FISIOLOGA VEGETAL. TEMA 19. AUXINAS: INTRODUCCIN.

El descubrimiento de las auxinas surgi como algo colateral a otro tipo de investigaciones. Las observaciones sobre los tropismos contribuyeron al descubrimiento de las hormonas vegetales. Julius von Sachs, a finales del siglo XIX, postula la existencia de sustancias morfogenticas, algunas sustancias qumicas que eran responsables de los efectos morfogenticos. Charles Darwin se interesa en la capacidad de movimiento que poseen las plantas y principalmente sobre el fototropismo (movimiento de las plantas hacia un estmulo luminoso) en coleoptilos de gramneas. Boysen-Jensen provoca la curvatura en un coleoptilo decapitado, tras restituir el pice.

Las semillas de gramneas, al germinar, primero emiten la radcula. Tras esto desarrollan el coleoptilo, que tiene como misin proteger a la hoja primaria. Hasta que la semilla germinada no vence la barrera del suelo, el coleoptilo protege al meristemo contenido en la hoja primaria. Una vez que la semilla sobresale, el coleoptilo se rompe, y la hoja primaria sale al exterior, se desenrolla y comienza a captar la luz (autotrofa). Alguna sustancia deba sintetizarse para regular todo este proceso. Darwin, trabajando con coleoptilos de avena, utiliz una fuente de luz lateral y vio como los coleoptilos se orientaban hacia el lado de donde provena el foco luminoso. Cuando cort el pice del coleoptilo, ste no creca hacia la luz. Lo cubri con un material opaco, y tampoco haba respuesta fototrpica hacia la luz. Sin embargo, cuando lo cubri con un material transparente que permita el paso de la luz, s hubo respuesta hacia la luz. Tambin cubri el resto del coleoptilo, dejando libre el pice, con un material opaco y s haba respuesta. Esto indicaba que haba algo en el pice del coleoptilo, que en presencia de luz, era responsable del movimiento dirigido hacia la luz. Boysen-Jensen cort el pice del coleoptilo, pero lo mantuvo interconectado al resto de la planta con agar, s haba respuesta. Hizo lo mismo pero interponiendo una lmina de mica (impermeable) entre el pice y el resto del coleoptilo, y no haba respuesta. Esto quera decir que un compuesto sintetizado por el pice difunda al resto del coleoptilo y produca el fototropismo.

Ellos no saban qu compuesto era, despus se vio que eran las auxinas. La distribucin de auxinas es diferente en la zona enfrentada a la luz y en la que est de cara a la oscuridad, y esta diferencia de concentracin de auxinas en las clulas produce el fototropismo, ya que las clulas con ms auxinas (zona oscura) se elongan ms, lo que produce la curvatura. F. W. Went elabor, en 1928, el primer bioensayo que permita establecer una relacin entre la cantidad de estmulo aplicado y la respuesta fisiolgica observada. Went decapit un pice de coleoptilo y lo situ sobre un bloque de agar y una fuente luminosa. Tras un tiempo, puso slo el bloque sin pice sobre el coleoptilo decapitado, en ausencia de luz. En ausencia de luz pero con las sustancias que haban difundido al agar, si situaba el bloque de agar de forma que cubriera todo el coleoptilo decapitado, ste se alargaba hacia arriba uniformemente, pero no se curvaba porque la sustancia difunda por igual en los dos lados del coleoptilo. Si lo situaba sobre un lado u otro de manera desigual, provocaba una diferencia de concentracin y se produca la curvatura. Tras varios intentos, entre 1934 y 1935, dos grupos: Kijgl, Haagen-Smit y Erxleben, partiendo de orina humana, y K.V. Thimann, usando extractos de cultivos del hongo Rhizopus

Consiguieron obtener una sustancia a la que se denomin auxina, del griego hacer crecer o incrementar y cuya estructura qumica result ser la del cido indolil 3-actico, comnmente llamado cido indolactico o AIA. En 1946, el AIA se aisl por primera vez de plantas. Se detect la presencia de AIA endgeno en el endospermo inmaduro de semillas de maz. El compuesto presenta un ncleo indlico, derivado del Trp, con una cadena lateral de Acetato. En las plantas existen otras hormonas con efectos similares al AIA. AIA es la ms importante porque est distribuida ampliamente por todo el Reino vegetal. Otras auxinas naturales importantes, in vivo, son: cido fenilactico (detectado en tallos de tomate y girasol). cido 4-cloro-indolactico (en guisante). Es un derivado clorado. cido indolbutrico (IBA). Igual al AIA, pero la cadena lateral es un Butirato.

Los laboratorios han sintetizado compuestos qumicos sintticos similares, para abastecer a la Agricultura, como son: cido naftalenactico (ANA). cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D).

Factores que afectan a la actividad auxnica. Concentracin hormonal. Las respuestas que se producen tras la aplicacin de auxinas a las plantas dependen de la concentracin de hormona, as como del tipo de rgano tratado. Por ejemplo, en funcin de si se trata de raz, tallo o brote, la misma concentracin estimular ms o menos el crecimiento. En la raz se estimular ms y los tallos menos. Las auxinas actan en un rango de concentraciones hasta que llegan a un ptimo, pero superado ese ptimo (en cualquier rgano) producen un efecto contrario e inhiben la elongacin. Esto implica que podemos utilizar las auxinas con dos finalidades, estimular o inhibir el crecimiento (como herbicidas). La concentracin ptima de AIA para el crecimiento en la raz es de 10-7 g/L, por encima de esa cifra se inhibe el crecimiento. Para estimular el crecimiento del tallo, el ptimo est en 10-3 g/L, ms all de esta cifra se inhibe el crecimiento. El AIA tiene diferentes efectos a diferentes concentraciones, y tendr diferentes efectos en rganos distintos. Sensibilidad frente a las auxinas. Cada rgano presenta una sensibilidad diferente frente a la auxina. Las races son ms sensibles que las yemas, y stas ms sensibles que los tallos. La sensibilidad de un tejido u rgano puede variar con la edad y con las condiciones ambientales. La sensibilidad va a depender de: La concentracin de receptores hormonales. La efectividad de la unin receptor-hormona. Modulado por muchos factores ambientales.

Mtodos para cuantificar las auxinas. Bioensayos. Hasta hace pocos aos los bioensayos eran el nico mtodo para cuantificar estas hormonas. En la actualidad existen otros mtodos. Mtodos fsico-qumicos: HPLC, o cromatografa lquida de alta presin (detectores: fluorimtrico, electroqumico y masas). GC, cromatografa de gases (detector: masas). Inmunoensayo.

Crecimiento de segmentos de coleoptilo de avena. Bioensayo. Primero se hace una recta de calibrado. Se hacen secciones de coleoptilo de avena. Se van incubando secciones en distintas concentraciones de AIA. Esas secciones de coleoptilo, al cabo de 24h, habrn crecido ms o menos. Con esto realizamos una recta de calibrado. Luego hacemos un extracto de la planta que queremos estudiar. Incubamos secciones de coleoptilo en ese extracto y observamos el incremento de tamao de las secciones, y los comparamos con la recta de calibrado. La concentracin de AIA que se corresponda a ese incremento en el crecimiento ser la concentracin de AIA presente en el extracto. Test de la curvatura del coleoptilo de avena. Bioensayo. Se mide el grado de curvatura que induce la auxina al estar en contacto con un coleoptilo decapitado. Al decapitar el coleoptilo, eliminamos el lugar donde se sintetiza la hormona. Para producir la curvatura, colocamos bloques de agar que contenga auxina sobre la zona decapitada del coleoptilo en posicin distorsionada, es decir, que slo difunda a un lado del coleoptilo. El grado de curvatura producido en el coleoptilo va a ser proporcional a la cantidad de AIA. Con esto realizamos una recta de calibrado. Ahora midiendo el grado de curvatura en cualquier coleoptilo y comparando con la recta, podemos determinar el grado de AIA endgeno. Metabolismo y transporte de AIA. Vamos a analizar la biosntesis, la conjugacin y el catabolismo. Tambin veremos el transporte, aunque no pertenece a la ruta metablica. Tanto el metabolismo como el transporte van a determinar, regulando homeostticamente, que la planta tenga las cantidades de AIA necesarias para el crecimiento vegetal adecuado a cada momento y cada lugar. Biosntesis de AIA. Parece ser que la ruta mayoritaria para el AIA, que se da en la mayora de las especies, es la de la parte central de la figura. Todas parten del Trp. En la mayora de las plantas, la ruta del cido indolpirvico parte de Trp y, por un proceso de transaminacion se convierte en cido Indol-3-pirvico. Despus, mediante descarboxilacin, el 4

cido Indol-3-pirvico pasa a Indol-3-acetaldehido. Y ahora, mediante oxidacin, el Indol-3acetaldehido pasa a cido Indol 3-actico. Algunas plantas presentan la ruta de la Triptamina. El Trp sufre una descarboxilacin, que va a generar Triptamina. La Triptamina, mediante desaminacin oxidativa, se transforma en Indol3-acetaldehido. Otra ruta minoritaria que slo se da en las Crucferas (Brasicaceae), el Trp sufre una descarboxilacin oxidativa y se forma la Indol-3-acetaldoxima. ste compuesto puede pasar directamente a Indol-3-acetonitrilo por prdida de una molcula de H2O, o llegar a lo mismo mediante etapas intermedias. Este Indol-3-acetonitrilo, mediante una nitrilasa, pasa a cido Indol-3-actico.

Conjugacin de AIA. El AIA cuando se conjuga con otras protenas conserva su estructura, pero pierde su actividad biolgica. Auxina ligada y auxina conjugada son sinnimas. Se utiliza esta terminologa para determinar todos los compuestos que se forman mediante enlaces covalentes entre el AIA y otras molculas. Es frecuente la conjugacin con aminocidos, glucosa, oligosacridos, pptidos, protenas, etc. La unin de AIA con aminocidos se produce mediante enlaces amida, que forman compuestos como el cido indolacetilasprtico (AIAasp). Este nuevo compuesto no tiene actividad biolgica. La unin con azcares se produce mediante enlaces ster, para dar compuestos como el indolacetilglucsido (AIAglu).

Estos conjugados se dan como forma de almacenamiento de AIA, y se detectan en semillas u otros rganos de almacenamiento (reserva). Aunque estos compuestos son inactivos fisiolgicamente hablando, hay enzimas que pueden hidrolizar de nuevo el AIA cuando la planta requiera niveles de AIA libre.

En algunos tejidos, la mayor parte del AIA se encuentra en forma de conjugados. Cuando la clula detecta que necesita AIA libre para una etapa fisiolgica determinada, hidroliza los conjugados, liberando AIA fisiolgicamente activo. Estas estructuras conjugadas tienen otras funciones importantes, como proteger el AIA de la oxidacin por peroxidasa, es decir, actan como formas de proteccin del AIA frente al ataque peroxidativo. Adems, las estructuras conjugadas pueden actuar como un mecanismo de detoxificacin para eliminar el exceso de auxina, ya que a niveles elevados podan inhibir el crecimiento. Catabolismo de AIA. La oxidacin del AIA es un proceso catablico irreversible, que implica la prdida de la actividad biolgica de la hormona. La oxidacin puede ser descarboxilativa o no descarboxilativa. Estas dos rutas son irreversibles, como hemos dicho, y los productos resultantes carecen de actividad biolgica. 6

Catabolismo de AIA. Oxidacin descarboxilativa. La oxidacin descarboxilativa est catalizada por la AIA oxidasa, que tiene actividad peroxidasa. Hay compuestos que pueden modular la actividad catablica de esta hormona, activndola o inhibindola. Los compuestos que activan la reaccin son, el H2O2, los monofenoles, y algunos iones metlicos como el Mn . Aceleran la degradacin del AIA. Otros compuestos inhiben a la enzima, como los di- y polifenoles (Flavonoides). Estos compuestos fenlicos ms complejos protegen al AIA de la AIA oxidasa. Esto es importante, ya que algunos metabolitos secundarios como son los fenoles modulan el crecimiento, de forma indirecta, modulando la actividad de la AIA oxidasa. Los productos iniciales de la reaccin son indol-3-metanol y oxindol-3-metanol, dependiendo de que la oxidacin se produzca en la cadena lateral o el ncleo indlico, respectivamente. La descarboxilacin siempre se produce en la cadena lateral. En ambos casos es un proceso descarboxilativo. Resumiendo, en la ruta de la oxidacin descarboxilativa, la descarboxilacin se da en la cadena lateral. Adems, hay una oxidacin, que puede ser en la propia cadena lateral, dando como primer producto indol-3-metanol, o en el ncleo indlico, dando como primer producto oxindol-3-metanol.
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Catabolismo de AIA. Oxidacin no descarboxilativa. La oxidacin no descarboxilativa se produce en el anillo indlico de AIA sin prdida del grupo carboxilo. La reaccin da lugar al cido 2-oxindol-3-actico y, posteriormente, al cido 7hidroxi-2-oxindol-3-actico. A diferencia de la oxidacin descarboxilativa, la oxidacin no descarboxilativa slo se ha podido comprobar en ciertas especies.

Transporte de AIA. Todas las hormonas vegetales pueden recorrer distancias cortas entre clulas prximas, donde se movilizan por difusin. Tambin pueden llegar a los diferentes rganos a travs de los tejidos vasculares, por xilema o floema. Las auxinas no se movilizan a largas distancias como el resto de hormonas, tienen un mecanismo propio que las diferencia del resto. Se movilizan por los tejidos parenquimticos, es decir, clulas no vasculares, asociados a los elementos conductores (clulas del cambium, clulas asociadas a floema). Esta va de transporte polar con gasto de energa se denomina transporte polar activo. Es especfico de auxinas, y ninguna otra hormona lo presenta. Las principales caractersticas del transporte polar de auxinas son: La direccin del transporte est polarizada, es decir, se produce desde el pice hacia la base del tallo (transporte baspeto), y en la raz la direccin es preferentemente acrpeta, es decir, desde la base de la raz hacia el pice. El movimiento del AIA requiere energa metablica, ya que no se produce en ausencia de O2 ni en presencia de inhibidores de la sntesis de ATP. Diseccionamos un trozo de tallo. Colocamos bloques de agar con AIA radioactivo en la seccin que daba al pice, y un bloque de agar receptor en la base. Se ve que, transcurrido un tiempo, todo el AIA radioactivo se encuentra en la base. Si invertimos el tallo, se observa que el transporte est bloqueado. Esto indica que el transporte est polarizado, siempre va desde el pice al tallo. Las mismas conclusiones sacaramos en la raz, slo que sera acrpeto.

Esto, a nivel celular, se ha demostrado con la hiptesis quimiosmtica. La hiptesis quimiosmtica presupone el movimiento de AIA de una clula a la inmediatamente inferior a lo largo de una columna de clulas transportadoras. La entrada de AIA a las clulas transportadoras se producira por toda la superficie celular, bien mediante transportadores de entrada (difusin facilitada), bien por difusin simple del AIA no disociado (AIAH). Para que el AIA entre de forma no disociada debe existir un pH que facilite que est en forma protonada. La difusin estara favorecida por el gradiente de pH existente a ambos lados de la membrana plasmtica. Este gradiente de pH sera generado por bombas protnicas (H+/ATPasas de la membrana plasmtica) que mantendran un pH ms bajo en la pared celular (pH = 5) que en el citoplasma (pH entre 7 y 7.5). De esta manera entrara sin gasto de energa en la membrana plasmtica. La membrana plasmtica, permeable al AIA no disociado (AIAH), permitira la entrada de la molcula que, una vez en el interior de la clula, se disociara en AIA- + H+ debido al mayor pH. La membrana es impermeable al anin AIA-, que slo podra salir de la clula mediante transportadores especficos. La polaridad del transporte vendra dada por la distribucin asimtrica de estos transportadores de salida que estaran localizados, exclusivamente, en la base de las clulas transportadoras. La energa se necesita para mantener el gradiente de pH entre la pared celular y el interior de la clula (bombeo de protones) y para el transporte del AIA- por el plasmalesma basal mediado por transportadores. Fuera de la clula, el bajo pH de la pared regenerara la molcula de AIA (AIAH) que, de esta forma, entrara en la clula siguiente.

Otros experimentos que avalan esta hiptesis son el uso de compuestos que pueden acoplarse con los transportadores de salida de AIA e inhibir el transporte polar. Por ejemplo, los flavonoides como Genistena o Quercetina, u otros compuestos sintticos. Estos compuestos pueden bloquear el transporte de forma total o parcial, dependiendo de su concentracin y el nmero de transportadores que bloqueen. Van a inhibir el crecimiento al impedir que las auxinas lleguen al lugar donde son necesarias. El transporte polar desempea un importante papel en el modo de accin de las auxinas. La planta modula la velocidad e intensidad del transporte para que se sincronice con los niveles de auxinas necesarios en cada lugar de la planta y en cada momento. El transporte polar puede intervenir en procesos como: El crecimiento del tallo. La dominancia apical. La diferenciacin vascular. El enraizamiento de esquejes, etc.

Efectos fisiolgicos mediados por auxinas. Las auxinas estn implicadas en muchos procesos del desarrollo vegetal porque afectan a la divisin, crecimiento y diferenciacin de las clulas. Se ha visto que controlan: Alargamiento o elongacin de las clulas y, por tanto, el alargamiento de races y de tallos. Pero no van a necesitar la misma concentracin de auxinas, ya que las races tienen mayor afinidad por ellas, cambian los niveles ptimos. Divisin celular del cambium, la diferenciacin vascular, la formacin de races adventicias. A una rama se le corta el meristemo apical, la zona de sntesis de la auxina ha sido eliminada. A continuacin se hace una hendidura que afecta a los elementos conductores (el xilema). En una yema se aplic AIA exgeno y se vio que el xilema se diferenciaba.

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Formacin de races adventicias. Las auxinas favorecen la formacin de races adventicias. Se usa en invernaderos para enraizar ms rpido claveles y otras plantas ornamentales Estimulan la partenocarpia de los frutos. Un fruto partenocrpico se ha desarrollado sin tener semillas en su interior. A veces, en el ovario de la flor se concentran altos niveles de auxinas y giberelinas y lo toma como seal de que ha sido fecundado, desarrollando un fruto sin semillas. Dominancia apical. Las auxinas favorecen la dominancia apical, las citokininas las yemas laterales. Al eliminar el pice de una planta, la zona de sntesis de auxinas, la planta pierde la dominancia apical. Al poco tiempo, comienzan a crecer yemas laterales. Si tras esto, colocamos auxina exgena en el pice amputado, se inhibe la produccin de yemas axilares y vuelve a haber dominancia apical.

Tropismos. Movimientos para alejarse o acercarse a un estmulo. Si el estmulo es la luz, se conoce como fototropismo. Si es la gravedad, se denomina gravitropismo o geotropismo. Estn controlados por auxinas. Los tallos presentan fototropismo positivo y las races fototropismo negativo. En el tallo, hay mayor nivel de auxinas en el lado que no recibe luz y, por eso, crecen ms y se produce curvatura hacia el lado iluminado. Esto se produce por transporte lateral de auxinas desde la zona iluminada a la no iluminada. o Geotropismo. Se hicieron estudios microscpicos. Se vio que en las races verticales, en la zona de la cofia haba una serie de amiloplastos (plastos donde se acumula el almidn) dispuestos de forma uniforme sobre el RE, ejerciendo una presin. En las races obligadas a estar horizontales frente al suelo, se vio que los amiloplastos no se disponan de forma uniforme y, con lo cual, no haba una presin uniforme sobre el RE. Este desequilibrio de la presin sobre el RE es una seal diferencial que hace que la auxina se distribuya de forma 11

diferente en el espacio de la raz. El desequilibrio en la presin ejercida sobre el RE puede originar una seal diferencial correspondiente a la gravipercepcin, en la que existe una estrecha relacin entre los amiloplastos y el RE. Cuando la distribucin de los amiloplastos en el RE es simtrica, el AIA que llega a la raz se distribuye homogneamente en ambas mitades de la raz y crecen de manera sincrnica. Si obligamos a la raz a estar paralela al suelo, se produce una distribucin desigual de los amiloplastos sobre el RE y se produce una diferencia de presin. Esto va a provocar una distribucin diferente de AIA, que se distribuye a mucha mayor concentracin en la mitad inferior que en la mitad superior. Niveles tan altos inhiben el crecimiento en la mitad inferior de la clula de la raz, creciendo ms la mitad superior.

Mecanismo de accin de las auxinas. La pared celular es un entramado de fibras de celulosa unidas a hemicelulosas, sustancias pcticas y algunas protenas estructurales. El crecimiento implica una ruptura en algunos de

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estos enlaces para permitir la expansin celular. Es decir, la pared primaria debe perder parte de su rigidez para que la clula pueda elongarse. En el caso de las monocotiledneas parece existir una degradacin en ciertos glucanos de la pared, mientras que en las dicotiledneas probablemente tenga lugar una despolimerizacin en los xiloglucanos. La ruptura de puentes de hidrgeno entre microfibrillas de celulosa, mediada por las protenas llamadas expansinas, podra ser otro mecanismo importante. Hiptesis cida del crecimiento. La auxina provoca la excrecin de protones en las clulas que crecen (crecimiento primario). Tambin se produce una entrada masiva de H2O en la clula, aumenta el volumen de la vacuola y la presin de turgencia. La vacuola presiona a la membrana plasmtica, y sta a la pared celular. Como la pared celular ya no tiene tanta rigidez, se deforma y permite el alargamiento. La incubacin de los tejidos en medios cidos ejerce un efecto similar al de la auxina, mientras que la incubacin en disoluciones reguladoras neutras contrarresta el efecto de las auxinas. Para que este mecanismo tenga lugar debe producirse la unin entre la auxina y su receptor.

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Receptores auxnicos. Una protena se considera receptor auxnico cuando presenta una elevada especificidad para estas sustancias (naturales o sintticas), as como una alta afinidad. La unin debe ser reversible. El receptor ms aceptado, por el momento, es una ABP-1 (auxin binding protein 1) aislada en coleoptilos de maz y consistente en un dmero con dos subunidades de 22 kDa cada una. La accin de la auxina es doble. Activa el bombeo de protones desde el citosol a la pared celular, es decir, activa las ATPasas. Cuando la auxina se acopla con el receptor (que no se sabe si es soluble o de membrana) hay una mayor tasa de liberacin de protones del citosol a la pared. El pH en la pared baja, y se activan las enzimas hidrolticas que van a despolimerizar a la pared. El AIA tambin puede activar segundos mensajeros que activaran la sntesis de mRNA para ATPasas. Es decir, estimulan la actividad y la sntesis de novo de las ATPasas. La fuerza impulsora del crecimiento es la entrada de agua, la auxina provoca que la entrada de agua pueda alargar a la clula debilitando la pared primaria.

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