Sunteți pe pagina 1din 4

Faza solida de sinteza a oligonucleotidelor Acest ciclu incepe cu un nucleoside care are la capatul 3 atasat un CPG(controlled pore glass)iar

la capatul 5 este blocat de dimetoxytritil-DMT Etape ale sintezei oligonucleotidelor SPALAREA 1)Pt a indeparta apa si gruparile nucleofile prezente se spala cu un reactive anhidru(acetonitril). 2) pt a curata de reactivul anhidru , reactiei de coloana i se atribuie un jet de heliu sau argon DETRITILAREA 1) Pt a obtine un reactive cu o grupare 5 hidroxil, 5-DMT se inlatura de la nucleozidul unde este atasat prin tratamentul cu acid dicloracetic (DCA)sau tricloracetic(TCA) 2) Acest tratament este urmat de spalarea cu acetonitril ,pt a indeparta DCA sau TCA ,apoi adaugarea unui jet argon SPALAREA DIN NOU

FOSFORAMIDITE Pt a fi adaugate lantului de crestere fiecare nucleotide are: DMT si un grup fosfat atasate capetelor 5-OH si 3 -OH respective o deoxiriboza O diisopropilamina si o grupare metil(cyanoetil) atasat de 3-fosfit daca baza este reactiva functiilor NH2 precum in A G SAU C, atunci derivati N-benzoil sau Nisobutiril sunt folositi pt a impiedica reactia lor

ACTIVAREA SI CUPLAREA Nucleotida urmatoare (fosforamidit) si tetrazolul sunt introduse simultan Tetrazolul activeaza fosforamidit-ul astfel incat 3-fosfit formeaza o legatura covalenta cu grupul 5- OH al nucleozidului initial. Acest pas este urmat de spalare(pt a indeparta fosforamiditele si tetrazolul) si de adaugarea unui jet de argon. spararea reluare

ADAUGAREA UNEI GRUPE PROTECTOARE 1) Anhidrida acetica si dimetiloaminopirimidina SUNT FOLOSITE PT A ACETILA GRUPAREA 5HIDROXIL a nucleozidelor detritilate nereactionate 2) acetilarea previne sinteza oligonucleotidelor de diferite lungimi si compozitie nucleotidica diferita. OXIDAREA 1) Dupa cuplare,legaturile internucleotidice sunt legaturi nestabile de fosfit triester predispuse la rupere sub efectul conditiilor acide sau bazice. 2) in prezenta unui amestec de iod, legatura fosfit triester este oxidata in fosfat triester pentavalent mai stabil 3) reactia de oxidare stabilizeaza si faca ca legatura fosfodiesterica sa fie mai putin suscetibila la rupere. SPALARE REPETARE INLATURAREA OLIGONUCLEOTIDELOR DIN COLOANA 1) Fiecare fosfat triester contine cate un grup metil sau cyanoetil 2) fiecare guanina citozina si adenina poarta grupul amino- protector 3) capatul terminal 5 al ultimului nucleotide are un grup DMT

INLATURAREA OLIGONUCLEOTIDELOR DIN COLOANA 1) Grupurile metil si cyanoetil sunt inlaturate printr-un tratament chimic in coloana de reactie. 2) Lanturile oligonucleotidice sunt clivate de la molecula spacer lasand un capat 3OH 3) oligonucleotidele sunt eluate din coloana si succesiv, gruparile benzoil si izobutiril sunt deposedate iar grupul DMT inlaturat 4) capatul terminus5-OH este fosforilat fie prin proceduri enzimatice fie chimice

CURSUL 7 ABORDARI DE A IZOLA ADN-UL

FAGII Inocularea celulelor suscetibile,colectarea lizatului,extractia proteinelor,precipitarea ADN-ului BACTERIA cultivarea celulelor,tratarea acestora cu lyzozime, adaugarea de detergent slab,(ex. triton x100)purificarea ADN-ului pe un gradient Cs Cl DROJDI Cresterea celulelor, tratare izotonica cu glusease, lizarea celulelor cu un detergent slab, purificarea ADN-ului pe un gradient CsCl Mucegaiuri cultivarea si recoltarea miceililor , tratarea izotonica cu novozima,lizarea cu ajutorul detergentului, purificarea ADN-ului pe un gradient CsCl PLANTE Inghetarea frunzelor in nitrogen lichid, distrugerea celulelor,liza cu SDS, purificarea ADN-ului pe un gradient Cs Cl CULTURA testurilor folosind un monostrat , se lizeaza celula tratand cu SDS proteinaza K la un pH alcalinde (9) ,se bobineaza ADN-ul pe o bagheta de sticla si se dizolva in TE buffer ORGANE inghetarea tesutului si mojararea acetuia in nitrogen lichid, lizarea celulelor cu SDS, indepartarea proteinelor cu poteinaza K si fenol, bobinarea ADN ului pe o bagheta de sticla si se dizolva in TE buffer

extractia FENOL:CLOROFORM O metoda comuna de indepartare a proteinelor este extractia fenol:cloroform fenolul si cloroformul sunt solventi organici care denatureaza si indeparteaza proteinele sin solutiile apoase. Ambi solventi se separa si sunt mai grei decat apa asfel incat o solutie de ADN cu fenol:cloroform ,de aceea se gaseste intro faza organica mica care contine fractiunea proteica extractia utilizeaza o mixtura de 25:24:1 fenol: cloroform :alcool izoamilic , acesta din urma ajuta la separarea fazei organice de cea apoasa ELECTROFOREZA

una din cele mai raspandite metode folosite in biochimie si biologi e moleculara. este o methoda analitica si preparativa pt separarea particulelor incarcate sub influenta unui camp electric. Acizi nucleici au constant sarcina electrica negativa data de scheletul fosfat. Fiind molecule incarcate negativ...acizi nucleici micreaza spre sarcina pozitiva(anod). SEpararea (intru mediu de suport)...electroforetica este bazata pe mobilitatea diferita a moleculelor de diferite dimensiuni in matrixa de gel. Moblitatea este data de incaracarea electrica , marime si forma(conformatie)

efectul dde nush ce matrici de gel Conformatiile moleculelor DNA sa RNA sunt legate in special de temperaura si concentratia agentilor de denaturare . conformatiile pot suferii tranzitii structurale sau conformationale. Stabilitatea anumitor conformatii pot fi studiate in detaliu cu ajutorul electroforezei.

Efectul brourii de etidiu