Sunteți pe pagina 1din 27

Curs XXII.

Haemophilus, Bordetella, Legionella, Corynebacterium

Genul Haemophilus
1. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. Minidefinitie Incadrare taxonomica Habitat Implicare in patologia umana Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie Factori de patogenitate Patogenie Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: cocobacili gram negativi, pretentiosi, capsul; factori X si V; afecteaza gazde cu imunitate compromisa; localizari diverse: tract respirator, sistem nervos central, genito-urinar, septicemii, localizari secundare articulare, cardiace, digestive etc. Infecii nosocomiale, rezistena antibiotice

1.

Minidefinitie

Din Genul Haemophilus fac parte cocobacili si/sau bacili Gram negatrvi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulati (tulpinile virulente sunt capsulate), pretenioi nutritiv, care au nevoie de factori din sange pentru a putea sa se dezvolte: O Factor X = hematina O Factor V = NAD Unele specii pot fi condiionat patogene, provocnd la gazde cu imunodeficiene infecii cu cele mai diverse localizri. Denumirea speciei tip, atribuit de Pfeiffer, provine dintr-o confuzie iniial cu agentul cauzal al gripei (Haemophilus = iubitor de sange; injluenzae = al gripei), deoarece era frecvent izolat n timpul marii pandemii de gripa din 1889 - 1892. Ulterior, Smith, Andrews si Laidlaw au demonstrat rolul secundar al H irfluenzae. Cu toate acestea, alturi de Streptococcus pneumoniae, Staphzlococcus aureus i mai rar alte bacterii condiionat patogene este implicat n complicatia bacterian a cazurilor de grip, care poate mbrca adesea aspecte severe, mai ales la vrste extreme i la pacieni care prezint ali factori de risc. II. Incadrare taxonomica Familie Pasteurellaceae O Gen Haemophilus O Gen Actinobacillus

Gen Pasteurella Inrudiri: O Enterobacteriaceae O Vibrionaceae O Aeromonaceae Habitat

III.

H influenzae colonizeaz mucoasele omului, altor mamifere, psrilor, petilor, reptilelor. Sunt comensali ai tractului respirator, cilor genitale, intestinului. Se pot ntlni la nivelul plcii dentare. Spre deosebire de H. inf1uenzae, H aegyptius si H ducreyi sunt totdeauna patogeni. IV. Implicare in patologia umana: Speciile care sunt totdeauna patogene sunt: H ducreyi - agentul cauzal al ancrului moale; H aegyptius - agentul cauzal al conjunctivitei purulente i febrei braziliene Speciile care pot provoca infecii la gazda imunocompromis sunt: H influenzae in special serovar b H parainjluenzae H aphrophilus

Speciile dependente numai de Factor V sunt denumite prin adugarea prefixului "para". Principalele forme de infecii cauzate de haemofili sunt: Tract respirator - pneumonii, meningite, epiglotita acut, otita medie: n special tulpinile capsulate Celulite Bacteriemii, septicemii Artrite, pericardite, endocardite, osteomielite Infectii genitale si materno-fetale Infectii ale plgii Infectii digestive, biliare Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie

V.

n cazul heamophililor se descrie polimorfismul morfologic legat de condiiile de cretere i vechimea culturii (Fig. 1) Exist, de asemenea, diferente n relaie cu specia. Haemophilii sunt "Gram la limita":. Se decoloreaza mai greu, prind mai greu coloraia secundara: se utilizeaza totdeauna fucsina, NU SAFRANINA.

Fig. 1. Frotiu cu Haemophilus injluenzae - polimorfism

Se dezvolt numai pe medii bogate, suplimentate cu peptone, glucoza etc. Necesita Factor X si V; uneori numai V sau X. Factorul X, termostabil ( 45 min la 120 o C), este un precursor al hemului, protoporfirina IX Factorul V, termolabil (15 min la 90 o C), este NAD sau NADP - inactivati de pirofosfataza si nicotinamindezoxiribonucleaza Aceti factori pot fi obinui prin diferite metode: - ocolatizarea mediului cu adaos de snge, adic nclzirea treptat la 80 o e, i meninerea acestei temperaturi timp de 10 minute. Factorii X i V sunt eliberai prin distrugerea hematiilor. - adugarea de suplimente cum sunt: factor X i V, supliment Fildes, Levinthal et. - hemoliza cu eliberarea coninutului hematiilor prin cultivarea pe mediul de izolare a unui striu de stafilococ hemolitic. n acest caz se observ fenomenul de satelitism, adic creterea hemofilului doar lng striul de stafilococ (Fig. 2). Fig. 2. Satelitism la Haemophilus

Unele specii sunt capnofile: H. ducreyi, aphrophylus, unii H. parainjluenzae

Pentru cretere, haemofilii au nevoie de umiditate i uneon prelungit, mai ales dup tratamente cu antibiotice. Pentru H ducreyi, incubarea trebuie prelungit la 5 zile. n cazul prelevatelor nalt contaminate se folosesc medii selective. VI. Factori de patogenitate

de incubare

Principalii factori de patogenitate sunt: capsula, lipooligozaharidul, cu rol n inflamaie, proteinele membranei externe Pl i P2. Toate tulpinile virulente produc neuraminidaza si o proteaz IgA, dar rolul lor nu este dovedit. Fimbriile cresc aderena bacteriei la mucoase. De asemena, pe hematii exist un antigen la care hamofilii se pot ataa cu ajutorul fimbriilor (antigenul Anton). VII. Patogenie Principalele faze ale instalrii infeciei sunt: aderena ptrunderea n submucoas ptrunderea n circulaie prin limfatice, vase de snge, unde rezist datorit capsulei poate ptrunde la nivelul LCR, prin depirea barierei hematoencefalice fenomene generale provocate de endotoxemie, cu sindrom febril, mergnd n cazurile grave pn la sindrom de coagulare intravascular diseminat (CIVD) VIII. Raspunsul imun. Noiuni de epidemiologie si profilaxie a infeciilor

Anticorpii protectori pot fi sintetizai activ sau transmii de la mam la ft sau la sugar. In absenta imunizrii, titrul Ac la copii de 2 luni - 3/4 ani este minim. De aceea, se impune vaccinarea de la 2 luni. Incidena bolii este invers proportional cu titrul anticorpi lor bactericizi n snge, achiziionai pasiv de la mam sau sintetizai activ. Exist vaccinuri conjugate, care se pot administra la copii, cum sunt cele care asociaz polizaharidul capsular cu anatoxina difteric, sau cu proteine din membrana extern a N. meningitidis. IX. Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de infecie cu haemophili trebuie fcut prin corelarea atent a datelor clinice cu cele de laborator, avnd n vedere faptul c haemophilii fac parte din flora normal a cilor respiratorii. Prezena factorilor de risc i a semnelor de infecie bacterian n absena altor microorganisme cu patogenitate recunoscut poate conduce la diagnosticul unei infecii cu haemophili. Hemoculturile sunt pozitive in peste 50% din cazurile simptomatice, cu exceptia celor cu conjunctivit. Prezena Poliribitolfosfatului n ser i LCR i concentrarea lui n urin apare n mai mult de 95% din cazurile de meningit cu H injluenzae.

Pentru O O O O O O O

cultivare se utilizeaz Medii speciale pentru haemophili: Geloza sange de cal sau iepure Geloza soco lat Geloza cu factori X i V Geloza XV diferenial Geloza Levinthal Geloza Fildes Medii selective

Identificarea preliminar i definitiv se face astfel: Identificare preliminara: Crestere comparativ pe medii cu factori V, X si VX, la aer i n atmosfer cu C02 Identificare definitiv etapizat, prin stabilirea spectrului metabolic fa de aminoacizi, zaharuri etc.; sunt 8 biotipuri de H injluenzae, dup comportamentul biochimie fa de indol, ureaz, omitin. Pentru scopuri epidemiologice se utilizeaz tipizarea prin metode imunologice, pentru incadrare n tipuri in funcie de particularitile unor antigene structurale (capsula, proteine ale membranei exteme, lipooligozaharid, proteine fimbriale etc.) sau prin metode moleculare bazate pe analiza ADN.

Genul Bordetella 1. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. Minidefiniie Incadrare taxonomic Habitat Implicare n patologia uman Microbiologie - principalele caractere i implicaii n patogenez i diagnosticul microbiologie Factori de patogenitate Patogenie Rspunsul imun Noiuni de epidemiologie i profilaxie a infecii lor nosocomiale Diagnosticul de laborator

1.

Minidefiniie

II.

Incadrare taxonomic

Domeniu: Bacteria Phylum: Proteobacteria Clasa: Betaproteobacterium Ordin: Burkholderiales Familia Alcaligenaceae Genul Bordetella Speciile genului cu B..bronchiseptica, B.holmesii III. Habitat importan medical: B.pertussi, B.parapertussis,

Genul Bordetella cuprinde specii obligatoriu parazite pentru om sau animale, cu tropism pentru mucoasa respiratorie, supravietuire f. scurta in mediul exterior (2 ore) Sunt distruse de antiseptice si dezinfectante uzuale, UV, temperatura de 55 o C timp de 30 minute. IV. Implicare in patologia umana B.pertussis, B.parapertussis: izolate numai la om, sunt agenti etiologici ai tusei convulsive B.bronchiseptica: izolata de la animale (infectii respiratorii), rar intalnita la om (imunodeprimati) B.holmesii: izolata din hemoculturi la om (tineri cu afectiuni subiacente)

Tusea convulsiva Poate surveni la toate varstele, mai frecvent la nou- nascuti si copii cu vrste sub 5 ani (nevaccinati) La nou-nascuti, chintele clasice de tuse pot fi inlocuite de crize de apnee, alterare importanta a starii generale, varsaturi, accese de cianoza, tuse paroxistica La adulti: semnele clinice clasice sunt f.rare, diagnosticul dificil sau absent Boala evolueaza in 3 faze: Incubatie : silentioasa de 8 zile (maxim. 14 zile) Faza catarala (10 - 15 zile): rinoree, febra moderata (38oC), tuse discreta nespecifica, neproductiva, tenace, noctuma Faza paroxistica (stadiul convulsiv, perioada de stare, 15-20 zile): chinte repetate de tuse spasmodica, emetizante (10-30 pana la 40 in 24 ore), expectoratie vascoasa, dificila, urmata de varsaturi, insotite de inspiratie

profunda, sonora, prelungita (latrat de caine sau zbierat de magar), limfocitoza ( pana la 40 000/mm3 ) Faza de convalescenta (3-4 saptamani) V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie

Bacteriile din Genul Bordetella sunt cocobacili mici (0,2-0,3Jlm pana la 0,51um), gram negative, dispusi izolati, perechi, rareori lanturi scurte. Bordetella pertussis, parapertussis i holmesii sunt specii mobile, strict aerobe, cu metabolism respirator, exigente nutritive mari: cultiva numai pe medii cu aminoacizi, vitamine, saruri minerale, substante neutralizante (amidon, carbune). Nu necesita factori X si V. Temperatura optima de cultivare este de 350-370 C. Speciile genului Bordetella sunt in general inactive metabolic. Nu fermenteaza hidratii de carbon, nu produc gaz, nu produc indol si hidrogen sulfurat, nu lichefiaza gelatina, dar alcalinizeaza laptele turnesolat VI. Factori de patogenitate

Adezine Hemaglutinina filamentoasa (FHA) - in fimbrii, se fixeaz pe celulele ciliate, limfocite si macrofage, are rol in imunogenitate Aglutinogenele - in fimbrii, se fixeaz pe celulele ciliate, determina serotipulla B.pertussis (serotipuri majore 1, 2, 3 ) Pertactina - proteina de suprafata ce intervine in procesul de adeziune Toxine
1. Toxina pertussis(PT)-proteina

hexamerica tip A-B (comuna la germenii gram

negativi). Este raspunzatoare de: - limfocitoza (semn important in tusea convulsive) - cresterea sensibilitatii la histamina - cresterea secretiei de insulina (factor hipogliceminat) - efect adjuvant manifestat prin cresterea raspunsului in anticorpi IgM, IgG si IgE Tratata cu formaldehida, toxina pierde activitatile antigenicitatii. biologice cu pastrarea

B.parapertussis si B.bronchiseptica poseda copii inactive ale genei responsabile de sinteza PT 2.Adenilat ciclaza (AC) - proteina complexa bifunctionala, cu activitate enzimatica si hemolitica - forma intracelulara (endotoxina), termostabila;apare numai la B.pertussis - forma extracitoplasmatica (exotoxina), solubila, termolabila la 560C; comuna de specie si responsabila de:

a) cresterea secretiei seromucoase a cailor respiratorii; b) permeabilizarea mucoasei respiratorii pentru PT; c) inhibare a functiei polimorfonuclearelor si macrofagelor alveolare. 3. Toxina dermonecrotica (HLT) - termolabila, se inactiveaza in 15 min. la 56oC, se elibereaza prin liza germenilor 4. Citotoxina traheala (TCT) - produce ciliostaza cu distrugere celulara 5. Lipopolizaharidul (LPS) - endotoxina, termostabila, cu structura asemanatoare cu cea de la Enterobacterii, dar cu actiune pirogenica mai scazuta VII. Patogenie

Bipertussis are tropism pentru celulele ciliate ale epiteliului respirator, adera pe cilii vibratili celulari si se multiplica rapid, produce paralizia cililor, activarea secretiilor mucoase. Nu produce bacteriemie VIII. Raspunsul imun

Rspunsul imun este de tip umora!. IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale

B.pertussis i parapertussis, speciile importante in patologia umana, sunt raspunzatoare de tusea convulsiva, boala infectocontagioasa cu declarare obligatorie. Habitatul natural este mucoasa respiratorie. Transmiterea se face direct pe cale aeriana de la om la om. Contagiozitatea este prezent in faza catarala. Receptivitatea este generala. Boala evolueaza endemo-epidemic cu "peak"-uri la interval de3-4 ani. n tarile cu protectie vaccinala buna, epidemiile sunt rare, spre deosebire de tarile cu acoperire vaccinala slaba, n care incidenta este crescuta. Alte microorganisme care pot provoca sindrom de tuse convulsiv "nonbordetella" sunt: adenovirusuri, VRS, Mycoplasma pneumoniae X. Diagnosticul de laborator

Se prelev secreii faringiene, cu ajutorul unor tampoane speciale, din dacron sau alginat de calciu (bumbacul este inhibitor), cu form curbat, pentru a atinge faringele inferior. O variant mai puin eficient este metoda "plcii tuite", constnd n pregtirea unei plci cu mediu Bordet-Gengou, care se pune n faa cavitii bucale a pacientului, n timpul accesului de tuse. Diagnostic direct: punerea in evidenta a agentului etiologie - imunofluorescenta directa (IFD) - cultura - cercetarea producerii de adenilat ciclaza

-PCR Diagnostic indirect urmrete evidenierea rspunsului imun in anticorpi, a modificrilor n formula (hiperlimfocitoza), evidenierea hipoglicemiei Diagnosticul direct

Prelevarea probelor se face precoce, la debutul bolii, inaintea administrarii de antibiotice. Tip de prelevat: aspirat nazo-faringian sau bronsic (in mediu spitalicesc), tampon nazo-faringian (Dacron sau calcium alginate), "placa tusita" Conditii de transport: insamantare la patul bolnavului sau mediu de transport Regan-Lowe semisolid selectiv, mediude transport universal ( Amies, Stuart) Cultivarea se face pe mediu Bordet-Gengou selectiv si neselectiv (infuzie de cartofi, glicerina, sange defibrinat de oaie, cefalexina sau meticilina) sau mediu ReganLowe (carbune activat, amidon, sange de cal) lncubarea se face la 350 - 370 C, aerobioza, atmosfera umeda 3-4 zile pana la 7 zile. Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, caracterelor de cultura, caracterelor biochimice, antigenice (aglutinare pe lama) Diagnosticul indirect: Diagnosticul serologie este util pentru diagnosticul cazurilor cultura negative sau PCR nerealizabil. Supravegherea epidemiologica se realizeaz prin diagnosticul cazurilor de boal i diagnosticul retrospectiv (in faza de convalescenta), Acesta din urm se efectueaza pe doua probe de seruri recoltate la debut si la 3-4 saptamani de boala. Metode de diagnostic serologie: a) reactia de aglutinare in tuburi (tip Flosdorf) - punerea in evidenta a Ac aglutinanti antipertussis si antiparapertussis b) ELISA - determinare IgA (boala) si IgG (boala si vaccinare) - determinare Ac anti-PT, anti-FHA Tratament Tratament simptomatic si preventiv: - izolare la domiciliu sau spitalizare - fluidifiante bronsice si mucolitice - sedative ale tusei Antibioterapia: eritromicina - antibiotic de electie; alternativa: cotrimoxazol, fluorochinolone; tratament cu eritromicina la contacti Imunoprofilaxie Vaccinare: Vaccinul DTP (diftero-tetano-pertussis) - 3 inoculari incepand de la 2 luni, la 2 luni interval si rapeluri in caz de contact cu un caz confirmat: - anatoxina

difterica, anatoxina tetanica, Vaccin Pertussis corpuscular; Varianta - vaccin pertussis acelular

Legionella 1. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. Minidefinitie Incadrare taxonomica Habitat Implicare in patologia umana Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie Factori de patogenitate Patogenie Raspunsul imun Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: bacil Gram negativ, biofilm sisteme alimentare cu apa, pneumonie 1. Minidefinitie

Legionella pneumophila este un bacil gram negativ, necapsulat, nesporulat, care se dezvolt n mediu cu umiditate crescut, ca de exemplu sistemele de alimentare cu ap sau de umidificare a aerului, de unde pot ajunge n cile respiratorii ale omului i pot provoca mbolnviri, n special la gazde cu imunitate sczut. II. Incadrare taxonomica

Familie de 46 specii si 64 serogrupuri : L. pneumophila - specia cea mai importanta in patologia umana - responsabila de peste 95 % din imbolnaviri - L. pneumophila serogrup 1 asociata la peste 80 % din cazuri III. Habitat Temperatura inferioara la 50 e, Zone "moarte", prezenta de biofilm, de alte micro organisme din mediul acvatic, cum sunt cianobacteriile sau amoebele libere (Fig. 1=sau prezenta unor materiale, cum sunt: fier, zinc, PVC).
D

10

Fig. 1. Legionella

i amoeba n structura biofilmului

IV.

Implicare in patologia umana

Legioneloza = pneumonie cu debut la nivelul comunitatii sau nosocomiala, provocata de bacterii din genul Legionella, facultativ intracelulare, Gram negative, cu tropism hidric, larg raspandite in natura - ecosisteme naturale (ape dulci, zone umede) si retele de distributie a apei Forme clinice legioneloza sau maladia legionarilor - incubare 2-10 zile, sindrom pseudogripal, febra, tuse seaca, cefalee, mialgie, anorexie febra de Pontiac forme extra-pulmonare V. Microbiologie - principalele diagnosticul microbiologie caractere si implicatii in patogeneza si

Bacili Gram negativi (slab colorati), nesporulati, um, cu tropism hidric VI. Factori de patogenitate factor de patogenitate

necapsulati,

0,3 - 0,9 Jlml2 - 20

Prtincipalul VII.

este capacitatea de supravieuire

intracelular

Patogenie

Ptruns la nivelul celulelor fagocitare, Legionella supravieuiete Ia nivelul fagozomului, unde se multiplic. La suprafaa celulei sunt exprimate antigene proprii

11

bacteriei, pentru ca n final fagocitul s fie distrus, iar bacteriile s treac la alte celule.(Fig. 2) Fig. 2. Legionella i relaia sa cu fagocitul

VIII.

Raspunsul

imun

IX.

Rspunsul imun este de natur umoral. Notiuni de epidemiologie si profilaxie

Legioneloza se manifesta in tot timpul anului, cu varfuri vara si toamna Factori de risc: a. Varsta (> SO ani) b. Sex (masculin) c. Tabagism d. Etilism e. Tratamente imunosupresoare cu boli asociate f. Expunere prelungita si repetata la surse de contaminare (calatorii, hoteluri, centre de ingrijire sau de odihna etc.) Contaminare prin inhalare de apa contaminate, prin aerosoli contaminati Declararea cazului obligatorie pentru a permite detectarea precoce a cazurilor grupate. Prevenie Preventie: supraveghere a mediului si clinica - program de intretinere constanta a retelelor (curatire pt. eliminare tartru, circulare permanenta a apei cu eliminarea zonelor moarte, o temperatura suficienta a apei (60C la locul de producere si SOC la punctele de utilizare).

12

Franta: obiectiv tinta in institutiile de sanatate - mentinerea concentratiei legionelelor < 103 UFC / litru apa.

X.

Diagnosticul de laborator Dg. de certitudine: pneumonie asociata cu criterii biologice clare (Ag urinar si cultivare) Imunofluorescenta directa Cultivare Antigene urinare Serologie PCR

Cultivare

Creste lent, in 3-10 zile, pe medii speciale: BCYE ("Buffered Charcoal Yeast Extract") continand cisteina, fier si carbune Bacterii aerobe strict, capnofile (2,5%) Colonii cu aspect caracteristic (en "verre fritte" = sticla pisata) (lupa binoculara marire x 30) (Fig. 3). Identificare prin imunofluorescenta directa sau latex-aglutinare cu Ac specifici

Fig. 3. Aspect de sticl pisat al colonii lor pe medii de cultur

Depistarea antigenelor urinare Depistare simpla, rapida si precoce a Legionella pneumophila serogrup 1. antigenele apar precoce: la 2 - 3 zile dupa semnele clinice (88 % din cazuri). Excretie lunga si variabila: de la cateva zile la 2 luni, p. la 1 an Prezenta Ag nu e influentata de antibioterapie

13

Tratament Antibiotice eficace: macrolide, fluoroquinolone, tetracicline si rifampicina nu se recomanda antibiograma in vitro (este intracelulara)

Genul Corynebacterium 1. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. Minidefinitie Incadrare taxonomica Habitat Implicare in patologia umana Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie Factori de patogenitate Patogenie Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor Diagnosticul de laborator

cuvinte cheie:

1.

Minidefinitie

Corznebacteriile constrtuie un grup heterogen de bacterii coryneforme cu caractere morfologice, metabolice si structurale commune, Gram pozitivi (exceptie C. diphtheriae - Gram pozitivi la limita in culturi vechi; granulatii intens G+) Sunt bacili drepti sau usor curbati, cu capete frecvent maciucate, segmente colorate neregulat, aspect barat sau segmentat prin prezena granulaiilor metacromatice (se coloreaza in rosu cu coloranti albastri) de polimetafosfat. Uneori apar ca bacili subtiri, usor ascutiti, alteori ovoidali sau cocali. Asezarea este caracteristic in litere ascutite: V, Y, L, litere chinezesti sau palisade, rar celule paralele II. Incadrare taxonomica

Domeniu: Bacteria; Phylum: Actinobacteria; Ordin :Actinomycetales; Familie: Corynebacteriaceae;

14

Gen: Corynebacterium

III.

Habitat

Corynebacteriile colonizeaz mucoase si tegumente la om si unele animale (cai, caini, maimute); la om, rezervorul este constituit din bolnavi i purttoribolnavi, purtatori IV. Implicare in patologia umana

Clasic:, numai C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis (fost ovis) erau implicate n patologia uman. Forme: de boal erau: difterie; - septicemii, endocardite, infectii osteoarticulare - posibil C. diphtheriae toxigen sau netoxigen, la pacieni imunosupresai, uneori chiar la vaccinati In prezent si alte specii sunt implicate, la persoane cu deficit imunitar. Aspecte clinice la alte specii: C. ulcerans- difterie, diphtheria-like, faringite acute, infectii cutanate, abcese Difteria este o boala infectioasa acuta cu evolutie endemo-epidemica manifestat pnn; Fenomene inf1amatorii locale Pseudomembrane la nivelul faringelui (diphtheria = membrana) Tulburari toxice generale datorate exotoxinei Mortalitate crescuta: aritmie cardiaca datorata miocarditei difterice Asfixie acuta datorita extinderii membranelor in laringe Romania 0%000; ultimul caz difterie 1989; ultima tulpina toxigena la CNR1998 reemergenta in 14 din 15 foste state URSS: datorit ratei redusa de vaccinare la copii, cresterii susceptibilitatii populatiei adulte, insuficientei supravegheri a bolii si circulatiei agentului patogen

Fenomene locale la nivelul amigdalelor falsa membrana (Fig. 1) care acopera amigdalele cu un depozit cenusiu, aderent, care se detaseaza greu, lasand tesuturile sangerande; are tendinta de extindere in rino-faringe; apare ca raspuns inf1amator la necroza celulara determinata de toxina difterica eliberata de localizarea bacilului difteric in straturile superficiale ale mucoasei adenopatia ganglionilor regionali edem al tesuturilor locale (gat proconsular) - Fig. 2 fenomene generale (febra 38-39, tahicardie, paloare, dispnee, varsaturi, hipotensiune) examenele de laborator indica: leucocitoza, albuminurie in exudatul recoltat din falsa membrana se identifica prezenta bacilului difteric; titrul anticorpilor antidifterici la bolnav este :S0,01UI/ml

15

Formele clinice:
- clasic, difteria faringo-amigdaliana care poate evolua cu extinderea membranei spre laringe, unde poate determina fenomene locale de tip mecanic (crup difteric) - rinita difterica - difteria oculara, pe conjunctiva - difteria vulvara - difteria cutanata - forme atipice la persoane tratate anterior cu antibiotice,sau la persoane care prezinta un nivel de protectie =O,OlUI/ml Forme: usoare, medii, grave; uneori forme hipertoxice, cu simptomatologie exacerbata si evolutie fulminanta. Agenti cauzali: C. diphtheriae, C. ulcerans (produce o toxina identica imunologie si ca activitate cu toxina difterica). Producerea de toxina este efectullizogenizarii tulpini lor C. ulcerans cu fag difteric; este neutralizata de serul antidifteric. Fenomenele toxice se datoreaza leziunilor produse prin fixarea ireversibila a toxinei la nivelul tesuturilor specializate (miocard, glande suprarenale, rinichi, muschi netezi, sistem nervos): miocardita acuta tardiv, paralizii post difterice cu localizare pe nervii cranieni (oculomotor, glosofaringian) polinevrite tardive paralizii de diafragm Decesul se produce prin fenomene de miocardita Fig. 1. Falsa membrana

16

Fig. 2. Gat proconsular n difterie

Fig. 3. Difterie cutanat

v.

Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si diagnosticul microbiologie

1896 - Bacillus diphtheriae redenumit C. diphtheriae - Lehman Neuman

C. diphtheriae are rezistenta redusa la temperatura umeda; este omorat in 10' la temperatura de 60oC. Este, usor distrus de alcool si antiseptice uzuale, rezistent la uscaciune, poate persista in praf timp indelungat. n cultura pe mediu Loeffler ferit de lumina si in mediu uscat, bacilul difteric poate fi mentinut viabil 2-3 luni la temperatura camerei; la temperatura de +4oC viabilitatea culturii de bacil difteric este foarte redusa; pentru acest motiv, culturile stoc vor fi mentinute la temperatura camerei in tuburi sigilate.

17

Este sensibil la antibioticele uzuale in special la eritromicina, penicilina, cloramfenicol, tetraciclina, gentamicina; prezinta insa sensibilitate redusa la oxacilina; sunt citate cazuri de rezistenta la penicilina (in special C.d. gravis), tetraciclina, lincomicina, neomicina, trimethoprim, rifampicina Este sensibil la actiunea bacteriofagilor difterici

Fig. 5. Corynebacterium diphtheriae - morfologie microscopic

Peretele celular muropeptida care contine meso c.s-acid diaminopimelic; peptidoglican, arabinogalactan o componenta avand la baza un glicolipid, un diester al trehalozei care contine acidul corynemicolic si corynemicolenic - cord factor cu efect de virulenta si invazivitate, determinata de actiunea locala a germenului fata de tesuturi. proteine situate la suprafata considerate antigene termolabile specifice de tip; antigene K Lantrop; fixarea acestora de peretele celular si rolul lor in infectie si imunitate nu au fost pana in prezent clarificate receptori pentru bacteriofagii specifici la exterior Stratul cel mai intern, reprezentat de membrana plasmatica careia i se recunoaste o participare activa in producerea de toxina difterica. Granulele de polifosfat (corpusculii metacromatici Babes-Ernst) - in interiorul celulei; asezate polar sau subpolar; apar in special in conditii de anaerobioza si constituie elemente de diagnostic diferential fata de speciile cu habitat comun. Material genetic - uneori in genomul bacterian material genetic apartinand unui fag temperat care determina starea de lizogenie si toxinogeneza. Pe mediu Loeffler (electiv): - Bacili Gram pozitivi la limita, 1-8 ~ lungime; 0,3-0,5 ~ grosime

18

Polimorfism accentuat: sinteza neechilibrata mureina in medii cu proteine serice, n prezenta Fe si fosfati in mediul de cultura, n culturi vechi Dispozitie: X, Y, V, L Inegalitate tinctoriala - corpusculi Babes-Emst 1888 - granule polifosfat (Gram violeti pe fond rosu, AM rosu pe fond albastru); mitis: bacili lungi, moniliformi; intermedius: bacili lungi, burati; gravis: bacili scurti, mai uniformi (putine granule) Aspect cocoidal, ovoidal pe alte medii: Gundel- Tietz, Tinsdale I.Pe medii solide: Loeffler: C.diphtheriae: cultura semicremoasa,granulara; alte specii din genul Corynebacterium: cultura lucioasa, cremoasa Gundel- Tietz (geloza-sange-cistina-telurit) C.diphtheriae varianta gravis (Fig. 6): colonii de 1-2 mm, plate, cu marginile crenelate, cu striatii radiale, suprafata granulara, consistenta friabila; se emulsioneaza greu; coloniile sunt negre, cenusii, sau negre cu marginea transparenta; cand colonia este bine izolata si dezvoltata aspectul ei este de margareta; Fig. 6. Corynebacterium diphtheriae varianta ravis

C.diphtheriae varianta intermedius (Fig. 7) : colonii de marime variabila mijlocii sau mici, cu diametrul de 0.5-0.75 mm, cu aspect plat si centrul usor mamelonat, cu margini circulare, cu suprafata granulara sau lucioasa; coloniile sunt negre, iar marginea lor este mai transparenta. Fig. 7. Corynebacterium varianta intermedius

19

C.diphtheriae varianta mitis (Fig. 8) : colonii de marime variabila cu diametrul de 1-2 mm, convexe, cu suprafata lucioasa si consistenta cremoasa; prin invechire coloniile devin mai plate si suprafata mai granulara. Aspecte asemanatoare apar si pe alte medii care contin telurit: mediu Hoyle-telurit, sau McLeod (geloza-sange-telurit). Fig. 8. Corynebacterium varianta mitis

Pe mediu cu agar snge (Fig. 9): Aspecte similare cu cele de pe Gundel- Tietz; caracteristic, coloniile au culoarea alb-gri perle: - gravis, colonii margareta, suprafata granulara, friabile - intermedius, plate,uneori acuminate,margini circulare, suprafata granulara, consistenta sem icre moasa - mitis,colonii circulare, convexe, lucioase, consistenta cremoasa Fig. 9. Corynebacterium diphtheriae pe mediu cu agar-snge

20

Pe mediu Tinsdale modificat (geloza-ser-cistina-telurit-tiosulfat)

- Fig. 10

Cidiphtheriae indiferent de biotip se dezvolta sub forma de colonii mici,

negru-cenusiu, cu halou cafeniu net bine delimitat; haloul isi intensifica culoarea dupa 48 ore. Mediul permite diferentierea Cidiphtheriae, Culcerans si Cpseudotuberculosis de alte specii din cadrul genului Corynebacterium care sunt inhibate cantitativ pe acest mediu, sau daca apar sunt lipsite de halou Fig. 10. Corynebacterium diphtheriae pe mediu Tinsdale

Pe medii lichide Pe medii lichide Cdiphtheriae gravis creste cu pelicula, depozit, bulionul ramane limpede Cidiphtheriae intermedius formeaza inel la suprafata, tulbura usor mediul,formeaza depozit

21

C.diphtheriae mitis tulbura

uniform,

produce

depozit

C.diphtheriae se dezvolta pe medii simple de cultura; cresterea este favorizata pe medii imbogatite cu proteine animale: ser de bou, ou Temperatura de crestere variaza intre 15 -40C cu optimum 37C. Se dezvolta in conditii aerobe, dar este si facultativ anaerob Pattern caracteristic de fermentare zaharuri Reduce sarurile de telur; telurul metalic incorporat sub forma de cristale in celule - aspect negru al coloniilor pe medii cu telurit Cistinaza - eliberare H2S (caracter diferential valoros pe mediu Tinsdale cu sercistina-telurit-tiosulfat: sulfura de telur, halou cafeniu; Ureaza si fosfataza negative la C diphtheriae si pozitive la C ulcerans si C

pseudotuberculosis
Hemolizina activa pe hematii de cobai, iepure, oaie pt. tipurile gravis si mitis; nu pentru intermedius Nitrat reductaza; negativ la biotipul belfanti; pozitiv la restul biotipurilor C. diphtheriae, C. ulcerans si C. pseudotuberculosis Neudaminidaza, catalaza Culturi vechi: coproporfirina

VI.

Factori de patogenitate

Toxina difteric este o exotoxina produsa de Cdiphtheriae toxigen, secretata in mediu; nu este eliberata prin liza celulara Tulpinile de Cdiphtheriae apartinand tuturor tipurilor biochimice si culturale, produc o toxina unica, universal neutralizata de serul antitoxic antidifteric preparat cu un antigen unic, anatoxina difterica (obtinuta prin detoxifirea toxinei difterice in urma actiunii combinate a formolului si caldurii). Este o toxina puternica dotata cu proprietati toxice specializate: - dermonecrotica - produce leziuni degenerative la nivelul miocardului (alterarea mitocondriilor), - tulburari ale activitatii contractile, tulburari de vascularizatie subendocardica, acumulare de produse toxice - produce leziuni degenerative cu staza capilara si hemoragii la nivelul suprarenalei - leziuni degenerative ale sistemului nervos Aspecte genetice Daca o tulpina Cdiphtheriae netoxigena se infecteaza cu un bacteriofag temperat acesta se poate integra in cromozomul bacterian iar celula devine lizogena; prin lizogenizare celula devine rezistenta la actiunea fagului pe care il poarta, sau fata de oricare fag inrudit antigenic cu acesta.

22

Daca bacteriofagul poarta gena tox+, fenomenul de replicare al ADN-ului viral in bacterie este insotit de producerea unei proteine eliberata extracelular, toxina difterica (conversie lizogena reversibila). Producerea toxinei este initiata la 3 minute post infectie fagica si eliberarea extracelulara a toxinei se produce inainte ca primele particule fagice sa fie eliberate de celula devenita lizogena La o concentratie redusa de Fe, ciclul de multiplicare al virusului se prelungeste, fapt care mareste productia de toxina difterica 2.Factori de invazivitate adezine cord factor (straturile superficiale care contin acizii corynemicolic si corynemicolenic) actioneaza la nivelul mitocondrii lor care sunt distruse; fragmentele ramase nu mai pot asigura evolutia normala a proceselor respiratorii si fosforilarea neuraminidaza si hialuronidaza factori necrozanti si de difuziune; neuraminidaza este prezenta la tulpini Cdiphtheriae toxigene si netoxigene VII. Patogenie

Aderenta Multiplicare Ia poarta de intrare Toxemie - Desi sunt citate cazuri de difterie produse de Cdiphtheriae netoxigen, difteria tipica este o toxemie, agentul patogen fiind Cdiphtheriae toxigen. Evolutia bolii este dependenta de cantitatea si de rapiditatea cu care toxina difterica difuzeaza in organism; Numai antitoxina difterica administrata rapid dupa internare, poate influenta favorabil evolutia bolii.

VIII.

Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectii lor

Difteria - boala infectioasa, acuta, transmisibila, cu declarare obligatorie; Boala obisnuita in zonele temperate si calde, fiind rara in zonele reci; In zonele temperate difteria are sezonalitate, cu incidenta redusa primavara - vara si cu incidenta mai mare toamna si iarna Forma de raspandire a bolii este faringiana; in tarile calde predomina difteria cutanata Pana in 1970 a fost mai frecventa la copii de 5-9 ani; rareori a aparut la copii in primele luni de la nastere datorita anticorpilor transmisi transplacentar. Poate sa apara insa la toate varstele, incidenta bolii in ultimii ani deplasandu-se catre varstele mai mari (adolescenti si adulti) datorita reducerii nivelului de.imunitate antidifterica la aceste grupe de varsta considerate de risc Este o boala tipica a colectivitatilor; focarele de difterie apar in special in conditii de contact strans (familie, internate, case de copii)

23

evolutia este determinata de factori socio-economici si de structura imunologica a populatiei sursa de infectie: - omul bolnav,cu rol epidemiologic limitat pentru ca este depistat si tratat in primele zile de la internare - purtatorul sanatos de tulpini C.diphtheriae toxigene, in general asimptomatic (simptomatic in 20% din cazuri) - purtatorul convalescent cazul se anunta telefonic izolarea obligatorie cu masurile care se impun atat in perioada transportului cat si in spital - decontaminare terminala la domiciliu - prelevarea probelor pentru confirmare bacteriologica si serologica anterior administrarii tratamentului cu antibiotice si seroterapiei supravegherea contactilor (de familie, de colectivitate) clinic 7 zile; sunt supusi examenului bacteriologie si se vaccineaza indiferent de antecedentele vaccinale; chiar cei cu imunizarea completa vor fi revaccinati, daca intervalul de la ultima revaccinare depaseste 5 ani desi nu exista dovezi certe referitoare la eficienta, majoritatea specialistilor recomanda contactilor apropiati tratament preventiv cu antibiotice, preferandu-se administrarea penicilinei retard, desi eritromicina este mai eficienta suspectul de difterie este internat si tratat ca bolnav pana la infirmarea diagnosticului

IX.

Diagnosticul de laborator

prelevarea probe clinice . izolarea agentului cauzal si obtinerea acestuia in cultura pura identificarea tulpinilor izolate care permite stabilirea diagnosticului de specie - recunoasterea tipului biochimie, - capacitatea de a produce toxina difterica La bolnav /suspect: - in difteria amigdaliana se recolteaza 3 tampoane din falsa membrana (prin detasarea unei portiuni din falsa membrana sau din depozitele aderente de pe amigdale) si 1 tampon cu exudat nazal - in celelalte forme clinice, se recolteaza trei tampoane din leziunile primare: exsudat din rinita difterica sau secretie purulenta oculara, vulvara, otica. Intrucat leziunea din difteria cutanata nu se deosebeste uneori de piodermite, tampoanele vor fi recoltate din fiecare plaga sau leziune cutanata de la suspectul de difterie sau de infectie difterica. In cazul oricarei localizari, este insa obligatorie si investigarea cavitatii nazale si faringiene La purtator: se recolteaza exudat faringian si nazal Prelevarea produsului patologic se efectueaza simultan la toti contactii din colectivitate; nu necesita alte recomandari fata de metoda de recoltare clasica.

24

Este necesara insamantarea rapida pe mediile specifice. In absenta materialelor necesare, se recomanda transportul probelor la un laborator de bacteriologie in maximum 2 ore de la prelevare Medii de imbogatire: OST (Ou, Ser, Telurit), pentru mentinerea viabilitatii germeni lor 45 ore, sau alte medii de transport (Amiens, mediul Stuart) La bolnav: tampoanele prelevate din falsa membrana: descarcare pe mediul Tinsdale si pe geloza sange - imbogatire prin introducere in mediu OST - frotiu colorat Gram tamponul cu exudatul nazal se introduce in mediul OST Examen microscopic direct din produs: Frotiul: permite evidentierea bacililor suspecti Gram pozitiv la limita, flora polimorfa sau prezenta fuzospirililor (angina Plaut Vincent); procura date pentru un diagnostic prezumptiv de suspiciune de C.diphtheriae Mediile insamantate sunt incubate 24-48 ore la temperatura de 370 C

a. Geloza- sange - valoare: caracterele morfologice coloniale diagnostic diferential cu faringo-amigdalitele streptococice sau infectiile mixte. unele tulpini de C.diphtheriae sunt sensibile la tel urit de potasiu, putand fi inhibate de medii care contin acest ingredient b. Mediu Tinsdale: colonii negre cu halou cafeniu net, bine delimitat - frotiul efectuat din colonii este obligator pentru a elimina confuzia cu unele specii de stafilococ c. Insamantarea tamponului faringian si nazal imbogatit in OST pe mediul Tinsdale La purtator: Tampoanele prelevate din nas si gat - mediul de imbogatire O.S.T. Incubare 24 ore la 37C, Descarcare pe mediul Tinsdale - aparitia coloniilor negre cu halou cafeniu net, bine delimitat dupa incubare 24-48 ore la 37C, indica suspiciunea de

C. diphtheriae.
Identificare Caractere morfotinctoriale Caractere de cultura Teste biochimice: testul cistinazei, testul ureazei, toxinogeneza Lizotipie

Toxigeneza

25

Testarea curenta "in vitro" prin testul Elek, test de imunodifuzie rapid, simplu, precis. Rezultatele la 24-48 ore de incubare la 37C. Test pozitiv: Aparitia unor linii de precipitare in unghiul format de cultura insamantata si de antitoxina (sant care contine ser antidifteric) Cdiphtheriae/Culcerans toxigen. Tulpini de referinta: Cdiphtheriae toxigen, slab toxigen, netoxigen Alte teste pentru determinarea toxinogenezei: - testul" in vivo pe cobai, metoda recomandata numai pentru diagnosticul unor tulpini Cdiphtheriae incerte si numai la nivelullaboratorului National de Referinta - metode moleculare pentru depistarea genei tox+(PCR), metoda utilizata in situatia unor tulpini Cdiphtheriae incerte sau netoxigene Fig. 11. Testul Elek

Lizotipia Metoda conventionala pentru determinarea tipurilor fagice la Cdiphtheriae Realizata in cadrullaboratorului National de Referinta si numai in scop epidemiologic. Are la baza fenomenele de lizogenie si de specificitate a receptori lor fata de anumiti bacteriofagi. Folosind schemele de tipizare (originala si aditionala), lizotipia stabileste sursa de infectie, delimiteaza focarul si relatiile dintre focare, indica tipul epidemiogen. In perioadele interepidemice, metoda este utila pentru stabilirea unor tipuri fagice in cadrul unui biotip de Cdiphtheriae predominant in teritoriu

Metode moleculare Permit studiul genomului bacterian pt. tipizare si detectie gena tox: - PCR digestie prin enzime de restrictie migrare electroforetica in gel; Ribotipia (ARN ribozomal 16 si 23S) poate discrimina tulpinile de Cdiphtheriae in cadrul aceluiasi lizotip Profilul de macrorestrictie in camp pulsator diferentiaza tulpinile in cadrul aceluiasi ribotip

26

Distanta genetica dintre tulpinile presupuse cu relatie epidemiologica (calculata pe baza acestor doua metode) da informatii privind clonalitatea tulpini lor circulante dintr-un areal Studiul molecular (RFLP) al unei regiuni de interes epidemiologic, detecteaza diferente de un nucleotid in secventa genomului a doua tulpini apartinand aceluiasi taxon

27