recoltarea sngelui pentru hemocultur, ceea ce n astfel de situaii ar necesita un interval de timp de numai 10-15 minute. Este recomandat ca recoltarea s fie urmat de nsmnarea direct pe mediul de cultur, la patul bolnavului, spre exemplu ntr-un sistem nchis de recoltarea i nsmnare aa cum a fost realizat de Prof. Dr. Matei Bal. Utilizarea sistemelor cu vacuum este relativ recent n ara noastr; n SUA a fost utilizat nc nainte de 1974. Altfel spus, recoltarea ar trebui s fie urmat imediat de nsmnare, fr a mai exista o etap de transport. Dac aceast recomandare nu poate fi urmat am putea folosi un tub care conine 1 ml dintr-o soluie 0,250,50% de polianetol sulfonat de sodiu n care realizm recoltarea sngelui i pe care l transmitem imediat ctre laborator pentru nsmnarea pe medii de cultur. Mediile de cultur sunt medii lichide, mbogite (ex. bulion infuzie de cord-creier pentru aerobi i respectiv bulion Columbia cu cistein pentru anaerobi) condiionate n flacoane corespunztoare cantitii de snge pe care trebuie s o recoltm. Pentru bacteriile cu multiplicare lent este recomandat utilizarea mediului bifazic (mediu solidificat n pant, de ex. geloz-chocolat plus mediul lichid bulion tripticaz din soia). n finalul prezentrii vom discuta i despre sistemele automate pentru hemocultur. n cazul n care recoltarea a fost realizat simultan n dou flacoane pentru hemocultur, unul va fi incubat n aerobioz iar cellalt n anaerobioz. Pentru unele microorganisme (ex. Brucella spp.) este necesar incubarea n atmosfer de 5-10% CO2. Temperatura de incubare este cel mai frecvent 35-37 C. Examinarea flacoanelor de hemocultur se realizeaz de 2 ori / zi n primele 3 zile, apoi zilnic pentru minim 7 zile (n anumite situaii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe sptmni). Examinarea o facem macroscopic urmrind o serie de aspecte care ar putea s semnifice dezvoltarea microbian (tulburarea mediului mai mult sau mai puin uniform, apariia unei pelicule la suprafaa mediului lichid, apariia unui depozit pe stratul de hematii din zona decliv a flaconului, apariia unor bule de gaz, apariia unor colonii pe mediul solid n cazul n care am utilizat mediul bifazic etc). Din punct de vedere microscopic, manipulnd aseptic flacoanele de hemocultur putem realiza frotiuri pe care le colorm Gram. n cazul apariiei unor modificri precum cele descrise mai sus dar i atunci cnd acestea nu apar (treceri oarbe) vom realiza subcultivri pe medii de cultur solide (de ex. geloz chocolat). Prin utilizarea mediului bifazic subcultivarea se realizeaz uor i fr riscul contaminrii, prin simpla nclinarea a flaconului i scldarea pantei cu mediul de cultur solid). Dup obinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a acestuia. n vederea testrii sensibilitii la antibiotice putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultur, dar rezultatele obinute vor fi confirmate prin antibiograma difuzimetric standardizat pornind de la coloniile izolate (cultura pur).

n momentul de fa exist numeroase sisteme automate utilizate pentru hemocultur (BacT / Alert, Isolator, BACTEC, Septi-Chek, Vital etc). Spre exemplu, sistemul BacT / ALERT reprezint un instrument automat pentru detectarea multiplicrii microbiene, capabil s incubeze, s agite i s monitorizeze continuu (pe baz de reflectometrie) aerob i anaerob prelevate de la pacieni suspeci de bacteriemie / fungemie. Instrumentul prezint: - un modul de control care include un ecran ce permite operatorului s intervin (prin atingerea cu degetul) n alegerea opiunilor de ncrcare i descrcare a flacoanelor introduse, - un modul de incubare ce poate prelucra 120 pn la 240 flacoane nsmnate, - posibilitatea realizrii automate a controlului de calitate al celulelor n care sunt introduse flacoanele (nefiind necesar intervenia operatorului). Intervalul optim de funcionare al instrumentului este situat ntre +5o i 45oC. Flacoanele introduse n instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui cititor de cod de bare (codul se afl pe partea lateral a flaconului). Flacoanele i instrumentul sunt produse n conformitate cu standardele internaionale de calitate n vigoare (ISO 9001, FDA i Quality System Regulations). Flacoanele de cultur conin mediu de cultur lichid (bulion), care permit multiplicarea majoritii speciilor bacteriene precum i a fungilor. Fiecare flacon conine un senzor LES (senzor emulsie lichid), ce detecteaz producerea de CO2, ca indicator al multiplicrii microbiene. Exist mai multe tipuri de flacoane, pentru incubare n aerobioz, anaerobioz, pentru aduli sau copii, pentru pacieni la care nu s-au administrat medicamente antimicrobiene anterior recoltrii (varianta strict recomandat) sau chiar i pentru pacieni aflai sub tratament antibiotic. Citirea se efectueaz automat la fiecare 10 minute, rezultnd o medie de 144 citiri / zi, prin reflectometrie cu afiaj pe monitor, semnal luminos sau sonor. n cazul unui rezultat pozitiv, flaconul respectiv este analizat prin metode ale microbiologiei clasice sau moderne n vederea identificrii speciei microbiene i stabilirii sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Interpretarea rezultatelor hemoculturii Avnd n vedere pe de o parte posibilitatea contaminrii unei hemoculturi iar pe de alt parte creterea incidenei hemoculturilor pozitive cu semnificaie clinic n care sunt implicate microorganisme condiionat patogene, care fac parte din flora microbian normal, rezultatele trebuie interpretate cu responsabilitate i n echip. Exist argumente bacteriologice (de ex. izolarea aceluiai microorganism din mai multe flacoane de hemocultur) i clinice care permit medicilor infecioniti n colaborare cu medicii microbiologi s stabileasc etiologia microbian (uneori polimicrobian) a unei infecii generalizate. Fiind vorba de infecii cu pronostic adesea rezervat, laboratorul are datoria s comunice rezultatele pe msur ce acestea sunt obinute (de ex. aspectul microscopic pe frotiul colorat Gram dup tulburarea bulionului de cultur, aspecte microscopice i culturale observate dup dezvoltarea unor colonii, rezultatele antibiogramei nestandardizate etc, sau faptul c dup o sptmn de observaie nu se poate evidenia multiplicarea microbian) pentru ca s poat fi luate cele mai adecvate msuri, n favoarea vindecrii pacientului respectiv.

32. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Klebsiella
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o intens activitate metabolic asupra hidrailor de carbon pe care i hidrolizeaz cu producere de acizi i uneori de gaz. Glucoza este degradat cu producere de gaz. Exist mai multe specii de exemplu Klebsiella pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis i K. oxytoca. Klebsiella pneumoniae este specia principal a genului i include bacili gram negativi, capsulai (capsula poate avea dimensiuni de 2-3 ori mai mari dect diametrul bacteriei). Considerat iniial ca agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai 1-3 % din pneumonii (grave, necrotice i hemoragice, n special la pacieni cu un sistem de aprare deficitar) sunt produse de Klebsiella pneumoniae. Microorganismul, condiionat patogen, poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc. Din ce n ce mai frecvent Klebsiella pneumoniae este izolat n infecii nosocomiale (de spital), vezi i capitolul 23.

Cu toate c nu este cea mai reprezentativ entitate clinic, vom discuta n continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice i de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util n stabilirea etiologiei i tratamentului antibiotic corespunztor. Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urin, snge, puroi etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate avea un aspect mucoid, de culoare rou nchis, n jeleu de coacze. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena bacililor gram negativi, de dimensiuni relativ mari, ncapsulai (nconjurai de o capsul voluminoas). Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i capitolul 52). n coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou n jurul klebsielelor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacia de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formeaz colonii lactozo pozitive, mari, de tip M bombate, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin de confluare. Se poate realiza i inocularea la animale de laborator sensibile (oarecele alb), vezi i capitolul 11. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulai, capsula fiind voluminoas, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai. n mediul de cultur pot pierde capsula. Caractere de cultur: Produc colonii lactozo pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu tendin la confluare. Caractere biochimice: Klebsiella este un microorganism lactozo pozitiv, ceea ce se poate evidenia nc din etapa de izolare pe mediul MacConkey. Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale de tip API. Klebsiella pneumoniae este glucozo pozitiv (cu producere de gaz), lactozo pozitiv, nu produce H2S, imobil, ureaz pozitiv, indol negativ, care se dezvolt folosind citratul ca unic surs de carbon. Produce acetoin, caracter evideniat prin reacia Voges-Proskauer. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare. Exist peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacii se pot practica n laboratoare de referin. Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi capitolul 11). Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre de referin): Testarea sensibilitii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite n Institutul Cantacuzino) Gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice Caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic, cu identificarea plasmidelor implicate n virulen etc). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 14).

33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Proteus
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde i numele genului), foarte mobili, gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, produc fenil-alanin-dezaminaz, sunt nesporulai, necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris. De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv (fac parte din flora microbian intestinal). Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios cu Proteus spp. n mod frecvent se discut despre infeciile tractului urinar (ITU), dar sunt posibile i alte infecii (tegumentare, genitale, cu alte localizri n cursul unei bacteriemii la pacieni cu status imun deficitar sau n spital / infecii nosocomiale). Vom discuta n continuare diagnosticul de laborator al ITU. Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Proteus spp. se pot recolta urin, puroi, diferite exsudate purulente, materii fecale, lichid de vrstur, alimente, snge etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de urin (vezi i capitolul 29). Din punct de vedere macroscopic, urina ar putea fi tulbure, purulent. Transportul urinei trebuie realizat rapid, n maxim 30 minute, iar dac aceast recomandare nu poate fi ndeplinit, p.p. trebuie transportat la rece (+ 4C). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul rezultat dup centrifugarea urinei. Examenul microscopic al urinei este foarte important pentru c este uor de realizat, este ieftin i permite observarea unor elemente care orienteaz diagnosticul. Examinarea microscopic a urinei ar putea conduce la economii importante (de timp, reactivi i materiale, medii de cultur); vezi i capitolul 29. Proteus spp. prezint un mare numr de cili peritrichi care confer mobilitatea caracteristic (exist i tulpini aciliate). Se poate realiza i un frotiu colorat Gram din urina omogenizat. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30 m. Sunt necapsulai i nesporulai. Prezena a cel puin 1 leucocit / cmp microscopic la examinarea cu obiectivul de imersie sugereaz piuria, care ntr-un context clinic sugestiv ajut la definirea ITU. n cazul n care din urina omogenizat prelevm cu ansa calibrat de 0,01 ml urin iar n frotiul rezultat identificm cel puin 1-2 bacterii / cmp (n microscopia optic cu imersie) acest rezultat sugereaz prezena a 105 bacterii (uniti formatoare de colonii) / ml i respectiv infecia tractului urinar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic trebuie realizat n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cresc pe medii simple inclusiv pe medii peptonate lichide cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i de pH. Este necesar realizarea uroculturii cantitative i demonstrarea prezenei a peste 105 bacterii / ml de urin. Pe mediile simple uzuale, pe agar-snge, pe AABTL etc, nu se pot obine colonii izolate, fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi i capitolul 11). Acest aspect sugereaz prezena Proteus spp. n produsul patologic. Fenomenul poate fi inhibat dac se realizeaz nsmnarea p.p. pe medii selectivodifereniale (ex. Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii Proteus spp. produce colonii lactozo negative, de tip S. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu un accentuat polimorfism (bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30 m), necapsulai i nesporulai. Caractere de cultur: Fenomenul de invazie: reprezint un caracter de identificare preliminar pentru Proteus spp., o bacterie foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde in aproape n aproape) pe toat suprafaa mediului

Pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii izolate (adugm la mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); aceste colonii sunt lactozo negative i de tip S Fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii epidemiologice, n cazul n care tulpinile implicate aparin genului Proteus; dac pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri); dac tulpinile nu sunt diferite va avea loc creterea n valuri fr demarcaie cu dezvoltarea unei pnze de cultur continue Fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a unei tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical va conduce (n cazul n care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea superioar a mediului de cultur. Caractere biochimice: Proteus spp. include microorganisme lactozo negative. Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale; Proteus spp. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de gaz), lactozo negativ, produce H2S, mobil, ureaz pozitiv, se poate dezvolta folosind citratul ca unic surs de carbon. Proteus spp. produce fenil-alanin-dezaminaz. Proteus mirabilis este indol negativ i ornitin decarboxilaz pozitiv n timp ce Proteus vulgaris este indol pozitiv i ornitin decarboxilaz negativ. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui (anti-O i anti-H) pentru identificarea tulpinilor de Proteus, prin tehnici de aglutinare (la nivelul laboratoarelor de referin). Alte caractere / teste utilizate n identificare (n centre de referin): Testarea sensibilitii la bacteriofagi Gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul 14).

34. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Yersinia
Genul Yersinia include 11 specii dintre care Yersinia pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica produc infecii umane. Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili gram negativi, care prezint coloraie bipolar. n produsul patologic prezint un pleomorfism accentuat. Nu formeaz spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt aerobi facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi, oxidazo-negativi. Cresc pe medii simple i produc colonii de tip S n 24-48 de ore; ultimele 2 specii sunt mobile la 22-30 C. n continuare vom discuta despre yersiniozele cu poart de intrare digestiv, care pot avea drept ageni etiologici Y. enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Y. enterocolitica reprezint o cauz destul de frecvent a BDA, cel puin din datele prezentate n literatura de specialitate internaional. Poate determina infecii cu caracter invaziv localizate pe ileonul terminal, cu prinderea ganglionilor mezenterici i apariia unor dureri n fosa iliac dreapt ceea ce poate conduce la punerea eronat a diagnosticului de apendicit acut, mai ales la copii. n cazul adulilor s-a dovedit implicarea Y. enterocolitica n declanarea unor artrite reactive sau a eritemului nodos cu dificulti n ceea ce privete diagnosticul diferenial. La pacienii cu variate grade de imunodepresie boala enteric poate fi urmat de manifestri extra-intestinale, uneori n cadrul unei infecii generalizate. Bolile produse de Y. pseudotuberculosis au o inciden mai redus; pot aprea enterite subacute, adenopatie mezenteric etc. Diagnosticul de laborator n yersiniozele cu poart de intrare digestiv este bacteriologic, direct. n cazul manifestrilor extra-intestinale este indicat diagnosticul serologic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul

patologic poate fi reprezentat de materii fecale, ganglioni recoltai intraoperator, snge etc. n continuare vom discuta diagnosticul unei BDA. Se poate folosi mediul de transport Cary-Blair. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel (nu se efectueaz frotiuri din materiile fecale). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu obiectivul 40. Vom evidenia prezena celulelor inflamatorii. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). n vederea izolrii Y. pseudotuberculosis sau Y. enterocolitica se pot utiliza diferite medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul CIN (cefsulodin, irgasan, novobiocin), eventual cu incubare la temperatura camerei (20-30 C). Exist diferite metode de mbogire, de ex. inocularea p.p. n tampon fosfat salin cu incubare la 4 C timp de 1-3 sptmni urmat de treceri pe mediile menionate mai sus. Coloniile suspecte se repic pe mediile multitest clasice sau pe galerii API. 4. Identificarea se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili sau bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-3m / 1-2m, posibil pleomorfi Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, de 1-1,5 mm (2-3 mm dup 48 ore) Pe mediul CIN coloniile sunt semitransparente, cu margini clare i centrul rou Caractere biochimice: se pot investiga folosind mediile multi-test clasice sau galeriile API fermenteaz glucoza fr producere de gaz, nu fermenteaz lactoza, nu produc H2S sunt imobile la 37C i mobile la 22 C, nu produc indol, produc ureaz Caractere antigenice: se utilizeaz seruri specifice anti-Yersinia, prin reacii de aglutinare pe lam Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: teste biochimice suplimentare reacii de aglutinare cu alte seruri imune, pentru tipuri mai puin frecvent ntlnite bacteriocinotipia tehnici ale biologiei moleculare (digestia endonucleazic a ADN-ului cromozomial, electroforeza n cmp pulsatil, ribotipia, PCR etc). 5. Este recomandat realizarea antibiogramei (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice), prin metoda difuzimetric standardizat. Se pot utiliza i sisteme automate, de exemplu trusa automat ATB G 5, cu citire i interpretare dup 18-24 ore de incubare (21 antibiotice), pentru bacili Gram negativi. Diagnosticul serologic Diagnosticul serologic este util n determinarea etiologiei artritelor reactive, eritemului nodos sau n cazul altor manifestri extra-intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii, ating valoarea maxim dup circa 14 zile i persist cteva luni. Se pot practica diferite tehnici, de ex. reacia de aglutinare n tuburi. Se consider c valoarea titrului semnificativ este 1/160. Este recomandat testarea serurilor pereche, n dinamic. Trebuie s fie luat n considerare posibilitatea apariia unor reacii ncruciate, datorit existenei unor antigene asemntoare la microorganisme din genurile Brucella sau Salmonella.

35. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Pseudomonas
Genul Pseudomonas face parte din familia Pseudomonodaceae i include mai multe specii. Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru) reprezint specia cea mai important a genului, relativ frecvent implicat n infecii la persoane cu reactivitate sczut, precum i n infecii nosocomiale

(infecii de spital). Aceti germeni sunt bacili gram-negativi aerobi,oxidazo pozitivi, nesporulai, cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, mobili datorit prezenei unuia sau mai multor flageli (polari). Datorit capacitii de adaptare i supravieuire n diferite medii, precum i datorit factorilor de virulen pe care i deine, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii tegumentare superficiale pn la stri de sepsis cu evoluie fulminant. Prezena piocianicului ar putea fi semnalat de culoarea albastr verzuie a pansamentelor. La persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecii oculare etc). La nivel dermic, procesul infecios poate avea i o evoluie grav, cu apariia de vezicule care se sparg i se refac pe o baz necrotic; procesul poate progresa n profunzime (ecthyma gangrenosum). La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuat i supuse unor manevre medico-chirurgicale invazive (intubaii, cateterizri etc) precum i la persoanele cu arsuri, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecii localizate, dar potenialul diseminrii i apariiei unor complicaii grave (bacteriemie, osteomielit, meningit, endocardit, sepsis) este foarte important. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav sau deosebit de grav. Un fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa produce o infecie pulmonar cronic la pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz). Dintre entitile clinice menionate mai sus, din punct de vedere al diagnosticului de laborator vom discuta infeciile supurative ale tegumentelor i mucoaselor. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). Puroiul trebuie examinat macroscopic, deoarece poate avea un aspect sugestiv (culoare albastr sau galben-verzui fluorescent). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena bacililor gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pseudomonas aeruginosa se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 5-42 C, cu dezvoltare optim la 30-37C. Se prefer utilizarea unor medii de cultur selective. Uneori cultivarea se realizeaz pe agar-snge. Pe mediile solide Pseudomonas aeruginosa formeaz colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). De menionat c pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe agar-snge produce hemoliz. n medii lichide, Pseudomonas aeruginosa tulbur mediul ns n timp duce la apariia unei membrane aderent, cenuie, la suprafaa acestuia. Dup 18-24 de ore, sub membran se poate evidenia prezena pigmentului produs. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai, relativ polimorfi. n culturi mai vechi pot aprea diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspt, ntre lam i lamel. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S care se pigmenteaz n mod specific, nsoindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). Pot aprea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dnd impresia prezenei concomitente a unor bacterii diferite. Coloniile pot prezenta o suprafa iridescent, cu luciu metalic i plaje de autoliz, degajnd o arom ptrunztoare particular. Pentru stimularea sintezei pigmenilor se poate folosi repicare pe medii speciale, King F (stimuleaz producerea de fluorescein) i King P (stimuleaz producerea de piocianin). Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie. Pe mediile cu snge produc hemoliz. Multiplicarea la 42 C poate fi util pentru identificare. Caractere biochimice: Produce diferii pigmeni, dintre care mai importani sunt piocianina (albastru) i pioverdina sau fluoresceina (galben-verzui fluorescent).

Este un germen catalazo pozitiv care degradeaz oxidativ glucoza i nu fermenteaz lactoza (att coloana ct i panta mediului TSI au culoare roie). Se poate realiza testul de oxidare-fermentare a glucozei. Bacilul piocianic este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12). Pentru studii mai aprofundate, n momentul actual anumite laboratoare utilizeaz sisteme comerciale care verific n acelai timp numeroase caractere biochimice permind nu numai ncadrarea n genul Pseudomonas, dar i identificarea precis a speciei (de exemplu Rapid NTF, cu identificarea speciei n 4-48 de ore). Caractere de patogenitate: Se pot studia n anumite situaii (inoculm 4 oareci cu cantiti fixe de germeni cultivai pe geloz nclinat 2 % i urmrim supravieuirea acestora timp de patru zile). Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor: Testarea caracterelor antigenice Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) i respectiv piocinopia se pot utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervate laboratoarelor de referin Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, analiza ADN dup utilizarea de endonucleaze de restricie, PCR). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Pseudomonas aeruginosa reprezint unul dintre microorganismele care pot crea dificulti deosebit de mari n alegerea tratamentului etiologic, datorit rezistenei la foarte multe dintre antibioticele uzuale. Cu toate c anumii autori indic faptul ca bacilul piocianic ar fi sensibil la mezlocilin, ticarcilin, ticarcilin-acid clavulanic, piperacilin, piperacilintazobactam, imipenem, aztreonam, anumite aminoglicozide, fluorochinolone sau cefalosporine de generaia a III-a, considerm c principiul care trebuie reinut este c n orice infecie cu Pseudomonas aeruginosa (atunci cnd s-a dovedit c acest microorganism este agentul etiologic al infeciei) antibiograma este obligatorie. n cazul unor infecii grave antibiograma difuzimetric trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

36. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Vibrio


Genul Vibrio include mai multe specii dintre care 12 sunt potenial patogene pentru om. Vibrionii sunt bacili gram-negativi, drepi sau uor ncurbai, foarte mobili, necapsulai, nesporulai. Specia principal este reprezentat de Vibrio cholerae (vibrionul holeric), aerob facultativ anaerob, oxidazo pozitiv, rezistent la pH alcalin i sruri biliare. Vibrionul holeric produce o enterotoxin i determin holera. n condiii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru om. Doza infectant este de 1081010 microorganisme. Holera nu este o boal invaziv. Germenii nu ajung n torentul circulator ci rmn cantonai la nivelul tractului intestinal; colonizeaz marginea n perie a celulelor epiteliale, se multiplic i elibereaz toxina holeric. Dup o perioad de incubaie de 14 zile apar brusc grea, vrsturi, diaree abundent (20-30 litri / zi) i crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme (ap de orez) conin mucus, celule epiteliale i un mare numr de vibrioni. Exist o pierdere rapid de fluide i electrolii care duce la deshidratare, colaps circulator i anurie. Rata mortalitii n lipsa tratamentului este 25-50%. Diagnosticul de laborator n holer este bacteriologic, direct, trebuie realizat ct mai rapid posibil (urgen din punct de vedere epidemiologic) i include etapele cunoscute. Diagnosticul unui caz grav de holer este uor de realizat, n special n contextul unei epidemii. Cu toate acestea, cazurile uoare sau cazurile izolate sunt relativ dificil de difereniat de alte boli diareice acute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de materii fecale, dar s-ar putea recolta i lichid de vrstur. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale sunt apoase, riziforme (ap de orez), de culoare verzuie, cu miros fetid, conin flocoane de mucus. Transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore. Se poate folosi ca mediu de transport mediul bacteriostatic Cary-Blair. Mediul ap peptonat alcalin (pH 9-9,5) poate fi utilizat att n calitate de mediu de transport ct i de mediu de mbogire. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel (nu se efectueaz frotiuri din produsul patologic). Preparatul se examineaz la microscopul optic cu

obiectivul 40. Esenial este faptul c nu se evideniaz prezena leucocitelor. Vibrionii sunt n numr mare i prezint micri active, de rostogolire sau micri haotice. Suplimentar, p.p. ar putea fi tratat cu Ac specifici; dac mobilitatea este stopat, se confirm diagnosticul. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Abordarea diagnosticului de holer se realizeaz n mod difereniat, respectiv prezumtiv (la nivelul unui laborator periferic) i de certitudine (la nivelul laboratorului de referin). Este recomandat utilizarea att a unui mediu moderat selectiv (ex. Bile Salts Agar / BSA) ct i a unui mediu nalt selectiv (ex. Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose / TCBS). Lund n considerare situaia n care se ridic suspiciunea unei infecii cu V. cholerae se recomand nsmnarea p.p., direct sau dup transportul n mediul Cary Blair, n ap peptonat alcalin (APA). Dup incubare pentru o durat de 6-8 ore la 35-37, facem trecerea pe mediul selectiv (TCBS i / sau BSA) lund 2 anse de la suprafaa APA (n acest interval, la suprafaa APA poate s apar un vl, respectiv cultura de vibrioni). Examenul microscopic al vlului (preparat proaspt, ntre lam i lamel: vibrioni foarte mobili, cu micri de rostogolire sau haotice) precum i utilizarea unor anticorpi specifici (reacie antigen-anticorp) pot grbi diagnosticul. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-3m / 0,5-0,8m Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, galbene, mari, cu diametrul de 2-4 mm (pe TCBS) Pe mediul BSA, V. cholerae produce colonii de tip S rotunde, strlucitoare, transparente ca picturile de rou (spre deosebire de coloniile de E. coli care sunt mate). Caractere biochimice: V. cholerae este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12) Testul uviei de ADN se poate utiliza pentru a diferenia tulpini care sunt oxidazo-pozitive i formeaz colonii cu aspect asemntor (V. cholerae i Aeromonas spp.); n acest scop suspensionm o colonie suspect ntr-o pictur de soluie 0,5% dezoxicolat de sodiu, pe o lam de microscop. n cazul n care este vorba de o colonie de vibrioni, acetia sunt lizai i elibereaz ADN-ul care poate fi tras cu ansa ca o uvi alte teste biochimice, prin metode clasice sau utiliznd galeriile manuale sau automate (ex. API 20E, ID 32E), se efectueaz la nivelul unui laborator de nivel superior sau la nivelul centrului naional de referin; testele biochimice pot diferenia biotipul clasic de biotipul El Tor (se apreciaz c V. cholerae O:139 este un mutant al biotipului El Tor) Caractere antigenice: Se utilizeaz ser anti-holeric O:1 i se practic reacia de aglutinare pe lam. La nivelul centrului de referin se confirm reacia pozitiv i se identific serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima) iar n cazul unei reacii negative se realizeaz o reacie de aglutinare pe lam folosind ser anti-holeric O:139 Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin. Exist sisteme de lizotipare care definesc peste 140 de lizotipuri diferite. Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: testul sensibilitii la agentul vibriostatic cu O/129 (10 g i 50 g) determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. cholerae prin reacia VET-RPLA (latex aglutinare pasiv inversat) tehnici de tip ELISA pentru identificarea unor structuri caracteristice V. cholerae tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, PCR etc). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene.

37. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Haemophilus

Microorganismele din genul Haemophilus sunt cocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, gram negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenioi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezena factorilor de cretere prezeni n snge (de unde i numele genului). Exist mai multe specii, dintre care cele mai cunoscute sunt Haemophilus influenzae i Haemophilus ducreyi; multe dintre tulpinile de H. influenzae sunt capsulate.

Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare i invazivitate. Microorganismul ptrunde pe cale respiratorie. Boala debuteaz ca o rinofaringit acut, probabil n asociere cu o infecie viral la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmat de epiglotit, laringotraheit, otit, sinuzit, mai rar de pneumonie dar i de celulit sau de meningit acut purulent la copiii mici precolari. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie local (se poate nota faptul c Haemophilus influenzae tip b i pneumococul se numr printre agenii etiologici foarte comuni ai otitei medii bacteriene i ai sinuzitelor acute). Dac microorganismul ptrunde n torentul sanguin, pe aceast cale poate infecta meningele. Ocazional infecia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheit obstructiv fulminant care necesit traheotomie sau intubare prompt a copilului respectiv. n vederea discutrii examenului de laborator vom avea n vedere meningita produs de H. influenzae. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Haemophilus influenzae este bacteriologic, direct, incluznd etapele care vor fi prezentate n continuare. n meningita produs de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluie cu sechele i / sau deces), de importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n stabilirea etiologiei. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta secreii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreii din sfera ORL, lichide recoltate prin puncie, snge, LCR etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de LCR (vezi i capitolul 6). Aa cum am mai menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul citologic i biochimic (vezi i capitolul 6). n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C, refrigerarea este contraindicat). H. influenzae ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocobacililor gram-negativi, fini, capsulai, dispui separat sau n grmezi aranjate n aceeai direcie, uneori dispui n lanuri scurte, situai intra sau extraleucocitar. Datorit faptului c aceste microorganisme se coloreaz relativ slab n coloraia Gram ar putea fi necesar colorarea frotiului de rezerv printr-o alt metod sau, recolorarea prelungit cu fucsin. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Haemophilus influenzae este un microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesit pentru iniierea creterii 5-10% CO2. Este necesar pentru incubare o atmosfer umed, la 35-37 C, i o durat de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de cretere precum hemina (factor X) i factorul V care poate fi nlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime. Ambii factori se obin din eritrocite, ns este necesar eliberarea coninutului acestora n mediu (de exemplu prin cldur, sau prin digestie peptic). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Coloniile sunt de tip S sau M i ating un diametru de 0.5-0,8 mm dup 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, avnd aspectul unor picturi de rou pe geloz chocolat. Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii

mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliz. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi, mici (1-1,5 / 0,3 mm), dispui separat sau n grmezi, uneori dispui n lanuri scurte. n medii complexe, la 6-8 ore, predomin formele cocobacilare, care au i capsul. n culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pierderea capsulei (dificulti de diagnostic diferenial microbiologic). Caractere de cultur: Produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0.5-0,8 mm dup 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, avnd pe geloz chocolat aspectul unor picturi de rou. Necesit prezena n mediul de cultur a factorilor de cretere (X i V). Factorul V este sintetizat i de stafilococul auriu, astfel c pe geloz snge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase i de dimensiuni mai mari n apropierea unei linii pe care a fost nsmnat o tulpin hemolitic de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe geloz-snge cu infuzie de inim-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care n primele 24 ore prezint irizaii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliz. Caractere biochimice: Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transform triptofanul n indol). Fermenteaz inconstant diferii carbohidraii. Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi mprit n biotipuri. Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus i Branhamella catarrhalis, n numai 4 ore. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin tehnici imunologice, n funcie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenia prin reacii de umflare a capsulei i de imunofluorescen. Tulpinile capsulate (Ag K) se pot identifica n p.p. (LCR sau urin dup centrifugare) prin contraimunoelectroforez, latex aglutinare sau ELISA. Tulpinile necapsulate se pot identifica i tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE). Alte teste: exist sonde nucleotidice produse comercial pentru identificarea H. influenzae. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este necesar i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. Este recomandat utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza i truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire i interpretare dup 18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire i interpretare dup 4-5 ore incubare). Determinarea CMI i CMB poate fi necesar i se realizeaz prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 14). Identificarea rspunsului imun fa de Haemophilus influenzae Identificarea prezenei de anticorpi fa de H. influenzae ar putea fi util pentru verificarea rspunsului imun n urma vaccinrii. n acest scop au fost utilizate RIA i ELISA.

Haemophilus ducreyi
Haemophilus ducreyi este strict patogen pentru specia uman fiind agentul patogen al unei boli cu transmitere sexual, ancrul moale. n regiunea genital apare ancrul moale (iniial se formeaz o papul sensibil, cu eritem n jur, urmat de apariia unei pustule i apoi a unei eroziuni care ulcereaz), dureros, cu eritem i edem. Pot exista ancre multiple. Ganglionii regionali sunt mrii, dureroi i pot supura. Diagnosticul diferenial se face cu sifilisul, infecia cu virusul Herpes simplex i limfogranulomatoza venerian. Diagnosticul de laborator este n special microbiologic (bacteriologic, direct). 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreii de la nivel genital (raclarea secreiei de sub marginea ancrului; puroi din abces). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n perechi sau lanuri paralele (n iruri), frecvent n asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.

3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cultivarea H. ducreyi este dificil. Necesit pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta dac produsul patologic este recoltat de la baza ancrului i cultivat pe geloz chocolat plus vancomicin 3 mg/ml la 33C n atmosfer de 5-10% CO2. 4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, gram negativi, dispui n perechi sau lanuri paralele. Se pot colora bipolar. Caractere de cultur: Produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, dup 3-7 zile de la cultivare. Pe geloz-snge pot produce hemoliz. Caractere biochimice: Necesit prezena n mediul de cultur a factorului de cretere (X). Haemophilus ducreyi este catalazo negativ. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este necesar i poate realiza prin metode difuzimetrice. Diagnosticul de laborator imunologic ancrul moale este singura afeciune produs de microorganisme din genul Haemophilus n care diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenei anticorpilor este util i n scop epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM care apar fa de H. ducreyi. Este nc n discuie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultur de bacili Ducreyi.

38. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Bordetella
Microorganismele din genul Bordetella sunt cocobacili polimorfi, imobili, nesporulai, capsulai, gram negativi, asemntori celor din genul Haemophilus, strict aerobi. Specia tip este reprezentat de B. pertussis agentul etiologic al tusei convulsive; alte exemple sunt reprezentate de Bordetella parapertussis i Bordetella bronchiseptica. Sunt germeni pretenioi; pentru a se dezvolta au nevoie de medii de cultur mbogite.

Bordetella pertussis
Bordetella pertussis este patogen numai pentru om. Transmiterea se realizeaz n special pe cale aerian (picturi Pflgge) ntr-un acces de tuse. Contagiozitatea este maxim n primul stadiu de boal i la nceputul stadiului al doilea (de tuse paroxistic). Microorganismul ader, se multiplic rapid, interfer cu activitatea mucociliar normal, apar primele manifestri clinice care se agraveaz treptat. Substanele toxice elaborate (i n special toxina pertussis / TP) au urmtoarele aciuni: TP conduce la hipoglicemie, sensibilizare la histamin, reducerea activitii macrofagelor, diminuarea rspunsului imun umoral (sinteza de anticorpi); adenilatciclaza pertussis diminu activitatea fagocitar a macrofagelor i leucocitelor; toxina letal produce necroze locale, citotoxina traheal are efect citotoxic pe celulele ciliate etc. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Bordetella pertussis este bacteriologic, direct; diagnosticul serologic este tardiv i ar putea fi util pentru un diagnosticul diferenial (post-factum) sau din punct de vedere epidemiologic. Diagnosticul etiologic este foarte util n primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este foarte contagios iar evoluia bolii poate fi influenat pozitiv prin administrarea de antibiotice); identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice i respectiv la contaci ar permite aplicarea unor msuri preventive. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n infeciile produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreii de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian); vom realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se las pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza adsorbia B. pertussis (bumbacul inhib dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea secreiilor traheobronice. Este descris i metoda plcilor tuite (se expune o plac Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adugat antibiotic, deschis, la aproximativ 20 cm n faa gurii bolnavului n timpul accesului de tuse). Este recomandat prelucrarea imediat a p.p., dac este posibil la patul bolnavului (microorganismul fiind foarte puin rezistent n mediul extern). Nu exist o metod perfect pentru recoltarea p.p. atunci cnd se

suspicioneaz o infecie cu B. pertussis (toate metodele au diferite limite att din punctul de vedere al sensibilitii sau specificitii ct i din punct de vedere practic). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Examinm frotiurile la microscopul optic cu imersie i notm prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocobacililor gram-negativi, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte. Datorit faptului c aceste microorganisme se coloreaz relativ slab n coloraia Gram ar putea fi necesar colorarea frotiului de rezerv printr-o alt metod (imunofluorescen direct) sau recolorarea prelungit cu fucsin sau safranin. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Bordetella pertussis este un microorganism foarte pretenios care nu se poate dezvolta pe medii de cultur obinuite; este inhibat de acizi grai, peroxizi organici etc. Izolarea B. pertussis n culturi este dificil, dar eforturile sunt necesare pentru a putea fi evaluat variaia genetic (de faz) i respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice i chimioterapice. Bordetella pertussis necesit pentru cultivare nicotinamid sau acid nicotinic i o temperatur optim de 3537C, cu incubare timp de 3-7 zile, n aerobioz i atmosfer umed. Cel mai cunoscut mediu de cultur este mediul Bordet-Gengou care conine agar, macerat de cartof, snge, glicerol i devine selectiv prin adugare de penicilin / meticilin sau cefalexin. Albuminele plasmatice din acest mediu leag acizii grai i permit dezvoltarea microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat de timpul scurt n care poate fi utilizat (1-7 zile). Actualmente se recomand utilizarea unui mediu folosit iniial ca mediu de transport, care include geloz nutritiv, crbune activat i este suplimentat cu 10% snge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe parcursul a 12 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid. n vederea izolrii primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu crbune activat, ns prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta i pe geloz-snge sau chiar i pe geloz simpl. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace i vor aprea modificri morfologice (pleomorfism), alterri structurale, virulena fiind sczut. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 m / 0,5-2 m, imobili, dispui separat sau n perechi, rareori n lanuri scurte, cu tendina de a deveni pleomorfi n urma subcultivrilor (pot aprea i forme filamentoase). Utiliznd coloraii speciale, n coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenia structurile capsulare. Dac frotiul se coloreaz cu albastru de toluidin, se pun n eviden granule metacromatice situate bipolar. Imunofluorescena direct este util i pentru identificarea microorganismului dup cultivare. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S sau M. Dup 3-7 zile de incubare la 37C pe mediul BordetGengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uor transparente, cu strlucire metalic, foarte aderente, nconjurate de un halou de hemoliz (faza I). n lumina transmis oblic coloniile seamn cu picturile de mercur. Pe mediul cu crbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaa perlat. Caractere biochimice: Bordetella pertussis este hemolitic, oxidazo pozitiv, ureazo negativ. Se pot utiliza truse comerciale manuale care identific specii de bacili gram negativi (ex. API 20 E, API 20 NE), fiind de regul necesare i teste adiionale de identificare. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin reacia de aglutinare pe lam. Alte teste de identificare utilizate n laboratoare de referin: Se poate utiliza amplificarea genetic folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bun specificitate i sensibilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) poate fi necesar n scopul supravegherii apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i se realizeaz prin metode difuzimetrice. Diagnosticul serologic este tardiv. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reaciile de aglutinare, hemaglutinare i hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Anticorpii apar din a 2-a sau a 3-a sptmn

de boal. Diagnosticul serologic ar putea fi util pentru un diagnosticul diferenial (retrospectiv) sau din punct de vedere epidemiologic.

39. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Brucella
Genul Brucella cuprinde 7 specii, cu numeroase biotipuri, care infecteaz animalele i se pot transmite de cele mai multe ori accidental omului de ex. Brucella melitensis (capre, oi), Brucella abortus (vaci), Brucella suis (porci), Brucella canis (cini). Sunt cocobacili gram negativi (de multe ori colorai bipolar), cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, imobili, prezentnd eventual o structur capsular, nesporulai, localizai n mod caracteristic intracelular, aerobi facultativ anaerobi, catalazo pozitivi, relativ inactivi metabolic, care se dezvolt relativ dificil pe mediile de cultur intrnd n categoria bacteriilor pretenioase cu necesiti nutritive complexe, sunt bacterii fastidioase (mai ales atunci cnd se realizeaz cultivarea iniial, din p.p.). Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau pentru om, capabile s determine infecii acute, cronice sau infecii inaparente. Cronicizarea depinde de capacitatea de multiplicare n celule fagocitare. Formele cele mai grave apar ca urmare a infeciei cu Brucella melitensis, urmat de infecia cu Brucella suis, Brucella abortus i respectiv Brucella canis. Transmiterea la om poate fi realizat pe cale digestiv, cutanat i mai rar pe cale respiratorie. De la nivelul porii de intrare, microorganismele ajung la nivelul ganglionilor limfatici regionali, depesc aceast barier i pe calea ductului toracic ajung n snge iar pe cale sangvin n organele cu sistem reticulohistiocitar i la nivel osos. Incubaia este n medie de 2-3 sptmni, ns uneori pot trece cteva luni ntre momentul infectrii i apariia fenomenelor clinice. Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziie, cefalee, artralgii, febr moderat, transpiraii abundente. n perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut clinic. Febra ondulant (care crete n cursul dup amiezii i scade n timpul nopii) nsoit de frisoane are o valoare istoric. n realitate, curba febril are un aspect variabil. Transpiraiile abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezint alte elemente care pot fi comune n cursul bolii. S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare n bruceloz. Durata bolii poate fi de 3-4 sptmni, dar cel mai frecvent depete 3 luni, ajungnd n formele cronice la ani de zile. n formele cronice diagnosticul se stabilete foarte dificil. Diagnosticul brucelozei n principiu, n realizarea diagnosticului se pornete de la aspecte clinice i epidemiologice, ns diagnosticul de laborator este esenial, reprezentnd unica metod cert pentru un diagnostic pozitiv. Diagnosticul de laborator n bruceloz poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologic include urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge, dar s-ar putea recolta i prin puncie ganglionar, puncie medular (rata de izolare crete), puncie hepatic sau splenic, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urin, bil, lapte, materiale necroptice etc n funcie de simptomatologie i stadiul bolii. n continuare vom discuta situaia n care se realizeaz o hemocultur prin metode clasice sau n sisteme de cultivare rapide, de tipul BactAlert, Bactec sau Septi-Chek (vezi i capitolul 31). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu aduce de regul informaii utile diagnosticului, n special dac este vorba de snge. Se poate folosi tehnica imunofluorescent care uneori duce la rezultate pozitive. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Toate speciile au cerine nutritive complexe necesitnd pentru dezvoltare medii mbogite cu substane nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoz, sruri, vitamine, ser, snge etc). Se recomand efectuarea hemoculturilor n mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura se incubeaz n atmosfer de 5-10% CO2, la 37C pentru o perioad de minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmrite pn la 4 sptmni. n cazul mediului bifazic, vom nsmna panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fr a deschide flaconul. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,6 m / 0,6-1,5 m, dispui izolat sau n perechi, lanuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi necesar o prelungire a timpului de recolorare cu fucsin, altfel sunt palid colorai. Caractere de cultur: Pe mediile mbogite corespunztoare nutritiv, pot produce dup 2-3 zile colonii de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se mrete astfel nct la 1 sptmn de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi identificate (n special dup incubare prelungit) colonii de tip R sau M Examinate folosind o surs de lumin la 45, coloniile apar transparente, galben-deschis, asemntor picturilor de miere n timp ce n lumina reflectat prezint o transparen cenuiu-albstruie Caractere biochimice: Brucella spp. dup repicare pe un mediu neselectiv prezint un metabolism oxidativ Microorganismele sunt catalazo pozitive, n timp ce testarea reaciilor oxidazei, ureazei i producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este posibil i utilizarea galeriilor API (ex. API 20E) Testm necesitatea n CO2, pentru izolare Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum i sensibilitatea la diferii colorani inclui de ex. n medii de cultur (ex. tionin sau fucsin bazic) Caractere antigenice: Utilizm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacii de aglutinare pe lam (exist reacii ncruciate); n cazul unei reacii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referin se pot realiza reacii de aglutinare pe lam cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R n cazul coloniilor de tip R) Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin; spre exemplu fagul Tbilisi lizeaz tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizeaz tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile n form R Alte teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: tehnici ale biologiei moleculare (exist sonde nucleotidice specifice pentru diferite biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 i 3 aparinnd B. melitensis; se ncearc punerea la punct a PCR, pentru diagnosticul brucelozei). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se realizeaz prin metoda difuzimetric standardizat, i este util att n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene ct i pentru stabilirea tratamentului corespunztor n cazul unei maladii infecioase n general dificil de tratat. Diagnosticul serologic Este de multe ori necesar, innd cont de dificultile ntlnite n cursul diagnosticului bacteriologic. Utilizm antigene cunoscute i ncercm s determinm prezena anticorpilor specifici n sngele pacientului, valoarea titrului anticorpilor i respectiv evoluia acestui titru n dinamic. Trebuie s menionm c anticorpii de tip IgM cresc n infecia acut (n cteva sptmni) dar persist i n infecia cronic sau chiar i dup tratamentul antibiotic realizat corespunztor (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar dup circa 3 sptmni de la debutul brucelozei, ating o valoare maxim la 6-8 sptmni i persist n cazul unei infecii cronice. n special din punct de vedere istoric discutm i putem practica n cadrul lucrrilor practice, aglutinarea pe lam (Huddleson, reacie calitativ, de screening). Cea mai cunoscut i utilizat tehnic de diagnostic serologic este reacia de aglutinare n tuburi (Wright) prin care putem determina att titrul anticorpilor de tip IgM ct i cel al anticorpilor de tip IgG. Avnd n vedere faptul c n bruceloz apar i anticorpi blocani (Ac de tip IgA care blocheaz activitatea aglutinant a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, exist dificulti i n ceea ce privete interpretarea rezultatelor obinute n diagnosticul serologic. Pentru a simplifica, considerm c un titru 1/160 este sugestiv, n timp ce o cretere de 4 ori n dinamic a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloz. Exist o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare: diluarea suplimentar a serurilor de cercetat testul de blocare (adugm tuburilor n care reacia Wright este negativ cte 1 pictur de ser imun antiBrucella; dac reacia rmne negativ i nici n acest caz nu apare aglutinarea, concluzionm c n serul de cercetat exist anticorpi blocani)

testul Coombs utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM i IgG care apar fa de proteinele membranei externe etc. Diagnosticul imunobiologic Datorit faptului c n infecia cu Brucella spp. este stimulat n special rspunsul imun mediat celular, diferii autori menioneaz utilizarea intradermoreaciei cu brucelin n investigarea unui caz suspect de bruceloz. IDR cu brucelin poate identifica existena unei stri de hipersensibilitate de tip IV, fa de antigenul brucelos.

40. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Corynebacterium

diphtheriae
Genul Corynebacterium include mai multe specii de bacili gram-pozitivi (se pot colora neuniform), uor incurbai, mciucai, aezai n V, L, n mici grmezi neregulate sau n palisade, nesporulai, necapsulai, imobili, aerobi i facultativ anaerobi, catalaz pozitivi. Studii recente au delimitat grupul Corynebacterium diphtheriae n care se regsesc speciile C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis i C. ulcerans (ultimele dou fiind ureaz pozitive). Cultiv mai bine pe medii mbogite (de ex. cu adaos de ser sau snge). Au capacitatea (n cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxin. C. diphtheriae include patru biotipuri: gravis, mitis, intermedius i belfanti. Dup ptrunderea care are loc cel mai frecvent la nivelul tractului respirator (faringian, nazal), urmeaz multiplicarea i inducerea unei inflamaii locale. Tulpinile lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+) sintetizeaz toxina care poate afecta orice tip de celul, dar cele mai importante efecte sunt la nivel cardiac (miocardit), nervos (demielinizare), renal (necroz tubular), suprarenalian, muscular i hepatic. n cteva zile de la debutul infeciei, toxina induce apariia unei structuri compuse din fibrin, leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii moarte i bacterii, respectiv falsa membran de culoare gri-maronie (diphthera - membran). Aceast structur se poate forma local (amigdalian, faringian, nazal etc) sau se poate extinde, acoperind faringele, obstrucionnd arborele traheobronic (crup laringian, asfixie mecanic). La adpostul falsei membrane, bacilii i continu multiplicarea i sinteza de toxin care difuzeaz pe cale sanguin i conduce la apariia unor tulburri la distan (tulburri de ritm cardiac, miocardit, dificulti vizuale, de vorbire, de nghiire etc). Cu ct diagnosticul este mai tardiv, cu att rata mortalitii prin difterie crete. Datorit faptului c n ultimii 15 ani nu au mai fost nregistrate cazuri de boal n ara noastr, exist riscul nerecunoaterii acestei patologii de ctre medicii care nu au vzut niciodat un caz de difterie. Riscul apariiei cazurilor exist iar sistemul de sntate trebuie s fie n permanen pregtit pentru a reaciona prompt, din toate punctele de vedere (clinic, terapeutic, diagnostic, epidemiologic etc). Diagnosticul de laborator n difterie este bacteriologic, direct i trebuie realizat urgent; exist anumite particulariti care trebuie menionate. n cazul suspicionrii unui caz de difterie diagnosticul i instituirea tratamentului se impun cu maxim urgen. Se pornete de la un diagnostic prezumtiv bazat pe urmtoarele semne: a). amigdalit i / sau faringit cu dureri de intensitate medie plus asocierea unei false membrane; b). adenopatie i edem cervical, mai ales dac se asociaz cu faringit membranoas i semne de toxicitate sistemic; c). cornaj i stridor (respiraii zgomotoase i uiertoare), tiraj (depresiunea prilor moi suprasternale, supraclaviculare, intercostale, epigastrice n momentul efortului respirator); d). paralizia palatului moale; e). secreie nazal serosanguinolent asociat cu prezena unor false membrane la nivelul mucoasei. Se adaug din punct de vedere bacteriologic examinarea frotiurilor realizate din produsul patologic colorate Gram i cu albastru de metilen. Tratamentul specific (administrare de antitoxin) se instituie fr ntrziere, fr a atepta finalizarea diagnosticului bacteriologic. Diagnosticul direct (bacteriologic), cu realizarea etapelor corespunztoare, este util pentru confirmare i n scop epidemiologic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6). Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul faringelui i de secreii nazale. n cazul prezenei falsei membrane se recomand detaarea cu precauie a acesteia i recoltarea secreiei aflate sub aceast structur. n vederea prelevrii p.p. vom utiliza minim patru tampoane

diferite, trei pentru recoltarea secreiilor faringiene i al patrulea pentru recoltarea secreiilor nazale. Primul tampon va fi utilizat pentru realizarea frotiurilor, al doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultur solide, selective i neselective (ex. geloz snge, Loeffler i medii cu telurit de potasiu, precum mediul Tinsdale), n timp ce al treilea i al patrulea tampon vor fi introduse ntr-un mediu de mbogire (OST, ou-sertelurit). Pentru fiecare cultivare n parte exist un anumit algoritm. Spre exemplu, mediul Loeffler va fi incubat pentru 4-8 ore la 35-37 C dup care se va realiza un prim frotiu, colorat Gram. Dac rezultatul este negativ tubul se reincubeaz timp de 18 ore iar dac este pozitiv se face o repicare pe mediul Tinsdale i se ncepe identificarea pe baza caracterelor biochimice. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic poate fi decisiv (n context clinic i / sau epidemiologic sugestiv) pentru nceperea tratamentului specific. Realizm minim dou frotiuri, unul colorat Gram iar cellalt colorat cu albastru de metilen. Prezena unor semne clinice sugestive la care se adaug vizualizarea pe frotiul colorat Gram a leucocitelor i a unor bacili gram-pozitivi (la limit), uor incurbai, mciucai, aezai n V, L sau sub form de litere chinezeti n timp ce la coloraia cu albastru de metilen (modificat) am putea remarca prezena granulelor metacromatice putea conduce la administrarea de antitoxin difteric; diagnosticul de certitudine urmeaz a fi stabilit ulterior. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Aspectul cel mai caracteristic se nregistreaz pe mediile cu telurit de potasiu (ex. Gundel-Tietz, Hoyle etc), dup 24-48 de ore. Biotipul gravis formeaz colonii opace de tip R, plate, cu margini crenelate, cu tendina de a se desface n fragmente atunci cnd sunt prelevate cu ansa, relativ dificil de emulsionat, de culoare cenuie sau neagr, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm. Biotipul intermedius formeaz colonii opace de tip S, plate cu centrul mamelonat, de culoare cenuie sau neagr cu margine transparent, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoate prezena unor colonii de dimensiuni diferite). Biotipul mitis formeaz colonii de tip S care pot trece n forma R prin mbtrnire, cu suprafa lucioas, culoare cenuie sau neagr, translucide, diametrul coloniei fiind de 0,5-1 mm. Biotipul belfanti formeaz colonii opace de tip S, de culoare cenuie sau neagr, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoate prezena unor colonii de dimensiuni diferite). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Se examineaz cel mai bine atunci cnd frotiul este realizat din colonii aprute pe mediul Loeffler (aspecte tipice apar i n cazul frotiurilor din p.p.). Sunt bacili gram-pozitivi(la limit), polimorfi, cu dimensiuni de 1-8m / 0,5-0,8m, uor incurbai, mciucai, aezai n V, L sau sub form de litere chinezeti. Exist recomandarea realizarea unor frotiuri colorate imunofluorescent, ceea ce ar permite realizarea unui diagnostic mai rapid. Caractere de cultur: n funcie de biotip, produc colonii de tip Ssau R, aa cum am menionat mai sus. Pe mediile de tipul gelozei-snge aspectul morfologic este aproape similar, culoarea fiind alb sau gri perlat. Biotipurile intermedius, mitis i belfanti produc o zon mic de b-hemoliz. Pe mediul Tinsdale coloniile sunt negre (datorit producerii de H2S) cu halo gri-maro. Anumii autori menioneaz c frotiurile realizate pornind de la coloniile dezvoltate pe acest mediu permit evidenierea granulelor metacromatice. Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile apar n 18 ore fiind albe, lucioase, bombate, semicremoase, asemntoare picturilor de spermanet. Caractere biochimice: n scopul diferenierii C. diphtheriae de alte specii ale genului se practic testul pirazinamidazei (negativ) i cistinazei (pozitiv). Testul catalazei este pozitiv. Diferenierea biotipurilor i confirmarea diagnosticului de specie se realizeaz prin testul catalazei (pozitiv), ureazei (negativ), reducerea nitrailor i fermentarea unor zaharuri. Se pot utiliza sisteme comerciale, precum galeriile API CORYNE care se bazeaz pe combinarea testelor biochimice cu testele enzimatice (20 teste) Caractere antigenice: Se utilizeaz ser antitoxin difteric pentru identificarea producerii toxinei prin testul ELEK (vezi i capitolul 16). Testul poate fi interpretat la 24-48 ore; este un test simplu i precis. Caractere de patogenitate: Testarea toxigenezei in vivo, pe cobai, la nivelul centrului de referin; cultura este inoculat subcutanat la un lot de cobai neprotejai i un lot de cobai protejai (cu antitoxin difteric). n cazul n care cultura testat

include microorganisme toxigen, cobaii neprotejai mor n 24-48 ore cu evidenierea semnelor de intoxicaie difteric. Testarea producerii de toxin pe celule Vero sau prin alte metode (Western-blot, ELISA, PCR pentru subuniti ale genei tox+ etc) Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza n studii epidemiologice sau n scop de cercetare, fiind rezervat laboratoarelor de referin. Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: Teste biochimice suplimentare tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, profilul de restricie al unei regiuni caracteristice, dup amplificare genic etc). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) se poate realiza prin metoda difuzimetric standardizat, n special n scopul supravegherii apariiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. De regul, tulpinile de C. diphtheriae sunt sensibile la antibioticele folosite uzual n tratament (penicilin, eritromicin).

41. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Listeria
Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai important specie este Listeria monocytogenes, care poate produce infecii variate, umane i animale. Mai rar au fost izolate tulpini din speciile L. ivanovii i sau L. seeligeri. Sunt bacili fini gram pozitivi, aerobi facultativ anaerobi, mobili la 25 C, care se dezvolt preferenial la 30 C dar se poate multiplica i la temperatura frigiderului (mbogire la rece).

Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes este patogen prin multiplicare i invazivitate (prezint o structur asemntoare proteinei M streptococice, produce diferite substane cu rol n invazivitate, inclusiv lecitinaza, fosfolipaza C i listeriolizina O, cu efect hemolitic). Infecteaz probabil iniial celulele intestinale, supravieuiete intracelular i se multiplic intramacrofagic. Listerioza este o zoonoz. Infecia uman apare accidental i foarte frecvent evolueaz inaparent. Dintre manifestrile clinice grave amintim listerioza perinatal, probabil o infecie intrauterin (avort spontan, natere prematur, sepsis cu deces nainte sau relativ repede dup momentul naterii etc). La aduli pot aprea meningoencefalit, bacteriemie urmat de metastaze septice (mai ales la imunodeprimai) i mai rar, diferite infecii focalizate. Dintre toate tipurile antigenice, 90% dintre tulpinile izolate la om aparin tipurilor Ia, Ib i IVb. Putem meniona c tipul IVb a fost mai frecvent asociat cu consumul de brnz fcut din lapte nepasteurizat. Asocierea unor epidemii de listerioz cu consumul de alimente contaminate sugereaz calea gastrointestinal drept cea mai important cale de ptrundere. Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu Listeria monocytogenes este bacteriologic, direct. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). Diagnosticul de laborator se bazeaz pe izolarea i identificarea microorganismului, n special din snge i / sau din LCR. n infeciile produse de Listeria monocytogenes se mai pot recolta lichid amniotic, placent, esut fetal, dar i prelevate patologice contaminate cu ali germeni precum materii fecale, secreii genitale, alimente, probe din mediul extern etc. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Listeria monocytogenes se prezint ca bacili sau cocobacili gram pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 mm / 0,5 - 0,8 mm, dispui izolat, n perechi sau n lanuri scurte, intra sau extracelular. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). De menionat c se poate multiplica la temperaturi ce variaz ntre 2-45C (temperatura optim fiind de 20-30C); n culturile iniiale, temperatura sczut favorizeaz multiplicarea L. monocytogenes (mbogire la rece); tolereaz o atmosfer de 5 - 10% CO2 precum i concentraii de peste 5% NaCl.

n cazul p.p. necontaminate (snge, LCR etc) vom utiliza spre ex. agar glucozat sau triptozat, suplimentat cu 5% snge de berbec. Atunci cnd dorim s realizm izolarea pornind de la p.p. contaminate (alimente, materii fecale etc) este necesar s folosim medii de cultur selective spre exemplu nsmnm iniial o parte p.p. n 9 pri de bulion pepton-tripton cu extract de carne i drojdie, suplimentat cu cu acid nalidixic i acriflavin iar dup 2-7 (sau chiar 30) zile de incubare la temperatura frigiderului, incubm nc 18-24 de ore la 35-37 C. Ulterior realizm o repicare pe medii selective (ex. agar, acriflavin, polimixin B, clorur de litiu, ceftazidim etc). Exist i alte strategii folosite pentru izolarea L. monocytogenes. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili fini sau cocobacili gram pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 mm / 0,5 - 0,8 mm, dispui separat sau grupai n palisade, n perechi sau n form de litere (asemntor corynebacteriilor). n culturile tinere predomin formele cocobacilare n timp ce n culturile vechi se caracterizeaz prin pleomorfism i pot aprea forme filamentoase. n preparatul proaspt se poate demonstra mobilitatea, n special dac s-a meninut cultura la 18-25 C (sau la temperatura camerei). Caractere de cultur: Cultura degaj un miros de lapte acidulat. L. monocytogenes formeaz colonii de tip S. Dup 1-2 zile de incubare la 35-37 C pe agar glucozat, coloniile ating un diametru de 1-1,5 mm (mai mici pe agarul triptozat); pot s aib aspect de picturi de rou. Pe agar-snge, coloniile sunt nconjurate de o zon discret de b-hemoliz. Dac nsmnm prin nepare o coloan de mediu semisolid, datorit mobilitii va aprea creterea n umbrel, caracteristic pentru L. monocytogenes. Multiplicarea la temperaturi extreme (245 C) poate fi util pentru identificare. Caractere biochimice: L. monocytogenes produce o zon discret de b-hemoliz. Utilizarea unor tulpini standard de Staphylococcus aureus (pentru L. monocytogenes i L. seeligeri) sau de Rhodococcus equi (pentru L. ivanovii) n cadrul testului CAMP este util pentru identificare. L. monocytogenes este catalazo-pozitiv i fermenteaz o serie de carbohidrai (fr producere de gaz). Se pot utiliza truse comerciale manuale (ex. API Listeria sau API 20 Strep) i respectiv truse automate (ex. rapid ID 32 Strep) care permit identificarea L. monocytogenes n 4-24 de ore, n funcie de trusa utilizat. Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru identificarea tulpinilor de Listeria monocytogenes, prin tehnici imunologice, n funcie de Ag somatice sau flagelare. Serotiparea este util n scop epidemiologic. Exist 13 serotipuri (serovaruri) majoritatea tulpinilor izolate la om aparinnd tipurilor Ia, Ib i IVb. Sensibilitatea la bacteriofagi: Lizotiparea este foarte util n scop epidemiologic; exist tulpini care nu pot fi testate prin aceast metod. Caractere de patogenitate: n general, tulpinile de Listeria monocytogenes izolate de la pacieni sunt virulente. n laboratoare de referin pot fi efectuate ns i teste de patogenitate. Dintre acestea o variant este reprezentat de cultivarea n bulion timp de 24 de ore, urmat de inocularea unei picturi de cultur n sacul conjunctival la iepure sau cobai; tulpina virulent va determina apariia unei conjunctivite purulente n 1-3 zile. Alte modaliti de studiere a virulenei tulpinilor izolate sunt reprezentate de inoculri la oareci imunocompromii (inoculare intraperitoneal) sau de inocularea membranei chorioalantoidian a oului embrionat de gin. Alte teste rezervate centrelor de referin: n scop epidemiologic sau n cadrul unor studii taxonomice se pot utiliza Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), analiza macrorestriciei ADN, RFLP sau RAPD-PCR. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) poate fi necesar i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul infeciilor grave se vor determina CMI i CMB (vezi capitolul 14).

42. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Mycobacterium
Elementele minime necesare stabilirii apartenenei la genul Mycobacterium sunt reprezentate de: 1. rezistena la decolorarea cu acid-alcool (bacili acid-alcool rezisteni, BAAR); 2. prezena unor acizi mycolici care conin 6090 atomi de carbon i care pot fi clivai prin piroliz n acizi grai cu 22 i respectiv 26 atomi de carbon; 3. un coninut procentual de G+C de 61-71%. n afar de M. tuberculosis i M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii considerate anterior saprofite dar care fiind condiionat patogene, sunt relativ frecvent implicate n patologia gazdelor

imunocompromise (mycobacterii ne-tuberculoase, atipice etc). Genul mycobacterium include peste 80 de specii diferite, multe dintre acestea fiind larg rspndite n natur. n continuare vom discuta aspectele legate de diagnosticul de laborator (microbiologic) n infeciile produse de M. tuberculosis, varianta hominis. Tuberculoza poate avea localizri variate, dar cea mai frecvent ntlnit este tuberculoza pulmonar. Din punct de vedere epidemiologic, pacienii cu tuberculoz pulmonar (care elimin prin sput BAAR) reprezint sursa de infecie cea mai important. Diagnosticul, tratamentul corect i complet al acestor pacieni este esenial. Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, paraclinice (ex. radiologice), alte elemente de laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea i identificarea M. tuberculosis. Diagnosticul de laborator microbiologic este n mod esenial bacteriologic, direct, la care se pot aduga datele obinute n cadrul diagnosticului imunobiologic i serologic. Diagnosticul de laborator bacteriologic include etapele cunoscute. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie inclusiv protecia personalului medical implicat etc). n funcie de forma clinic de tuberculoz se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, lichid de spltur bronic, LCR, urin, lichide recoltate prin puncie articular, peritoneal, pleural, pericardic, probe obinute prin biopsie, puroi etc. Uneori este necesar concentrarea p.p. prin centrifugare. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6). Sputa trebuie decontaminat (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) i neutralizat n vederea baciloscopiei i cultivrii. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu AM, Gram i respectiv Ziehl Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivelul tractului respirator (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena BAAR. n esuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoi apar ca bastonae subiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 , acid-alcool rezisteni (apar roii pe fond albastru, toate celulele i bacteriile non-AAR sunt colorate n albastru, la coloraia Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulai, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent. Examenul microscopic rmne o etap esenial n diagnosticul unei infecii mycobacteriene att n momentul examinrii unui produs patologic (examenul microscopic direct) ct i n momentul cnd prin microscopie se confirm (sau infirm) morfologia i tinctorialitatea microorganismelor dintr-o colonie izolat. Rezultatele examenului microscopic (coloraie fluorescent i Ziehl-Neelsen) trebuie cuantificate prin numrul de BAAR n raport cu numrul de cmpuri examinate (10-30 n cazul coloraiei fluorescente, 100-300 n cazul coloraiei Z-N). Spre exemplu, prezena a 1-9 bacili / 10 cmpuri n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR / 100 de cmpuri n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 1+ n timp ce prezena a 10-90 bacili / 1 cmp n microscopia cu fluorescen i respectiv a 1-9 BAAR / 1 cmp n microscopia optic permite notificarea n buletinul de analiz a unui rezultat cu 3+ (maxim fiind 4+, atunci cnd se identific spre ex. peste 9 BAAR / 1 cmp la coloraia Z-N). Notaia semicantitativ este obligatorie deoarece exprim unitar densitatea BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosit, permind comparaii ntre laboratoare diferite, ntre bolnavi diferii i pentru acelai bolnav n momente evolutive diferite. Dac rezultatul final este nedeterminat trebuie s facem nc un frotiu din acelai produs patologic i s indicm recoltarea unui nou produs patologic. Baciloscopia negativ nu exclude diagnosticul de tuberculoz. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine o cultur pur, care se va identifica. n momentul actual, la nivel mondial, exist o mare varietate de medii de cultur. Mycobacteriile se dezvolt n general pe medii complexe. Mediile de cultur utilizate n diagnosticarea unei infecii mycobacteriene se mpart n 3 grupe principale: medii de cultur lichide (ex. bulion 7H9), medii de cultur pe baz de ou (ex. mediul Lwenstein) i medii de cultur bazate pe compoziia n agar (tip Middlebrook). Pentru izolarea primar a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menionat. Mediile pe baz de ou au ca ingrediente: ou sau glbenu de ou, fin de cartof, sruri, asparagin i glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substane reprezint elementele de baz ale mediului clasic Lwenstein-Jensen la care se adaug verde malachit pentru selectivitate (n acelai scop se pot aduga antibiotice). Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum i a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizat de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a mediului Lwenstein-Jensen. Atunci cnd ncercm s realizm izolarea primar, este necesar ca mediile de cultur s se incubeze ntr-o atmosfer de 8-10% CO2. Culturile se incubeaz de rutin la o temperatur de 35-37C. Mediile de cultur solide se vor examina zilnic n prima sptmn dup inoculare iar apoi sptmnal pn la mplinirea a 6-8-12 sptmni deoarece mycobacteriile tuberculoase au o rat de diviziune de 12-27 ore.

Se pot utiliza i sisteme de cultivare rapid (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creterii mycobacteriene n 4-25 de zile. n Romnia aceste sisteme au nceput s fie utilizate n unele centre ncepnd cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilitii la medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandrilor programului naional. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: n frotiul realizat din colonia izolat se evideniaz BAAR Caractere de cultur: M. tuberculosis i respectiv M.. bovis-BCG formeaz colonii R, rugoase, neregulate, conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate. Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S. Caractere biochimice: Identificarea speciei se realizeaz pe baza a cteva teste fenotipice clasice i anume: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor, testul catalazei la 22 C i la 68 C, hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) i susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS). Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (n timp ce pentru M. bovis numai al 3-lea test este pozitiv). Testul catalazei la 68 C i respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitiv pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se dezvolt pe mediul cu TCH n timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de ctre aceast substan). Testul este util n special n cazul tulpinilor de M. bovis care prezint reacii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste. Caractere antigenice: Se pot examina n centre de referin. Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai. Inocularea p.p. la cobai este uneori practicat n vederea diagnosticului. Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (la nivelul unor centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (ex. studiul cromatografic al acizilor grai din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, sonde nucelotidice, PCR). Exist i posibilitatea testrii sensibilitii fa de anumii mycobacteriofagi etc. 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) poate fi necesar i se realizeaz conform recomandrilor Programului Naional de control al tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc. Diagnosticul imunobiologic are la baz un mecanism de rspuns imun de tip celular. Se utilizeaz intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolul 21. Diagnosticul serologic se bazeaz pe rspunsul imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi evideniai prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate c metodologia nu este perfect standardizat, subliniem faptul c n diagnosticul tuberculozei nici un element nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importan ntr-un anumit context clinic, paraclinic i epidemiologic. *** Dei nu am prezentat elementele necesare identificrii mycobacteriilor netuberculoase dorim s menionm c, n cazul utilizrii unui numr redus de teste, exist riscul de a pune un diagnostic eronat i respectiv de a considera o tulpin drept Mycobacterium tuberculosis, cu toate c a fost izolat o mycobacterie atipic.

43. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus

anthracis

Genul Bacillus aparine familiei Bacillaceae i cuprinde un numr foarte mare de specii, dintre care n patologie sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus i B. subtilis. Germenii din specia B. anthracis se prezint sub form de bacili gram pozitivi, de dimensiuni mari, imobili, sporulai, cu sau fr capsul. Sunt aerobi facultativ anaerobi. Manifestrile clinice ale infeciilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate de antraxul cutanat (forma cel mai frecvent ntlnit la om), antraxul pulmonar i respectiv antraxul gastrointestinal; n toate formele poate avea loc diseminarea infeciei. De menionat c B. anthracis infecteaz n special animalele i poate produce ocazional infecii umane. n ultima perioad se discut frecvent despre implicarea acestui microorganism n bioterorism. Diagnosticul de laborator n antrax este bacteriologic, direct i trebuie realizat ct mai rapid; sunt urmate etapele cunoscute dar exist anumite particulariti.

Diagnosticul unui caz de antrax pornete de la datele clinice i epidemiologice. Examenul bacteriologic va confirma diagnosticul. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreii de la nivelul leziunilor cutanate dar se pot recolta i aspirat din edemul local i / sau din ganglionii regionali, sput, materii fecale, alimente incriminate, lichid cefalorahidian, probe necroptice, snge (pentru hemoculturi) etc, n funcie de forma clinic. n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi o serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective, tratarea termic sau tratarea cu alcool a p.p. n cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent utilizat este polimixina B. n cazul celei de a treia variante, utilizm etanol steril de 95. Vom suspensiona p.p. n proporie egal n etanol pentru o durat de 30-60 minute, la temperatura camerei, dup care vom preleva circa 0.25 ml din suspensie pe care o cultivm pe mediul de cultur ales. n cazul n care estimm c transportul ctre laborator va dura mai mult de 60 minute, asigurm o temperatur de transport de 2-8 C. Trebuie s menionm faptul c atunci cnd presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate msuri de biosecuritate speciale. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care se coloreaz cu albastru de metilen i Gram; cel puin un frotiu se va pstra de rezerv. Se mai pot utiliza albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraia imunofluorescent, pentru evidenierea capsulei bacteriene. n p.p. se pot remarca structuri tisulare, leucocite i bacili gram pozitivi, cu capetele tiate drept, de dimensiuni mari (11,5mm / 3-10mm), capsulai, dispui izolat, n perechi sau lanuri scurte, inclui ntr-o capsul comun. n coloraia cu albastru de metilen policrom bacilii apar albatri iar capsula apare ca un halo de culoare roz. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Putem utiliza geloz nutritiv sau geloz snge, n condiii de aerobioz, la o temperatur de 37 C (dei se poate multiplica ntre 15 i 42 C). n cazul n care este de presupus c p.p. este contaminat se pot folosi metodele menionate mai sus. Pentru izolarea B. anthracis se poate folosi un mediu cu polimixin B, lizozim, EDTA i acetat de thaliu, mediul PLET. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiuni de 1-1,5m / 3-8m, formnd lanuri lungi; ncepe procesul de sporogenez (sporul este oval, situat central, mai mic dect grosimea bacilului respectiv). Caractere de cultur: Pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de 2-5 mm; marginile sunt neregulate, cu prelungiri laterale filamentoase care au permis asemnarea acestora cu capul de meduz sau coama de leu; pe mediile cu snge, poate aprea o zon discret de b-hemoliz dei n mod caracteristic B. anthracis este nonhemolitic. Pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei polipeptidice (vezi mai jos). Pe mediul PLET produc colonii mici, de tip S. Caractere biochimice: Bacillus anthracis este catalazo pozitiv, produce lecitinaz i este sensibil la penicilin (fa de majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilin); exist i alte teste biochimice care sunt efectuate la nivelul centrului de referin Un alt caracter care trebuie investigat se refer la motilitate, absent n cazul B. anthracis i prezent la majoritatea speciilor din genul Bacillus. n acest scop putem nsmna o coloan de geloz moale, cu incubare la 37 C pentru 1-4 zile i urmrim dezvoltarea culturii fa de traseul pe care am nsmnat asemntor cu interpretarea mediului MIU n cazul enterobacteriilor Caractere de patogenitate: Testarea producerii capsulei in vitro, caracteristic tulpinilor virulente de B. anthracis se poate realiza prin cultivare (repicare) pe un mediu care conine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37 C i n prezena unui procent crescut de CO2; dup 24 de ore, tulpinile capsulate vor produce colonii mucoide iar prezena capsulei se va demonstra microscopic (ex. coloraia McFadyean sau Giemsa). Testarea patogenitii la oarecele alb (vezi capitolul 11) Testarea sensibilitii la bacteriofagul g Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: diferite alte teste biochimice

examene microscopice (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenei globulelor lipidice de b-hidroxibutirat) alte teste pentru demonstrarea sensibilitii la penicilin (ex. testul colierului de perle) tehnici ale biologiei moleculare (depistarea prezenei plasmidelor pX01 i pX02). 5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice) nu este necesar. Bacillus anthracis este sensibil la penicilin, eritromicin, tetraciclin, cloramfenicol, ciprofloxacin etc. n ceea ce privete diagnosticul imunobiologic, n Romnia a fost pus la punct tehnica IDR cu antraxin (Blteanu-Toma). Trebuie menionat faptul c este de o deosebit importan punerea diagnosticului de antrax la animale (n special ierbivore), principalul rezervor pentru Bacillus anthracis. n acest scop, se pot utilizat tehnici ale diagnosticului bacteriologic (evidenierea microscopic a bacililor n leziuni, obinerea de culturi, identificarea antigenelor prin reacii de precipitare sau tehnici de tip ELISA; pentru reacia Ascoli, vezi capitolul 16) sau ale diagnosticului imunologic (intradermoreacia cu antraxin).

44. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Clostridium
Genul Clostridium include peste 100 de specii care se gsesc n intestinul animalelor i se pot elimina n mediul exterior prin materiile fecale, sporulnd. Sunt bacili gram pozitivi (uneori la limit), de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili peritrichi (cu excepia C. perfringens). Multe dintre specii sintetizeaz exotoxine. n cele ce urmeaz vom discuta despre speciile care produc tetanos, botulism i gangrena gazoas. Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare i toxinogenez (produce o exotoxin neurotrop). Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibai de ctre glicin i acidul g aminobutiric. Toxina blocheaz eliberarea acestor mediatori ceea ce determin excitarea neuronilor motori spinali, cu apariia de spasme severe i dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastic). Contiena este pstrat. Toxina poate ajunge la nivelul SNC i retrograd prin propagare pe cale axonal de la poarta de intrare sau pe cale sangvin. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminat, apoi ale muchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) i facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipit un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%. Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conin toxina produs de Clostridium botulinum, fiind o toxiinfecie alimentar de tip toxic (toxin preformat n aliment). Toxina botulinic este cea mai puternic otrav cunoscut; doza letal pentru om este de circa 1-2 mg. Dup ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge n circulaie, iar pe aceast cale la nivelul plcilor neuromotorii unde mpiedic eliberarea de acetilcolin (determin paralizie flasc). Paralizia ncepe la extremitatea cefalic (ex. paralizia muchilor globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie i se manifest prin diplopie) i evolueaz descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorit paraliziei muchilor respiratori). Botulismul infantil (posibil i la aduli) este urmare a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerai. Mortalitatea n botulismul neo-natal este foarte mare. Botulismul plgilor poate aprea la persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau prezint leziuni contaminate cu pmnt. Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre urmtoarele specii: C. perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum i C. sporogenes. Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). n condiii de anaerobioz sporii germineaz, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i apare gaz. Distensia tisular, obstrucia mecanic a structurilor vasculare n conjuncie cu sinteza de toxine favorizeaz diseminarea infeciei. Enzimele (toxinele) produse contribuie i la alterarea grav a strii generale. Gangrena gazoas este caracterizat prin edeme dure, crepitante (datorit prezenei de gaz) i necroz. Necroza tisular se extinde, multiplicarea bacterian se amplific, apare anemie hemolitic, toxemie i evoluie (n 20-80% din cazuri) ctre deces. nainte de a discuta cteva aspecte legate de diagnosticul infeciilor produse de clostridii dorim s menionm faptul c exist i alte microorganisme anaerobe de interes medical (bacili gram pozitivi nesporulai, bacili gram negativi, coci gram pozitivi i gram negativi, spirochete). Diagnosticul de laborator al infeciilor

produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor i de regul poate fi definitivat numai n laboratoare specializate; sunt necesare dotri speciale i un personal medical cu experien. n continuare vom prezenta cteva aspecte privind diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganismele din genul Clostridium. 1. Etapa de recoltare i transport a p.p. este esenial; trebuie meninute condiiile de anaerobioz. 2. Din punct de vedere macroscopic am putea meniona mirosul putrid al p.p., prezena unor fragmente de esut necrotic, a unor secreii de culoare nchis, existena de snge i puroi n plag etc. Examenul microscopic are rol orientativ (pentru majoritatea laboratoarelor este i ultima activitate care poate fi realizat atunci cnd agentul etiologic este un microorganism anaerob). C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 mm / 2-18 mm i poate prezenta un spor rotund localizat terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20 mm i poate prezenta un spor oval localizat central sau subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 1,5-19 mm i poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate permite n acelai timp un control al calitii p.p. (evideniind prezena celulelor inflamatorii i a celulelor lezate) i ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene. 3. Pentru cultivarea p.p. vom pregti cel puin 3 medii de cultur: bulion VF (viande-foi) cu acid tioglicolic i albastru de metilen (care testeaz digestia crnii de ctre clostridii), mediul geloz - snge suplimentat cu neomicin 100 mg / ml incubat n anaerobioz i mediul geloz - snge incubat n condiii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plgi care sugereaz gangrena gazoas am putea folosi i mediul Nagler (cu glbenu de ou) care permite evaluarea producerii de lecitinaz i lipaz. Pentru a distruge formele vegetative i a reine sporii putem proceda aa cum am artat n capitolul 10 (tehnici de izolare speciale). Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz 24-48 de ore la 35-37 C. nainte de a trece la etapa de identificare trebuie s ncercm s dovedim c am izolat germeni anaerobi i s verificm puritatea culturii care urmeaz a fi identificat. n condiiile n care p.p. a fost nsmnat pe 2 plci cu geloz - snge incubate aerob i anaerob, este util s realizm examenul microscopic al coloniilor. Dac apar colonii asemntoare n ambele plci iar din punct de vedere microscopic prezint caractere similare, este vorba de microorganisme facultativ anaerobe. Dac pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat n anaerobioz apar i alte tipuri morfologice, nseamn c exist microorganisme strict anaerobe. Pentru a verifica puritatea culturii obinute, nainte de a trece la etapa de identificare, repicm coloniile suspecte n bulion VF regenerat (prelevm colonia prin decupare cu geloza subiacent). Incubm timp de 24 ore la 35-37 C. n cazul n care exist multiplicare bacterian procedm la a. realizarea unui frotiu colorat Gram (i comparm rezultatele cu cele obinute anterior); b. repicarea pe o pant de geloz nutritiv cu incubare n aerobioz (nu trebuie s apar cultur bacterian n cazul n care bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dac rezultatele sunt corecte, trecem la identificarea microorganismelor. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere, aa cum am discutat i n capitolele precedente. Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiunile menionate mai sus. n culturi nvechite bacteriile pot fi gram negative i se pot detecta endosporii (deformeaz bacilii). n cazul n care la examenul microscopic nu evideniem spori vom repica pe mediul Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36 C i apoi la temperatura camerei. Urmrim sporularea pe un nou frotiu colorat Gram. Putem evalua fenomenul de sporogenez i prin metode de cultur (vezi mai jos). Caractere de cultur: Speciile mobile (marea majoritate) formeaz la suprafaa mediului colonii de tip S, cu margini ondulate, neregulate, cu tendin de invadare a mediului (datorit mobilitii). n jurul coloniilor remarcm prezena b-hemolizei. Dac a avut loc inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos. Clostridium perfringens (specia imobil) formeaz colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe dar care pot avea i aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc hemoliz dubl (zona intern, de b-hemoliz, este mai ngust n timp ce zona extern, de a-hemoliz este mai larg); exist i tulpini care produc zone foarte largi de hemoliz precum i tulpini slab hemolitice. Aa cum am menionat, prin cultivare putem s evalum fenomenul de sporogenez (cunoscut fiind c sporii rezist timp de 10 minute la temperatura de 80 C). Dac pe frotiul din cultur colorat Gram nu evideniem spori, pregtim 2 tuburi cu bulion pepton, glucoz, amidon i extract de levur. Repicm coloniile suspecte n cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi n supunem unei temperaturi de 80 C, 10 minute. Incubm cele 2 tuburi la 35-37 C pn apare multiplicarea bacterian. Dac bacteriile se dezvolt n ambele tuburi, am dovedit existena sporilor. Dac dup o incubare de cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacterian n tubul supus la temperatur, nu exist spori.

Caractere biochimice: Exist numeroase caractere biochimice care pot fi utile n diferenierea speciilor de clostridii. n identificarea microorganismelor din acest gen utilizm iniial testarea producerii de lecitinaz i lipaz. Pe mediul Nagler inoculm tulpina n striu (se pot testa concomitent mai multe tulpini). Pentru aprecierea producerii de lecitinaz incubarea dureaz 48 de ore. n cazul n care testul este pozitiv (precipitat opac n mediul din jurul striului de cultur) poate fi vorba de o tulpin de C. perfringens. Testul este negativ pentru C. tetani sau pentru C. botulinum. Pentru tulpinile lecitinaz pozitive, la nivelul centrului de referin se mai pot testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia crnii etc. Pentru aprecierea producerii de lipaz incubarea dureaz 1 sptmn. n cazul n care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultur i n mediul adiacent) poate fi vorba de o tulpin de C. botulinum. Testul este negativ pentru C. tetani i C. perfringens. Testul plcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referin. Folosim o plac cu mediul Nagler. Pe jumtate din plac etalm anti-toxin (lecitinaz). Dup uscarea plcii inoculm n striuri o tulpin martor pozitiv, o tulpin martor negativ i cteva tulpini de testat. Incubm timp de 18-24 de ore la 3537 C n anaerobioz. C. perfringens (ca i tulpina M+) d un rezultat pozitiv doar pe jumtatea de plac fr anti-toxin. Creterea n lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag alveolar n laptele turnesolat). Clostridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la colistin. Ali autori propun testarea sensibilitii la metronidazol. Caractere antigenice: pot fi testate n centrele de referin. Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referin Demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la oareci (un animal este protejat cu 1-2 ore nainte de test prin injectare subcutanat a 1000 de UAI de anti-toxin tetanic; injectm la ambele animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat supravieuiete, iar cellalt va prezenta semne tipice de tetanos) Testarea (la om) a prezenei anti-toxinei tetanice n titruri protective prin ELISA sau hemaglutinare (T 0,01 UAI / ml). Demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii fecale, ser sau n medii de cultur. Spre ex. prelevm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacterian, centrifugm iar supernatantul l mprim n 2 tuburi. Unul dintre tuburi l supunem temperaturii de 100 C (toxina botulinic este termosensibil). Inoculm intraperitoneal p.p. la dou loturi de oareci. Dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinic. Urmrim oarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariia semnelor de botulism (reducerea mobilitii, respiraii ample, contracii ale muchilor abdominali urmate de convulsii i deces). Prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare (protejm spre ex. un animal de laborator cu anti-toxin de tip A i un alt animal de laborator cu anti-toxin de tip B dup care i injectm cu p.p. respectiv; dac animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C. botulinum de tip A) Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. n vena cozii i curbe standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip) Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnic de tip ELISA (poate detecta 10 pg) Testul inhibiiei sialidazei, pozitiv n 2-6 ore pentru C. perfringens etc. 5. Antibiograma de regul nu se realizeaz. Clostridiile sunt sensibile la penicilin, cefalosporine, vancomicin, tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mult mai complex; n unele dintre bolile clostridiene nu a fost eficacitatea tratamentului cu antibiotice sau chimioterapice nu a fost dovedit.

45. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Treponema
Ordinul Spirochaetales cuprinde dou familii importante n patologia uman, familia Spirochaetaceae (n care se descriu genurile Treponema i Borrelia) i familia Leptospiraceae cu un singur gen, Leptospira. Genul Treponema include specia Treponema pallidum cu patru subspecii care produc infecii la om. Treponema pallidum subspecia pallidum este agentul etiologic al sifilisului.

Sifilisul poate fi congenital sau dobndit. n cazul sifilisului dobndit exist mai multe stadii, respectiv stadiul primar, stadiul secundar, stadiul latent (recent, tardiv sau de durat nelimitat) i stadiul teriar. n stadiul teriar, n funcie de organele sau sistemele afectate putem discuta despre afectarea nervoas (neurosifilis), cardiovascular etc. n mod particular se discut sifilisul congenital, sifilisul la gravide i sifilisul aprut la pacienii infectai cu HIV. Infecia natural cu T. pallidum este limitat la gazda uman. Infecia se transmite de obicei prin contact sexual, iar leziunile de primoinfecie sunt cantonate la nivelul tegumentelor i mucoaselor din zona genital. Totui n 10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la nivel rectal, perianal sau oral. Spirochetele se multiplic local la poarta de intrare, iar unele trec de bariera ganglionilor limfatici i ajung n circulaie. n 2-10 sptmni de la infecie, la locul inoculrii se dezvolt o papul care se deprim pentru a forma o ulceraie cu baza curat, indurat (ancru dur) la nivelul creia se gsete un lichid clar, ns foarte bogat n treponeme. Aceast leziune primar se vindec ntotdeauna spontan, dar dup circa 2-10 sptmni apar leziunile secundare, care constau n leziuni eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe corp i papule umede, palide (condiloame) n regiunile anogenital, axilar i n cavitatea bucal. Pot aprea de asemenea meningita, corioretinita, hepatita, nefrita sau periostita sifilitic. Leziunile secundare se remit i ele spontan. Att leziunile primare, ct i cele secundare sunt bogate n spirochete i foarte contagioase. n cele ce urmeaz vom aborda diagnosticul de laborator n cazul sifilisului primar sau secundar. Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice, dar trebuie confirmat prin metode de laborator. Diagnosticul de laborator n sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. Diagnosticul bacteriologic Treponema pallidum nu poate fi cultivat pe medii artificiale, n laborator. Din acest motiv, diagnosticul bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasic a schemei diagnosticului direct. Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat att n sifilisul primar ct i n sifilisul secundar. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei, avnd o serie de particulariti. Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare n funcie de localizare (penian, cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni umede bogate n treponeme n cazul sifilisului congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali. n cazul ancrului, vom recolta p.p. dup ndeprtarea cu grij (fr a produce sngerare) a crustelor care acoper leziunea. Ar putea fi necesar s comprimm baza leziunii pentru a stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice. Prelevm lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie aplicnd pur i simplu lama de sticl pe leziunea umed. Acoperim cu o lamel i eliminm prin uoar apsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie s fie realizat foarte rapid, de preferat n maxim 20 de minute astfel nct se recomand ca recoltarea s fie realizat ntr-un spaiu corespunztor, n imediata vecintate a laboratorului. Este o etap esenial. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul microscopului cu fond ntunecat, fie prin imunofluorescen direct (exist i alte tehnici, care nu vor fi discutate n acest manual). Pentru examenul microscopic pe fond ntunecat, pregtim 2 lame (preferabil 3) pentru fiecare leziune pe care dorim s o examinm. Preparatele nu trebuie s conin hematii, leucocite, fragmente de esut sau bule de aer. n timp ce examinm primul preparat microscopic vom introduce celelalte 2 preparate ntr-o cutie Petri n care exist puin vat sau hrtie de filtru umezit, pentru a pstra atmosfera umed i a preveni uscarea. Preparatul microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute n cazul unui rezultat aparent negativ), iniial cu obiectivul uscat, ulterior, dup vizualizarea unor microorganisme care par s aparin genului Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul s aib experien n acest tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subiri i lungi (0.25-0.3mm / 6-14 mm), spiralate, prezentnd 8-14 spire (regulate, strnse, adnci i rigide), mobile (spirele nu se deformeaz), deplasarea n cmpul microscopic nu este foarte rapid dar seamn cu o micare de nurubare (exist i microorganisme care sunt imobile dar pstreaz micrile de translaie, rotaie lent, flexie uoar de la un cap la cellalt sau flexie median cu revenire ca un resort), luminoase pe fondul negru al cmpului microscopic. n cazul unui rezultat negativ putem repeta recoltarea i examinarea, n anumite situaii se poate recomanda nceperea tratamentului, iar evoluia va fi monitorizat clinic i serologic (rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv, atunci cnd poate fi exclus prezena unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar nainte ca anticorpii s poat fi detectai serologic.

Imunofluorescena direct permite diferenierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcai fluorescent (reacie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de faptul c nu este necesar ca treponemele s fie mobile. n plus, pentru c reacia este specific, se poate utiliza cu succes i n cazul unor leziuni foarte probabil contaminate cu treponeme saprofite (ex. orale, rectale). n cazul n care examinarea nu poate fi realizat imediat secreia poate fi recoltat ntr-un tub capilar care se nchide la flacr i poate fi transportat la +4 C; alternativ putem realiza frotiul, ateptm s se usuce n vecintatea becului de gaz i putem s l trimitem ctre laborator. Frotiul poate fi colorat: cu Ac anti-T. pallidum obinui de la pacieni cu sifilis sau de la iepuri infectai cu T. pallidum; serul este tratat pentru creterea specificitii cu tulpina Reiter (o tulpin nepatogen de T. phagadenis) iar Ac sunt apoi marcai cu izotiocianat de fluorescein sau cu Ac monoclonali anti-T. pallidum subspecia pallidum marcai fluorescent. Subliniem nc odat importana examenului clinic urmat de recoltarea, transportul i examinarea microscopic a p.p. n laboratoarele de referin ar mai putea fi utilizate i alte metode n scop diagnostic (mai rar) sau pentru cercetare. Inocularea p.p. la animale de laborator reprezint cea mai sensibil metod pentru detectarea T. pallidum. Pentru meninerea n laborator a unor treponeme viabile sau pentru determinarea infectivitii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei etc) ns cel mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat) cu orice tip de p.p. cu condiia ca ntre momentul recoltrii i inoculare s nu treac mai mult de 60 minute. n caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatur de cel puin -78 C (ex. n azot lichid) i meninut astfel pn n momentul inoculrii. Testul infectivitii la iepure (RIT) rmne metoda standard; cu ajutorul RIT se apreciaz sensibilitatea i specificitatea oricrei alte metode care este propus pentru diagnosticul sifilisului. n centrele de referin au mai fost utilizate i tehnici ale biologiei moleculare (sondele nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostic atunci cnd p.p. este reprezentat de lichidul amniotic. Treponema pallidum i pstreaz sensibilitatea la penicilin, medicament care rmne de elecie pentru tratamentul sifilisului. Exist i o serie de alternative, dar dorim s subliniem c n vederea tratamentului acestei maladii trebuie respectate recomandrile fcute de ctre comisia de specialitate a ministerului sntii, pentru fiecare form de sifilis n parte. Diagnosticul serologic Diagnosticul serologic se realizeaz folosind antigene nontreponemice i antigene treponemice. Testele nontreponemice (nespecifice) i treponemice (specifice) sunt complementare; nu se exclud. Testele nontreponemice sunt utilizate n screening, diagnostic i monitorizarea pacienilor n cursul tratamentului. n vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza i testele treponemice n corelaie cu cele nontreponemice (nici unul dintre cele dou tipuri nu pot acoperi din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai frecvent utilizm VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua categorie). De obicei utilizm serul provenit de la pacientul suspect, dar n anumite situaii testul este realizat folosind plasm sau LCR. A. Reacii serologice care utilizeaz antigene nontreponemice Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite esuturi. Cardiolipina este un difosfatidil-glicerol. Pentru creterea sensibilitii, cardiolipina este cuplat cu colesterol i lecitin. Anticorpii anti - cardiolipin au fost numii reagine. Sunt depistai n serul pacienilor la 2-3 sptmni i n LCR la 4-8 sptmni de la debutul infeciei, n cazurile netratate. Reacia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizat o lung perioad de timp, ncepnd cu 1906. Datorit faptului c RFC este o metod laborioas i n special datorit apariiei unor alte tehnici, RBW este discutat n prezent din punct de vedere istoric. Tehnica actual standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de floculare. Testele de floculare se bazeaz pe faptul c particulele antigenice rmn dispersate n serul normal, dar formeaz grunji vizibili atunci cnd se combin cu reaginele. Testele se preteaz la automatizare i la folosirea pentru screening datorit costului redus. O variant economic i elegant este microreacia VDRL care se practic n plci cu godeuri. Ag tip VDRL se prepar conform recomandrilor productorului. Pregtirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarific prin centrifugare), inactivarea timp de 30 minute la 56 C i o nou centrifugare (n cazul apariiei unor particule n suspensie). Nu

vor fi testate serurile infectate sau hemolizate. n cazul n care trec mai mult de 4 ore din momentul inactivrii, serul va fi inactivat din nou timp de 10 minute la 56 C. Temperatura din camera de lucru trebuie s fie ntre 23-29 C. Testul se efectueaz pe ser nediluat (pentru monitorizarea evoluiei sub tratament se pot face diluii binare). Se pot testa mai multe seruri concomitent i este necesar o notare clar a godeurilor, pentru fiecare godeu n parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscut, martor pentru Ag). n fiecare godeu punem cte 0,05 ml ser (n godeul pentru martor Ag punem soluie salin fiziologic). Dup agitarea flaconului cu suspensia antigenic, utiliznd o sering cu ac calibrat depunem cte o pictur (1/60 ml) n fiecare godeu. Acoperim placa i o aezm pe un agitator care poate fi reglat la 180 turaii pe minut, pe o durat de 4 minute. Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe, ncepnd cu martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) i continund cu serurile de testat. Rezultatul este negativ dac lichidul nu prezint flocoane i este asemntor martorului negativ i martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mici ntr-un lichid uor turbid n timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetm rezultatele slab pozitive sau dificil de interpretat. n cazul n care suspicionm existena fenomenului de prozon (inhibiia total sau parial a floculrii prin exces de Ac), vom repeta testarea se va repeta pe diluii de ser. Rezultatul negativ nu elimin diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla n perioada de incubaie sau poate fi cazul unui sifilis latent (evideniabil prin TPHA). n cazul unui pacient suspect pentru sifilis primar, repetm testul dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni. Vom lua n considerare un rezultat pozitiv n corelaie cu rezultatul obinut la testul treponemic, rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice i epidemiologice. Un rezultat pozitiv n condiiile n care toate celelalte date sunt negative este de obicei un rezultat fals pozitiv. Pot aprea rezultate fals pozitive la persoane cu hepatit viral acut, pneumonii virale, rujeol, malarie, mononucleoz infecioas, alte infecii virale, la persoane care au fost recent vaccinate, precum i la persoane cu boli ale esutului colagen, persoane care se drogheaz, la persoanele n vrst etc. Reaciile fals pozitive pot aprea i pe parcursul sarcinii. Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util n urmtoarele situaii: scderea de 4 ori a titrului n sifilisul recent, tratat, semnific de regul eficacitatea tratamentului; creterea de 4 ori a titrului sugereaz o infecie activ n evoluie, o reinfecie sau ineficacitatea tratamentului. Alte teste de floculare utilizate n practic Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar mai multe cercuri de 18 mm. Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenic tip VDRL modificat (pentru a elimina etapa de inactivare prin cldur). Reactivul conine i particule de crbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat n cercul de pe card. Daca Ac anti-T. pallidum sunt prezeni, se combin cu particulele lipidice din Ag i produc aglutinarea lor. Particulele de crbune coaglutineaz cu Ac i duc la apariia unor granule negre pe fondul alb al cardului. n absena Ac rezult un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ i cantitativ (diluii de ser). Testul RST (Reagin Screen Test) Testul USR (Unheated Serum Reagin) Testul TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test) A fost pus la punct i o tehnic de tip ELISA cu acest tip de antigene. Modul de interpretare al testelor nontreponemice depinde i de populaia care este testat B. Reacii serologice care utilizeaz antigene treponemice Au fost realizate i tehnici serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din T. Reiter (specifice de grup) de tipul RFC i CIE. De utilitate practic sunt reaciile serologice care utilizeaz antigene treponemice extrase din tulpina Nichols de T. pallidum, cu o mare specificitate. Pentru o lung perioad de timp, tehnica standard a fost testul imobilizrii treponemelor (TPI). Tehnica a fost pus la punct n anul 1949. Serul de cercetat era diluat i amestecat cu complement i treponeme vii, mobile, obinute din ancrul testicular de la iepure. n prezena Ac specifici, treponemele erau imobilizate, n timp ce n lipsa acestora, mobilitatea era pstrat (examinarea se fcea cu microscopul pe fond ntunecat). Testele de imunofluorescen indirect (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA) au nceput s fie utilizate n 1957, serul de cercetat fiind diluat 1/5. Datorit rezultatelor fals pozitive, ulterior s-a trecut la diluarea 1/200 a serului (FTA-200). Din 1962 a nceput s fie utilizat tehnica pe care o avem la dispoziie i astzi, FTA-Abs. Pornind de la tulpina Reiter s-a obinut prin ultrasonicare un extract antigenic, pentru a

ndeprta Ac care nu sunt specifici pentru T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR de la pacieni sunt diluate 1/5 cu un extract care conine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene i comensale. Astfel sunt nlturai Ac nespecifici. Exist lame pe care a fost fixat tulpina Nichols de T. pallidum. Probele de ser i/sau LCR absorbite i martorii corespunztori se depun pe spoturile de pe lam. Dac n ser/LCR exist Ac specifici, acetia se vor lega de treponemele fixate pe lam formnd complexe antigen-anticorp. Dup ndeprtarea materialului nelegat prin splri repetate, Ac legai se detecteaz prin incubare cu un conjugat fluorescent anti Ig umane. Dup ndeprtarea prin splare a conjugatului nelegat de complexele antigenanticorp, lamele se examineaz la microscopul cu fluorescen (UV). n cazul n care serul de cercetat este pozitiv, treponemele de pe lam apar fluorescente (galben verzui). Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la punct n urm cu 30 de ani. n prezena unor Ac fa de Ag adsorbite pe membrana lor, hematiile aglutineaz n reele caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic este extras din tulpina Nichols i adsorbit pe suprafaa hematiilor de oaie sau pasre fixate (hematii sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fr Ag treponemice (nesensibilizate). n cazul n care n serul de cercetat sunt prezeni Ac anti-T. pallidum, hematiile sensibilizate aglutineaz; hematiile nesensibilizate nu aglutineaz i se depun sub forma unui buton pe fundul godeului. Pentru creterea specificitii, majoritatea truselor comerciale includ n diluent un extract de treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat calitativ sau semi-cantitativ (diluii ale serului de cercetat). Exist metode automate, utilizate pentru testarea sngelui donat. Tehnica ELISA Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este util pentru documentarea infecie intra-uterine. Tehnica Western blot poate detecta att Ac de tip IgM ct i de tip IgG. Aa cum am mai menionat, interpretarea rezultatelor obinute se face innd cont de contextul clinic, epidemiologic i de laborator. Lund n considerare numai rezultatele de laborator pentru testele menionate n acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dac testul VDRL este negativ i testul TPHA este tot negativ, de regul infecia este exclus. Dac ne gndim c pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt nc nedectabili, repetm testele dup 3 sptmni. n cazul n care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este posibil s ne aflm n situaia de mai sus, la debutul bolii i repetm testele dup 3 sptmni. Dac rezultatele rmn nemodificate, este vorba de o reacie fals pozitiv. Pot fi luate n discuie i alte posibiliti.

46. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Leptospira
Genul Leptospira include mai multe specii, dintre care mai cunoscute sunt L. interrogans i L. biflexa. Leptospirele sunt spirochete foarte mobile, descriind micri de burghiu imprimate de dispoziia particular a flagelilor, cu dimensiuni de 0,1 mm / 6-15 mm, prezentnd un crlig la unul sau la ambele capete. n cadrul speciei Leptospira interrogans exist peste 218 serotipuri (serovaruri n terminologia anglo-saxon, de ex. L. icterohaemorrhagiae; un serovar include mai multe grupe) care pot determina boala la animale i accidental la om. Specia Leptospira biflexa reunete peste 63 de serotipuri saprofite. L. interrogans este patogen prin multiplicare i invazivitate. Leptospiroza se caracterizeaz prin polimorfism, pe parcursul evoluiei aspectul clinic putndu-se modifica. Dup o perioad de incubaie de 1-2 sptmni, debutul bolii poate fi marcat de febr, perioad n care leptospira este prezent n snge. Microorganismul se cantoneaz apoi n organele parenchimatoase (ficat i rinichi), n forma cea mai grav (sindromul Weil) putnd determina apariia de icter, hemoragii, necroz tisular i disfuncii de organ. Boala este frecvent bifazic (dup o ameliorare iniial urmeaz faza a doua a bolii remarcndu-se creterea titrului de anticorpi de tip IgM). Infecia leptospirotic poate conduce relativ frecvent la meningit aseptic (cu lichid clar). Diagnosticul de laborator n leptospiroz poate fi bacteriologic i / sau serologic. Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectnd etapele cunoscute i este cel mai frecvent realizat la nivelul centrului de referin. Diagnosticul pornete de la elemente clinice i epidemiologice. Diagnosticul bacteriologic al leptospirozei este laborios i costisitor.

1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de snge sau LCR (n primele 7-10 zile), urin (dup 9 zile de la debut pn la 2-8 sptmni de boal), dar s-ar putea recolta i lichid peritoneal, pleural etc. Datorit fragilitii leptospirelor i fenomenului de autoliz, transportul trebuie s fie realizat rapid, n maxim 1-3 ore, la temperatura camerei. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt (fr a folosi ns lamela). Preparatul se examineaz la microscopul cu fond ntunecat. Exist o serie de proceduri utilizate pentru pregtirea preparatului. n cazul lichidului peritoneal, LCR etc, produsul de centrifugheaz la 1.500g pentru o durat de 30 minute, utilizndu-se sedimentul obinut. n cazul sngelui, recoltarea se face pe anticoagulant (dar nu cu citrat), urmnd o prim centrifugare la 500g pentru o durat de 5 minute. Prelum supernatantul pe care l centrifugm la 1.500g pentru o durat de 30 minute i utilizm sedimentul obinut. n aceste condiii, un medic microbiolog cu experien ar putea stabili diagnosticul prezumtiv. Leptospirele apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu, pe fondul negru al preparatului. Unii autori recomand realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic (FontanaTribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar ca filamente regulat spiralate cu extremitile fin ngroate sub form de buton, de culoare maro. A fost recomandat i colorarea imunofluorescent (IF direct) n cazul suspicionrii diagnosticului de leptospiroz. n ultima perioad, pornind de la p.p. (ser, urin, LCR etc) au fost puse la punct tehnici PCR. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz dificil, cu costuri ridicate, datorit sensibilitii n mediul extern i particularitilor de multiplicare a leptospirelor. De regul cultivarea se face la nivelul centrului de referin; utiliznd medii de cultur lichide nu obinem colonii izolate. Exist i posibilitatea inoculrii p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea clinic trebuie monitorizat zilnic. Identificarea infeciei se poate face prin diagnostic serologic, prin izolarea leptospirelor (hemocultur) sau anatomopatologic i bacteriologic dup decesul sau sacrificarea animalului respectiv. n cazul utilizrii mediilor de cultur este recomandat ca toate p.p. s fie nsmnate att pe medii de cultur selective ct i neselective. Mediul de cultur cel mai cunoscut este mediul Korthof (cu acizi i alcooli grai, care conine i ser de iepure), pregtind n acest scop mai multe tuburi n care nsmnm cantiti progresive de p.p. (ex. pornim de la o pictur, continum cu 2 picturi etc). Mediile selective includ neomicin i / sau 5fluorouracil. Realizm incubarea la 28 C. Multiplicarea bacterian nu determin o tulburare a mediului (apariia turbiditii reprezint cel mai frecvent o contaminare cu o alt bacterie). Dup 3 zile, respectnd cu strictee normele de asepsie, realizm preparate native pe care le examinm la microscopul cu fondul ntunecat. n cazul n care rezultatul este negativ, repetm aceast examinare la interval de circa 3 zile pentru o durat total de minim 4 sptmni, sau pn la obinerea unui rezultat pozitiv. n general creterea bacterian are loc n 3-14 zile de la momentul nsmnrii. Costul i durata diagnosticului cresc i datorit faptului c, pentru identificare sunt necesare cel puin 1-2 repicri pe un alt mediu lichid, dup detectarea microscopic a unor microorganisme care ar putea fi implicate patogenic. O alternativ (i mai costisitoare, utilizat mai ales dac presupunem contaminarea culturii cu o alt bacterie) este reprezentat de inocularea intraperitoneal a culturii respective la cobai. Dup 30-60 minute, avnd n vedere faptul c leptospirele invadeaz sistemul circulator mai rapid n comparaie cu alte bacterii, dup anestezierea animalului se recolteaz snge (prin puncie cardiac) i realizm o hemocultur. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Realizm un preparat proaspt (fr a folosi lamela) din mediul de cultur i l examinm la microscopul cu fond ntunecat. Leptospirele cu dimensiuni de 0,1 mm / 6-15 mm, apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu micri de nurubare i flexiune, dar i cu o uoar deplasare n spaiu, pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentic (Fontana-Tribondeau) precum i prin IF direct. Caractere de cultur: Leptospirele nepatogene se multiplic la 11-13 C n timp ce L. interrogans nu Caractere biochimice: Leptospirele nepatogene sunt rezistente la 8-azaguanin n timp ce L. interrogans este sensibil Caractere antigenice: Se utilizeaz seruri de referin cu anticorpi fa de serogrupurile cunoscute i tulpina de identificat izolat n cultur pur i concentrat la o densitate standard, prin reacii de aglutinare microscopic, la nivelul

centrului de referin care a elaborat protocolul standard de operare; n mod similar se poate identifica i serovarul implicat Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: tehnici ale biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obinute prin restricie endonucleazic etc). 5. Antibiograma nu se realizeaz (nu a fost pus la punct o tehnic n acest scop). Este cunoscut faptul c leptospirele sunt sensibile la penicilin, amoxicilin, tetraciclin, doxiciclin etc dar tratamentul se stabilete n funcie de forma i gravitatea bolii. Diagnosticul serologic Anticorpii specifici se pot evidenia n serul pacienilor ncepnd cu a 4-6 - a zi de la debutul bolii, atingnd un nivel maxim ntre sptmna a 3-6 - a de boal, dup care scad progresiv. Tehnica de referin este reprezentat de reacia de aglutinare microscopic, realizat pe seruri pereche (primul recoltat la 1-2 sptmni de la debut, al doilea recoltat la 3-4 sptmni de la debut). O cretere de 4 ori a titrului la a doua determinare semnific un diagnostic pozitiv. Un titru 1/800 n prezena unor semne clinice este foarte sugestiv. Trebuie s menionm c pentru unii pacieni seroconversia are loc mai tardiv. O alt problem este reprezentat de faptul c se utilizeaz leptospire vii n calitate de Ag cunoscut, motiv pentru care aceast reacie nu se poate practica dect n centrul de referin. La nivelul altor uniti sanitare se pot practica reacii de tip ELISA, reacia de hemaglutinare indirect sau reacia de aglutinare pe lam utiliznd Ag preparate din tulpini saprofite (sensibilitatea i specificitatea acestor reacii este mai sczut). Tehnica ELISA de identificare a anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infeciei acute dar nu poate permite determinarea serogrupului implicat aa cum se ntmpl n cazul tehnicii de referin.

47. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Borrelia
Genul Borrelia include spirochete de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale, mobile (cu micri de rotaie i rsucire), care infecteaz n special animalele i se transmit la om prin intermediul unor vectori. Produc spre exemplu febra recurent, boal transmis de artropodele hematofage, borrelioza Lyme etc. Borreliozele transmise prin cpue sau pduche poart de obicei numele regiunii geografice n care se gsesc preponderent. Vom discuta n cele ce urmeaz aspecte legate de febra recurent cu agent etiologic Borrelia recurrentis, care produce infecii i n Europa. B. recurrentis supravieuiete mai multe luni n sngele contaminat sau n culturi la 4C. n anumite cpue, bacteriile sunt transferate din generaie n generaie. Tulpinile de B. recurrentis izolate n diverse pri ale lumii, de la diferite gazde i de la vectori diferii (cpue sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale speciei principale. n urma infeciei apare un rspuns imun umoral, putnd fi detectai anticorpi aglutinani i anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul c, inclusiv n decursul unei singure infecii apar modificri antigenice, care explic recderile. Ultima vindecare (dup 3-10 recderi) este asociat cu prezena anticorpilor mpotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea consecutiv infeciei este de obicei de scurt durat. Dup o perioad de incubaie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane i creterea rapid a temperaturii. Se asociaz cefalee sever, mialgii, artralgii, letargie, fotofobie i tuse cu sau fr expectoraie. n acest timp, spirochetele se afl n numr mare n snge. Pot aprea hemoragii (peteii, epistaxis etc) dar de regul fr evoluie fatal. Febra persist 3-6 zile, apoi scade. Perioada afebril dureaz 4-10 zile i este urmat de un al doilea atac de frisoane, febr, cefalee intens i stare de ru. Pot aprea succesiv pn la 10 asemenea recderi, a cror severitate scade n general progresiv. Puseele febrile se asociaz cu bacteriemie. Diagnosticul de laborator n borrelioza recurent este bacteriologic, direct urmnd etapele cunoscute. Diagnosticul serologic poate oferi unele date. Diagnosticul borreliozelor pornete de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date de laborator i este confirmat prin diagnostic bacteriologic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de snge dar s-ar putea recolta i vectori (pduchi, cpue) sau LCR,

lichid sinovial etc, n funcie de manifestarea clinic. Sngele trebuie recoltat n perioadele febrile. n cazul n care produsele nu se pot examina imediat, recomandm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4 C) sau inocularea unor animale receptive (ex. oareci) i transportul acestora ctre laborator. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui preparat proaspt ntre lam i lamel utiliznd sngele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond ntunecat. Borreliile se vd ca spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza frotiuri subiri sau examenul picturii groase, colorate Giemsa prelungit, May-Grnwald-Giemsa sau Wright precum i cu acridin-orange sau cu Ac monoclonali marcai fluorescent i cu examinare la microscopul cu fluorescen. Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre hematii. Examenul microscopic realizat de ctre un medic experimentat permite identificarea borreliilor n circa 70% dintre cazuri, n condiiile respectrii normelor diagnosticului bacteriologic. Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectai (pduche, cpu). De menionat faptul c n cazul acestui p.p. borreliile i menin pentru o lung durat de timp forma i mobilitatea caracteristice n timp ce n sngele recoltat de la gazda uman sufer modificri datorit prezenei anticorpilor specifici, iar n timp i pierd mobilitatea). n ultima perioad s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind de la produsul patologic. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz de regul la nivelul centrului de referin, existnd mai multe tehnici care ar putea fi utilizate. Se pot inocula animale de experien sensibile (ex. oareci sau obolani), cu inoculare intraperitoneal. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic i prin examinarea microscopic a sngelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (pduchi sau cpue) sau oul de gin embrionat (la nivel intra alantoidian sau n membrana chorioalantoidian). Se pot utiliza i medii de cultur artificiale speciale (cu ageni reductori, N-acetilglucozamin, acizi grai nesaturai cu caten lung, ser de iepure), n condiii de microaerofilie, cu incubare la 32-37 C. Se recomand i utilizarea mediilor selective care includ o combinaie de ageni antimicrobieni precum rifampicin, amfotericin B i fosfomicin. Datorit faptului c mediile de cultur sunt lichide, nu se obin colonii izolate. Creterea microbian trebuie verificat prin realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond ntunecat la fiecare 3 zile, pentru o durat de 2-6 sptmni. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza: Caracterelor morfotinctoriale: Sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire largi i inegale, foarte mobile (cu micri de rotaie i rsucire), pe fondul negru al preparatului. Pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate. Caracterelor de cultur: Dac are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultur acesta rmne limpede, fr sediment, dar i modific culoarea (ex. vireaz de la rou-portocaliu spre roz-glbui) Caracterelor biochimice: Borreliile sunt microaerofile, fermenteaz glucoza producnd bioxid de carbon i acid lactic (dar aceste teste nu sunt utilizate de regul n diagnostic). Alte caractere / teste utilizate n identificare la nivelul centrelor de referin: tehnici ale biologiei moleculare (PCR). 5. Nu a fost pus la punct o metod pentru realizarea antibiogramei (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice). Febra recurent se trateaz cu tetraciclin, cloramfenicol, penicilin sau eritromicin. n urma tratamentului poate aprea sindromul Jarisch-Herxheimer (frison sever, creterea temperaturii, hipotensiune, leucopenie). Diagnosticul serologic nu este foarte util, datorit variaiilor antigenice (care au loc inclusiv pe parcursul bolii) i complexitii fenomenului de recuren. n ser pot fi decelai anticorpi aglutinani, imobilizani i fixatori de complement. Sunt foarte puine laboratoare care practic aceste reacii, de obicei n scop de cercetare. La pacienii cu febr recurent epidemic (purttori de pduchi) pot aprea aglutinine fa de Proteus OXK i o reacie VDRL fals pozitiv. Se poate nregistra o leucocitoz de pn la 25.000 celule / mm3 i o cretere important a VSH-ului (de pn la 110 mm / h).

48. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din familia

Rickettsiaceae
Rickettsiile sunt microorganisme care iniial au fost ncadrate printre virusuri deoarece au dimensiuni mai mici dect bacteriile (600/300 nm) i n majoritate nu se pot cultiva dect pe gazde vii. Familia Rickettsiaceae include trei genuri, genul Rickettsia, genul Coxiella i genul Ehrlichia. Microorganismele sunt transmise de obicei de ctre artropode (pduche, purice, cpu) multiplicndu-se n corpul acestora. Cel puin patru rickettsii (Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia akarii) i probabil i altele sunt transmise transovarian n artropode care servesc deopotriv ca vector i rezervor. Rickettsia prowazeckii, agentul etiologic al tifosului exantematic este considerat ca specia tip a genului Rickettsia. n cele mai multe cazuri, rickettsiozele se caracterizeaz prin asocierea unui sindrom infecios sever cu un exantem. Clasificarea lor se poate face dup mai multe criterii. Dup principalele caractere clinice i epidemiologice rickettsiozele se pot mpri n urmtoarele grupe: a). tifosul de pduche sau purice; b). grupul febrelor butonoase (febrele peteiale) reunete rickettsiozele transmise prin cpue care paraziteaz animalele domestice i slbatice; c). grupul tifos tropical reunete rickettsiozele transmise de larvele unor mici acarieni. Tifosul pulmonar sau febra Q are ca agent etiologic Coxiella burnetii poate fi transmis i de cpue, contaminarea este ns posibil i pe cale respiratorie sau digestiv. Microorganismele se multiplic n celulele endoteliului vaselor sanguine mici i produc vasculite. Celulele se umfl i se necrozeaz, apar tromboze ale vaselor care duc la ruptur i necroz. Leziunile vasculare par a fi baza alterrilor hemostazei. Pot aprea coagulare intravascular diseminat i ocluzii vasculare. La nivel cerebral apar agregri limfocitare, leucocitare i ale macrofagelor ceea ce conduce la apariia nodulilor tifici. Se observ leziuni similare n vasele mici la nivel cardiac sau la nivelul altor organe. Infeciile rickettsiene se caracterizeaz prin febr, cefalee, indispoziie, prostraie (stare general foarte alterat), rash (erupie) cutanat i mrirea splinei i ficatului. n febra Q nu exist leziuni cutanate. Vom discuta n continuare despre diagnosticul febrei Q dei Coxiella burnetii poate produce i un sindrom febril auto-limitat (2-14 zile), endocardit, hepatit, osteomielit etc. Febra Q se poate manifesta prin pneumonie atipic, pneumonie rapid progresiv sau pneumonie n care semnul principal este reprezentat de febr (simptomatologia pulmonar fiind absent iar implicarea pulmonar putnd fi demonstrat paraclinic). Pornim de la elemente clinice (nespecifice), paraclinice i de laborator i ncercm stabilirea etiologiei prin diagnostic microbiologic (bacteriologic i serologic). Obinerea de hemoculturi i sputoculturi negative pentru alte microorganisme este un element care n contextul clinic i paraclinic reprezint un element sugestiv. Diagnosticul bacteriologic 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sput; putem recolta i snge (ar fi de preferat cheagul sanguin), lichid pleural, lichid pericardic, fragmente de placent (n cazul unui avort) etc. Transportul trebuie realizat rapid i n condiii de maxim siguran (ceea ce trebuie respectat n toate etapele diagnosticului bacteriologic; microorganismele din familia Rickettsiaceae prezint un grad nsemnat de infeciozitate prin aerosoli). n cazul n care p.p. nu poate fi procesat i inoculat imediat este recomandat meninerea la -20 C (inclusiv pe parcursul transportului). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic este rareori util pentru diagnostic. n sput, mai ales dac este recoltat prin biopsie transbronic, putem remarca prezena macrofagelor alveolare iar printre acestea prezena unor cocobacili de dimensiuni mici. Pornind de la gena pentru superoxid-dismutaz au fost obinui primeri (amorse) utilizai n amplificarea genetic, pornind de la produsul patologic. 3. Cultivarea pe produsului patologic se poate realiza numai pe gazde vii, la nivelul unui laborator de referin. Trebuie luate toate msurile de prevenire a unei infecii n laborator. Coxiella burnetii poate cultiva pe animal de laborator (cobai), culturi de celule sau ou de gin embrionat (la nivelul sacului vitelin). n afar de p.p. menionate mai sus am putea folosi pentru inoculare i artropode. La nivelul sacului vitelin C. burnetii sufer o variaie de faz, ntructva similar variaiei de la forma S la forma R ntlnit la alte bacterii. Tulpinile recent izolate sunt n faza I n timp ce dup subcultivare se obin tulpini cu virulen sczut, n faza II. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza astfel:

Caractere morfotinctoriale: evidenierea prin imunofluorescen direct a microorganismelor n hemolimfa animalelor infectate sau la nivelul sacului vitelin al oului de gin embrionat realizarea de frotiuri colorate prin metoda Gimenez (microorganismele apar de culoare roie pe fondul verde al frotiului) sau Machiavello (microorganismele apar de culoare roie pe fondul albastru al frotiului); se poate utiliza i metoda Giemsa Evaluarea prezenei anticorpilor anti-C. burnetii la animalele de laborator inoculate cu p.p. Tehnici ale biologiei moleculare (PCR) etc. 5. Testarea sensibilitii la antibiotice nu se realizeaz de rutin. Cercetri efectuate dup cultivarea C. burnetii pe linii de celule fibroblastice L929 au permis autorilor s afirme c tulpinile studiate au fost sensibile la chinolone (n special) i rifampicin dar mai puin la cloramfenicol, doxicilin i trimetoprim. Totui, tratamentul febrei Q se poate face cu se face cu tetraciclin sau macrolide n asociere cu rifampicin. Diagnosticul serologic Datorit dificultii i riscurilor diagnosticului bacteriologic, cel mai frecvent n practic se utilizeaz diagnosticul serologic. Exist mai multe tehnici de laborator care pot fi utilizate dar RFC rmne n continuare metoda de referin. O cretere de 4 ori a titrului la a 2-a determinare ajut la punerea diagnosticului pozitiv n febra Q. Mai putem utiliza reacia de microaglutinare, reacia de microimunofluorescen indirect, o tehnic de tip ELISA sau reacia de latexaglutinare (pozitiv n infecia acut). Reacia de microimunofluorescen indirect prezint un nivel ridicat de sensibilitate i specificitate n condiiile n care personalul de laborator este bine pregtit i are experien n acest tip de diagnostic. n ceea ce privete depistarea specific a Ac de tip IgM, n acest caz nu este util deoarece IgM pot persista ntre 1 i 2 ani dup infecia acut. n diferite studii epidemiologice a fost utilizat i reacia de seroneutralizare. Injectnd la oarece ser specific anti-C. burnetii, acesta va neutraliza efectul inoculrii de microorganisme vii pe cale intraperitoneal sau intravenoas. Pentru ultima metod reamintim necesitatea lurii tuturor msurilor de prevenire a unei infecii a personalului de laborator.

49. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Chlamydia
Chlamydiile sunt bacterii de dimensiuni mici (0,25-1 mm), gram negative, strict parazite, imobile, care se multiplic n citoplasma celulelor gazd printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic. Datorit importanei pentru diagnostic, vom prezenta ciclul de dezvoltare al chlamydiilor. Dup ce ptrunde n interiorul celulei gazd, particula infecioas (corpusculul elementar, form cocoid, cu diametrul de 0,25-0,3 mm) se transform ntr-o particul mai mare (corpuscul reticulat, cu diametrul de 0,5-1 mm). Corpusculii reticulai se reunesc i se multiplic prin diviziune binar, formnd colonii (incluzii) intracitoplasmatice. Dup o perioad variabil n funcie de specia de chlamydii i de celula parazitat, de la nivelul incluziilor apar noi corpusculi elementari, care sunt expulzai, urmnd s paraziteze alte celule. ntregul ciclu dureaz 24-48 ore. Genul conine trei specii care pot fi implicate n patologia uman. De regul infecia este subclinic, boala reprezentnd o excepie la gazdele naturale ale acestor germeni. Transmiterea de la psri la om favorizeaz apariia bolii. C. trachomatis produce incluzii compacte intracitoplasmatice, cu glicogen. Include tulpini care determin pneumonie la oarece i cteva afeciuni umane: trahom (serovarurile A, B, Ba i C), conjunctivite, uretrite nongonococice, salpingite, cervicite, pneumonii la nou-nscui (serovarurile D-K) i limfogranulomatoza venerian (serovarurile L1-L3). C. psittaci produce incluzii intracitoplasmatice difuze, srace n glicogen. Include tulpini care determin psitacoza uman, ornitoze la psri, meningit, pneumonie la feline i multe alte afeciuni ale animalelor. (provoac infecii la animale dar poate fi transmis omului). C. pneumoniae poate provoca la gazda uman pneumonii atipice la fel ca i C. psittaci, Coxiella burnetii sau Mycoplasma pneumoniae. Unii autori clasific C. psittaci i C. pneumoniae n genul Chlamydophila. Diagnosticul de laborator n infeciile chlamydiene poate fi bacteriologic i imunologic. Infeciozitatea (prin aerosoli) este important astfel c trebuie luate toate msurile necesare pentru prevenirea apariiei unor infecii la personalul de laborator. Diagnosticul bacteriologic Diagnosticul bacteriologic complet poate fi realizat la nivelul unor centre de referin. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei i

respectnd msurile de precauie. Produsul patologic poate fi reprezentat deraclat conjunctival sau de la nivelul altor mucoase (ex. cervival), urin, sperm, secreie purulent uretral, secreii nazale, secreii faringiene, sput, aspirat ganglionar, puroi din fistul etc. Ne vom referi n continuare la diagnosticul infeciei produse de C. trachomatis. n cazul n care spre ex. secreia uretral nu este evident, putem utiliza un tampon subire pe care l introducem cu blndee 3-5 cm n uretr, rotindu-l uor. Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele nu trebuie s fie din vat sau alginat de calciu ci din Dacron. Produsul trebuie s fie prelucrat imediat. Dac acest lucru nu este posibil, transportul se va face n medii speciale de transport sau la cel puin -20 C (preferabil -70 C). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unor frotiuri pe care le colorm dup cum urmeaz. Cea mai sensibil i specific metod pentru punerea n eviden a incluziilor intracitoplasmatice sau corpusculilor elementari este imunofluorescena. Frotiul este uscat, fixat chimic (cu aceton, la -20 C) i colorat imunofluorescent (metoda direct sau indirect). Urmrim prezena celulelor inflamatorii (PMN) i a celulelor caracteristice esutului de la nivelul cruia am realizat recoltarea. Incluziile apar ca o mas bine definit, cu fluorescen de ex. galben-verzui, n interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puin 3 minute n cazul n care pare s fie negativ. n afar de Celelalte frotiuri le putem colora prin metoda Gimenez (corpusculii elementari apar aglomerai i de culoare roie pe fondul verde al frotiului), cu lugol (incluziile de C. trachomatis conin glicogen; apar ca o mas de culoare brun) sau Machiavello (corpusculii elementari apar aglomerai i de culoare roie pe fondul albastru al frotiului). Unii autori menioneaz c examenul citologic, cu punerea n eviden a unor limfocite transparente i a unui numr crescut de histiocite este sugestiv pentru infecia cu C. trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA se pot pune n eviden antigene n p.p. Exist i tehnici ale biologiei moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR etc). 3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul de gin embrionat (la nivelul sacului vitelin) dar de regul se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229 (tratate cu dextran i cicloheximid), McCoy (tratate cu cicloheximid 1 mg/ml), pentru Chlamydia pneumoniae se pot utiliza liniile celulare HeLa, HEp-2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celular McCoy etc. nainte de inocularea pe culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000g, timp de 60 minute). Se pot utiliza culturile de celule n sistemul clasic sau micrometoda de cultivare pe culturi de celule n godeuri. Incubarea dureaz 48-72 de ore. Tehnica incubrii este destul de complex (incubri repetate, n condiii diferite) i trebuie s respecte strict protocolul de lucru. 4. Identificarea se va realiza difereniat. n cazul n care s-a utilizat micrometoda, godeurile se examineaz microscopic dup colorare cu lugol sau prin imunofluorescen. n cazul cultivrii prin metoda clasic, realizm frotiuri pe care le fixm chimic (de ex. cu metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C. trachomatis conin glicogen) iar altul cu Ac monoclonali marcai fluorescent. Se pot aplica i tehnici de biologie molecular. 5. Nu exist tehnici standardizate de stabilire a sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a tulpinilor de Chlamydia spp. n tratament se pot folosi eritromicina (sau alte macrolide), tetraciclinele sau fluorochinolonele. Diagnosticul serologic Diagnosticul serologic implic utilizarea reaciei de fixare a complementului, reaciei de microimunofluorescen i a tehnicilor de tip ELISA. Se consider c un titru 1/64 este sugestiv n timp ce o cretere de 4 ori a titrului n dinamic permite diagnosticul pozitiv. Identificarea prezenei Ac de tip IgM la nou nscui permite diagnosticul de pneumonie cu C. trachomatis. Tehnicile imunologice sunt frecvent utilizate n scop epidemiologic (studii de seroprevalen). Diagnosticul imunobiologic Utilizarea intradermoreaciei (IDR Frei) a intrat n istoria medicinii.

50. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Mycoplasma
Clasa Mollicutes include patru ordine. Ordinul Mycoplasmataceae include genurile Mycoplasma (circa 100 specii) i Ureaplasma (6 specii). Cteva dintre speciile acestor genuri prezint interes medical. Mycoplasmele sunt cele mai mici microorganisme care pot tri liber n natur (125-250 nm) i se pot multiplica pe medii de laborator. M. pneumoniae este implicat n infecii respiratorii, M. hominis poate produce infecii cu localizare genital inclusiv infecii post-abortum i post-partum n timp ce U. urealyticum a fost izolat din uretrite nongonococice i din alte infecii uro-genitale.

Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic i / sau serologic, n funcie de localizarea infeciei i specia implicat. Diagnosticul infeciilor respiratorii pornete de la elemente clinice i paraclinice i poate fi confirmat etiologic prin diagnosticul microbiologic. Diagnosticul bacteriologic 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 6), n special recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat faringian, secreii nazale, sput, secreii genitale, urin etc dar n continuare vom discuta numai diagnosticul de laborator n infeciile respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4 C) ct mai rapid posibil, fr a depi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativ este reprezentat de utilizare mediilor speciale de transport care pot asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de ore. Utilizarea azotului lichid (-70 C) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar nu este nc accesibil (cu foarte puine excepii) sistemului sanitar romnesc. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu permite obinerea unor rezultate utile, M. pneumoniae ca i celelalte specii ale ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii autori recomand realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar putea realiza amplificarea genetic (PCR) cu o sensibilitate foarte bun. Prin tehnici de tip ELISA pot fi puse n eviden Ag de M. pneumoniae n sput. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se poate realiza utiliznd tehnici i medii speciale. Unul dintre mediile de cultur cunoscut este mediul mbogit, pe baz de infuzie de cord bovin numit generic PPLO. Acest mediu include att substane nutritive, surse de energie, indicator de pH (rou fenol) ct i substane care i asigur selectivitatea (penicilin i/sau acetat de taliu). Cei mai muli autori recomand nsmnarea p.p. att pe un mediu de cultur solid ct i pe un mediu de cultur lichid (ex. bulion PPLO). Vom realiza o incubare la 37 C n atmosfer de 5% CO2 i urmrim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza ct mai rapid (dar nu mai devreme de 48-72 ore de incubare) modificrile de culoare care trdeaz virajul pH-ului. Mediul devine acid prin fermentarea glucozei n cel mult 3-4 sptmni. Este recomandat s realizm repicri pe medii solide i lichide ct mai curnd dup ce am observat virajul pH-ului. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale nu sunt utile n identificarea M. pneumoniae Caractere de cultur: Se pot examina la stereomicroscop (cu mrire de minim 25). n scopul identificrii trebuie s citim placa cu mediu agarizat de cel puin 2 ori pe sptmn. Pot aprea colonii de dimensiuni foarte mici (cu diametru de la 10 mm pn la 200 mm), cu aspect muriform. Sunt descrise i colonii cu aspect de ou-ochi, cu centrul dens, opac, nconjurat de o zon periferic mai clar pe care unii autori le consider drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de colonii ar mai putea fi produse de bacterii n form L i necesit realizarea diagnosticului diferenial). Se poate realiza i cultivarea pe oul de gin embrionat (inoculare intravitelin) sau n culturi de celule. Caractere biochimice: Fermenteaz glucoza, nu metabolizeaz arginina, nu hidrolizeaz ureea dar reduce (n aerobioz) tetrazoliul. Acesta este un compus incolor, iar n cazul n care este redus la formazan, culoarea devine roie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care presupunem prezena coloniilor de M. pneumoniae. Alte caractere care ar putea fi utilizate n identificare sunt Fenomenul adsorbiei hematiilor de cobai Colorarea imunofluorescent a coloniilor cu seruri specifice marcate cu fluorocromi Inhibarea dezvoltrii coloniilor n jurul unor discuri impregnate cu anticorpi specifici Tehnici ale biologiei moleculare (sonde nucleotidice, PCR) etc. 5. Nu exist o standardizare a tehnicilor pentru determinarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Tratamentul pneumoniei cu M. pneumoniae se poate face cu eritromicin sau alte macrolide sau cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3 sptmni. Diagnosticul serologic n cursul infeciei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru neutralizarea M. pneumoniae n timp ce alii acioneaz ca auto-Ac. Dintre acetia, aglutininele la rece sunt Ac de tip IgM oligoclonali care reacioneaz cu un Ag de la suprafaa hematiilor pacienilor infectai cu M. pneumoniae. Cu toate c exist i alte maladii n care apar aglutinine la rece, iar pe de alt parte acetia nu se pot identifica la toi pacienii infectai cu M. pneumoniae, demonstrarea aglutininelor la rece continu s fie util n diagnosticul serologic. Utilizm serul pacientului pe care l amestecm cu eritrocite provenite de la pacieni de grup O, incubm la 0 C

cteva minute i urmrim apariia aglutinrii. Dac apare aglutinarea repetm testul realiznd diluii de ser pentru a determina titrul. Un titru 1/32 este sugestiv pentru infecia cu M. pneumoniae. Se poate utiliza i RFC, dar pentru c Ac fixatori de complement apar tardiv este util n studii epidemiologice. Tehnica de tip ELISA poate determina Ac de tip IgM i este util n infecia acut.

51. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul

Candida
Diagnosticul infeciilor fungice nu este un diagnostic facil, dar este foarte important pentru c trebuie s avem n vedere c aceste afeciuni sunt mult mai frecvente dect sunt raportate n ara noastr. Oricare laborator clinic ar trebui s poat realiza cel puin examinarea microscopic n vederea evidenierii levurilor sau structurilor miceliene sau pseudo-miceliene precum i testul filamentrii. Dintre infeciile fungice vom discuta doar despre infeciile produse de levuri i dintre acestea numai despre infeciile produse de levurile din genul Candida, mai precis de specia Candida albicans. n ceea ce privete diagnosticul unei infecii cu Candida spp. (respectiv C. albicans) exist anumite particulariti de care trebuie inut cont atunci cnd se diagnosticheaz o candidoz localizat la nivel mucocutanat n comparaie cu o candidoz localizat profund. Diagnosticul poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect). Diagnosticul micologic 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice antifungice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n cazul candidozelor superficiale, dup antiseptizarea suprafeei leziunii raclm spre ex. tegumentul i colectm scuamele rezultate ntr-un recipient. Mai putem recolta fire de pr, fragmente de unghie etc. n principiu putem introduce p.p. recoltat n pachet de hrtie, introdus la rndul lui ntr-o cutie Petri. Transportul trebuie s dureze maxim 48 de ore. n cazul candidozelor profunde ca i n cazul candidozelor localizate la nivelul mucoaselor trebuie s evitm uscarea p.p. pe parcursul transportului. Vom utiliza recipiente care se pot nchide ermetic i dac estimm c transportul va dura mai mult de 1-2 ore introducem n recipient un tampon de vat sau tifon umezit cu soluie salin fiziologic. Pentru a preveni multiplicarea bacterian putem aduga p.p. antibiotice (ex. penicilin, streptomicin, cloramfenicol). Este bine ca volumul de p.p. recoltat s fie ct mai mare. n cazul candidozelor profunde preferm ca recoltarea s fie urmat imediat de realizarea preparatelor microscopice i nsmnare pe medii de cultur (la patul bolnavului). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic se realizeaz diferit, n funcie de p.p. prelucrat, dar face parte din orice examen micologic. n cazul n care examinm o secreie sau un produs obinut prin raclare de la nivel tegumentar sau fragmente de unghie vom realiza un preparat proaspt (umed), montat n soluie de 10-30% KOH-glicerol. Putem utiliza pentru colorare calcofluor alb, un fluorocrom care permite evidenierea levurilor datorit faptului c au n compoziie chitin (la nivelul peretelui celular). Elementele fungice (levuri ovoide, cu dimensiunea de 4/6 mm, pseudomicelii i micelii) apar galben-verzui sau alb-albstrui n funcie de lungimea de und a radiaiei de excitaie. Punerea n eviden a formaiunilor menionate mai sus permite suspicionarea prezenei Candida spp., dar pentru confirmarea prezenei C. albicans este necesar obinerea culturilor pure i identificarea acestora. n cazul n care examinm secreii de la nivelul mucoaselor vom pregti att preparate umede ct i frotiuri pe care le vom colora (Gram, AM sau Giemsa). Pentru creterea sensibilitii examinrii preparatelor umede, acestea vor fi colorate cu calcofluor alb sau cu lactofenol albastru cotton. Indiferent de metoda utilizat, punerea n eviden a levurilor i pseudomiceliilor ridic o suspiciune, ns datorit prezenei Candida spp., n flora microbian normal (ex. bucal, vaginal etc) doar punerea n eviden a miceliilor alturi de prezena formelor levurice (gram pozitive la coloraia Gram) poate permite confirmarea infeciei. Este necesar obinerea culturilor pure i identificarea acestora. Pe de alt parte, dorim s menionm c o cultur pozitiv n absena unui examen microscopic pozitiv ridic semne de ntrebare privind diagnosticul infecie cu C. albicans. n cazul candidozelor profunde, interpretarea se va face difereniat. Atunci cnd p.p. este normal steril (recoltat prin puncie lombar, lavaj bronho-alveolar, puncie bioptic etc), identificarea structurilor fungice (levuri, micelii) este foarte important pentru diagnostic. Dac p.p. este reprezentat de urin, materii fecale, sput sau alt produs potenial contaminat de flora microbian normal, interpretarea este mai dificil n ceea ce

privete semnificaia structurilor fungice observate. Pentru examinarea p.p. recoltate de la pacieni care prezint candidoze profunde vom realiza att preparate umede ct i frotiuri fixate, colorate prin metodele amintite. Este posibil ca elementele fungice s apar deformate datorit fixrii precipitatelor de colorant, pe frotiul colorat Gram. n cazul biopsiilor tisulare am putea utiliza coloraiile histochimice. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Exist mai multe medii de cultur care pot fi utilizate. Cel mai cunoscut este mediul Sabouraud (agar, glucoz sau maltoz, polipepton) produs i de INCDMI Cantacuzino. n cazul p.p. contaminate vom folosi i medii selective, de ex. mediul Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol, gentamicin i/sau tetraciclin) i/sau mediul Sabouraud cu cicloheximid. Dorim s menionm c n cazul p.p. necontaminate realizm cultivarea numai pe mediul Sabouraud neselectiv n timp ce n cazul p.p. contaminate vom realiza cultivarea att pe mediul neselectiv ct i pe mediile selective. Putem incuba plcile la 22-30 C, dar mai frecvent incubarea se realizeaz la 28 C (sau la temperatura camerei) i la 35-37 C, timp de 24-96 ore n cazul candidozelor superficiale i pn la maxim 3 sptmni n cazul candidozelor profunde. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Examenul microscopic al culturilor de levuri se realizeaz asemntor cu ceea ce am discutat n cazul identificrii bacteriilor. Exist ns i anumite particulariti. Vom realiza att preparate proaspete, colorate de ex. cu lactofenol ct i frotiuri fixate i colorate. Vom putea remarca prezena levurilor (blastoconidii), rotunde, ovoide sau puin mai alungite, gram pozitive, putnd prezenta muguri i pseudomicelii. Prin examenul microscopic dovedim i puritatea coloniei. Dup repicarea pe agar cu fin de porumb sau agar cu extract de cartof (medii srace din punct de vedere nutritiv), examinarea microscopic a preparatului proaspt va demonstra producerea de chlamidoconidii (chlamidospori) care apar la extremitatea pseudomiceliilor. Testul este negativ n numai 3-4% dintre cazuri. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, rotunde, bombate, netede, asemntoare cu unele colonii bacteriene dar cu dimensiuni mai mari. Coloniile apar n 1-4 zile, au o culoare alb sau alb-glbuie i consisten cremoas. n timp suprafaa coloniilor capt un aspect zbrcit. Caractere biochimice: Auxanograma: Levurile prezint un anumit echipament enzimatic cu ajutorul cruia pot s utilizeze un anumit carbohidrat ca unic surs de carbon. Dezvoltarea pe un mediu n care este inclus un singur carbohidrat demonstreaz utilizarea acestuia ca unic surs de carbon. n mod asemntor se poate testa capacitatea asimilrii unor substane azotate. C. albicans asimileaz glucoz, maltoz, trehaloz, galactoz etc (vezi i capitolul 12). Zimograma: Testarea fermentrii unor carbohidrai Utilizarea unor teste produse comercial precum API 20C, API 32C, Vitek etc Relativ recent au fost puse la punct medii cromogene (ex. CHROMagar) care testeaz producerea anumitor enzime i sunt utile n identificarea C. albicans, C. krusei i C. tropicalis. Caractere antigenice: Se pot utiliza reacia de aglutinare pe lam, reacia de latex-aglutinare sau ELISA folosind antiseruri cunoscute. Ultimele dou tehnici sunt folosite i n scopul identificrii prezenei Ag de Candida spp. n diferite p.p. Caractere de patogenitate: Pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid separm sedimentul i realizm o suspensie 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic steril; inoculm n venele cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obinut i urmrim evoluia animalelor timp de 4-10 zile; dac este vorba de o tulpin de C. albicans patogen, animalele vor muri dup circa 1 sptmn (anatomopatologic vom putea evidenia abcese miliare renale, splenice, hepatice) etc. Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor: Testul filamentrii (testul producerii de tubi germinativi): Verificm capacitatea blastoconidiilor de a produce, n anumite condiii, tubi germinativi. Repicm tulpina de studiat pe medii care conin ser de iepure sau de berbec. La intervale de 60 de minute realizm preparate proaspete (ntre lam i lamel), examinm microscopic pentru a identifica apariia tubilor germinativi. C. albicans produce n maxim 4 ore pseudofilamente (tubi germinativi) relativ scurte, fr stricturi, cu acelai calibru. Detectarea unor metabolii prin gaz-lichid cromatografie (GLC) Teste de biologie molecular (sonde nucleotidice, PCR).

5. Antifungigrama (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) a fost pus la punct relativ recent. Eforturile depuse n vederea standardizrii acestei tehnici au avut la baz creterea interesului fa de infeciile fungice precum i apariia fenomenului de rezisten la medicamentele antifungice a tulpinilor izolate. Metoda recomandat de NCCLS este cea a diluiilor n bulion. Diagnosticul imunologic poate fi serologic i imunobiologic. Diagnosticul serologic Cu toate c o serie de autori consider drept nerelevant acest tip de diagnostic, diferite studii arat c identificarea i titrarea Ac anti-C. albicans poate fi util n diagnosticul candidozelor profunde. Iniial au fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea prezenei Ac anti-manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea prezenei Ac fa de Ag localizate n citoplasma C. albicans. Au fost utilizate imunodifuzia n gel, contraimunoelectroforeza, ELISA i tehnica de latex-aglutinare. Diagnosticul imunobiologic Intradermoreacia cu candidin este pozitiv la practic toate persoanele adulte, fiind astfel util nu n diagnosticarea unei infecii cu Candida, ci n aprecierea RIC. Se mai poate utiliza testul transformrii blastice a limfocitelor n prezena unor Ag de C. albicans. Trebuie s menionm c exist o serie de probleme privind standardizarea i interpretarea tehnicilor diagnosticului imunologic. Cu toate c prin aceste modaliti utilizate izolat nu putem pune diagnosticul de candidoz, interpretarea ansamblului rezultatelor de laborator obinute poate fi de folos n elucidarea implicrii patogenice a tulpinilor de Candida albicans.

S-ar putea să vă placă și