Sunteți pe pagina 1din 11

Importanta reactiilor antigen-anticorp

Asigura componenta umoral Confera rezistenta efectoare specifica a raspunsului imun de tip

a gazdei la boli infectioase a:

Reactii antigen-anticorp

In diagnostic
-

- reprezinta

mijloace de recunoastere

Prezentei antigenelor unui agent infectios in organismul gazda (identificarea antigenului cu ajutorul serurilor imune obtinute prin inocularea Ag la animale) Relatiei organismului gazda cu un anumit agent infectios (infectie acuta, infectie cronica etc.) si a starii de imunitate a organismului fata de acest antigen (identificarea si/sau masurarea anticorpilor specifici pentru un anumit agent infectios in organismul gazda)

Conf. Univ. Or. Irina Codita

Antigene, determinanti antigen ici, epitopi


Antigen = substanta sau corp celular strain de organism, cu proprietati imunogene (determina producerea raspunsului imun) Determinanti antigen ici sau epitopi molecula antigenica care determina specificitatea anticorpilor Antigen simplu antigenic

Natura reactiei antigen-anticorp


Se produce la suprafata moleculelor de antigen si anticorp Potrivire de tip "cheie in broasca" Interactiuni necovalente:
- l.eqaturi de hidrogen - Forte electrostatice (ionice)

= portiuni

din

= are

un singur determinant mai multi determinanti

Antigene complexe antigenici (epitopi)

= au

- Legaturi Van der Waals - Legaturi hidrofobe

Caracterele legaturilor necovalente


Forte slabe Legaturi multiple Vizeaza lanturile usoare si grele ale Fab regiunile variabile (mai ales fragmentele hipervariabile)

Notiunile de afinitate si aviditate


Afinitate = forta legaturilor intre un singur determinant antigenic si anticorpul produs ca urmare a contactului cu acest determinant Aviditate = rezultanta fortelor legaturilor dintre determinanti antigen ici multipli ai unui antigen cu mai multi determinanti cu anticorpii multivalenti specifici pentru acesti determinanti - cel mai frecvent in lumea reala

Afinitatea
Inalta:
- cand potrivirea intre Ag si Ac este perfecta (Ac specifici pentru determinantul antigenic sau epitopul respectiv) - Intervin exclusiv forte de atractie

Specificitate si cross-reactivitate
Specificitate =
Capacitatea determinant unui anticorp de a se combina cu un singur antigenic sau Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi (ex. de tip Ig M, Ig G etc.) sa reactioneze cu un singur antigen Capacitatea determinant unui anticorp de a recunoaste antigenic sau mai mult de un

Cross-reactivitate =
Capacitatea unei populatii de molecule de anticorpi de a reactiona cu mai mult de un antigen - in urmatoarele situatii: Epitopul fata de care a fost elaborat Ac este impartit de antigenul A si antigenul B Antigenul A si antigenul B au un epitop similar

Joasa:
-Intre un Ac si un determinant antigenic asemanator -Intervin forte de atractie si forte de respingere

Etapele reactiei antigen-anticorp si modalitati de detectare


Interactiuni primare, rapide, cu fonnarea unui complex labil Ag-Ac - nu formeaza complexe vizibile - se detecteaza utiiizand tehnici de vizualizare a r. Ag-Ac prin marcare (RIA, ELISA, imunofiuorescenta) II. Interactiuni secundare urmate de realizarea unui complex AgAc insolubil cu aspect diferit in functie de forma de prezentare a antigenului: 1. Reactii de precipitare - precipitat imun 2. Reactii de aglutinare si hemaglutinare imuna

Reactii de precipitare
Antigenul si anticorpul sunt in faza solubila Anticorpii sunt de tip Ig G

Reactii specia le: 1. Reactia de neutralizare a activitatii toxice a antigenului 2. Reactii in care participa complementul cu imunocitoliza/hemoliza

Formarea precipitatului imun Ag-Ac


Depinde de:
_ Afinitate
. . Depind de:

Proportia optima
Raportul cantitativ dintre antigen si anticorp in care reactia de precipitare se produce in timpul cel mai scurt Reprezinta un indicator al raportului de echivalenta

- Calitatea

- AViditate - Raportul antigen-an ticorp:


Echilibrat (echivalenta)

antigenului: GM, nr. si pozitia determinantilor antigenici si _Calitate anticorpului: tip, heterogenitate

Fenomen de zona - cand unul dintre reactanti

este in exces

Fenomenul Danisz - antigenul (toxina) neulralizata la concentratia de echivalenta adaugata treptat peste cantitatea echivalenta de Ac nu este complet neutralizata - consum initial excesiv de Ac

- Temperatura, pH, volum de reactie

Constanta de echilibru (raport concentratii molare)


Ag + Ac ~ Ag-Ac [Ag-AC] K eq

Raportul dintre antigen si anticorpechivalenta, exces Ac, exces Ag

Variante si aplicatii - precipitare in mediu lichid


Reactia de precipitare 1. 2. II. in amestec (ftoculare): ~~~~n~a~~~~~~~i~~~ltf)Uro~~~~J~~e~~~it~~~~~~c~tUnei Dean si Webb: stabilirea titrulul unui antiser folosind Ag cu

Precipitare in inel si in amestec


Ring ~recl~l\otl.n t t

-.

r-;::::!~l!!:m'~~====-,
c 10UI 20UI 40UI 80UI 160UI

B='E;:::;:~'""'

~fWe~~r~t~~a~~~~~C~~a~~i~~C~r~~e~i;C~a~i~~I:)atoxina
Reactia de precipitare in tub rn~~~~t:~itarea amestecului 1. 2. /II.

in inel) : procedura speciala intre Ag si Ac - reactie la

IV.

Diagnostic retrospectiv antrax (Reactia Asco1i) Originea petelor de sange (Reactia Uhlenhut - medicina legala) Reactii de precipitare in tub capi/ar - detectare proteina patologice In ser pacienti, determinare de tip pe baza proteinei M - streptococi Reactii de precipitare pe lama (Metoda Ferreira); detectare produsi de degradare fibrinogen la pacienti cu SCIVD 9 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Variante si aplicatii - precipitare in mediu solid


Difuzia simpla radiala - difuzia unui reaelant intr-un gel in care este
incorporat celalalt reactant: echivalenta precipitarea are loc in zona de - ~Ct~~tio~iot~i~~c~~)U~ii~z:!~

Imunodifuzie simpla

~~~~:~~~~}~~e~~el~tiva a unor
ei de

Imunoplaci cu gel si Ac anti Ig A, 19 G, 19 M Serul pacientului - aduce antigenul!H ::; imunoglobulina prin functia antigen care reactioneaza cu anticorpul anti-imunoglobulina

Inel de precipitare la zona de echivalenta (semicantitativadiametrul inelului corepunzator unei anumite concentratii) Difuzia dubla - difuzia simultana unul spre celalalt a Ag si Ac repartizati in godeuri diferite ale agarului care nu contine initial nici un reactiv - Ex. dubla difuzie metoda Ouchter1ony pentru determinarea unor proteina C reactiva, alfa1 fetoproteina, toxigenezei bacililor

Acin ser

~~~~::~: g:~~~~:~~ane: - ~ft~~c?:~~i1ti di~t~~~u~:~eree~~~o1:~~~~:rea


Arcuri de precipitare la zona de echivalenta

runOdifUZie dUl'a

Metode de imunodifuzie combinate cu migrarea in camp electric


Imunoelectroforeza - etape:
1. Electroforeza in gel (separare prin migrare a antigenelor in functie de incarcatura electrica) 2. Adaugare de Ac si dubla imunodifuzie - ex. pentru studiul cantitativ si separarea diferitelor componente ale serului sanguin

Imunoelectroforeza

"7"~~

~-~ ... ~.,


~

"I . ,,t

Metode de imunodifuzie combinate cu migrarea in camp electric


Contraimunoelectroforeza - dubla difuzie accelerata in camp electric; Ag si Ac au incarcatura diferita si sunt asezati in asa fel incat sa migreze unul spre celalalt - ex. pentru decelarea ac specifici unui anumit agent infectios (ex. antigen HBs)

1.

Ag

2.

Ac

Contraimunolectroforeza
+

Metode de imunodifuzie combinate cu migra rea in camp electric


Electroimunodifuzia - electroforeza antigenului in gel care contine Ac;
unidimensionala: spoturi; bidimensionala: formare de conuri de precipitare cu h proportionala cu concentratia antigenului

Ag Ac

Electroimunadifuzie mana si bidimensianala

Variante si aplicatii Reactii de aglutinare/hemaglutinare


Caz particular al reactiei de precipitare Ag este de natura corpusculara (bacterii) sau fixate la suprafata unor particule corpusculare inerte (latex, hematii - rol de purtator) Ag aglutinanti sunt Ig M sau Ig G

Realizarea reactiei de aglutinare


Depinde de:
- Raportul antigen-anticorp - Caracterele reactantilor fizice, chimice si structurale ale

Tipuri de reactii de aglutinare


Aglutinarea directa Aglutinare indirecta Aglutinare pasiva Hemaglutinare

- Prezenta anticorpilor incompleti - se evidentiaza utilizand Ac anti-imunoglobuline specifice (reactia Coombs) - Factori nespecifici: timp de incubare, in cursul reactiei, temperatura, pH, concentratie de electroliti agitare

Aglutinarea directa
Se utilizeaza pentru identificarea si titrarea:
- Ag in prezenta Ac specifici cu titru cunoscut (identificarea serologica) - Ac in prezenta Ag cunoscute (serodiagnostic)

Variante folosite:
- Calitativa - Cantitativa - aglutinare - aglutinare pe lama in tuburi sau godeuri

Exemple:
- Bacteriana: salmoneloze - somatica suprafata (tip Vi), flagelara (tip H) (tip O), de

Aglutinare indirecta
Se utilizeaza in evidentierea Ac incompleti prin folosirea Ac antiglobulina adaugati in reactie (test antiglobulinic Coombs) Agregate: Ag corpuscular si Ac blocanti pe suprafata + Ac antiglobulinici care determina aparitia aglutinarii

Aglutinare pasiva ("de purtator")


Antigenele solubile sunt fixate pe un suport corpuscular, celular, hematii sau particule inerte (latex) Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiunea serului specific pentru Ag fixat pe particulele purtatoare

Aglutinare pasiva inversata


Anticorpii sunt fixati pe un suport corpuscular, celular, hematii sau particule inerte (latex) Purtatorii de Ag sunt agregati sub actiunea Ag care a determinat elaborarea anticorpi lor fixati pe particulele purtatoare Se utilizeaza pentru identificarea unui antigen: ex. antigen de grup streptococic Formarea
-Ag:

Hemaglutinarea
unor agregate:
hematiilor

Proprii membranei

Macromoleculare. adsorbite pe suprafata membranei hematiilor - se utilizeaza ca mordant tratarea prealabila a hematiilor cu tanin sau formol

(A, 8, C, G)

- Ac: specifici Ag membranare adsorbite

sau Ag

Reactii Ag-Ac care utilizeaza complementul


Reactia de fixare a complementului Citoliza Imunoaderenta

Reactia de fixare a complementului (RFC)


Se bazeaza pe capacitatea C de a se fixa la suprafata Ig M si Ig G numai daca acestia sunt complexati cu Ag specifice Elementele in reactie:
in cantitate strict suficienta hemolitic - Sistemul Ag-Ac - Complementul (titrat anterior) - Sistemul

Opsonizarea

indicator

Principiul RFC
Competitie pentru fixarea complementului intre sistemul Ag-Ac si sistemul indicator hemolitic Prezenta complexelor Ag-Ac fixeaza complementul Reactie pozitiva absenta hemolizei Reactie negativa prezenta hemolizei

= =

Conditii de efectuare a RFC interpretare


Complement in prealabil Martori:
-

Titrare complement
ComplemantTltntlon

(alexina) - strict standardizat,

titrat

Ser sigur pozitiv Ser sigur negativ Martor ser pentru complementaritate nespecifica Martor antigen pentru anticomplementaritate nespecifica

~~:::~:::& ..
Hamol!!sln (AntlohUII)

nt (mJj'
I I I 1 1 1 I I

Ser de cercetat inactivat la 56 o C pentru inactivarea complementului propriu Intensitatea hemolizei apreciata pe o scara

RFC
ComolementFlxlIUon(Dllutlonof Antlsorum)

Aplicatiile RFC
Reactia Bordet-Wasserman: diagnosticul sifilisului - cu antigen cardiolipinic

"nllbody

~
1

11:2

1/4

IlS

1/161/321/641/126

"ntlbody (mI) Anllgln (mii compllm8nt(ml~ 2CFU aRaC Hemolysln (A"tllneep)

~d~~8Bii
1 I 1 I 1 1 1 1 I 1 1 1 I I 1 1 1 1 1 1

Diagnosticulleptospirozelor
1 1 1

Diagnosticul tifosului exantematic etc.

Citoliza - 1
Sistem de reactie 1:
- Cultura celulara infectata -Imunoser specific
- Celule

Citoliza - 2
Sistem de reactie 2:
- Imunoser anti complex Histocompatibilitate) - Complement MHC (Complex Major de

- Complement

Principiu: prezenta Ac specifici agentului infectios determina liza celulara prin activarea complementului si fixarea pe membrana a complexului de atac

Principiu: prezenta Ag de histocompatibilitate corespunzator unui anumit antiser determina liza celulara prin activarea complementului si fixarea pe membrana a complexului de atac

Imunoaderenta
Definitie: capacitatea unor microorganisme (bacterii, virusuri, paraziti) de a se fixa pe un suport particulat (celule, hematii) in prezenta Ac corespunzatori si a Complementului

Opsonizarea

Definitie = stimularea fagocitarii unor antigene in prezenta serurilor imune si a complementului

Reactii de seroneutralizare (RSN)


Reactie Ag-Ac care are ca rezultat inhibarea specifica a activitatii biologice exercitate de Ag asupra unui substrat specific: Activitate biologica determinata (virusuri, toxine, enzime)

Complexarea Ag-Ac
Depinde de:
- Raportul antigen-anticorp - Caracterele fizice, chimice si structurale reactantilor (stabilitatea legaturilor) ale

- Factori nespecifici: viteza de combinare, temperatura, pH, concentra tie de electroliti

Sistemul de reactie
Antigene biologic active (ex. hemolitice, citotoxice etc.) Imunoseruri neutralizante specifice Substrate celulare indicatoare:
- Animale sensibile - Culturi celulare sau celule - Substrat marcat chimic pe suport inert

Etapele RSN

Etapa 1: in vitro = complexare Ag-Ac Etapa 2: in vivo sau in vitro - punerea in contact cu sistemul decelant, pentru evidentierea eventualei neutralizari a efectelor Ag (ex. Hematie sau celula asupra careia actioneaza activitatea biologica a antigenului)

Tipuri RSN
In functie de mediul in care are loc evidentierea seroneutralizarii:
Seroneulralizare in vivo: lOR Shick, Oick; administrare seruri antitoxice, identificarea tipului de toxina botulinica pe soarece Seroneutralizare

Seroneutralizare

in vivo - 1: IDR

in vi/ro: ASLO, serodiagnosticul

infectiilor virale

Evidentierea unui nivel neutralizant eficace de Ac circulanti protectori fata de anumite toxine bacteriene:
- lOR Schick - in difterie - lOR Oick - in scarlatina

In functie de scopul urmarit:


- Identificarea si clasificarea serologica a structurilor antigenice
Terapia cu seruri imune neutralizante antitoxice, antibacteriene Ac

sau antivirale
Evaluarea eficacitatii protectori detenninati unor vaccinuri: prin vaccinare; stabilirea concentratiei stabilirea potentei

vaccinuriJor
Titrarea concentratiei (puterea toxica a exotoxinelor)

Principiu - prezenta Ac serici neutralizanti impiedica aparitia inflamatiei locale produse de injectarea toxinei

Seroneutralizare in vivo - 2 Administrare terapeutica de seruri antitoxice


Blocheaza actiunea toxinelor elaborate de germeni patogeni Ex.: ser antidifteric, ser antitetanic

Seroneutralizare in vivo - 3 Testul de seroprotectie (toxinotipaj)


Se practica pe soarece, care este omorat de toxina botulinica Se evidentiaza prezenta celor 3 tipuri de toxina botulinica: A, B, E, cu ajutorul serurilor specifice de tip

Seroneutralizare in vitro - 1 Reactia ASLO


Sistem de reactie: Antistreptolizina O Streptolizina (toxina streptococica cu activitate hemolitica Oxigen stabila) Sistem indicator (hematii) Scopul determinarii:
- Determinarea titrului Ac in serul bolnavilor convalescentilor - Utilizare in diagnostic, evolutie, prognostic sau

Seroneutralizare in vitro - 2 Serodiagnosticul infectiilor virale prin titrarea Ac neutralizanti


Sistem de reactie:
- Antigene - Anticorpi virale standard neutralizanti

Alte reactii antigen-anticorp


Reactia de imunofluorescenta Reactia imunoenzimatice

~orH'2'lor~
fITI: IUI"p. hZllm.

Iii!

Metode radioimunometrice

Imunofluorescenta
Ag se cupleaza Evidentierea fluorescenta cu Ac marcati cu fluorocromi la microscop cu complexelor
-Ag

Reactii imunoenzimatice
Sistem de reactie:
- Ac specific cuplat cu o enzima (peroxidaza, alcalina) - Substrat enzima - Sistem de detectie a degradarii substratului fosfataza

Aplicatii: detectare antigene microbiene, detectare Ac in boli autoimune 2 metode:


- Directa: Ag + Ac fluorescent

= complex

fluorescent

Principiu: enzima actioneaza numai daca Ac marcat formeaza un complex cu Ag Ex. - evidentierea Ag HBs crescuta Avantaj: sensibilitate

- Indirecta: Ag + Ac specific + Ac antigamaglobulina marcat cu fluorocrom complex fluorescent; varianta: sistem biotina-avidina

10

Metode radioimunometrice

Sistem de reactie: Ag si Ac - unul dintre ei marcat cu izotopi radioactivi (H3, C14, 1125) Utilizare: detectare substante in cantitati foarte mici

La multi ani!

11