16.

Terapia infeciilor bacteriene Antibioticele sunt substane chimice cu greutate molecular mic, produse de microorganisme prin procese de biosintez, semisintez sau prin sintez chimic, care n concentraie mic inhib multiplicarea sau omoar microorganismele (Mihescu i colab., 2008). Datorita specificitii lor de aciune, antibioticele manifest eficien diferit fa de diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic definete spectrul de activitate al antibioticului respectiv (Fig. 361). n funcie de numrul i diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi: - larg (de exemplu, spectrul de aciune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative, inclusiv chlamidii i rickettsii i specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active n special fa de specii Gram-pozitive, dar i Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un numr mare de specii bacteriene Gram-pozitive i Gram-negative i pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente); - ngust (novobiocina este activ pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar i pe coci i bacili Gram-negativi, cum ar fi Haemophilus sp. i Pasteurella sp.; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram pozitive); - limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe). Chiar n cadrul aceleiai specii microbiene, pot exista diferene mari de sensibilitate a diferitelor tulpini fa de un anumit antibiotic, astfel c stabilirea tratamentului cu antibiotice n clinic necesit izolarea tulpinii microbiene care reprezint agentul etiologic al infeciei respective (mai ales dac acesta aparine unor genuri i specii supuse fenomenului de dobndire a rezistenei clinice) i determinarea spectrului su de sensibilitate la antibiotice.

Fig. 361. Reprezentarea spectrului de activitate al principalelor clase de antibiotice (http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/micro%20resources.htm).

Activitatea antimicrobian in vivo este mult mai complex, implicnd pe lng antibiotic i agentul antimicrobian, i factorul gazd. Astfel, n organismul gazd o serie de factori locali (presiunea parial a O 2, pH etc.) influeneaz activitatea antibioticului. Datorit multiplelor mecanisme de aprare ale gazdei, microorganismele au o rat metabolic redus, ceea ce scade eficiena antibioticelor. Pe de alt parte antiboticele se absorb din tractul intestinal i se distribuie inegal n diferite esuturi i umori ale organismului i foarte puine realizeaz concentraii active n SNC sau n interiorul celulelor eucariote. De asemenea, este foarte dificil de meninut concentraia activ a antibioticului pe o perioad mai lung de timp, de aceea intervalul dintre doze trebuie respectat riguros. Unele antibiotice au efect postantibiotic (de exemplu carbapenemii fa de bacilii Gram-negativi), i pot modula rspunsul inflamator, n sensul cronicizrii reaciei inflamatorii datorit

acumulrii de fragmente bacteriene. De asemenea, antibioticele pot determina apariia unei stri de disbioz, care favorizeaz suprainfecia cu tulpini microbiene rezistente (Pseudomonas sp., Clostridium difficile, Candida albicans). Antibioticele exercit efecte toxice asupra gazdei i pot induce reacii de hipersensibilitate. Adiministrarea empiric a antibioticelor, nainte de izolarea i identificarea agentului infecios i de determinarea pattern-ului de sensibilitate la antibiotice, poate masca o infecie grav i poate conduce la dezvoltarea rezistenei la antibiotice n populaiile microbiene. Asocierea a a dou sau mai multe substane antimicrobiene este recomandat n cazul infeciilor foarte severe, n cazul infeciilor cornice, pentru evitarea apariiei mutantelor rezistente (ex. tuberculoz), n infeciile mixte, pentru obinere unui sinergism de aciune i a unui efect puternic bactericid (ex. aminoglicozide i beta lactamice, trimetroprim i sulfametoxazol, amfotericina i flucitozina, inhibitorii de beta-lactamaze i beta-lactamicele). Efectul antagonist poate aprea atunci cnd un antibiotic bacteriostatic este asociat cu unul bactericid. Medicamentele antimicrobiene acioneaz pe urmtoarele ci (Fig. 362): - inhibiia sintezei peretelui celular; - inhibiia funciilor membranei celulare; - inhibiia sintezei proteinelor la diferitele trepte (traducerea i transcrierea materialului genetic); - inhibiia sintezei acizilor nucleici; - blocarea unei ci metabolice prin inhibiie competitiv.

Fig. 362.Principalele inte de aciune ale substanelor antimicrobiene (http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/micro%20resources.htm)

Inhibiia sintezei peretelui celular. Antibioticele beta-lactamice Peretele mureinic este o cu o structur nchis, legat covalent, care permite adugarea noilor uniti pentru cretere. Straturile de murein sunt adugate secvenial pe faa extern a membranei citoplasmatice, n proximitatea ei, chiar sub stratul mureinic anterior. Pe msur ce noile straturi de murein sunt adugate, cele vechi sunt deplasate spre exterior i sunt supuse unor fore de ntindere tot mai mari, pn la limita elasticitii lor. n acest punct, autolizinele sunt extruzate din celul i hidrolizeaz stratul cel mai tensionat. Fragmentele mureinice sunt eliberate i uneori chiar reutilizate. Sinteza mureinei are loc n 3 stadii. n primul stadiu, n citoplasm, se sintetizeaz precursorii solubili cu greutate molecular mic - UDP-GlcAc i UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mezoDap-D-Ala-D-Ala. Unii ageni antibacterieni interfer cu treptele timpurii ale sintezei peretelui. Iniial, la UDP-MurNAc este adugat un tripeptid, la care va fi legat dipeptidul D-ala-D-ala, sintetizat de o enzim specific. D-ala este produs din L-ala sub aciunea alanin-racemazei.

Stadiul al doilea al sintezei peretelui celular este catalizat de enzime legate de membran. Regiunea non-nucleotidic a moleculei precursoare sintetizat anterior (intermediarul N-acetil glucozamina i acidul Nacetil muramic-pentapeptid) este ataat la un purttor lipidic (undecaprenol-pirofosfat, denumit bactoprenol), genernd lipidul I. Acesta este integrat n membran i modificat ulterior prin adugarea GlcNac i pentaglicinei. Se formeaz undecaprenol pirofosfat-MurNac(-L-Ala-D-Gln-(NH2-(Gly5)L-Lys-D-Ala-D-Ala)(1-4)-GlcNac (lipidul II) i este translocat prin membrana plasmatic. Lipidul II are rol de substrat pentru reacia de transglicozilare, polimeriznd catenele glican ale peretelui celular bacterian. Rezult astfel dizaharidul repetitiv (MurNac-GlcNac)n. Purttorul lipidic are rol de punct de ataare de membran pentru precursori i permite transportul subunitilor prin interiorul hidrofob al membranei citoplasmatice, la suprafaa celulei. n stadiul al treilea al sintezei, subunitile peptidoglicanice sunt polimerizate prin inseria n peretele celular existent. Polimerizarea se face prin transferul peptidoglicanului nou, de la purttorul su localizat n membran, la peptidoglicanul parietal preexistent, printr-o reacie de transpeptidare ce implic lanurile peptidice ale ambilor polimeri, dintre care unul trebuie s posede resturi D-ala-D-ala terminale. Reacia este catalizat de un complex de enzime secretate prin membran. Ele sunt autolizine, transglicozilaze i transpeptidaze, toate cu aciune degradativ strict controlat asupra peretelui celular, permind creterea i diviziunea celulei. Polimerizarea glucidului i legarea ncruciat a catenelor tetrapeptidice, denumit reacia de transpeptidare, este catalizat de proteine-enzime care leag penicilina (penicillin binding proteins - PBP), localizate la nivelul membranei citoplasmatice i n spaiul periplasmic. Dizaharid-pentamuropeptidul extruzat prin membrana citoplasmatic, este inserat n reeaua mureinic n cretere. Peptidul se leag de un alt peptid ce aparine altui lan. Legarea celor dou dizaharidpentamuropeptide prin secvenele terminale se face cu consum de energie furnizat de reacia de transpeptidare i pierderea D-ala terminal a uneia dintre cele dou muropeptide. Rezult astfel un nonamuropeptid (pentatetrapeptid). Restul D-ala al celuilalt muropeptid este adeseori hidrolizat i rezult un octa- sau chiar un heptamuropeptid. Diferitele enzime int ale antibioticelor sunt denumite generic PLP (lb. francez - protein liant les penicillines) sau PBP (lb. englez -penicillin binding protein). Funcia enzimatic a fiecrei PBP a fost studiat n detaliu la E. coli. La aceast specie exist patru PBP cu greutate molecular mare (PBP 1a, 1b, 2 i 3). Toate sunt enzime bifuncionale: catalizeaz transpeptidarea i transglicozilarea peptidoglicanilor. Rolul PBP ca enzime implicate n procesul final al formrii peretelui mureinic a fost descoperit prin marcare cu penicilin G radioactiv. PBP sunt enzime care catalizeaz reaciile de legare ncruciat ntre polimerii peptidoglicanului, una dintre treptele finale n procesul asamblrii peretelui celular. La Staphylococcus aureus, PBP au funcii fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze i carboxipeptidaze. Unele PBP sunt eseniale pentru supravieuirea i creterea celulei. Existena PBP eseniale este argumentat de mutantele care nu sintetizeaz PBP i sunt condiionat letale. Transpeptidazele (transamidaze) acioneaz asupra mureinei prin clivarea unor legturi peptidice critice i reformarea legturii cu alt partener peptidic: legtura D-ala-D-ala este clivat i tetramuropeptidul rmne legat de enzim, pn cnd alt muropeptid furnizeaz un grup amino al unui rest de acid diaminopimelic. Autolizinele (hidrolaze) leag apa n locul gruprii amino i n reacia de hidroliz a mureinei elibereaz D-ala. Aciunea lor mpiedic formarea legturilor transversale locale i distruge mureina numai ntr-o zon strict limitat a peretelui. Baza aciunii antibioticelor -lactamice const n aceea c substratul transpeptidrii captul carboxil al D-ala din structura intermediarului dizaharid-tetrapeptid - are omologie structural strns cu inelul lactamic (fig. 363). Antibioticele -lactamice inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanilor, adic formarea punilor interpeptidice. Aceti compui prezint analogie structural cu dipeptidul terminal D-ala-D-ala, care face parte din pentapeptidul mureinic. Antibioticele acioneaz ca pseudosubstraturi i acileaz situsurile active ale transpeptidazelor PBP, care devin astfel incapabile s catalizeze reaciile de polimerizare ale subunitilor mureinice. Reacia de acilare a PBP este foarte lent reversibil. Enzimele PBP deacilate devin incapabile s catalizeze reaciile de legare

ncruciat a peptidelor. Complexul antibiotic-PBP stimuleaz eliberarea autolizinelor, cu efect degradativ asupra peretelui celular, care are drept consecin liza osmotic a celulei bacteriene.

Antibioticele beta-lactamice sunt divizate in 4 subclase: peniciline, cefalosporine, monobatcami i carbapenemi. Antibioticele -lactamice inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanului, adic formarea punilor interpeptidice. Aceti compui prezint o analogie structural cu dipeptidul terminal D - ala - D - ala, care face parte din pentapeptidul mureinic. Penicilina G este antibioticul de elecie n cazul infeciilor cu streptococi, pneumococi, meningococi, spirochete, clostridii, bacli aerobi Gram-pozitivi, streptococi sensibili la penicilin, gonococi i actinomicete, enterococi (pentru un efect bactericid, acest ultim caz necesit asocierea cu un aminoglicozid). Benzatin penicilina G (moldamin sau penicilina retard) este o sare geu solubil care administrat intramuscular asigur o concentraie activ pe o durat lung de timp. De exemplu, o singur de doz de 1.2 milioane UI (0.7 g) este suficient pentru tratamentul faringitei streptococice cu streptococ de grup A i al sifilisului primar. Doze succesive administrate odat la 34 sptmni asigur profilaxia reinfeciei cu streoptococi de grup A la pacienii cu febr reumatic. Stafilococii productori de beta-lactamaz necesit tratament cu peniciline rezistente la beta-lactamaze (oxacilin). Amoxicilina administrat oral se absoarbe mai bine dect penicilina i asociat cu acidul clavulanic este extrem de eficient n terapia infeciilor cu H influenzae productor de beta-lactamaz. Ticarcilina este foarte activ pe bacili Gram-negativi, fiind administrat n sepsisul cu bacterii Gram-negative, asociat cu un aminoglicozid. Piperacilina este foarte activ fa de Pseudomonas sp. Penicilinele au toxicitate foarte sczut comparativ cu alte clase de antibiotice, efectele secundare fiind rezultatul reaciilor alergice la penicilin (alergenul major este acidul peniciloic, rezultat din hidroliza acidului 6-aminopenicilanic). n doze foarte ridicate, pot produce ocazional iritaii ale SNC (encefalopatie, delir, convulsii), sngerri, nefrit interstiial sau diaree.

Fig. 363. Structura diferitelor peniciline, n raport cu nucleul de baz beta-lactamic i cefalosporine, raport cu nucleul de baz 7 aminocefalosporani (Brooks i colab., 2007).

Cefalosporinele de generaia I (CG I) (cefalotin, cefazolin, cefalexin etc) sunt foarte active fa de cocii Gram-pozitivi, mai puin enterocii i stafilococii productori de beta-lactamaz i moderat active fa de E coli, Proteus sp. i Kebsiella sp (fig. 364). Cefalosporinele de generaia a II-a (CG II) (cefamandol, cefuroxim, cefalcor, cefoxitin, cefotetan, cefprozil) au un spectru similar cu al celor precedente, dar sunt active i pe Proteus sp. i Kebsiella sp., dar nu pe pseudomonade (fig. 363). Cefalosporinele de generaia a III-a (CG III) (cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefotetan, ceftizoxim, cefoperazon, cefixim) au activitate redus pe coci Gram-pozitivi, exceptnd S. pneumoniae; enterococii sunt natural rezisteni. n schimb, sunt foarte active pe bacili Gram-negativi, inclusiv P. aeruginosa i Burkholderia pseudomallei (fig. 363). De asemenea, pot traversa bariera hematoencefalic, cefotaximul, ceftriaxona i ceftizoximul fiind administrate intravenos pentru tratamentul sepsisului i meningitei produse de bacterii Gram-negative. Cefalosporinele de generaia a IV-a (CG IV) (cefpiroma, cefepimul) prezint activitate fa de Enterobacter i Citrobacter rezistente la celelalte cefalosporine, fa de P. aeruginosa, streptococi i stafilococi sensibili la nafcilin (fig. 363). Cefalosporinele pot de asemenea genera reacii de hipersensibilitate (alergia ncruciat cu penicilinele apare n 5% din cazuri), tromboflebit dup administrarea intravenoas, hipotrombinemie, reacii disulfiram (este interzis consumul de alcool n timpul tratamentului), suprainfecii cu bacterii rezistente (ex. enterococi). Monobactamii (aztreonam) au un nucleu lactam monociclic i sunt rezisteni la aciunea betalactamazelor, sunt activi fa de bacili Gram-negativi, dar nu fa de coci Gram-pozitivi i bacterii anaerobe, care pot genera suprainfecii la pacienii tratai cu monobactami. Carbapenemii (imipenem, meropenem, ertapenem) sunt rezisteni la aciunea Ser-betalactamazelor, dar sunt inactivai de dihidropeptidaze la nivelul tubulilor renali i de ctre metalobeta-lactamaze. Sunt activi fa de bacili Gram-negativi, coci Gram-pozitivi i bacterii anaerobe, au o buna distribuie tisular, traverseaz BHE.

Nucleu monobactamic

Nucleu carbapenemic

Transpeptidazele (PBP) sunt diferite la bacteriile Gram-pozitive, Gram-negative i respectiv anaerobe, ceea ce explic ntr-o oarecare msur diferenele activitii antibacteriene a antibioticelor -lactamice. Legarea unui antibiotic -lactamic la PBP determin modificri morfologice ale celulei bacteriene: de exemplu, unele antibiotice se leag de PBP implicat n formarea septului de diviziune. Consecina este c celulele continu s creasc sub forma filamentelor lungi. Legarea de alt PBP duce la liza rapid a bacteriei, deoarece peretele proemin i celula se sparge. Mecilinam (amidino-penicilina) nu se leag de PBP ale bacteriilor Gram-pozitive i nu influeneaz creterea lor, iar aztreonam se leag numai de PBP ale bacteriilor Gram-negative i nu inhib creterea celor Gram-pozitive sau anaerobe. Rezistena la antibioticele -lactamice este conferit pe urmtoarele ci: - sinteza -lactamazelor; - mutaiile PBP, al cror efect este reducerea afinitii de legare cu antibioticele -lactamice; - nglobarea diminuat a antibioticelor datorat modificrii de permeabilitate a peretelui celular sau activitii pompelor de eflux. Cel mai important mecanism de rezisten la antibioticele -lactamice const n sinteza enzimelor cu efect hidrolizant asupra antibioticelor. Unul dintre primele rapoarte cu privire la rezistena antibioticelor a fost

referitor la o tulpin bacterian productoare de lactamaz, o enzim ce hidrolizeaz legtura -lactamic a acestei clase de antibiotice.

Aceast legtur este esenial pentru activitatea antibioticelor -lactamice, deoarece are rolul de analog al legturii peptidice ce leag D-ala terminal a peptidului de monomerul peptidoglicanic. -lactamazele sunt enzime foarte eficiente: o singur molecul poate hidroliza peste 100 000 de molecule -lactamice. lactamazele sunt o familie mare de enzime cu structur unitar, toate cliveaz ciclul -lactamic i inactiveaz antibioticul, dar difer prin secvena aminoacizilor. Spectrul lor de activitate este restrns. -lactamazele s-au diversificat prin mecanismul mutaiilor punctiforme ce se acumuleaz gradat n genele codificatoare. Clasificarea -lactamazelor. -lactamazele s-au clasificat n funcie de substratul pe care-l hidrolizeaz, de sensibilitatea la inhibitori, de modul de producere (constitutiv sau inductibil) i de localizarea cromosomal sau plasmidial a genelor codificatoare. -lactamazele pot fi penicilinaze (cele care acioneaz asupra penicilinelor) sau cefalosporinaze (hidrolizeaz cefalosporinele) (fig. 365). Unele au spectru larg de aciune (cele care hidrolizeaz penicilinele i cefalosporinele). -lactamazele produse de S. aureus i S. epidermidis sunt exoenzime, pe care celula le elimin n mediul extracelular, n cantiti mari. -lactamazele produse de bacteriile Gram-negative sunt endoenzime, pe care celula le sintetizeaz i le concentreaz n spaiul periplasmic. Enzimele hidrolitice sunt polipeptide, al cror punct izoelectric este 8,9. Clasificarea pe baza secvenei de nucleotide a genelor codificatoare recunoate 4 clase de -lactamaze: A, B, C, D. Aceast clasificare este stabil i reflect raporturile fundamentale ce nu pot fi modificate de mutaii.

Fig. 365. Situsurile de aciune a -lactamazelor (indicate de sgei).

Enzimele din clasele A, C i D au serin la situsul activ, iar cele din clasa B au 4 atomi de Zn.
8

-lactamazele claselor A i B sunt foarte active fa de benzil-penicilin i respectiv, peniciline i cefalosporine. Enzimele clasei C sunt n general inductibile, dar mutaiile genelor codificatoare pot duce la supraexpresie. Enzimele clasei D sunt de tip OXA, deoarece hidrolizeaz preferenial oxacilina.

Acid clavulanic

Tazobactam

Sulbactam

Unele antibiotice beta-lactamice sunt lipsite de activitate antimicrobian, dar leag cu mare afinitate beta-lactamazele (acid clavulanic, tazobactam, sulbactam). Acestea sunt utilizate in asociaie cu penicilinele sau cefalosporinele, pentru a extinde spectrul acestora asupra bacteriilor productoare de beta-lactamaze codificate plasmidial, sensibile la inhibitori, inclusiv beta-lactamaze de spectru larg, care hidrolizeaz penicilinele i cefalosporinele (CGI, CGII, CGIII i CGIV). Unele beta-lactamaze, codificate de gene cromozomale, sunt rezistente la inhibitori de tipul acidului clavulanic. Penicilinele de timpul Cloxacilinei, Meticilinei, Oxacilinei, Nafcilinei sunt rezistente la aciunea betalactamazelor, probabil datorit lanului R lung care impiedic legare enzimei la nucleul beta-lactamic.

Cloxacilin Oxacilin Meticilin Beta-lactamazele de clas B, care au in centrul catalitic activ Zn sunt sensibile la chelatorii de metale bivalente de tipul EDTA. Rezistena natural prin scderea afinitii ntre inta bacterian i antibiotic. Micoplasmele, bacterii lipsite de perete celular, sunt natural rezistente la aciunea antibioticelor care acioneaz la acest nivel (enzimele PBP). La alte specii bacteriene, PBP manifest afinitate natural slab pentru antibioticele -lactamice. Este cazul aztreonamului, inactiv asupra bacteriilor Gram-pozitive i anaerobe stricte (Georgopapadakou, 1982), cefsulodinului inactiv fa de enterobacterii (Barry, 1981) i cefalosporinelor i penicilinei M inactive fa de enterococci. Rezistena la lactamice la bacteriile Gram pozitive. Utilizarea n clinic pe scar larg a -lactamilor, constituie factorul major selectiv care influeneaz sinteza -lactamazelor de ctre agenii patogeni. S. aureus este de obicei rezistent la benzil-penicilin, deoarece majoritatea tulpinilor izolate (80-95%) produc penicilinaz. Rezistena tulpinilor de S. aureus la meticilin se datoreaz legrii antibioticului de ctre PBP, cu rol n sinteza peretelui celular. Dup legarea antibioticului, PBP se inactiveaz i sinteza peretelui celular este inhibat. Rezistena la concentraiile mari de -lactamice este totdeauna dependent de sinteza unei noi variante biochimice de PBP (PBP2), codificate de o gen cromosomal. Expresia genei este constitutiv sau inductibil de ctre unele antibiotice -lactamice. Rezistena la concentraiile mici de meticilin se datoreaz producerii lactamazei, creterii nivelului PBP sau diminurii afinitii de legare a antibioticului de proteinele implicate n sinteza peretelui celular (PBP).

Rezistena la concentraiile mari este totdeauna dependent de sinteza unei noi variante biochimice a PBP (PBP2), codificat de gena mecA, cu localizare cromosomal. Proteina PBP2 are o afinitate mic pentru cele mai multe antibiotice -lactamice. Expresia genei mecA este constitutiv sau inductibil n prezena unor antibiotice -lactamice. Rezistena la meticilin a tulpinilor de S. aureus (MRSA) este mai mare la 30oC dect la 37oC i se datoreaz producerii PBP2, care nu este sensibil la aciunea meticilinei. n unele cazuri, singurele medicamente eficiente pentru tratamentul infeciilor cu S. aureus rezistente la meticilin sunt antibioticele glicopeptidice ca vancomicina. Rezistena tulpinilor de Str. pneumoniae la penicilin se datoreaz prezenei PBP modificate, n special PBP2, care au o afinitate redus pentru penicilin. La Str. pneumoniae, -lactamazele nu au fost niciodat detectate, dar diferitele tulpini codific 6 variante biochimice de PBP: PBP 1a, 1b, 2a, 2b, 2x i PBP3. Antibioticele cu structur -lactamic formeaz un grup de antibiotice larg utilizate n clinic pentru terapia infeciilor bacteriene, dar sunt deosebiri foarte mari n ceea ce privete spectrul i intensitatea aciunii antibacteriene. Diferenele se datoreaz afinitii diferite de legare cu transpeptidazele bacteriene, enzime implicate n sinteza peretelui celular sau cu enzimele care inactiveaz antibioticul (-lactamaze). Rezistena natural la lactamice prin -lactamaze la bacilii Gram-negativi. La Klebsiella, rezistena este legat de sinteza unei -lactamaze cromosomale cu spectru larg care antreneaz rezistena la peniciline, anulat prin administrarea de inhibitori enzimatici ca acidul clavulanic, sulfbactam sau tazobactam. La Enterobacter, Serratia, Morganella, Providencia, Ps. aeruginosa, rezistena este determinat de producerea unei -lactamaze cromosomale de tipul cefalosporinazei (Bush, 1995). Terapia infeciilor cu Ps. aeruginosa se realizeaz cu aminoglicozide i cu -lactamice. Rezistena celulelor de Ps. aeruginosa se datoreaz permeabilitii sczute a peretelui, precum i sintezei de -lactamaze. Serratia marcescens produce n mod natural o enzim codificat de o gena cromosomal capabil s inactiveze kanamicina, tobramicina, netilmicina i amikacina, iar Providencia stuartii produce o enzim capabil s inactiveze neomicina, gentamicina, tobramicina i netilmicina. Speciile anaerobe aparinnd genului Bacteroides i care fac parte din microbiota tubului digestiv al omului, sunt natural rezistente la aminopeniciline i la numeroase cefalosporine prin producerea de -lactamaze codificate de gene cromosomale cu spectru larg, care sunt inhibate de acidul clavulanic. Glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina) inhib stadiul iniial al sintezei peptoglicanului (prin legarea de dipeptidul carboxi-terminal D-Ala-D-Ala (fig. 364), se absorb slab din intestin, aadar nu se administreaz pe cale oral, cu excepia cazurilor de colit pseudomembranoas post tratament cu antibiotic. Vancomicina este bactericid pentru stafilococi, clostridii i unii bacili. Se administreaza intravenos n tratatmentul infeciilor cu stafilococi rezisteni la meticilin, iar in edocardita sau sepsisul cu enterococi se asociaz cu o penicilin.

10

Fig. 364. Reprezentarea etapelor biosintezei peptidoglicanului i a mecanismului de aciune a vancomicinei (Courvalin, 2006).

Structura vancomicinei

Teicoplanina are structur similar cu cea a vancomicinei, este activ fa de stafilococi, streptococi, enterococi i alte bacterii Gram-pozitive. Cocii Gram pozitivi (Leuconostoc sp.) i Lactobacillus sp. sunt rezisteni pentru c lanul lateral al peptidoglicanului const din D-alanil-D-lactat, care are afinitate mai mic pentru antibioticele glicopeptidice.

11

Ca efecte secundare, pot aprea tromboflebita, erupii cutanate, leucopenie, ototoxicitate, nefrotoxicitate.

Structura teicoplaninei

Bacitracina (un peptid ciclic) mpiedic defosforilarea moleculei lipidice purttoare, ce transfer molecula de peptidoglican nou sintetizat, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Este toxic pentru rinichi i de aceea nu se administreaz sistemic, dar se aplic local pentru tratamentul leziunilor tegumentare i ale membranelor mucoase.

Structura bacitracinei

Cicloserina inhib competitiv formarea D-ala din L-ala i astfel stopeaz sinteza dipeptidului D-ala-Dala. Este relativ toxic i se folosete pentru tratamentul infeciilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte medicamente.

12

Fosfomicina este un inhibitor al piruvil-transferazei i astfel blocheaz sinteza acidului N-acetilmuramic. Cicloserina i fosfomicina se comport ca analogi ai precursorilor peptidoglicanului. Sunt molecule foarte hidrofile i ptrund n citoplasm pe calea sistemelor de transport pentru metaboliii nrudii: fosfomicina este anolog structural cu fosfo-enol-piruvatul, iar cicloserina este analog D-alaninei:

Structura molecular a fosfo-enol-piruvatului

Structura molecular a D-Cicloserinei

Structura molecular a D-Alaninei

Inhibiia funciei membranei citoplasmatice. Membrana citoplasmatic acioneaz ca barier de permeabilitate selectiv pentru ioni, nutrieni, este sediul structural al sistemelor de transport i controleaz compoziia chimic a citoplasmei. Perturbarea integritii structurale i/sau funcionale atrage dup sine modificarea permeabilitii selective i pierderea echilibrului ionic sau macromoleculelor. Bacteriile i fungii au membran diferit de aceea a celulelei animale, fiind mai uor lezat de diferii ageni terapeutici, ceea ce face posibil terapia selectiv. Membranele biologice sunt alctuite dintr-o matrice lipidic, n care sunt distribuite aleatoriu, proteinele globulare ce penetreaz stratul lipidic. Agenii antimicrobieni pot s dezorganizeze membranele: pot fi cationici, anionici sau neutri. Efectul polimixinelor este asemntor cu al detergenilor cationici. Molecula lor conine grupri hidrofile i hidrofobe. La pH neutru sunt ncrcate pozitiv i pot fi considerate ca nite compui cationici, cu activitate fa de membrana extern polianionic a bacteriilor Gram-negative, sarcin conferit de lipopolizaharide. Detergenii, molecule care conin grupri lipofile i hidrofile, dezorganizeaz dublul strat lipidic i celula se sparge. Polimixinele sunt antibiotice polipeptidice (octapeptide cu greutate molecular mare), cu caracteristici chimice i proprieti biologice identice. Sunt recunoscute 5 polimixine majore, distincte chimic, desemnate polimixina A, B, C, D, E.

Structura general a polimixinelor

13

Cele mai reprezentative sunt polimixina B i polimixina E sau colistina. Toate sunt sintetizate de Bacillus polymyxa i au acelai spectru antibacterian. Sunt active n concentraii asemntoare, dar produc efecte secundare semnificative. Polimixinele A i D sunt nefrotoxice i nu au fost niciodat folosite n clinic, iar polimixinele B i E au cel mai sczut nivel de toxicitate. Aceste antibiotice sunt active fa de bacteriile Gramnegative, deoarece membrana extern conine lipide cu sarcin negativ (Acinetobacter sp., Brucella sp., Escherichia sp., Hemophilus sp., Klebsiella sp., Yersinia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Vibrio sp.), la concentraii de pn la 5 g/ml. Nu sunt active fa de bacteriile Gram-pozitive, cocii Gram-negativi i micobacterii. Trichomonas vaginalis este sensibil la concentraia de 125-250 g/ml. Polimixinele nu sunt absorbite dup administrare oral sau tegumentar, nu difuzeaz semnificativ n esuturi. De aceea nu sunt eficiente fa de infeciile sistemice difuze sau ale organelor parenhimatoase profunde, dar se folosesc n tratamentul infeciilor localizate: rni, arsuri, mucoase ale tractului intestinal, cavitatea pleural, spaiul dural, grefe sau pentru sterilizarea tractului digestiv.. Se folosesc cu mare eficien n tratamentul infeciilor meningeale, pulmonare i ale tractului urinar. Polimixinele se asociaz frecvent cu alte antibiotice, pentru a le extinde spectrul antimicrobian. inta polimixinelor este membrana lipidic, adic membrana extern i citoplasmatic a bacteriilor Gram-negative. Fixarea polimixinelor de membrane duce la dezorganizarea acestora i la liza celulei. Activitatea polimixinelor este antagonizat de compuii anionici, de Mg2+ i de Ca2+, deoarece neutralizeaz sarcinile negative ale gruprilor fosfat din membrana lipidic. Polimixinele dezorganizeaz structura membranelor i modific profund permeabilitatea. Nu se folosesc pentru tratamentul sistemic, deoarece se leag de diferii liganzi tisulari i sunt toxice pentru rinichi i pentru sistemul nervos. Fixarea antibioticelor n structura membranei depinde de concentraia cationilor bivaleni din mediu: carena sau excesul acestora inhib aciunea polimixinelor. Compoziia n LPS, fosfolipide i proteine a membranelor bacteriene influeneaz de asemenea fixarea i gradul de sensibilitate sau de rezisten al diferitelor specii bacteriene la aciunea polimixinelor. Polimixina i alte molecule policationice se leag de lipidul A al LPS, ntr-un raport stoichiometric i se inser n structura membranei. Un astfel de mozaic molecular dezorganizeaz straturile lipidice, iar membrana nu mai funcioneaz normal ca barier osmotic eficient. Datorit alterrilor structurale ale membranei externe i interne, echilibrul osmotic este perturbat prin pierderea ionilor de K+. Modificrile permeabilitii sunt asociate cu pierderea constituenilor celulari solubili i a viabilitii. Mecanismul este acelai cu cel propus pentru hemoliz sub aciunea detergenilor ionici. Efectul hemolitic se datoreaz dezorganizrii complexului colesterol-fosfolipide-lipoproteine din membrana eritrocitului. Concentraiile minime inhibitorii ale polimixinelor opresc temporar creterea bacteriilor sensibile, iar concentraiile de 2-4 ori mai mari au efect bactericid rapid. Sensibilitatea nu depinde de faza de cretere a celulelor bacteriene. Bacteriile sensibile leag cu afinitate nalt polimixinele. Specificitatea nalt a legrii st la originea unei metode eficiente pentru ndeprtarea endotoxinei din plasma pacienilor septici, care este perfuzat printr-o coloan la care este legat polimixina. Rezistena se datoreaz incapacitii antibioticului de a penetra membrana extern. O alt clas de ageni terapeutici cu aciune asupra membranei sunt ionoforii, compui care permit difuzia rapid a cationilor specifici prin membran: valinomicina mediaz trecerea specific a ionilor de K i omoar celula prin perturbarea echilibrului electric, esenial pentru fosforilarea oxidativ. Ionoforii nu au aciune selectiv asupra celulei bacteriene. Daptomicina este un antibiotic lipopeptidic, bactericid prin legarea de membrana citoplasmatic, dependent de Ca2+. Efectul este depolarizarea membranei i eliberarea K+ intracelular. Se folosete pentru tratamentul infeciilor tegumentare i tisulare produse de bacteriile Gram-pozitive rezistente la beta-lactami i vancomicin. Ali ageni ce acioneaz asupra membranei citoplasmatice sunt amfotericina B, colistinul, imidazolii i triazolii. Inhibiia sintezei proteinelor O serie de clase de antibiotice acioneaz specific asupra ribosomilor 70S, blocnd astfel la diferite niveluri sinteza proteic (Fig. 366).
14

Fig. 366. Situsuri de aciune ale diferitelor clase de antibiotice cu int de aciune la nivelul sintezei proteice (http://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/micro%20resources.htm).

Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu greutate molecular mic, dar foarte hidrofile, care se acumuleaz n celul numai printr-un proces de transport dependent de energie. Acumularea lor n celula bacterian parcurge dou faze: faza I este lent i depinde de gradientul transmembranar al potenialului electric i deci de sinergonul respirator oxidativ; faza a II-a este rapid i se traduce printr-o acumulare intracelular important. Concentraiile intracelulare sunt de circa 100 ori mai ridicate dect cele din mediul extern. Acumularea lent a antibioticului determin un efect bacteriostatic, iar acumularea rapid produce efectul bactericid. Rata acumulrii este condiionat de mrimea componentei electrice (), a forei proton-motrice care la rndul ei depinde de funcionarea catenei de respiraie i de ATP-aza membranar. Astfel se explic de ce microorganismele cu sisteme transportoare deficiente, cum sunt cele anaerobe, sunt intrinsec rezistente la aminoglicozide. Din acelai motiv, enterococii i ali anaerobi facultativi sunt rezisteni la concentraiile mici de aminoglicozide. Un rol important n acumularea intracelular a aminoglicozidelor l au proteinele periplasmatice a cror sintez este indus de antibiotic.

15

HOH2C HO HO

H3CHN

O H

OH CH3 H CHO O H

H2C HO HO

NH2 O OH O HO

NH2 NH2 O CH2OH OH HO NH2

H2N C NH HN HO

HN

C NH

NH2 O

HO

OH

kanamicina

streptomicina

Aminoglicozidele se leag de ribosomii bacterieni i inhib sinteza proteinelor. Ribosomul este o structur complex, n alctuirea cruia intr 3 molecule de ARN i peste 50 de tipuri de proteine. Subunitatea mare a ribosomului cuprinde dou molecule de ARN 5S i 23S, i 33 proteine, iar subunitatea mic conine o singur molecul de ARN 16S i 20-21 proteine. Aminoglicozidele se leag de subunitatea 30S, care are rol esenial n traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc fenomenul de pleiotropism (modific expresia unui numr mare de gene) i interacioneaz cu mecanismul sintezei proteice. Pentru c interacioneaz cu ribosomii, aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm. Secvena de baze a ARNm este citit greit i se sintetizeaz proteine nefuncionale sau sinteza proteinelor este stopat. Streptomicina a devenit un instrument pentru studiul fidelitii traducerii informaiei genetice. Alte antibiotice aminoglicozidice (bluensomicina, kanamicina, neomicina i paromomicina (toate sunt sintetizate de specii de Streptomyces), induc erori de citire a mesajului in vitro, n sisteme acelulare. Aminoglicozidele sunt antibiotice cu efect rapid i cu spectru larg de aciune: sunt sensibile bacteriile strict sau facultativ aerobe Gram-pozitive sau negative. Acestea sunt zaharuri sau pseudo-zaharuri aminate, cu caracter policationic, care explic cteva aspecte legate de modul lor de aciune. Toate aminoglicozidele utilizate n terapeutic, streptomicina i streptinomicina conin un ciclu deoxistreptomicin bisubstituit n poziia 4 i 6 (Caron, 1994). Spre deosebire de alte familii de antibiotice, n special -lactamice i fluoroquinolone, aminoglicozidele folosite n prezent conin mai puine variante moleculare. Legndu-se la ribosom, aminoglicozidele, pe de o parte perturb procesul de traducere introducnd erori de citire, iar pe de alta antreneaz stoparea total a traducerii, interfernd cu etapele de iniiere, alungire i terminare. Efectul primar al aminoglicozidelor ar fi ocuparea situsului acceptor (A) al ribosomului. Streptomicina este un glicozid aminociclitol, larg folosit n terapia tuberculozei. La micobacterii, streptomicina inhib sinteza proteinelor dup 5-15 min., iar sinteza acizilor nucleici continu pentru o lung perioad de timp. Deoarece inhib sinteza proteinelor, efectul aminoglicozidelor este bactericid. Streptomicina se leag de proteina S12 din subunitatea 30S i face ca ribosomul s citeasc greit codul genetic. Alte aminoglicozide se leag nu numai de proteina S12, ci i de proteina L6 a subunitii 50S. Acest ultim situs de legare este important pentru rezistena bacteriilor la aminoglicozide. Componenta chimic ce determin citirea greit este streptamina sau deoxistreptamina, din moleculele de streptomicin, kanamicin, neomicin, paroromicin, gentamicin, bluensomicin etc. Spectinomicina este un antibiotic aminociclitol, nrudit cu aminoglicozidele i care are aciune bacteriostatic. Aciunea sa antibacterian const n legarea cu o alt protein ribosomal. Este astfel blocat interaciunea ARNm-ribosom, fr s produc citirea greit. Se folosete pentru tratamentul gonoreii (N. gonorrhoeae) rezistente la penicilin. n scopul tratamentului infeciilor intracelulare, aminoglicozidele au fost ncapsulate n liposomi. ncapsularea n liposomi poate s creasc indexul terapeutic al medicamentului prin diminuarea nivelului medicamentului eliberat la situsurile unde este toxic fa de nivelul eficienei terapeutice.
16

Aminoglicozidele sunt eliminate prin filtrare glomerular i sunt parial reabsorbite de celulele tubulare proximale printr-un mecanism de pinocitoz n vezicule mici, care fuzioneaz cu lizosomii, unde se acumuleaz. Ele induc o fosfolipidoz lizosomal caracterizat prin inhibiia activitii sfingomielinazei i fosfolipazei A1 i prin acumularea fosfolipidelor n lizosomi. Fosfolipidoza este nsoit de necroz celular i regenerare postnecrotic. Diferii compui sau medicamente administrate concomitent cu aminoglicozidele pot s mreasc nivelul toxicitii (vancomicina, cisplatinul i hidrocortizonul) sau pot s-l diminueze (ticarcilina, carbenicilina, cefalotina, acidul poli-L-aspartic). Toxicitatea aminoglicozidelor nu este influenat de modul de administrare (singure sau n asociaie), dar unele medicamente diminueaz nivelul renal al acumulrii n celulele tubulare. Rezistena la antibioticele aminoglicozidice este larg rspndit i se produce prin urmtoarele mecanisme: - nglobarea sczut a antibioticului; - modificarea intei ribosomale; - efluxul antibioticului; - modificarea enzimatic a aminoglicozidelor. nglobarea aminoglicozidelor necesit funcionarea catenei de respiraie celular, care genereaz un potenial electric prin membrana citoplasmatic. Un nivel sczut al potenialului transmembranar sau absena sa determin rezistena intrinsec a bacteriilor anaerobe i scderea sensibilitii bacteriilor facultativ anaerobe (enterococi) la aminoglicozide. Modificarea chimic a aminoglicozidelor este principalul mecanism de rezisten bacterian. Alte mecanisme mai rare de rezisten la aminoglicozide sunt sistemele de eflux i mutaiile situsului ribosomal de legare la ARNr. Modificarea enzimatic a aminoglicozidelor este mecanismul major de rezisten la aminoglicozide al izolatelor clinice Gram-pozitive i Gram-negative. Modificarea chimic are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 de enzime care modific aminoglicozidele (tabelul 65). Majoritatea genelor codificatoare ale enzimelor se gsesc la bacteriile Gram-negative. n funcie de tipul modificrii chimice pe care o catalizeaz, acestea se clasific n 3 familii: - aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC); - aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT); - aminoglicozid-fosfotransferaze (APH). Tabelul 65. Determinismul genetic al mecanismelor de rezisten enzimatic la aminoglicozide i distribuia acestora la diferite genuri i specii bacteriene (Dup Shaw i colab., 1993) Enzima Gene Substratul enzimatic Comentarii Acetilare AAC(3)-I AAC(3)-II aac(3)-Ia aac(3)-Ib aac(3)-Iia aac(3)-Iib aac(3)-Iic aac(3)-IIIa aac(3)-IIIb aac(3)-IIIc aac(3)-Iva aac(3)-Via Gm Gm, Tob

AAC(3)-III

Gm, Tob, Km, Neo, Prm

Pseudomonas spp. Rar ntlnite Enterobacteriaceae Salmonella spp.

la

AAC(3)-IV AAC(3)-VI

Gm, Tob Gm

Nu confer rezisten la Tob i Km. Rar ntlnite la Enterobacteriaceae

17

AAC(6)-I

aac(6)-Ia aac(6)-Ib aac(6)-Ic aac(6)-Id aac(6)-Ie aac(6)-If aac(6)-Ig aac(6)-Ih aac(6)-Ii aac(6)-Iia aac(6)-Iib aac(6)-aph(2) aac(2)-Ia ant(2)-Ia ant(2)-Ib ant(2)-Ic ant(3)-Ia ant(4)-Ia ant(4)-Iia ant(6)-Ia

Tob, Amk

AAC(6)-II AAC(6)-APH(2) AAC(2-I) Adenilare ANT(2)-I

Gm, Tob Gm, Tob, Amk Gm, Tob Gm, Tob, Km

Numai la P. aeruginosa Enzim bifuncional stafilococci i enterococci la

Larg rspndite la bacteriile Gram-negative

ANT(3)-I ANT(4)-I ANT(4)-II ANT(6)-I Fosforilare APH(2)-I APH(3)-I

Sm, Spcm Tob, Amk Tob, Amk Sm Larg rspndite la bacteriile Gram-pozitive

aph(2)-Ia aph(3)-Ia aph(3)-Ib aph(3)-Ic aph(3)-Iia aph(3)-IIIa aph(3)-Iva aph(3)-Va aph(3)-Vb aph(3)-Vc aph(3)-Via aph(3)-Vib aph(3)VIIa aph(3)-Ia aph(3)-Ib aph(6)-Ia aph(6)-Ib aph(6)-Ic aph(6)-Id

Gm, Tob, Amk Km, Neo, Prm

APH(3)-II APH(3)-III APH(3)-IV APH(3)-V

Km, Neo, Prm, GmB Km, Neo, Prm, Amk, GmB Km, Neo, Prm Neo, Prm S. aureus E. faecalis

APH(3)-VI APH(3)-VII APH(3)-I APH(6)-I

Km, Neo, Prm, Amk, GmB Km, Neo Sm Sm

Acinetobacter spp. Campylobacter jejuni Streptomyces griseus Streptomyces spp.

18

Abrevieri: Amk, amikacin; Gm, gentamicin, GmB, gentamicin B; Km, kanamicin; Neo, neomicin; Pm, paromicin; Spcm, spectinomicin; Sm, streptomicin; Tob, tobramicin. Aminoglicozid O-fosfo-transferaza (APH) i aminoglicozid O-adenil sau nucleotidil-transferaza (AAD sau ANT), catalizeaz fosforilarea i respectiv nucleotidilarea gruprii hidroxil, iar aminoglicozid- Nacetiltransferaza (AAC) catalizeaz acetilarea gruprilor amino. APH i ANT folosesc ATP i ACA (acetilcoenzima A). Fiecare dintre aceste familii de enzime este mprit n clase, desemnate prin situsul pe care-l modific (fig. 367). Aminoglicozid-fosfotransferazele - APH - (7 clase) sunt kinaze, utilizeaz ATP ca substrat secundar i fosforileaz gruprile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice. Aminoglicozid-acetiltransferazele AAC - (4 clase de enzime) utilizeaz acetil-CoA ca donor al gruprii acetil pentru modificarea aminoglicozidelor la gruparea amino din poziiile 1 i 3 ale inelului deoxistreptaminei i la poziiile 2 i 6 ale inelului 6-aminohexozei. Aminoglicozid 6-acetiltransferazele au spectru larg i pot modifica majoritatea aminoglicozidelor cu importan clinic. Aminoglicozid-nucleotidiltransferazele ANT - (5 clase) utilizeaz ATP ca substrat secundar i modific antibioticele aminoglicozidice prin transferul AMP la gruparea OH la poziiile 2, 3, 4 i respectiv 9. Aminoglicozidele modificate la gruprile amino sau la grupul OH sub aciunea celor trei categorii de enzime, se leag slab sau pierd total capacitatea de a se lega de ribosomi i nu declaneaz faza a II-a a nglobrii dependent de energie.

Fig. 367. Situsurile de inactivare a moleculei de gentamicin de ctre diferite enzime inactivatoare (Mingeot-Leclercq i colab, 1999). Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor celulare nu se mai produce i bacteriile supravieuiesc n prezena medicamentului. Inactivarea enzimatic a aminoglicozidelor este mecanismul principal de rezisten a stafilococilor. Din punct de vedere biochimic, acest mecanism de rezisten este de departe cel mai important,

19

fiind implicat n totalitatea cazurilor de rezisten observate la enterobacterii (> 95%), la Acynetobacter (95%) i la bacteriile Gram-pozitive i jumtate din cazurile de rezisten observate la Pseudomonas. Mecanismele neenzimatice de rezisten la antibioticele aminoglicozidice sunt: - sistemele de eflux; - mutaiile ARNr. Rezistena datorat modificrii intei macromoleculare este o modalitate major de dezvoltare a rezistenei. Modificrile intei care determin rezistena la aminoglicozide includ schimbrile mutaionale ale proteinelor ribosomale sau ale ARN 16S i metilarea enzimatic a ARNr. Schimbrile mutaionale produc rezistena n special la streptomicin. Studiile de RMN (rezonan magnetic nuclear) asupra nucleotidelor ce cuprind situsul A (acceptor) al ARN 16S, complexat cu paromomicina, precum i asupra subunitii 30S complexat cu acelai antibiotic, relev c medicamentul se leag n depresiunea major a situsului A. Metilarea N7 a resturilor de guanin ale ARN 16S produce rezistena la concentraii mari de aminoglicozide la microorganismele productoare de aminoglicozide, dar acest tip de rezisten n-a fost raportat la bacteriile cu importan clinic. Sinteza proteinelor necesit ca anticodonii aminoacil-ARNt i codonii ARNm s se recunoasc specific. Evenimentul recunoaterii are loc la nivelul subunitii 30S. Fidelitatea recunoaterii este garantat de o secven ARNr nalt conservat, care constituie situsul interaciunii dintre codon i anticodon (situsul A). Aceast secven este situsul preferat de legare al aminoglicozidelor (kanamicina i streptomicina), care pot s interfere cu sinteza proteinelor prin inducerea citirii greite a codonilor i terminarea prematur a traducerii. La enterococi, s-au identificat dou tipuri de rezisten la streptomicin: - rezistena la nivele moderate de antibiotic, datorat permeabilitii sczute a membranei, ce poate fi depit cu administrarea concomitent a penicilinei, care crete permeabilitatea pentru aminoglicozide; - rezistena la doze mari, mediat ribosomal sau datorat producerii enzimelor inactivatoare ale streptomicinei. Rezistena la gentamicin se datoreaz prezenei enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaz-6acetiltransferaz. Enzima confer rezisten la gentamicin, tobramicin, metilmicin, amikacin i kanamicin. Rezistena la gentamicin este un indicator al rezistenei bacteriene la alte aminoglicozide, cu excepia streptomicinei. La M. tuberculosis nu s-au descris enzime care s modifice aminoglicozidul streptomicin, dar rezistena este determinat de modificarea mutaional a intei ribosomale. n principiu, dac mecanismele de rezisten la antibiotice ar fi inhibate, sensibilitatea bacteriilor la aminoglicozide ar putea fi restabilit. Acest concept este inspirat de asocierea cu succes a primului inhibitor al -lactamazelor acidul clavulanic cu amoxicilina (o penicilin). Nu s-au identificat inhibitori ai sintezei enzimelor care modific aminoglicozidele (Vakulenko, 2003). Streptomicina produce efecte secundare: este afectat nervul acustic i apar deficiene de auz, care pot disprea dup ntreruperea tratamentului sau pot s persiste. Toxicitatea aminoglicozidelor se datoreaz faptului c sunt cationi polari, filtrai de glomerulul renal i excretai nemodificai n urin. n tubii renali, aminoglicozidele sunt reabsorbite prin legarea de fosfolipidele membranare anionice, urmate de endocitoz i sechestrare n lizosomi. Se crede c la o anumit concentraie

prag, lizosomii se rup, elibereaz enzimele hidrolitice i produc necroza tisular.

Tetraciclinele formeaz o familie de antibiotice inhibitoare ale sintezei proteinelor prin mecanismul blocrii atarii complexului aminoacil-ARNt la situsul acceptor al ribosomului (situsul A). Efectul bacteriostatic al acestor antibiotice are un spectru larg de aciune, fiind active fa de bacterii Gram-pozitive i Gram-negative, fa de chlamidii, micoplasme, ricketsii i protozoare. Tetraciclinele sunt ageni chelatori puternici, proprietile lor farmacologice sunt influenate de prezena ionilor metalici. Fiecare dintre inelele nucleului linear tetraciclic trebuie s conin numai atomi de C, pentru ca antibioticul s-i pstreze activitatea. Excepia este 6-tiotetraciclina, care dei posed un atom de S la poziia 6 a inelului C, are aciune antibacterian.

20

Tetraciclinele atipice (tiotetraciclina i ali analogi ai tetraciclinelor) perturb structura membranei citoplasmatice i efectul este bactericid, ceea ce contrasteaz cu efectul bacteriostatic reversibil al tetraciclinelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Efectul atipic de dezorganizare a membranei este probabil consecina caracterului lipofil al moleculei, rezultat din planaritatea inelelor B, C i D. Tetraciclinele atipice sunt probabil ncorporate n mediul hidrofob al membranei. Din cauza efectelor secundare, derivate din interaciunea lor nespecific cu membranele celulelor procariote i eucariote, tetraciclinele atipice nu prezint interes terapeutic. n mod obinuit, se utilizeaz tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, dar i cele noi, de semisintez: minociclina i doxiciclina. Toate sunt bacteriostatice, se absorb uor din tubul digestiv i se distribuie larg n esuturi i fluide, cu excepia lichidului cefalorahidian. Tetraciclinele au un spectru foarte larg de aciune: sunt active fa de multe bacterii Gram-pozitive i Gram-negative, fa de rickettsii, chlamidii, micoplasme i fa de unii fungi, dar distrug i microbiota normal a intestinului i produc tulburri gastro-intestinale. Tetraciclinele pot produce efecte toxice asupra esutului hepatic i renal. Tetraciclina administrat n timpul sarcinii poate duce la deformarea oaselor cutiei craniene a ftului. Administrarea n timpul sarcinii sau n primii 5 ani de via are ca rezultat colorarea dinilor, att deciduali, ct i permaneni, doarece mugurii ambelor dentiii se formeaz nainte de natere. Efectele tetraciclinelor asupra dinilor i oaselor se datoreaz capacitii lor de a lega ioni de Ca2+. Tetraciclinele difuzeaz liber (pasiv) prin porii hidrofili ai membranei externe a bacteriilor Gramnegative, dar necesit un sistem de transport dependent de energie pentru a traversa membrana citoplasmatic. La bacteriile Gram-pozitive (nu au membran extern), aceste antibiotice nu difuzeaz liber n celul. n citoplasm formeaz complexe cationice cu Mg2+, datorit activitii lor chelatoare. Complexul molecular format din tetraciclin i Mg se asociaz cu subunitatea ribosomal 30S. Consecina este inhibiia sintezei proteinelor, prin blocarea asocierii aminoacil-ARNt la situsul A al ribosomului bacterian. Tetraciclina inhib faza de elongare a catenei polipeptidice n timpul traducerii, exercitnd un efect bacteriostatic. O secven foarte conservat a ARNr 16S pare a fi parte a situsului de legare, ceea ce explic spectrul larg de activitate al tetraciclinei. n alctuirea situsului de legare pare s intre i proteina ribosomal 7S. Efectul direct al legrii tetraciclinei la ribosomi este blocarea accesului aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului. Civa derivai ai tetraciclinei acioneaz pe alt cale: chelocardina i tiotetraciclina sunt active fa de E. coli i B. subtilis, dar sunt inhibitori ineficieni ai sintezei proteinelor, pentru c nu se leag stabil de ribosomi. Spre deosebire de alte tetracicline, ele pot inhiba sinteza ADN, ARN i a proteinelor (Speer, 1992). Cele dou tetracicline ar putea avea efecte asupra membranei citoplasmatice. Olivera i Chopra (citai de Speer, 1992), pe baza modului de aciune, au mprit tetraciclinele n dou categorii: - cele care inhib sinteza proteinelor (teraciclina, clortetraciclina, minociclina); - cele care interacioneaz cu membrana citoplasmatic (chelocardina, tiotetraciclina, anhidrotetraciclina). Legarea tetraciclinelor cu proteinele ribosomului este tranzitorie, ceea ce explic efectul bacteriostatic al acestor antibiotice. Sunt inhibitoare fa de o varietate larg de bacterii Gram-pozitive i Gram-negative, chlamidii i micoplasme. Celulele mamiferelor nu concentreaz tetraciclina (aa cum fac bacteriile) i de aceea ribosomii lor sunt rezisteni, cu posibila excepie a ribosomilor 70S mitocondriali. Se administreaz oral, dar formeaz complexe neabsorbabile cu ionii bivaleni. Tetraciclina i derivaii si au o utilizare clinic limitat, datorit frecvenei crescute a tulpinilor rezistente. De exemplu, n anii 80, tetraciclina era folosit pentru tratamentul infeciilor cu transmitere sexual, dar dup apariia tulpinilor rezistente de N. gonorrhoeae, n-a mai fost utilizat ca antibiotic de prim importan terapeutic. Oxitetraciclina i tetraciclina sunt nc folosite n tratamentul uretritei nongonococice i a infeciilor chlamidiale. Rezistena la tetraciclin este larg rspndit la cocii Gram-pozitivi i se manifest i la Mycoplasma. De aceea, tetraciclina nu se folosete pentru tratamentul primar al infeciilor tractului respirator inferior. Dei aciunea sa principal este antibacterian, tetraciclina este activ fa de protozoarele parazite: inhib Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum. Eficiena derivailor tetraciclinei fa de protozoarele parazite este corelat cu gradul de ptrundere n celul. Cei mai eficieni sunt derivaii lipofili, care strbat repede membrana citoplasmatic (tiotetraciclina).

21

Numeroase specii bacteriene au dobndit rezisten la aciunea bacteriostatic a tetraciclinelor. S-au identificat cel puin 24 de gene codificatoare ale rezistenei la tetraciclin i 3 determinani de rezisten la oxitetraciclin, mai nti la Streptomyces, care produce oxitetraciclina i la Mycobacterium sp. Rezistena determinat genetic (Taylor, 1996) este mediat de 3 mecanisme diferite: - pompe de eflux, dependente de energie, care elimin tetraciclina din celul; - protecia ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile; - inactivarea enzimatic (degradarea oxidativ)a antibioticelor. Mecanismul de aciune a proteinelor de protecie ribosomal. Protecia ribosomal este rezultatul sintezei unor proteine codificate de genele de rezisten, care se asociaz cu ribosomii i interfer cu legarea tetraciclinei. Tetraciclinele inhib sinteza proteinelor prin legarea cu afinitate nalt, de un singur situs localizat pe subunitatea ribosomal 30S, probabil de proteinele S7, S14 i S19. Legarea tetraciclinei n acest situs blocheaz legarea aminoacil-ARNt sintetazei la situsul ribosomal A (acceptor). Treapta sintezei proteice inhibat de tetraciclin este cea catalizat de EF-Tu (elongation factor thermo-unstable). Activitatea pompelor de eflux este o modalitate de a limita accesul tetraciclinei la ribosomi i are ca rezultat creterea capacitii celulei de a elimina antibioticul la o rat egal cu rata nglobrii. Este cel mai comun mecanism de rezisten, mediat de produsele de sintez ale genelor de rezisten: acestea sunt proteine ale membranei citoplasmatice care funcioneaz ca transportori ai tetraciclinei, dependeni de energie. Dei efluxul mpiedic acumularea tetraciclinei chiar n celulele rezistente, nivelul intracelular al antibioticului depete nivelul inhibitor al sintezei proteinelor (B. Speer, 1992). Explicaia se bazeaz pe capacitatea tetraciclinei de a exista n mai multe forme ionice. Este posibil ca o anumit form s se lege mai uor de ribosomi, comparativ cu altele. La tulpinile rezistente, este eliminat forma activ a antibioticului, iar n celul rmne o concentraie mare de tetraciclin inactiv sau mai puin activ, compatibil cu sinteza proteinelor. Impermeabilitatea structurilor de suprafa ale celulei constituie o cauz important a rezistenei la tetracicline. Pentru a inhiba sinteza proteinelor, tetraciclinele trebuie s ptrund n celula bacterian i s se lege de ribosomi. Tetraciclina poate exista n dou forme: o form protonat (TH2) i o form legat de Mg2+ (THMg). Proporia THMg2+ crete la pH mai mare. Tetraciclina este acumulat n celul ca THMg2+, deoarece pH intern este mai mare dect cel extern. Forma protonat a tetraciclinei difuzeaz prin membrana citoplasmatic. Difuzia simpl nu explic faptul c bacteriile sensibile acumuleaz tetraciclin n citoplasm. n afara difuziei, tetraciclina este nglobat printr-un mecanism dependent de energie, care nu implic o protein de transport, ci diferena de pH ntre mediul celular i extracelular. Alterarea porinelor, cu limitarea difuziei tetrciclinelor n spaiul periplasmic este un mecanism posibil de rezisten la bacteriile Gram-negative. Cele 2 mecanisme de rezisten la tetracicline (proteinele protectoare ale ribosomilor i proteinele de eflux) nu inactiveaz antibioticul. Rareori, antibioticul este inactivat sau modificat pe cale chimic. Inactivarea enzimatic a tetraciclinelor nu are semnificaie ca mecanism de rezisten, dar s-a evideniat la Bacteroides. Cteva specii de Bacteroides (bacterie anaerob) degradeaz oxidativ molecula de antibiotic. Gena care codific acest tip de rezisten este localizat pe 2 transpozoni nrudii, ce poart de asemenea o gen de rezisten la eritromicin. Gena codificatoare a enzimei care degradeaz tetraciclina este inactiv la celulele de E. coli crescute n anaerobioz sau de Bacteroides.

22

Gliciltetraciclinele sunt reprezentate de tigeciclin, utilizat pentru tratamentul infeciilor cutanate i intraabdominale. Caracteristica structural a tigeciclinei const n substituia n poziia 9 a tetraciclinei, cu un rest de glicin. Este un antibiotic cu spectru larg de aciune fa de bacterii Gram-pozitive, Gram-negative, aerobe i anaerobe, dar i fa de bacterii patogene rezistente la alte antibiotice: enterococi rezisteni la vancomicin, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA), Str. pneumoniae rezistent la penicilin. Este activ fa de patogenii Gram-negativi: enterobacterii, H. influenzae, N.gonorrhoeae, Legionella pneumophila, micobacterii netuberculoase cu cretere rapid.

Structura molecular a tigeciclinei Dactilociclinele sunt derivai ai tetraciclinei, produi de Dactylosporangium. Ele difer de ali derivai prin aceea c sunt tetracicline glicozidice. Utilizarea clinic este limitat, deoarece par s fie active numai fa de tulpinile bacteriene care poart gene de rezisten la tetraciclina din clasa K. Unele izolate bacteriene sensibile la tetraciclin nu sunt inhibate de dactilocicline. Incapacitatea lor de a inhiba bacteriile Gram-pozitive i negative se datoreaz probabil impermeabilitii structurilor de suprafa fa de dactilocicline (Speer i colab., 1992). Tetraciclinele se administreaz oral, dar unele sunt disponibile ca produse pentru administrare parenteral. Dup administrare oral, tetraciclinele sunt absorbite n stomac i n intestinul subire. Absorbia este influenat de coninutul alimentar i de cationii bivaleni. Cu ionii de Ca 2+, tetraciclinele formeaz complexe neabsorbabile. Ele ptrund moderat n fluidele organismului i n esuturi i sunt excretate prin urin. Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru larg, fiind utilizate n clinica uman pentru tratamentul infeciilor cu bacterii Gram-pozitive i Gram-negative. Sunt de asemenea active fa de agentul malariei i se folosesc pentru profilaxia tulpinilor de Plasmodium falciparum rezistente la agenii chimioterapeutici specifici.

23

Macrolidele, Lincosamidele i Streptograminele (MLS) au o structur chimic diferit, dar acioneaz ntr-o manier asemntoare asupra unei game variate de bacterii (Gram-pozitive, coci Gram-negativi, Chlamydia, micoplasme, Legionella). Absena efectului asupra bacililor Gram-negativi se explic prin incapacitatea de a difuza prin membrana extern, datorit caracterului hidrofob al moleculei acestora. Macrolidele i lincosamidele au proprieti antibacteriene, cel mai adesea bacteriostatice. Situsul aciunii macrolidelor este subunitatea mare a ribosomilor bacterieni. MLS acioneaz asupra ribosomilor i mpiedic ribosomul bacterian s traduc ARN n dou moduri diferite. a) Macrolidele inhib sinteza proteic dependent de ARN, la treapta alungirii catenei, producnd inhibiia translocrii peptidil-ARNt de la situsul acceptor(A), la situsul peptidil donor (P). Ele se leag de subunitatea ribosomal 50S i interfer cu procesul de translocaie a polipeptidului nascent, deoarece stimuleaz disocierea complexului peptidil-ARNt de ribosomi, n timpul sintezei. Centrul peptidil-transferazei (din subunitatea 50S) este situsul interaciunii antibioticelor MLS, al cloramfenicolului i puromicinei i pare a fi format n ntregime de structura secundar a ARN 23S din bucla central a domeniului V(din cele 6 domenii). Consecina este terminarea prematur a catenei i oprirea reversibil a sintezei proteinelor. Pentru eritromicin este suficient legarea unei singure molecule cu subunitatea mare a ribosomului. Eritromicina interacioneaz cu ARNr, la nivelul unei bucle a unor domenii ndeprtate n structura primar a ARN, dar care prin pliere sunt aduse n juxtapoziie: domeniile II i V ale ARNr 23S. Macrolidele se leag probabil la situsul peptidil donor (P) al ribosomului i prin competiie interfer cu translocaia peptidului de la situsul acceptor la situsul donor. Eritromicina poate s produc disocierea peptidil-ARNt de ribosom. La E. coli, eritromicina inhib formarea subunitii ribosomale 50S. b) Al doilea mecanism de aciune const n inhibarea treptelor iniiale ale asamblrii subunitii ribosomale 50S. Macrolidele i ketolidele interacioneaz cu subunitatea 50S parial asamblat, blocnd procesul asamblrii. Componentele neasamblate sunt supuse degradrii nucleolitice. n celulele tratate cu eritromicin se acumuleaz un precursor al subunitii 50S. Eritromicina se leag de subunitatea incomplet format din ARNr 23S, 5S, dar conine numai 18 dintre cele 34 proteine ribosomale ale subunitii mari. Situsul de legare la subunitatea ribosomal 50S este comun pentru eritromicin, pentru macrolidele noi, pentru lincosamid i streptogramina B. Denumirea de macrolide desemneaz un grup de antibiotice nrudite structural, produse de specii ale g. Streptomyces. Grupul macrolidelor cuprinde numai compui nepolienici (de exemplu, eritromicina). Compuii care conin un sistem format din mai mult de dou legturi duble de C conjugate, sunt clasificai ca poliene. Din punct de vedere structural, macrolidele sunt caracterizate printr-un inel lactonic multiunitar, cu puine legturi duble, fr atomi de N, la care se ataeaz, prin legturi glicozidice, 1-3 componente glucidice. Macrolidele pot fi glucide aminate sau glucide fr N (neutre). Sunt poliketide naturale, produse ale metabolismului secundar la multe specii ale g. Streptomyces. Macrolidele prezint diferene structurale, dar posed un schelet de C comun. Dup numrul de atomi de C ai inelului lactonic (de obicei par), se disting compui cu 12, 14, 15 sau 16, cu substitueni variai (grupri metil, hidroxil). Prezena gruprilor determin asimetria centrilor inelului lactonic. Componentele glucidice ataate prin legturi glicozidice de inelul lactonic sau legate una de alta, sunt totdeauna 6-deoxihexoze. Glucidele poart grupri N-, O- sau metil. La unele macrolide, glucidele sunt esterificate de un acil: grupul acetil sau izovaleril. Fiecare compus are caracteristici chimice ct i biologice, proprii: - majoritatea celor care au cicluri formate din 14 atomi de C sunt substane naturale (eritromicina, oleandomicina) sau derivai semisintetici (roxitromicina, diritromicina, claritromicina); - un singur compus are 15 atomi (azitromicina); - compui naturali cu 16 atomi (josamicina, spiramicina, kitasamicina, midecamicina i tilosina) sau derivai semisintetici(rokitamicina, miocamicina, tilmicosina). Eritromicina, cel mai important antibiotic macrolid, este produs de Streptomyces erythreus. Structura sa const dintr-un inel lactonic macrociclic, de care se ataeaz dou resturi de zahr.

24

Structura molecular a eritromicinei Eritromicina este puin solubil n ap i este rapid inactivat de sucul gastric. Ca i alte macrolide, penetreaz greu peretele bacteriilor Gram-negative. Eritromicina este un antibiotic cu spectru larg: este activ fa de bacteriile Gram-pozitive i Gram-negative, fa de actinomicete, Mycobacterium, T. pallidum, Micoplasma pneumoniae, Chlamydia, Rickettsia. n funcie de concentraie, de specie, de faza de cretere sau de densitatea inoculului, eritromicina poate fi bacteriostatic sau bactericid. Eritromicina este un nlocuitor al penicilinei, la persoanele alergice pentru ciclul -lactamic. Cele mai multe antibiotice macrolide sunt substane bazice, iar unele sunt neutre. Pot fi solubile sau insolubile n ap, dar solubile n etanol. Cele folosite n clinic constau dintr-un inel lactonic cu 14, 15 sau 16 atomi de C, substituit cu dou sau mai multe glucide neutre sau aminate la C3 i C5. Macrolidele inhib creterea bacteriilor dar nu sunt active fa de fungi, iar lactonele polienice inhib fungii, dar nu influeneaz creterea bacteriilor. Spectrul de activitate al macrolidelor include bacteriile Gram-pozitive (Staphylococcus i Streptococcus) i pe cele anaerobe (Clostridium). Bacteriile Gram-negative (H. pylori, Haemophilus spp., Pasteurella spp. i Legionella spp.) sunt de asemenea sensibile. Microorganismele enterice (E. coli i Salmonella) sunt intrinsec rezistente, prin excluderea macrolidelor din citoplasm datorit arhitecturii membranei externe. Moleculele noi, ca azitromicina i claritromicina au activitate antibacterian superioar eritromicinei, deoarece au coeficieni superiori de penetrare intracelular i tisular, sunt mai stabile, mai uor absorbite, iar efectele secundare gastrointestinale au o inciden mai sczut. Azitromicina este activ fa de bacteriile enterice. Mycoplasma spp. i Chlamydia spp. sunt de asemenea sensibile la macrolide. Claritromicina are activitate antibacterian semnificativ, in vitro, fa de micobacteriile netuberculoase. Macrolidele sunt antibiotice bacteriostatice, utilizate pentru tratamentul unui spectru larg de infecii bacteriene ale tractului respirator cu Legionella, Chlamydia, Haemophilus, al unor specii de Mycobacterium (M. intracellulare, M. avium, dar nu M. tuberculosis), al ulcerului gastric asociat cu H. pylori i infecii ale esuturilor moi. Streptograminele sunt reprezentate de doi compui (A i B) cu aciune sinergic. Ca i macrolidele i lincosamidele i compuii A i B ai streptograminelor se fixeaz la subunitatea 50S a ribosomilor, la nivelul ARNr 23S. Lincomicina i clindamicina nu sunt macrolide, dar multe dintre proprietile lor biologice sunt asemntoare cu ale eritromicinei. Sunt formate dintr-un aminoacid legat cu un zahr aminat.

25

Lincomicina este activ fa de o larg varietate de bacterii, n primul rnd Gram-pozitive. Ele au aceleai situsuri de legare la subunitatea 50S ca i macrolidele i cloramfenicolul i pot intra n competiie pentru legare. Dei sunt foarte diferite ca structur chimic, eritromicina i clindamicina se leag de subunitatea ribosomal 50S. Inhib sinteza proteinelor prin interferen cu reacia de transpeptidare, probabil prin blocarea situsului P (peptidil-donor). Astfel este blocat alungirea catenei peptidice. Efectul este bacteriostatic. Macrolidele i lincomicina sunt bacteriostatice: inhib numai iniierea noilor catene peptidice. Utilizarea terapeutic a macrolidelor a fost sever compromis de emergena tulpinilor rezistente ale multor specii de bacterii patogene. Fenomenul de rezisten a aprut curnd dup introducerea eritromicinei n terapie n anii 50. S-a observat c tulpinile rezistente la eritromicin, au devenit rezistente nu numai la toate celelalte macrolide, dar i la lincosamid i streptogramin B, antibiotice nenrudite chimic cu macrolidele. De aceea, fenomenul s-a denumit rezistena fenotipic la macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB). Rezistena la antibioticele MLS (macrolide, lincosamida i streptogramina B) este indus prin mai multe mecanisme: - scderea permeabilitii peretelui celular la medicament; - efluxul activ al medicamentului din celul; - modificarea mutaional a unei singure proteine a subunitii 50S; - modificarea ARNr 23S al subunitii 50S prin metilare. Metilazele sunt codificate de genele erm (erithromycin ribosome methylation); - inactivarea enzimatic a antibioticelor: enzimele care hidrolizeaz inelul lactonic al nucleului macrolid i fosfotransferazele care inactiveaz macrolidele prin fosforilarea gruprii 2-OH a glucidului aminat. Rezistena la macrolide este cel mai adesea rezultatul modificrii intei antibioticului i const n modificarea posttranscriere a ARNr 23S sub aciunea adenin-N6-metiltransferazei. Unele metilaze confer rezisten numai la unul sau la dou antibiotice ale clasei MLSB. Enzimele de metilare adaug una sau dou grupe metil la un rest de adenin situat ntr-o poziie fix (A2058 la E. coli) a ARNr 23S. Metilarea are ca rezultat schimbarea conformaional a ribosomilor, ducnd la scderea afinitii pentru toate antibioticele MLS. Metilaza ribosomal confer rezisten ncruciat la antibioticele MLSB, deoarece situsurile de legare ale acestor antibiotice se suprapun. Ketolidele reprezint o nou entitate chimic, caracterizat prin nlocuirea L-cladinozei din inelul A al eritronolidei, cu o funcie 3-ceto i un carbamat la C11- C12. Restul 3-OH rmas dup nlturarea L-cladinozei (un glucid neutru) a fost oxidat la grupul 3-ceto. Denumirea clasei deriv de la gruparea 3-ceto i de la inelul lactonic (Ackermann, 2001, citat de Rodloff, 2003). Telitromicina i ABT 773 reprezint cea mai recent generaie de medicamente, caracterizate prin grupul 3-cetonic ce substituie restul de zahr 3-cladinoz din eritromicin i claritromicin. Ambele ketolide au gruparea carbamat C11-C12, care la telitromicin se extinde cu un grup alkil-aril. Aceast extensie permite telitromicinei s interacioneze cu domeniul al II-lea al ARNr 23S (Vester, 2001).

Structura molecular a telitromicinei

26

Oxazolidinonele reprezint o clas unic de ageni antimicrobieni sintetici. Utilizarea lor n clinic a fost impus de necesitatea tratrii infeciilor produse de stafilococii rezisteni la meticilin, de pneumococii rezisteni la penicilin, de enterococii rezisteni la vancomicin. Aceti ageni au un mecanism unic de aciune, ceea ce elimin riscul rezistenei ncruciate cu agenii antimicrobieni disponibili. Deoarece nu sunt molecule naturale, genele de rezisten specific nu preexist n genofondul natural. Oxazolidinonele au fost iniial utilizate n terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei, dar ulterior s-a descoperit c au i activitate antimicrobian. Primul agent al acestei clase a fost produs de compania DuPont de Nemours, la sfritul anilor 70 pentru controlul bolilor foliare bacteriene i fungice la diferite plante, inclusiv la tomate. Modificarea chimic a oxazolidinonei a dus la descoperirea a doi ageni, eperezolid i linezolid, cu activitate in vitro i toxicitate diminuat. Linezolidul are activitate in vitro fa de N. gonorrhoeae i N. meningitidis i are o eficien bun fa de multe bacterii Gram-pozitive anaerobe (grupul Bacteroides fragilis). Bacteriile Gram- negative sunt probabil intrinsec rezistente, deoarece posed pompe de eflux, eficiente fa de linezolid. In vitro, linezolidul are o eficien relativ bun fa de M. tuberculosis i foarte bun fa de Nocardia.

Structura molecular a linezolidului

Concentraiile subinhibitorii de linezolid diminu producerea hemolizinei i coagulazei la S. aureus i inhib sinteza streptolizinei O i DN-azei la streptococi. Mecanismul de aciune i rezisten. Oxazolidinonele sunt inhibitorii sintezei proteinelor ribosomale la bacterii, dar spre deosebire de ali ageni antimicrobieni cu aciune asupra ribosomilor, au un mecanism unic de aciune deoarece blocheaz prima treapt a asamblrii ribosomilor din subunitile disociate. Oxazolidinonele se leag de un situs al subunitii 50S, la interfaa sa cu subunitatea 30S i previn formarea complexului de iniiere 70S, care cuprinde ARN-fMet, ARNm i cele dou subuniti ribosomale.
Linezolidul se leag la sau lng situsul de legare a cloramfenicolului i lincomicinei, deoarece cele 3 molecule intr n competiie pentru situsurile de legare din domeniul V al ARN 23S al subunitii 50S. Domeniul V este centrul peptidil-transferazei, care catalizeaz formarea legturii peptidice. Spre deosebire de cloramfenicol i lincomicin, linezolidul nu inhib formarea legturilor peptidice i ntre ele nu exist rezisten ncruciat. Asemntor majoritii inhibitorilor sintezei proteinelor ribosomale, activitatea linezolidului fa de bacterii in vitro este considerat bacteriostatic, deoarece bacteriile sunt omorte mai ncet dect de agenii bactericizi. Linezolidul este metabolizat prin oxidarea inelului morfolino i se formeaz doi metabolii: acidul aminoetoxiacetic i hidroxietil glicina. Linezolidul este un agent antimicrobian cu spectru larg, activ virtual fa de toate bacteriile Gram-pozitive. ntreaga cantitate administrat pe cale oral sau parenteral rmne disponibil aciunii antimicrobiene. Perioada de njumtire permite administrarea a dou doze/zi. Un parametru esenial al unui agent chimioterapeutic este indicele terapeutic, adic raportul dintre doza toxic minim i doza cu eficien maxim. Valoarea mare a acestui raport este caracteristic agenilor chimioterapeutici foarte eficieni.

27

777Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiie competitiv (tabelul 66) Sulfonamidele sunt ageni chimioterapeutici foarte importani din punct de vedere practic. Nu sunt antibiotice, deoarece termenul de antibiotic este rezervat substanelor sintetizate de organisme, de cele mai multe ori, bacterii sau fungi, care n concentraii foarte mici inhib sau omoar microorganismele. Sulfonamidele reprezint primul grup de substane microbiostatice introduse cu succes n clinic, avnd ca prototip sulfanilamida (para-amino-benzen-sulfonamida). Mecanismul aciunii sulfonamidelor a fost clarificat cnd Woods a demonstrat c acidul para-aminobenzoic (APAB) are o aciune antagonist fa de aceste substane, n sensul c anihileaz efectul lor antimicrobian: dublarea concentraiei de inhibitor adugat n mediu necesit dublarea concentraiei de APAB pentru a relua creterea. Toxicitatea selectiv a sulfonamidelor deriv din faptul c organismul uman preia acidul folic din surse externe, dar multe bacterii i sintetizeaz propriul acid folic.

Structura molecular a acidului para-aminobenzoic (APAB) Tabelul 66. Ageni chimioterapeutici care acioneaz prin inhibiie competitiv (adaptare dup Topley i Wilsons, 1998). Clasa de ageni inta specific Structura chimic chimioterapeutici Sulfonamide Inhibarea dihidropteroid sintetazei (DHPS)
H2N SO2NH2 sulfonamide

Diaminopirimidina (Trimetoprim)

Inhibarea reductazei

dihidrofolat
N H2N N

NH2

OCH3

CH2

OCH3

trimetoprim

OCH3

Nitroimidazoli

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN)

O2N N

CH3

CH2 CH2OH metronidazol

Nitrofurani (Nitrofurantoil)

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN).

O2N CH O N N

O C NH C O

H2C nitrofurantoil

Aciunea antagonist a APAB nu este direct, ci se exercit prin intermediul metabolismului bacterian. APAB este un nutrient esenial, fiind precursorul acidului folic, un factor de cretere pentru bacterii. Acidul

28

folic i formele sale reduse acidul dihidrofolic i tetrahidrofolic transfer fragmente cu 1C derivate din serin, pentru sinteza metioninei, purinelor, timinei, tiaminei, pantotenatului (Black, 1996). Datorit marii asemnri a structurii chimice a celor dou substane(APAB i sulfanilamida), ntre ele are loc un fenomen de competiie pentru intrarea n calea sintezei acidului folic.

Structura molecular a acidului folic

Enzima bacterian implicat n conversia APAB la acid folic(pteridin-sintetaza), adeseori greete i se combin cu sulfanilamida, n loc de APAB. Astfel, sinteza acidului folic i toat calea metabolic dependent de acidul folic este blocat. Sulfanilamida intr n competiie cu APAB pentru situsul activ al enzimei. Acest tip de inhibiie este reversibil: dac sulfanilamida este ndeprtat, enzima funcioneaz normal. Cu ct raportul moleculelor de sulfanilamid/APAB este mai mare, cu att inhibiia metabolismului bacterian este mai ampl. Sulfonamidele au afinitate mai mare dect APAB pentru pteridin-sintetaz. Trimetoprimul (un analog al acidului dihidrofolic) are afinitate de 10000-100000 de ori mai mare pentru dihidrofolat-reductaza (DHFR) bacterian dect pentru cea mamalian. Aceast enzim catalizeaz conversia dihidrofolatului la acidul tetrahidrofolic (Wistreich, 1996). Astfel sunt blocate cile metabolice dependente de acidul folic, care acioneaz ca purttor al gruprilor C1 i este necesar pentru sinteza ADN, ARN etc. Spre deosebire de mamifere, bacteriile i protozoarele parazite nu au sistem de transport care s preia acidul folic preformat din mediul extern.Majoritatea acestor organisme trebuie s-l sintetizeze, dei unele pot s foloseasc timidina exogen, acoperind astfel necesarul metabolic. Sulfamidele sunt toxice pentru bacteriile capabile s sintetizeze acidul folic, pornind de la molecule mai simple. Bacteriile care necesit aportul exogen al moleculelelor preformate, nu sunt sensibile la sulfonamide. Efectul sulfonamidelor este antagonizat necompetitiv (independent de creterea concentraiei) de un amestec de intermediari ai cii acidului folic. Sulfanilamida inhib sinteza acidului folic n stadiul timpuriu, prin inhibiie competitiv cu sintetaza acidului dihidropteroic, enzima care catalizeaz condensarea dihidropteridinei cu acidul para-aminobenzoic. Deoarece acidul folic i pstreaz activitatea n celulele bacteriene, efectul inhibitor al sulfonamidelor devine evident dup cteva generaii de celule, cnd cantitatea de acestui metabolit s-a diminuat sub un nivel critic, prin distribuie n celulele fiice. Toxicitatea selectiv deriv din faptul c bacteriile sensibile sintetizeaz acidul folic de novo, iar omul absoarbe cofactorul preformat. Cele mai cunoscute sulfonamide sunt sulfadiazina i sulfametoxazol (cotrimoxazol), bine absorbite dup administrare oral i excretate n urin.

Structura molecular a sulfametoxazolului (Cotrimoxazol).

29

Aciunea derivailor sulfanilamidei este bacteriostatic fa de bacteriile Gram-pozitive i Gramnegative. Se folosesc n tratamentul infeciilor vezicii urinare, cauzate n marea lor majoritate de E. coli. Circa 5% dintre pacieni sufer efecte secundare, mai ales reacii alergice, cu febr i eritem tegumentar. Ca i sulfamidele, acidul paraaminosalicilic (APAS) i Dapsone, obinui prin sintez chimic sunt inhibitori competitivi ai metabolismului APAB i inhib sinteza acidului folic.

Structura molecular a Dapsone

Structura molecular a APAS (Acid para-aminosalicilic).

Rezistena bacterian la sulfonamide este mediat de plasmide, dar i de gene cromosomale, prin hiperproducia de acid p-aminobenzoic. Familia derivailor diaminopirimidinici cuprinde trimetoprimul i tetroxoprimul. Trimetoprim este un analog al acidului dihidrofolic, component esenial al sintezei aminoacizilor i nucleotidelor. Agentul chimic blocheaz metabolismul dependent de acidul folic, dar la alt nivel dect sulfonamidele, a cror eficien o ridic foarte mult (Wistreich, 1996). Agentul inhib competitiv dihidrofolatreductaza, enzima care convertete dihidrofolatul la cofactorul activ acidul tetrahidrofolic. Trimetoprim blocheaz regenerarea acidului tetrahidrofolic, precursorul acidului folinic i ulterior al purinelor i al sintezei ADN, fiind un inhibitor al creterii bacteriilor mai eficient dect sulfonamida.

Structura molecular a acidului tetrahidrofolic.

Blocajul secvenial al aceleiai ci de biosintez, sub aciunea sulfonamidelor i trimetoprim, determin un grad nalt de activitate sinergic fa de un spectru larg de microorganisme. Omul nu sintetizeaz acidul folic, dar necesit aportul exogen i sinteza purinelor n celula uman nu este influenat semnificativ de trimetoprim. Are aciune selectiv deoarece este de 50 000 100 000 de ori mai activ fa de dihidrofolat-reductaza bacterian, comparativ cu cea uman. Trimetoprim are spectru larg de aciune: coci Gram-pozitivi i majoritatea bacililor Gram-negativi, cu excepia Ps. aeruginosa i Bacteroides. Rezistena mediat de gene cromosomale ori plasmidiale, este consecina dobndirii unei gene a dihidrofolat-reductazei (DHFR), mult mai puin sensibil la trimetoprim sau altor mecanisme: supraproducia DHFR, mutaii ale genei structurale a DHFR sau dobndirea unei gene care codific o enzim rezistent la DHFR. Genele ce codific enzimele modificate se gsesc frecvent pe plasmide autotransferabile. Enzimele modificate sunt produse n celule, concomitent cu o dihidrofolat reductaz de tip slbatic, dar cantitatea

30

enzimei alterate depete blocajul sintezei acidului folic mediat de efectul trimetoprimului asupra enzimei de tip slbatic. Rezistena la sulfonamide se produce printr-un mecanism asemntor. Datorit rezistenei la sulfonamide, trimetoprim a fost introdus ca un poteniator al sulfonamidelor, n asociaie cu care s-a administrat mult timp, considerndu-se c are proprieti antibacteriene slabe. Acum se administreaz pe scar larg, ca agent terapeutic unic. Ageni chimioterapeutici activi prin inhibiia replicrii i transcrierii ADN Quinolonele (denumite i 4-quinolone) sunt primele substane antimicrobiene obinute pe cale sintetic i formeaz o familie de compui care se aseamn prin existena nucleului quinolinic (fig. 368). Primul compus din acest grup, folosit n terapie este acidul nalidixic. Quinolonele, alturi de lactamice i macrolide, reprezint una dintre cele trei familii principale de ageni antimicrobieni folosii n terapeutica uman (Wolfson & Hooper, 1989). Importana lor terapeutic este n continu cretere ncepnd din 1968, data comercializrii primei quinolone, acidul nalidixic. Acidul nalidixic este un produs intermediar de sintez a quinolonelor. Ulterior quinolonele s-au diversificat prin introducerea unui atom de fluor (F) n poziia 6 i a unui heterociclu n poziia 7 (piperazine, pirolidina, etc.) care au generat fluoroquinolonele. Aceste molecule posed un spectru antibacterian foarte larg i pot fi divizate n molecule metabolizabile i nemetabolizabile (grupele III i IV). Quinolonele se pot clasifica n dou grupe: - cele de prim generaie, ca acidul nalidixic, active asupra bacililor Gram-negativi; - de generaia a II-a - fluoroquinolonele.

Acid nalidixic

Norfloxacin

Ciprofloxacin

Ofloxacin

Pefloxacin

Enoxacin

Amifloxacin

Flerofloxacin

Lomefloxacin

31

Temafloxacin

Tosufloxacin

PD 127, 391

Fig. 368. Structura molecular a agenilor antimicrobieni fluoroquinolonici (dup Wolfson & Hooper, 1989).

Gama derivailor quinolonei s-a diversificat prin modificarea nucleului de baz, 4-quinolona. La atomul C6 s-a adugat unul de fluor, ceea ce a crescut semnificativ spectrul i potenialul lor antimicrobian. Avnd n vedere spectrul lor de activitate antibacterian, limitat la bacterii Gram-negative i n principal la enterobacterii, acidul nalidixic i derivaii si au fost folosii pentru tratamentul infeciilor urinare. Modificrile structurii au dat natere la quinolone, denumite noile quinolone sau fluoroquinolone (norfloxacin, pefloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin etc.), al cror spectru de activitate antibacterian se extinde la alte specii Gram-negative (de ex. Ps. aeruginosa), dar i la anumite specii Gram-pozitive (S. aureus) i micobacterii. Totui, activitatea noilor quinolone fa de alte specii, aa cum sunt cele natural-sensibile la acidul nalidixic, rmne modest, ceea ce corespunde unui anumit grad de rezisten intrinsec a acestor specii. Mecanismul de aciune a quinolonelor este foarte complex. Aceste molecule ptrund n celula bacterian prin difuzie pasiv i acioneaz asupra intelor specifice reprezentate de topoizomeraze: ADNgiraza (topoizomeaza II) i topoizomeraza IV. Aciunea celor dou enzime este inhibat. Quinolonele se leag i stabilizeaz complexele giraz-ADN (quinolona singur nu se asociaz cu ADN), dup clivarea lanului, mpiedicnd aciunea catalitic a ADN-polimerazei la nivelul bifurcaiei de replicare. Complexul genereaz o rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repar eficient. Fluoroquinolonele formeaz complexe stabile cu topoizomeraza II, efectul fiind moartea celulei. S-a sugerat c quinolonele nu se leag cu ADN-giraza nsi, ci probabil chiar la situsuri specifice pe ADN, create de ADN-giraz. Studiile comparative ale sensibilitii la fluoroquinolone i de dezvoltare a rezistenei, au relevat c ADN-giraza este inta primar a fluoroquinolonelor la bacteriile Gram-negative, iar topoizomeraza IV este inta primar la bacteriile Gram-pozitive. Excepia o constituie Streptococcus pneumoniae, la care fie giraza, fie topoizomeraza pot fi inte primare, n funcie de fluoroquinolona folosit. Activitatea antibacterian este dependent ntr-o msur semnificativ de atomul de fluor din poziia 6 i de nucleul piperazinic din poziia 7. Configuraia spaial a quinolonei determin nivelul activitii. Astfel, enantiomerii stereochimici (care difer unul de altul numai prin poziia n spaiu a unei grupri particulare), ce implic grupul metil ataat la inelul al III-lea de ofloxacin, au activiti antibacteriene foarte diferite, care difer n proporie de 1/10. Quinolonele sunt ageni bactericizi. Ele stopeaz rapid sinteza replicativ a ADN i ntrerup progresia bifurcaiei de replicare. Inhibiia activitii ADN-girazei sub aciunea fluroquinolonelor induce moartea rapid a celulei bacteriene. Inhibiia rapid a sintezei ADN nu explic moartea celulei bacteriene. Pentru efectul letal sunt necesare alte evenimente suplimentare: inhibiia sintezei ARN i a proteinelor. La concentraiile de quinolone care depesc un anumit prag, activitatea bactericid diminu, probabil pentru c este inhibat numai sinteza ARN i a proteinelor. Quinolone induc probabil efecte pleiotrope, ce pot fi consecine secundare ale inhibiiei sintezei ADNgirazei: leziuni ale ADN bacterian, deoarece quinolonele sunt inductoare ale sistemului reparator SOS, dependent de Rec A.

32

Noile quinolone au reprezentat un real progres terapeutic avnd n vedere caracteristicile aciunii lor antibacteriene (spectru larg, activitate bactericid i farmacocinetic). Aceasta explic spectaculoasa cretere a utilizrii lor n ultimii 10 ani. Dar utilizarea extensiv a noilor quinolone s-a tradus prin emergena ngrijortoare a tulpinilor rezistente a unor specii bacteriene de mare importan medical (enterobacteriile, Ps. aeruginosa, S. aureus, Mycobacterium tuberculosis, N. gonorrhoeae) i a tulpinilor multirezistente la alte antibiotice. Mecanismele rezistenei bacteriene la fluoroquinolone sunt de trei categorii: - modificri ale enzimelor int ale medicamentelor; - alterri care limiteaz accesul medicamentelor la int; - activitatea pompelor de eflux. Rezistena la quinolone este, predominant, consecina modificrilor enzimei int, la situsurile active ale enzimei. ADN giraza i topoizomeraza IV sunt localizate n citoplasma bacterian. Pentru a-i atinge inta, antibioticele fluoroquinolonice trebuie s traverseze nveliul celular. Modificrile structurale ale membranei externe a bacteriilor Gram-negative asociate cu diminuarea nglobrii sunt factori importani ai rezistenei la fluoroquinolone. Variantele Gram-negative rezistente la quinolone care se selecteaz, se datoreaz modificrii porinelor din membrana extern, asociate cu scderea permeabilitii. Rezistena la quinolone nu este transferabil prin intermediul plasmidelor. La bacteriile Gram-pozitive, scderea ratei nglobrii nu s-a demonstrat a fi un mecanism al rezistenei. Att bacteriile Gram-pozitive, cat i cele Gram-negative pot dobndi un nivel sczut al rezistenei, mediat de activitatea pompelor de eflux, cu rol de transportori multipli, a cror activitate este dependent de gradientul electrochimic (fora proton motrice). Nu s-au identificat enzime cu efect inactivator fa de quinolone. Ciprofloxacina are un potenial antibacterian mult mai ridicat dect acidul nalidixic. Efectul bactericid al ciprofloxacinului este rapid, cu o pierdere de 90% a viabilitii, ntr-un interval de 19 minute. Ciprofloxacina se folosete n tratamentul infeciilor respiratorii, ale tractului urinar, gonoreii, pentru tratamentul infeciilor diareice cu tulpinile enterotoxice de E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella. Este activ, de asemenea, fa de M. tuberculosis. Este parial metabolizat de ficat i excretat de rinichi. Medicamentele antiacide (Maloox) blocheaz absorbia ciprofloxacinei i nu vor fi administrate concomitent. Administrat mpreun cu teofilina, ciprofloxacina poate duce la acumularea unor niveluri sanguine nalte ale teofilinei. Ionii de Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ pot s lege ciprofloxacina i diminueaz mult absorbia medicamentului. Multe antibiotice, inclusiv ciprofloxacina, pot altera microbiota normal a colonului, favoriznd dezvoltarea bacteriilor care produc inflamaia mucoasei (colita pseudomembranoas) i determin tulburri diareice. Colita pseudomembranoas se datoreaz creterii n exces a bacteriei Clostridium difficile i poate induce stri febrile, durere abdominal, tulburri ale tranzitului intestinal i chiar starea de oc. Tratamentul cu ciprofloxacin poate duce la creterea n exces a levurii Candida albicans, cu localizare vaginal (vaginit) sau intestinal (disbioza). Manifestarea efectelor secundare este prevenit prin administrarea probioticelor: Lactobacillus casei, L. acidophilus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisiae. Derivaii quinolonici se folosesc pentru tratamentul infeciilor cilor urinare, unde, dup administrare oral, se acumuleaz n concentraii inhibitorii. Fluoroquinolonele ptrund n esutul prostatic la concentraii care echivaleaz sau depesc de cteva ori pe cele din plasm. Cele mai sensibile la aciunea quinolonelor sunt enterobacteriile, dar compuii grupului sunt activi fa de chlamidii i micobacterii. Quinolonele au efect antimicrobian prelungit dup administrare, ceea ce se reflect n continuarea supresiei creterii bacteriene, dup eliminarea agentului antimicrobian din organism. Dac un medicament are un efect persistent dup administrare, nseamn c poate fi eficient chiar n intervalele dintre doze, cnd nivelul seric i tisular au sczut sub nivelul concentraiei minime inhibitorii. Quinolonele i pstreaz activitatea fa de multe bacterii rezistente la antibiotice, inclusiv fa de bacilii Gram-negativi cu rezisten multipl, fa de S. aureus rezistent la meticilin, fa de N. gonorrhoeae rezistent la penicilin, fa de Haemophilus influenzae productor de -lactamaze.
33

Ciprofloxacina, ofloxacina i tosufloxacina sunt active fa de Chlamydia trachomatis i Mycoplasma hominis. Quinolonele sunt de asemenea active fa de Rickettsia spp. Acidul nalidixic inhib numai speciile de bacterii Gram-negative aerobe. n molecula de ciprofloxacin, fluorul confer activitate fa de bacteriile Gram-pozitive. Grupul piperazinic crete activitatea fa de enterobacterii, iar gruparea piperazin i ciclopropil confer activitate fa de speciile de Pseudomonas. Rifampicina B este sintetizat natural, iar rifampicina este derivatul semisintetic cu cea mai larg utilizare clinic. Rifampicina este alctuit dintr-o grupare cromofor aromatic, inclus ntr-o caten alifatic. Ea se asociaz cu subunitatea B a ARN-polimerazei dependente de ADN i probabil chiar cu ADN n complexul de iniiere, blocnd astfel iniierea transcrierii i sinteza ARN. Antibioticul se folosete n terapia combinat a tuberculozei. Mutantele rezistente, cu subunitatea B a ARN-polimerazei modificat se selecioneaz repede.

Structura molecular a rifampicinei B

Actinomicina D (Dactinomicina) este format dintr-o grupare cromofor aromatic i un ciclu peptidic. Ea interacioneaz cu ADN i inhib replicarea i transcrierea. Gruparea aromatic se intercaleaz n dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rmne la suprafa.

Structura molecular a actinomicinei D Novobiocina interfer cu sinteza ARN, deoarece inhib ARN-polimeraza dependent de ADN, iar griseofulvina inhib replicarea ADN, consecutiv interferenei cu polimerizarea nucleotidelor purinice . Cercetri recente sugereaz c novobiocina acioneaz asupra subunitii B a ADN-girazei (topoizomeraza II) care produce i menine starea supraspiralizat a ADN. Griseofulvina sintetizat de Penicillium griseofulvum a fost izolat ca un factor care produce dezvoltarea anormal (rsucirea) a hifelor fungice. Se folosete pentru tratamentul infeciilor fungice

34

superficiale. Inhib creterea fungilor micelieni, dar nu este activ fa de bacterii sau levuri. Nu influeneaz creterea fungilor cu perei celulozici, dar inhib creterea fungilor care conin chitin. Griseofulvina influeneaz celulele fungice prin contact direct: creterea hifelor aeriene nu este modificat. Concentraiile mici produc rsucirea hifelor, ramificarea extensiv, micorarea distanei dintre pereii transversali, creterea diametrului. La concentraii mari de antibiotic, modificrile de cretere se amplific i hifele se rup.

Structura molecular a griseofulvinei

Antibioticele care interacioneaz cu ADN produc efecte nediscriminatorii asupra ADN bacterian, viral sau al celulei eucariote.
Ali ageni chimioterapeutici de sintez. Hidrazida acidului nicotinic (izoniazida, INH), introdus n clinic nainte de 1950, mpreun cu rifampina, formeaz baza chimioterapiei antituberculoase. Izoniazida este un derivat al nicotinamidei. Mecanismul de aciune nu este cunoscut, dar influeneaz sinteza lipidelor, acizilor nucleici i acidului micolic la M. tuberculosis.

Structura molecular a izoniazidei

Structura molecular a piridoxinei (vitamina B6)

Se presupune c izoniazida este activ prin competiie cu piridoxina (vitamina B6) necesar creterii celulelor de M. tuberculosis, sau inhib sinteza acizilor micolici (acizi grai specifici acestor bacterii). Este bactericid fa de celulele care cresc i se divid i are aciune bacteriostatic fa de celulele care nu se multiplic. Toate cele trei (PASA, dapsone i izoniazida) se folosesc pentru tratamentul infeciilor cu Mycobacterium. Etambutolul, pirazinamida i etionamida blocheaz reaciile enzimatice n celula bacterian, deoarece sunt similare dar nu identice cu vitaminele bacteriene. Etambutolul inhib arabinozil-transferaza, enzim implicat n biosinteza arabinogalactanului i lipoarabinomananului. Alte efecte atribuite aciunii etambutolului sunt inhibiia metabolismului ARN i sintezei fosfolipidelor, inhibiia transferului acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular mureinic, sinteza spermidinei i inhibiia unei trepte timpurii a conversiei glucozei n monozaharidele utilizate pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) i a peptidoglicanului. Este un medicament foarte specific i eficient, utilizat n asociaie cu izoniazida, pentru tratamentul tuberculozei. Are efect bacteriostatic. Nu se cunoate mecanismul care determin rezistena la etambutol (Musser, 1995).

35

Structura molecular a etambutolului Pirazinamida este un derivat sintetic al nicotinamidei. Nu se cunoate mecanismul de aciune, nici baza molecular a rezistenei. Unele tulpini sensibile la pirazinamid au o enzim specific (pirazinamidaza), ce metabolizeaz pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian. Tulpinile rezistente la pirazinamid au pierdut activitatea pirazinamidazic. S-au identificat i tulpini foarte rezistente la pirazinamid, care au i activitate pirazinamidazic. Aceasta sugereaz c, n plus fa de pierderea capacitii de sintez a pirazinamidazei, exist i alte mecanisme de rezisten.

Structura molecular a pirazinamidei Etionamida, derivat a acidului izonicotinic, este activ fa de M. tuberculosis i alte micobacterii. In vitro, celulele de M. tuberculosis i pierd acidorezistena. Se crede c mecanismul su de aciune implic inhibiia sintezei acizilor micolici.

Structura molecular a etionamidei Nu se cunosc mecanismele rezistenei la etionamid i la izoniazid. Metronidazolul a fost introdus n clinic n 1959 pentru tratamentul infeciei cu Trichomonas vaginalis. Ulterior s-a demonstrat eficiena sa fa de infeciile cu bacterii anaerobe i fa de alte infecii parazitare. Difuzeaz bine n esuturi, inclusiv n sistemul nervos. Are cea mai bun activitate bactericid, dintre toate medicamentele active fa de bacteriile anaerobe. Aciunea sa const n activarea reductiv a grupriii nitro. Metronidazolul acioneaz ca acceptor preferenial de electroni(e-), fiind redus de proteinele transportoare de e- cu potenial redox sczut. Reducerea scade concentraia sa, ceea ce menine un gradient ce favorizeaz ncorporarea medicamentului n celul i generarea produselor intermediare ale reducerii, cu efecte toxice pentru celul. Toxicitatea se datoreaz compuilor intermediari sau radicalilor liberi ce interacioneaz cu ADN i probabil cu alte molecule, producnd leziuni. Intermediarii citotoxici se descompun n produse finale netoxice i inactive: acetamida i acidul 2-hidroxietil oxamic. Efectul asupra microbiotei intestinale este minim, deoarece medicamentul este redus n condiii anaerobe. Methenamina este produsul ciclic de condensare a formaldehidei i amoniului. Are activitate antibacterian slab, dar la pH acid, fiecare molecul hidrolizat genereaz 4 molecule de amoniu i 6 molecule de formaldehid:

36

Este excretat n urina acid, unde este hidrolizat i formaldehida eliberat este bactericid. Este disponibil ca sare a acidului mandelic sau hipuric pentru acidifierea urinii. Nu s-a descris rezistena la formaldehid, dar tulpinile de Proteus, care produc frecvente infecii urinare sunt rezistente, deoarece ureaza lor cliveaz ureea la CO2 i NH3 i alcalinizeaz urina. Derivaii nitrofuranului (furazolidon, nitrofurantoina, nitrofuratel, nitrofurazon) au efect bacteriostatic fa de bacteriile Gram-pozitive i Gram-negative. Cel mai utilizat este nitrofurantoina. Derivaii nitrofuranului se folosesc pentru terapia infeciilor tractului urinar, deoarece realizeaz concentraii suficient de mari n urin. Nu au aciune sistemic. Un intermediar redus al nitrofuranilor produce ruperea catenei de ADN, ceea ce explic efectele mutagene ale acestor compui in vitro. Sunt activate mecanismele de reparare a ADN. Metaboliii reactivi redui ai nitrofurantoinei interfer nu numai cu ADN, ci par a fi capabili s se lege cu proteinele ribosomale i inhib sinteza proteinelor. Inhib respiraia bacterian i metabolismul piruvatului. Evaluarea in vitro a eficienei unui antibiotic se realizeaz prin msurarea a 3 parametri, care variaz n funcie de concentraia antibioticului i de timpul su de aciune: concentraia minim activ (= C.M.A.) - este concentraia la care antibioticul poate induce anumite perturbri n activitatea metabolic a microorganismelor, fr a afecta capacitatea de multiplicare i viabilitatea acestora; concentraie minim inhibitorie (= C.M.I.) - este concentraia la care un antibiotic inhib multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic); concentraie minima bactericid (= C.M.B.) - este concentraia la care un antibiotic are aciune letal asupra microorganismelor (efect bactericid). Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice Metoda difuzimetric (Kirby-Bauer) Este o metod foarte simpl i rapid, care permite determinarea spectrului de sensibilitate a microorganismului la diferite antibiotice. Metoda are mai multe variante, n practic folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizat, recomandat de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation). O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbian studiat (densitatea inoculului, specia, vrsta culturii), mediul de cultur (compoziia mediului, valoarea pH, densitatea i grosimea stratului de mediu), tehnica folosit i criteriile de interpretare a rezultatelor obinute, pot influena rezultatele unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuat n condiii standardizate, reproductibile, conform indicaiilor forurilor internaionale n domeniu. Pe suprafaa unui mediu agarizat nsmnat n pnz cu un inocul standardizat, obinut din tulpina de testat, se plaseaz la distane egale discuri impregnate cu soluii de antibiotice de o anumit concentraie care vor difuza n mediu, realiznd un gradient de concentraie invers proporional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distana fa de disc. Dac tulpina este sensibil la un anumit antibiotic, creterea microbian va fi inhibat pe o anumit suprafa n jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafa denumit zon de inhibiie a creterii. Citirea rezultatelor se realizeaz prin masurarea diametrelor zonelor de inhibiie a creterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. n cazuri de urgen clinic se poate realiza o prim citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face n funcie de dimensiunea zonelor de inhibiie a creterii, exprimnd rezultatul cu termenii de tulpin sensibil (S), rezistent (R) sau intermediar sensibil (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate i corespunztoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetric recomandat de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute). Termenii S, I, R definesc de fapt i categoriile de antibiotice, n funcie de efectul lor clinic, dup cum urmeaz: categoria S, nseamn c exist o mare probabilitate ca antibioticul, administrat n doze obinuite, s elimine infecia determinat de tulpina testat (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentraiilor umorale obinute n urma administrrii unei doze obinuite);
37

categoria I, semnific probabilitatea ca antibioticul s fie eficient in vivo prin administrare local sau prin realizarea n mod fiziologic a concentraiilor mari n organele sau esuturile (rinichi, ficat, ci biliare), la nivelul crora este localizat procesul infecios; categoria R nseamn c, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din organism a agentului infecios a crui sensibilitate a fost testat sau rezultatul tratamentului este imprevizibil; categoria NS (non-sensibilitate), raportat pentru antibioticele pentru care nu exist puncte critice de separare ntre cele 3 categorii, S, I, R. La citirea i interpretarea rezultatelor se iau n considerare diametrele zonelor de inhibiie, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber. Apariia coloniilor la marginea sau n interiorul zonei de inhibiie se poate datora urmtorilor factori: cultura este mixt sau suprainfectat; cultura este pur, dar prezint celule heterorezistente; apariia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiv a unor celule, de fapt sensibile, i apariia coloniilor dup ce antibioticul s-a diluat prin difuzie n mediu. Prepararea inoculului Metoda n mediu lichid: Se repic 3-5 colonii egale din placa de dipersie de 18-24 ore, se suspensioneaz n 5 ml de mediu lichid (Brain-Heart, Todd Hewitt, Tripticase soia etc.) i se incubeaz la 35C timp de 2-6 ore, pn la obinerea unei turbiditi de 0,5 pe scara Mac Farland densitate optic la 550 nm de 0,125. Daca turbiditatea este superioar, cultura se dilueaz cu ser fiziologic steril. Metoda suspensionarii directe a coloniilor: Se repic un numr de colonii de pe placa cu cultur de 18 ore i se suspensioneaz n ser fiziologic steril, pentru obinerea unei turbiditi echivalente cu cea a etalonului 0.5 MacFarland densitatea optic la 550 nm este 0,125 (fig. 369). Se agit cu ajutorul unui agitator vortex, timp de 15-20 secunde. Se calibreaz suspensia prin adugarea unei cantiti mai mari sau mai mici de soluie clorurat izotonic pn la obinerea densitii optice dorite. Pentru prepararea standardului MacFarland 0,5, se combin 0,5 ml BaCl2 0,048 M (1,175% BaCl2+2H2O), 99,5 ml H2SO4 0,18 M (1% v/v), se agit continuu i se controleaz absorbia la 625 nm, care trebuie s fie 0,08-0,10. Se distribuie volume de 4-6 ml n tuburi cu dop filetat. Se pstreaz la ntuneric, la temperatura ambiant.

Fig. 369. Metoda nefelometric (cu ajutorul standardului MacFarland) (stg.), respective densitometric (dr.) de ajustare a densitii inoculului microbian.

Inocularea plcilor

38

Plcile uscate sunt inoculate la cel mult 15 minute dup prepararea inoculului. Se introduce un tampon steril n suspensia calibrat i se retrage prin rotirea de mai multe ori, cu presiune contra peretelui tubului, pentru eliminarea excesului de lichid. Inocularea n plcile cu agar MllerHinton se realizeaz prin tehnica nsmnrii n pnz, prin rotirea plcii cu cte 600, cutnd s obinem o nsmnare uniform (fig. 370).

Fig. 370. Aspectul striurilor de nsmnare n pnz, cu tamponul.

n funcie de specia testat, se vor alege antibioticele indicate de ultima ediie a standardului CSLI, n care antibioticele sunt clasificate n mai multe categorii: Grup A- panelul de rutin; Grup B- antibiotice cu raportare selectiv (se testeaz atunci cnd tulpina izolat este R la antibioticele de clasa A, dac pacientul este alergic la antibioticele din panelul de rutin sau nu tolereaz antibioticele de clas A, CGIII se testeaz pentru bacilii Gram-negativi (BGN) izolai din LCR, trimetroprim sulfametoxazol (SXT) pentru tulpinile izolate din infecii urinare, polimicrobiene, generalizate etc.); Grup C antibiotice suplimentare/alternative (se testeaz pentru tulpinile R la antibioticele primare, cum sunt tulpinile nosocomiale care prezint rate crescute de R, la pacienii cu alergii, intoleran, cloramfenicolul pentru tulpinile de Salmonella extraintestinale etc.); Grup O antibiotice care nu se testeaz n rutin, dar care sunt eficiente n infeciile cu anumii ageni patogeni; Grup U nitrofurantoin, quinolone- se testeaz pentru tulpinile izolate din ITU; Inv antibiotice n investigare, care nu sunt aprobate de FDA (Food and Drug Administration). Discurile de antibiotic vor fi depuse cu ajutorul unor dispensere sau pense sterile, aplicndu-se o presiune discret pe discuri, pentru asigurarea contactului perfect cu suprafaa agarului (fig. 371).

39

Fig. 371. Metode de depunere a discurilor de antibiotic pe placa cu mediu nsmnat (individual,cu ajutorul pensei sau simultan, cu ajutorul dispenser-ului).

Discurile vor fi aezate la cel puin 15 mm de marginea plcii i distribuite n aa fel nct s nu existe suprapuneri ntre zonele de inhibiie. Dup 15 minute de la depunerea disurilor, plcile sunt introduse n termostatul de 35C, rsturnate, cu mediul n partea superioar, n grupuri de maximum 5 placi, i n aerobioz timp de 16-18 ore. n cazul stafilococilor sensibili la meticilin incubarea se prelungete la 24 de ore pentru confirmarea absenei coloniilor rezistente la meticilin. Dup 18 ore (24 de ore n cazul testrii sensibilitii la meticilin i vancomicin) de incubare se msoar cu o rigl diametrul zonelor de inhibiie, pe spatele plcii. Citirea diametrului pentru meticilin se realizeaz cu ajutorul luminii transmise, pentru observarea coloniilor foarte mici, rezistente. n cazul apariiei coloniilor rezistente n interiorul zonei de inhibiie, poate fi vorba de mutante rezistente, contaminare, populaii heterogene sau culturi mixte. Pentru controlul de calitate (CC) se utilizeaz tulpini standard pentru controlul reproductibilitii i fiabilitii metodologiei utilizate. Tulpinile standard pentru control se pstreaz n congelator la 70C pentru conservarea calitilor i evitarea modificrilor genetice. Pentru reconstituire nu se decongeleaz, ci se scarific suprafaa tubului cu ansa sau cu tamponul i se nsmneaz ntr-un mediu lichid. Se incubeaz la 35C, timp de 18-20 ore, se realizeaz un nou pasaj i apoi se testeaz. Se utilizeaz tulpinile de control la fiecare lot nou de mediu sau de antibiotic. Tulpina Enterococcus faecalis ATCC 29212 este folosit pentru detectarea nivelului inhibitorilor din mediul MllerHinton, n vederea testrii trimetoprimului i/sau sulfametoxazolului. Tulpina ATCC 25923 este utilizat pentru CC al discurilor de antibiotice utilizate. Tulpina Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853 servete pentru CC al coninutului cationic i al valorii pH a mediului, care pot influena n special rezultatele testrii la aminoglicozide. Diametrele obinute cu tulpinile standard sunt comparate cu cele specificate n tabelele NCCLS/CLSI. Testarea cantitativ a activitii antimicrobiene - determinarea unor parametri cantitativi ai aciunii antimicrobiene (CMI) Tehnica microdiluiilor binare n mediu lichid Se realizeaz n mediu lichid (bulion Mller Hinton), repartizat n placi cu 96 de godeuri, n vederea determinrii concentraiei minime inhibitorii CMI. n acest scop, se realizeaz diluii seriale binare ale soluiei stoc de antibiotic ntr-un anumit volum de mediu, ulterior godeurile fiind nsmnate cu suspensie microbian cu densitate 0.5 MacFarland (1:5). La fiecare testare se lucreaz cu martor de cultur microbian (godeuri care conin exclusiv mediu de cultur inoculat cu suspensie microbian) i cu martor de sterilitate a mediului (godeuri care conin exclusiv mediu de cultur). Dup incubarea placilor la 37oC timp de 24 de ore, se analizeaz rezultatele obinute prin observare macroscopic. Concentraia de antibiotic corespunztoare ultimului tub n care nu se mai observ dezvoltarea culturii reprezint valoarea C.M.I. (g/ml). n tuburile urmtoare, inclusiv tubul martor de cretere, mediul se tulbur ca urmare a creterii microbiene. Tubul martor de sterilitate nu prezinta cultur dezvoltat. Metoda E-test (Epsilometer test)

40

Metoda E-test utilizeaz benzi impregnate cu diferite concentraii ale aceluiai antibiotic, nscrise pe banda respectiv. Zona de inhibiie a creterii microorganismului testat are aspect de elips, a crei suprafa variaz direct proporional cu gradientul de concentraie a antibioticului difuzat n mediu, diminundu-se odat cu scderea concentraiei astfel c, la o anumit valoare, zona de inhibiie a creterii va intersecta banda, concentraia nscris pe band la acest nivel indicnd valorea C.M.I. (fig. 372).

Fig. 372. E-test ESBL (deformarea elipsei n zona central a benzii, datorit sinergismului de aciune dintre cefalosporincefepim, PM) i inhibitorul de beta-lactamaz- cefepim cu acid clavulanic, PML).

Teste fenotipice pentru detectarea mecanismelor de rezisten la antibiotice Metoda discurilor duble Aceasta metod presupune compararea diametrelor zonelor de inhibiie date de un disc impregnat cu un antibiotic betalactamic (penicilin, cefalosporin sau carbapenem) cu un alt disc impregnat cu acelai antibiotic asociat cu un inhibitor de betalactamaze (acidul clavulanic pentru betalactamaze sensibile la inhibitori i respectiv chelatori de metale bivalente, de exemplu EDTA, pentru metalo-betalactamaze). Dac tulpina testat produce o enzim sensibil la aceti inhibitori, diametrul zonei este mai mare pentru discul ce conine antibiotic + inhibitor. . Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL Pe o plac cu mediu Mller-Hinton inoculat cu tulpina de testat (cultur de 24 h, nsmnare pe plac prin tehnica n pnz) se aplic discuri cu amoxicilin / clavulanat (AMC) i la 25-30 mm distan se plaseaz discuri coninnd cefalosporine (ceftazidim, cefotaxim). Se incubeaz peste noapte la 37oC. Producerea de ESBL este certificat dac diametrul zonei de inhibiie este extins din cauza clavulanatului (inhibitorul de -lactamaze) (fig. 373).

41

Fig. 373. Fenotip ESBL, cu synergism ntre AMC i cefalosporin de generaia a IV-a (cefepim)

Avantajul acestei metode simple este costul sczut; dezavantajul este acela c alegerea optim a discurilor poate varia cu fiecare tulpin. Izolatele cu ESBL-uri de tip TEM i SHV dau rezultate pozitive, n schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un rezultat pozitiv numai atunci cnd cefotaximul sau cefpodoximul nlocuiesc ceftazidimul, ca indicator de cefalosporine. Tulpinile productoare de ApmC i majoritatea tulpinilor hiperproductoare de enzime K1, dau rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine. Se recomand utilizarea discurilor de cloxacilin pentru detectarea penicilinazelor (acest antibiotic inhib cefalosporinazele); N.B. - inoculul dens poate masca hiperproducia de -lactamaze; N.B. - cnd sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionrii zonelor de inhibiie, se ndeprteaz discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic n patru; N.B.- existena unor discrepane mari ntre diametrul zonelor de inhibiie la CAZ i CTX se datoreaz prezenei unei alte enzime pe lng ESBL (ex. -lactamaze AmpC la Enterobacter cloacae). Teste pentru confirmarea prezenei unui mecanism de rezisten inductibil (-lactamaze cromosomale inductibile de tip AmpC sau fenotip MLSb inductibil) Cefalosporinele de generaie I (ampicilina i amoxicilina) induc exprimarea enzimelor tip AmpC i sunt distruse de ctre acestea, la majoritatea speciilor de Enterobacteriaceae. Consecutiv, tulpinile bacteriene productoare de -lactamaze inductibile tip AmpC devin rezistente constitutiv. Unele tulpini aparinnd speciilor productoare de -lactamaze inductibile tip AmpC sunt mutante derepresate care produc enzime AmpC fr inducie (derepresie stabil). Aceste mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele i cefalosporinele (Livermore i colab., 2001) i sunt frecvente n izolatele clnice (fig. 374).

42

Fig. 374. Fenotip de rezisten la cefalosporine i AMC.

Speciile productoare de -lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de antagonism ntre cefoxitin i cefotaxim (Sanders i colab. 1982). Pentru efectuarea acestui test se inoculeaz plci, conform protocolului din metoda antibiogramei, i se plaseaz discuri cu ceftazidim i cefoxitin, pe acceai plac, la o distan de 25 mm. Inducia de -lactamaze este evideniat prin aplatizarea zonei de inhibiie a ceftazidimului n dreptul discului de cefoxitin. Astfel, cefoxitinul a determinat producerea de -lactamaze inductibile care au hidrolizat ceftazidimul. Imipenemul este de asemenea inductor al cefalosporinazelor inductibile. Acidul clavulanic este un inductor al -lactamazelor tip AmpC i de aceea apariia unor mici colonii n interiorul zonei de inhibiie a discului AMC poate fi un indicator util al prezenei enzimelor de tip AmpC. Fenomenul de antagonism ntre discul de eritromicin i clindamicin poate indica prezena mecanismului de rezisten inductibil la lincosamide si streptogramine, prezent la stafilococi i pneumococi (fig. 372).

Fig. 375. Fenotip de rezisten la macrolide (eritromicin E) i sensibilitate la lincosamide (clindamicin CD) - stg; fenotip de rezisten MLSBi - dreapta.

43

Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitaii -lactamazice, dar numai o parte se preteaz ca analize de rutin. Majoritatea folosesc cefalosporine cromogene, sau coreleaz hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reacie, mediat de iod sau detectat cu un indicator de pH. Testul la nitrocefin Nitrocefinul este o cefalosporin care poate funciona ca substrat cromogen pentru -lactamaze i i schimb culoarea de la galben la rou atunci cnd este hidrolizat. Acesta reprezint testul cel mai sensibil pentru majoritatea lactamazelor, exceptnd penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic n testele de evideniere const n faptul c el este hidrolizat de toate lactamazele cunoscute, indiferent de specificitatea acestora. Nitrocefinul este disponibil sub form de pudr purificat de la Becton Dickinson (Oxford, UK) sau de discuri mbibate cu antibiotic (OXOID). Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid i resuspendate n tampon fosfat obinnduse o suspensie dens, peste care se adaug soluie nitrocefin. Activitatea -lactamazic este evideniat prin apariia culorii roii n 1-2 minute. n cazul enzimelor cu activitate mai mic rspunsul poate ntrzia, ns rezultatele pozitive aprute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism ntruct ele pot fi cauzate de o activitate lactamazic secundar a proteinelor care leag penicilina (penicillin binding protein - PBP) care formeaz complexe acil instabile (OCallaghan i colab., 1972).
Bibliografie 1. Ackermann, G., Tang Y. J., Kueper R., Heisig P., Rodloff A. C., Silva J. Jr., and Cohen S. H. 2001. Resistance to moxifloxacin n toxigenic Clostridium difficile isolates is associated with mutations in gyrA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45:2348-2353. 2. Barry A.L., Jones R.N., Thornsberry C. 1981. Cefsulodin: antibacterial activity and tentative interpretive zone standards for the disk susceptibility test, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 20(4): 525-529. 3. Brooks G.F., Caroll K.C., Butel J.S., Morse S.A. eds. 2007. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, 24th Edition http:// www.accessmedicine.com 4. Bush K., Jacoby G. A., Medeiros A. A. 1995 A functional classification scheme for -lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233 5. Chopra I., Roberts M. 2001. Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65(2): 232-260. 6. Courvalin P. 2006. Vancomycin resistance in gram-positive cocci. Clin. Infect. Dis. 42(Suppl 1):S25-34. 7. Georgopapadakou N.H., Smith S.A., Sykes R.B. 1982. .Mode of action of azthreonam, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 21(6): 950-956. 8. Brooks G.F., Caroll K.C., Butel J.S., Morse S.A. eds. 2007. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology, 24th Edition Jawetz, Melnick i Adelberg. http:// www.accessmedicine.com 9. Livermore D.M. 1995. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology Reviews. 8: 557-584. 10. Mihaescu G., Chifiriuc M.C., Ditu L.M. 2008. Antibiotice i substane chimioterapeutice antimicrobiene. Ed. Acad. Romane, Bucuresti ISBN 978-973-27-1573-4 11. Mingeot-Leclercq MP, Glupczynski Y, Tulkens PM. 1999. Aminoglycosides: Activity and Resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43: 727-37. 12. Musser J.M. 1995. Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights, Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8: 496-514. 13. O' Callaghan C. H., Morris A., Kirby S. M., Shingler A. H. 1972. Novel method for detection of P-lactamase by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1:283-288. 14. Sanders C. C., Sanders W. E. Jr. 1986. Type I beta-lactamases of gram-negative bacteria: interactions with betalactam antibiotics. J Infect. Dis. 154 :792-800 15. Shaw KJ, Rather PN, Hare RS, et al. 1993. Molecular Genetics of Aminoglycoside Resistance Genes and Familial Relationships of the Aminoglycoside-Modifying Enzymes. Microbiological Reviews 57:138-63. 16. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. 1992. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance, Clinical Microbiology Reviews. 5(4): 387-399.

44

17. Taylor D.E., Courvalin P. 1988. .Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter species, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(8): 1107-1112. 18. Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998. 19. Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A.,Chow J.W. 2003.Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47(4): 1423-1426. 20. Vakulenko S.B., Mobashery S. 2003. Versatility of Aminoglycosides and Prospects for Their Future, Clinical Microbiology Reviews. 16(3): 430-450. 21. Vester B., Douthwaite S. 2001. Macrolide Resistance Conferred by Base Substitutions in 23S rRNA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45(1): 1-12. 22. Wistreich A.G., Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications (Hardcover), 1996. 23. Wolfson J. S., Hooper D. C. 1989. Fluoroquinolone antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev.2: 378-424

45