I

I I

embrioni, - trebuie s3 fie imperecheate cu cei rnai buni rnasculi. Se intensificg prin transferul de embrioni ~i ritmul ameliorgrii efectivelor. lm~ortanta economicZi a transferului de embrioni rezida i n faptul ca r e obfin rnai multi descendenti valoro.$ rezultati din cupluri cu insugiri superioare, iar reproducgtorii cei mai buni (masculi gi fernele) sunt folositi intens la reproductie. Transferul de ernbrioni are gi irnportante imwlicatii sanitarveterinare ~igenetice. lnteresul genetic se explica prin posibilitatea de a schimba, far3 risc, genele dorite, regrupate individual, independent de mediul matern. T anumite conditii de rnanipulare, transferul de embrioni n constituie rnijlocul cel mai sigur pe plan sanitar-veterinar de rnutatie a genelor. De o mare actualitate, cu implicatii sanitar-veterinare, dar gi economice, este problerna ernbrionilor purtstori de boli. i n cadrul opera,iunilor de asanare, m i de anirnale contaminate sunt eliminate dln efectiv prin sucrificare, rezultand astfel pierderi economice imense. Unele cercetari intreprinse de Singh Elizabeth $i col. i n 1982. au demonstrat c i ernbrionii recoltati de la animale serologic pozitive gi transferati la receptoare negative, nu au transmis infectia la produgri rezultati. Din punct de vedere ~tiintific, transferul de embrioni permite studierea proceselor intime ale reproducerii animalelor, ca gi utilizarea unor metode biotehnologice conexe, cum ar fi: micrornanipularea $i microchirurgia ovulelor $i embrionilor, fertilizarea "in vitro", conservarea embrionilor pe lunga durata, obtinerea de hirnere, etc. Ca un corolar al activitaei pe plan mondial i n domeniul transferului de embrioni, stau miirturie importantele consfituiri $i simpozioane gtiintifice organizate i n diferite tari, care au subliniat importanta acestei biotehnologii. Astfel, i n 1974, in SUA s-a infiintat "International Embryo1
i

mblioni la specia umanil pi la animale. In Europa, la paris, in ,982 s-a ituit "L' Association Europene de Transplantation Embrionairen. I n tara noastra s-au facut lucrgri de transfer de embrioni la taurine (ICPCB Balotegti. SEZ Tg. Mureg, Facultatea de zootehnie gi Biotehnologii Timigoara), la ovine (SCPCOC Palas, USAM" Cluj-Napoca $ Timigoara), la suine (Romsuintest Perig) $1 acestea 1
14.5.2. Napele transferului de embrionj

Transferul de embrioni cuprinde rnai multe &ape.

alegerea donatoarelor gi receptoarelor, sincronizarea estrului la femelele donatoare gi femelele receptoare; provocarea poliovulatiei la fernelele donatoarerecoltarea embrionilor gi controlul Calitatil lor; conservarea embrionilor; transferul propriu-zis al embrionilor la fernelele receptoare; ingrijirile donatoarei gi receptoarelor dups transfer,

- preggtirea fernelelor donatoare gi receptoare;

I
(

14.5.2.1.Aleaerea donatoarelor

Alegerea donatoarelor este

etapa deoseb~t importants pentru de seama de

reugita transferului de embrioni. in aceasta acthitate se !in, starea de reproductie a efectivulul d ~ n care provln donatoarele

I 1

Princ~palelecriterii de selecfie a donatoarelor sunt, rasa, vgrsta valoarea zootehnica, dezvoltarea corporala armonioasi, starea de sanatate perfect&. modul de comportare la reproductie, rnodul cum au decurs fgtarile anterioare, rezistenta la boli. etc. Foane importants este valoarea progesteronemiei, stabilitg i n perioada ciclului de control, inaintea inducerii s~per~vulatiei. mare actualitate este De

( Transfer Society", care cuprinde speciali~tidin dorrieniu~transferului de

problems

utilizsrii gi reutilizgrii donatoarelor pe parcursul unuia sau mai mu{tor

,.

consecutivi. Pentru aceasta sunt cercetate posibilitatile de evitare a imbolnavirilor donatoarelor i n timpul sincronizsrii estrulu~,a provocarii poliovulatiei, recoltarii embrionilor gi altor operatiuni legate de transferul de embrioni.
'

rarea animalelor, variaqile - dimatice, actiuni sanitar-veteij~larip,

.&urata i intensitatea zilei luminil (ovine). Scopul acestor m8suri preventive este realizarea unui echilibru

[
14.5.2.2. Aleaerea receptoarelor. Cu toate ca, aparent, receptoarele sunt mai ugor de selec!ionat decat donatoarele, alegerea lor este o problema complexii. Se au i n vedere rnai multe criterii:
,

hormonal, metabolic, de histocompatibilitate pentru a pastra calitatea mediului uterin ce conditioneazg implantarea gi nidatia embrionului. 14.5.2.3,lnducerea poliovulatiei la donatoare.

<B
i

Principalul factor lirnitativ i n eficacitatea transferului de embrioni este productia de embrioni. Actualmente se apreciaza c3 30% din

- este de preferat ca transferul de embrioni sa se fac3 la tineret

femel gi primipare, deoarece la aceste categorii de femele frecventa infectiilor genitale este rnai redusa, traumatismele postpartum sunt rnai rare, iar raspunsul la sincronizare este mai bun;

1 d
i
1

donatoare nu produc niciun embrion utilizabil, iar 45% produc i n medie 4 embrioni. Aceasta diferentg de rispuns se datoreaza, pe de-o parte, variabilitstii produselor hormonale utilizate, iar pe de altg parte receptivitgtii individuale (Saumande, J. 1980, Buggin, M. 1990). Pentru provocarea poliovulatiei la donatoare se pot folosi diferite scheme de tratament: - administrarea de PMSG i n doz3 unicg sau i n doze r.?petate, la diferite intervale de timp, asoc~atcu anticorpi anti-PMSG gi cu progesteron;

%
9

! i

- starea de sangtate perfects, pentru aceasta fiind obligatoriu

examenul ginecologic;

i
t

starea de intretinere bung pentru a face fat3 solicit3rilor din timpul gestatiei;

$
?

- situatia epizootologic2 a efectivului - bung.

Receptoarele pot avea cslduri naturale sau. induse hormonal. T n efectivele mici se recomanda sincronizarea provocat8, iar din efectivele mari se pot folosi femele cu calduri spontane, urmarite pe parcursul mai multor cicluri. Foarte importante sunt: depistarea caldurilor i stabilirea momentului optim pentru insamintarea donatoarei $i respectiv transferul propriu-zis la receptoare; este necesars eliminarea receptoarelor care nu

- folosirea FSH, obtinut din extracte hipofizare de porc; - utilizarea uor produse comerciale, pure, de FSH $i LH; - adm~n~strarea gonadotrop~na corionic3 (HCG), urmats de de
PGF2, la 48 ore dupe stimularea hormonala cu HCG. lndiferent de substantele stimulente utilrzate, eficac~tatea lor depinde de reactiv~tatea ovarelor donatoarei, de echilibrul neurohormonal $i metabolic al acesteia.

sunt bine sincronizate cu donatoarele. lnainte de efectuarea transferului gi dups acesta trebuie sa se evite stresul provocat de schimbarea brusca a regimului de furajare,

:.

14.5.2.4. Sincronizarea estrulur recei~toarelor a1 donatoarelor. cu i n vederea asigurarii conditiilor optime pentru n ~ d a t ~ edezvoltarea $i produsului de conceptie transferat i n organele genitale ale "mamei adoptive" (femela receptoare) este necesars sincronizarea estrului

acesteia cu al urnarnei naturalen (fernela donatoare). Aceart8 necesitate decurge din faptul c3 nurnai astfel modificerile aparatului genital al receptoarei sunt identice cu cele de la niveiul aparatului genital a 1 donatoarei. Exista doue posibilititi de sincronizare a estrului donatoarei cu receptoarele: naturala gi horrnonala. Sincronizarea pe cale naturalg este rnai greu de realizat, deoarece necesita

1
1

'1
Metoda hormonala de sincronizare a estrului la cele doua categbrii fernele, degi este rnai costisitoare, este mai raspindita i n practici pi rezultatele obtinute sunt rnai sigure, rnai bune.
14.5.2.5.Recoltarea embrionilor.

Tehnica pi mornentul recoltarii ernbrionilor variaza i n functie de specie, cunoscindu-se metode nechirurgicale $i rnetode chirurgicale. Metoda nechirurgicali de recoltare a embrionilor se aplice la taurine gi ovine gi necesita un instrurnentar adecvat cu ajutorul ciruia se realizeaz3 spalarea oviductelor $i a coarnelor uterine. Acest procedeu 1 de recuperare a ernbrionilor din aparatul genital a femelei donatoare se
i

1(1

existents

unui nurnar mare de femele din care sa fie alese

receptoarele gi o perioada rnai indelungata de tirnp, i n care fernela donatoare $i viitoarele receptoare sZi fie urrnirite riguros pe parcursul

3 10
fl
I

rnai multor cicluri succesive de cilduri. La ovine, aceasti sincronizare consti i n aplicarea "flushing-ului" gi introducerea berbecilor i n turma de oi. Flushingtul asigura o rnai buna rnetabolizare a proteinelor din hrana $i ca urrnare cregte greutatea hipofizei, care este urmata de intensificarea capacitatii acesteia de a sintetiza horrnoni gonadotropi: FSH $i LH. Prezenta berbecilor i n turrna, prin ferornonii elaborati, stirnuleaza functia de reproductie a oilor (Signoret, J.P. 1991). DacP, ins& berbecii sunt introdugi prea devrerne i n turrni, inainte ca oile s i fie receptive, atunci prezenta berbecilor poate avea efecte stimulative doar pentru o parte din oi. i n tirnp ce altele i ~ i prelungesc anestrul. S~ncronizarea caldurilor poate fi obtinuta $i prin utilizarea unor produse hormonale ca:
i
1

aplica la citeva zile dupa rnornentul fecundatiei, cand embrionii se gisesc la nivelul segrnentelor respective. La vaca, aceasts metods se asearnana cu insamantarea spermei prin rnetoda bimanuali, i n timp ce la oaie este necesara endoscopia precedata de anestezie $ i laparascopie; aceasta metode de recoltare a ernbrionilor nu se aplica la scroafa d&torita lungirnii mari a coarnelor uterine. Recoltarea ernbrionilor prin rnetode chirurgicale se poate face de la animale sacrificate sau de la animale vii. Astfel, i n cazul sacrificarii animalelor, se pot recolta at%t ovule pentru fecundare "in vitro", cat $i ernbrioni din oviducte sau din coarnele uterine. Aceasti rnetoda nu este raspandita datorita lmposibilitgtii reutilizgrii donatoarelor. Recoltarea de la animate vii elirnina acest neajuns, creind posibilitatea reutilizarii donatoarelor de rnai multe ori. Se face la 4-5 zile de la fecundare $ i cuprinde urrnatoarele rnomente operatorii: contentia

'

a a

cloprostenol, care este un analog al prostaglandinei PGF2,; PGF2, - i n doza de 100-150pg. de 2 orihi, la intervale de 13-15 zile;

progesteron

administrat intramuscular sau sub forrna de 11-12 zile, urrnat de

fernelei i n decubit lateral sau dorsal (in functie de specie); laparatomia pe linia alb5, aproape de sirnfiza ischic-pubiena; exteriorizarea aparatului genital; realizarea punctiei cornului uterin cu un ac bont, care face parte dintr-un crrcuit: oviduct-corn uter~n-canula-cateter-placa de recoltare1

pesarii (bureti vaginali) rnentinute inocularea a 400-750 U.I. de PMSG.

& . ,

pghar colector cu peretii dubli; spillarea cornului uterin; examinarea embrionilor cu stereolupa; cultivarea sau transferul imediat al nsferuldi, nidatiei $i gestatiei.
{
, :

embrionilor; aplicarea unor tratamente postoperatorii pentru prevenirea infectiilor gi aderenfelor. 14.5.2.6.Examinarea embrionilor. Dupa recoltare pi p 5 n i c%ndace~tia sunt transferati la receptoare sau conservati, embrionii sunt examina\i pentru a se aprecia viabil~tatea lor in momentul recoltarii gi gansele ulterioare de a fi transferati. Examenul embrionilbr & realizeazi i n dou3 etape:

Metode utilizate pentru aprecierea viabilitgtii embrionilor sunt:

aprecierea morfologic~;

1
:

- metode biochimice;
metode histologice;

it
i

- cultura "in vitro".

i n aprecierea morfologica a embrionilor se are in vedere o serie de criterii, cum ar fi: sfericitatea embrionilor, forma gi regularitatea embrionului, grosimea, fisurile membranei pelucide, transparenta ernbrionului, structura lui, conturul celular, variabilitatea taliei celuielor, integritatea celulelor. Pe baza acestor criterii se stabilegte calitatea embrionilor: excelenti, bung, mijlocie, slaba. Dintre metodele biochimice utilizate amintim: folosirea diacetatului de fluoroscein5 (devin fluorescente numai celulele vii), determinarea consumului de glucozA, determinarea lactatdehidrogenazei, care este invers propoqional5 cu calitatea embrionilor. Prin metode histologice se apreciazs ca fiind nesatisfiicatori embrionii care au celule cu nucleu picnotic. Pentru cultura "in vitro" a embrionilor, se folose9te mediul PBS, cu adaos de ser de capri (25%) sau de ser fetal (20%) sau de ser de bou (20/0) sau de ser urnan inactivat (20%); acest mediu complex se aduce C la temperatura de 37 O gi trebuie s i contin3 5% oxigen, 5% dioxid de carbon, 90*/0 azot. 14.5.2.7. Conserwarea embrionilor Pentru mentinerea qi prelungirea vrabilititii embrionilor pan8 i n rnomentul transferulu~,se folosesc diferite metode de conservare de scurti durata gi respectiv de lung4 durats.

identificarea gi clasificarea embrionilor;

i
I

- aprecierea viabilitgtii embrionilor:

Prima etapa const3 in identificarea gi recuperarea embrionilor din lichidul de spalare, unul cate unul, cu ajutorul unei lupe binoculare qi a unei micropipete gi introducerea lor intr-o placa cu mediul de cultura; cel ma; des utilizat mediu de cultura este PBS (Phosphate Buffered Saline). Urmeaza clasificarea lor astfel:

11
I

i i

- ovocite nefecundate
celular;

au membrana pelucida neregulata,

iI

lipsegte conturul celular, apar vacuole gi dispersia rnaterialului

- embrioni degenerati

caracterizati prin

degenerescenla

blastomerelor, aparitia in interiorul membranei pelucide a unei mase netransparente, nestructurate;

embrioni normali dezvolta!~

au blastomerele integre 51 i n

numar variabil, i n funcfie de momentul recoltarii; embrioni retardati - au blastomerele integre, dar ca dezvoltare nu corespund momentului recoltirii. Cea de-a doua etap5 gi anume aprecierea viabilitajii embrion~lor are o mare important3 pentru evitarea factorilor de risc in aparitia gi

Consewarea de hcurta durat.

arigurd mentinerea embr~onilori n

I

incepdnd cu lucr~rile Foley 9i col. (1984), vitrificareq suscits un lui mare interes T criobiologie, constituind o nouA cale de crioconservare a n embrionilor, prin care este depA9it obstacolul de formare a cristalelor mari de gheata, intracelular. Cu ajutorul vitrificarii, trecerea de la stadiul lichid la cel solid se realizeaza progresiv, astfel incat, la o temperatura suficient de joasa, lichidul devine atit de vascos incit are rigiditatea unui solid. i n cazul metodelor clasice de congelare, concentratiile de crioprotector sunt prea mici pentru a obtine un stadiu viscos gi la exteriorul celulelor embrionare. De aici, necesitatea cregterii acestor concentratii, indiferent de viteza de congelare. lnconvenientul major al concentratiilor mari de crioprotectori este toxicitatea acestora pentru embrioni. De aceea, s-a incercat reducerea acestui efect toxic prin scaderea temperaturii gi a duratei de expunere a celulelor inainte de congelare gi utilizarea unor amestecuri de crioprotectori (glicerol+propandiol). Embrionii aflati i n diferite stadii de dezvoltare (morule compacta, blastocist tsnar, blastocist) sunt aspira!i intr-o paietfi cu mediu de vitrificare gi depugi intr-o picatura din ace1 rnediu, situat la mijlocul
4

vitro", o perioada variabilG de timp: 9-48 ore, i n cazul conservar~ila C temperatura camerei; c i n d temperatura este de 37 O embrion~ii g ~ continua dezvoltarea putind ajunge pan8 i n stad~ulde blastoc~st;la temperatura de 0-10 O dezvoltarea embr~on~lor oprita gi se rela la C este 37 O . se folosesc diferite medii de culturfi, dar rata gestatiilor este mai C mica decat T cazul in care embrionii ar fi transferati imediat dupe n recoltare. Conservarea de lunaii durata presupune congelarea embrionilor. Embrionul, spre deosebire de spermatozoid este un ansamblu de celule

a I
I r

bogate i n apa gi evolueaza i n timp. De aceea, congelarea embrionilor este un proces mai complex, care impune mdsuri severe pentru evitarea mortalitatilor. T procesul de crioconservare sunt implicati doi factori: n

evitarea formarii ghetii intracelulare, care prin forrnarea de cristale mari poate sfi duce la distrugerea membranei citoplasmatice;

- evitatarea deshidratarii brutale.

Pentru evitarea acestor factori daunatori se iau urmatoarele masuri:

I
I
I
I

asigurarea unei viteze optime de racire. Pentru aceasta, embrionul aspirat intr-o paieta de plastic se introduce intr-un congelator prograrnabil, echilibrat la -7 O . Apoi temperatura C scade progresiv cu 0,3 "C, p2na ajunge la -30 O , dupa care C paieta cu embrion se introduce in azot lichid la -196 OC.

paietei. Picatura cu embrion este separata prin doua bule de aer de o solutie de sucroza. Paieta se inchide apoi la cele doua capete uzinal. Dupa o duratfi variab~lti stocaj, paietele sunt scoase d ~ n de azotul lichid pi imersate intr-o baie de ap5 la temperatura de 20
OC,

$1

este

plonjatg progresiv i n azot lichid, incep2rrd cu extremitatea dinspre capul

utilizarea crioprotectorilor pentru reducerea 9ocurilor osmotice: dimetil sulfoxid (DMSO), glicerol 10% sau propandiol.
i
I

pin8 t e

d~sparegheata din solutia de sucroza Continutul f~ecereipaiete ~

Eficienta congelgrii i n paiete se apreciaze prin compararea ratei de

i

trecut apoi fntr-o place gi Issat la temperatura camerei tirnp de 5-10 minute; apoi embrioni~ sunt trecuti de 1-3 ori prin solutie de PBS, inainte e a fi pugi in culture sau transferati la receptoare.

I uupravietuire obtinuta dupa stocare cu cea a ratei utilizsrii embrionilor

I

necongelati.

if

I
Y

11'1

74.5.2.8.~~~~l

la D ~ ~ ~ ~ ~ - Zefbbn'nndl~r rece~toare, I S . I I /

disting o serie de tehnici ca: fecundatia 'in vitro", diagnosticul timpuriu sexului, rnanipularee &$tic&.
.

lntroducerea embrionilor proaspat recoltati sau a celor congelati in aparatul genital al receptoarelor se poate realiza prin metode nechirurglcale sau chirurgicale. Metodele nechirurgicale se aplica la vaca, dupa aceiagi tehnica de ~noculare spermei, prin metoda recto-vag~nalg. a Metodele chlrurg~calese aplicg la oaie 81 scroafa $ constau in 1 efectuarea laparatomiei pe linia alba, ev~dentiereacornului uterln in care se va introduce embrionul cu ajutorul unui p~pete plastic sau a unel de ser~ngi speciale. Locul de depunere a embrionului trebuie s i corespunds cu dezvoltarea lui gi poate fi treimea posterioara a oviductului sau viirful cornului uterin La oale, transferul embr~onilor face gi prln metoda endoscoplca, se procedindu-se astfel: receptoarea se contenfioneazii i n decub~t dorsal, I se face toaleta mecanici local3 ~i anestezia localti. Apoi se punctioneaza abdomenul gi se insufla aer i n cavitatea abdorninala. Se v1zualizeaz3 cornul uter~n corespondent ovarulur cu corp galben
$1
1

Fecundatia "in vitro" cuprinde o serie de etape: obtinerea ovocitelor, maturarea ovocitelor "in vitro", capacitarea spermatozoizilor, fecundarea, cultura embrionilor "in vitro", transferul embrionilor. Sexarea ernbrionilor se poate realiza prin.

procedeul citogenetic - presupune analiza cariotipului celulelor trofoblastice, in metafaza, recoltate prin microchirurgie; este traumatizant pentru embrion; procedeul imunolog~c se bazeaza pe prezenta la suprafata celulelor mascule a unui antigen de histocompatibilitate, numit AgH-Y; acesta poate fi evidentiat prin imunofluorescent~sau cu ajutorul anticorpilor monoclonali anti H-Y;

1
?

j
'i

procedeul enzimologic - care se bazeaza pe faptul c i unele enzime celulare sunt codificate de cgtre gene din cromozomul

X; cantitatea acestor enzime este de 2 ori mai mare la celulele

se

femele decst la cele mascule,

fixeazii cu o pensi. Se punctioneaza cornul uter~ngi se depune embrionul la locul corespunzator virstei lur.
14.5.3. Pers~ectivele transferului de embrioni.

determinarea unei secvente de AND speclfics cromozomului Y ajuta la identificarea embrionilor masculi, cu o precizie de 95%

Biotehnica transferului de embrioni a creat posibilitatea obtinerii ovulelor gi a embrionilor in stadiile de dezvoltare dorite, pe care apoi se pot efectua diferite manipulari genetice. Cu ajutorul unui microscop micromanipulator gi a unor microinstrumente specifice se pot efectua diferite manopere microchirurgicale, cum ar fi: Transferul de embrioni va capata o extindere mai mare, deoarece cu ajutorul lui pot fi studiate procese biologice, cum ar fi: limitele de hranire ~i adgpostire a produgifor de conceptie i n uter, relatiile dintre embrion-uter-ovar, influenla unor factori genetici gi nutritionali asupra produsului de conceptie, crearea de linii consangvine, de rase noi. Biotehnologiile finalizate prin transfer de embrioni cuprind totalitatea metodelor qi tehnicilor rezultate din integrarea 9tiintelor biologice, biochimiei, biofizicii, informaticii, i n scopul manipularii genetice a unui embrion, celule embrionare, nucleu, gene, etc. in cadrul acestora

- extractiile de celule embrionare, pronuclei. fragmente de nuclei; - sectionarea embrionului gi repunerea jumZitelllor rezultate i n alte
membrane pelucide; obtinerea de himere, de clone;

- transferul de gene, grupuri de gene, nuclei d~ploizi.