Sunteți pe pagina 1din 36

CULTIVAREA BACTERIILOR

Cultivarea bacteriilor: totalitatea fenomenelor legate de creterea i multiplicarea bacteriilor n afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a unor condiii ct mai apropiate de cele naturale, adecvate necesitilor metabolice ale acestor microorganisme. Scop: identificarea agentului etiologic al unei infecii; determinarea farmacorezistenei microorganismelor izolate; preparare seruri i vaccinuri. Definiii: populaia bacterian: multitudinea de indivizi ai unei specii care habiteaz ntr-un biotop; clona bacterian: populaia rezultat dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ (colonie bacterian); tulpina bacterian: populaia microbian alctuit din descendenii unei singure izolri n cultur pur; inoculare/nsmnare: punerea n contact a unei culturi bacteriene sau a unui produs patologic cu mediile de cultur; mediu de cultur: un complex de substane care permite creterea i multiplicarea bacteriilor (conine substane nutritive, are pH i umiditate corespunztoare, este steril, asigur condiii de aero/anaerobioza) sau mediu care asigur nutrienii i condiiile fizicochimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene; cultura bacterian: totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare pe / n mediul de cultur, aglomerare de bacterii vizibil cu ochiul liber; izolare: repicarea unei singure colonii pe alte medii de cultur cu scopul de a obine cultur pur. Clasificarea mediilor de cultur a. dup scopul utilizrii: - medii uzuale - pe care se dezvolt majoritatea germenilor patogeni aerobi i anaerobi; - medii speciale destinate izolrii, cultivrii i cercetrii nsuirilor biologice ale anumitor specii bacteriene: - medii de izolare: cu ser, cu snge Pasteurella pentru Corynebacterium, cu glicerin, cu cartofi, cu ou pentru Mycobacterium; - medii de mbogire: conin substane care stimuleaz dezvoltarea unor germeni patogeni: mediui hiperclorurate (tip Champan) pentru stafilococi; mediul Kauffmann-Muller pentru enterobacterii, mediul Korthoff pentru leptospire; - medii selective favorizeaz, prin compoziia lor chimic, dezvoltarea anumitor germeni de interes, inhibnd n acelai timp dezvoltarea altora, prezeni n numr mai redus: mediul Istrati-Meiterf: E. coli, Shigella, Salmonella; mediu Lowenstein Jensen pentru micobacterii; mediul Muller Hinton pentru antibiograme;

- medii difereniale: permit creterea difereniat a unor specii microbiene sau pun n eviden anumite particulariti metabolic cu semnificaie n diagnostic: - fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare; - diferenierea speciilor lactozo-pozitive; - detectarea formrii H2S; - producerea de indol; - medii de transport; - medii de conservare; - medii pentru controlul sterilitii. b. dup consisten: medii lichide (repartizate n eprubete); medii semisolide (repartizate n eprubete); - medii solide (geloz dreapt, nclinat, n plci). Consistena mediului de cultur este dat de includerea n compoziie a unor substane inerte: agar (geloz) sau gelatin. c.dup tipul respirator: - pentru germeni aerobi: - pentru germeni anaerobi. d. dup compoziie: naturale (care conin substane nutritive n forma lor natural fr a fi prelucrate n prealabil: lapte, bil, ser, cartof); artificale [medii la care este obligatorie o prelucrare prealabil, pornind de la proteine animale (carne i organe de vit, fin de pete) sau vegetale (mazare, soia, drojdie)]; sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substane chimice (aminoacizi, factori de cretere, sruri); semisintetice: sunt acele medii care pe lng substane chimice mai conin i proteine animale sau vegetale. Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc mediile de cultur: - s ofere substanele plastice i energetice necesare fiecrui microorganism (s conin o sursa de N i C, factori de cretere, sruri minerale; - s aib un pH optim pentru specia respectiv, de obicei uor alcalin 7,2-7,4; - s asigure, dup caz, cerinele de aerobioz sau anaerobioz; - s aib un anumit grad de umiditate; - s fie stabil (trebuie s-i pstreze toate calitile iniiale pe toat durata incubrii); - s fie sterile, pentru a nu se dezvolta i alte microorganisme, n afara celor nsmnate; - s se pstreze ferite de contaminare, att nainte, ct i dup folosire. Mediile de cultur pot fi: preparate n laborator conform unor reete; procurate ca medii deshidratate (rehidratate cu ap distilat, demineralizat); procurate ca medii gata pentru utilizare, condiionate n plci Petri, tuburi. Controlului de calitate: - se efectueaz pentru fiecare lot n parte:

- mediile de cultur trebuie s fie sterile; - se verific prin incubarea a 2 plci (ex. agar-snge) la 37C timp de 48 de ore; - nu trebuie s apar modificri macroscopice. Mediile de cultur sunt stocate: - pentru un timp, la adpost de lumina solar, la +4C, n folie de plastic nchis ermetic; - n dulapuri, la ntuneric, la temperatura camerei n cazul mediilor pentru cretere n anaerobioz (bulion tioglicolat, alte medii). Mediu de cultur Medii de baz Geloz simpl (geloz nutritiv, conine bulion de carne i agar) Geloz - snge (conine 5% snge defibrinat de animal) Geloz cordcreier Ap peptonat Medii selective Geloz-chocolat Medii de cultur folosite n bacteriologie Utilizri Mediu de cultur de uz general pentru cultivarea microorganismelor nepretenioase: Mediul se distribuie n plci Petri Mediu pentru cultivarea microorganismelor pretenioase i nepretenioase. Mediul se distribuie n plci Petri Pentru cultivarea germenilor pretenioi Mediu de cultur de uz general pentru germeni nepretenioi. Mediu utilizat atunci cnd se suspecteaz prezena Vibrio cholerae, pH 8,6-9,0. Mediul este repartizat n tuburi Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. i Neisseria. Mediul se toarn n plci Petri Recomandat pentru cultivarea Haemophilus spp. i Neisseria

Geloz chocolat suplimentat cu factori de cretere Geloz Thayer Mediu special pentru cultivarea neisseriilor Martin Geloz lactozat Pentru studierea fermentrii lactozei Baza geloz Pentru realizarea unui mediu fr snge pentru izolarea Campylobacter Campylobacter spp. fr snge (Blood free - CCDA) Baza geloz Mediu folosit pentru realizarea unui mediu selectiv i diferenial n Clostridium vederea izolrii Clostridium difficile difficile (necesit supliment) Medii pentru testarea sensibilitatii antimicrobiene Geloza MuellerMediu folosit pentru testarea sensibilitii microorganismelor la Hinton II antibiotice, cu concentraie foarte sczut de tiamin i timidin (NCCLS) precum i cu nivel corespunztor de Ca i Mg.

Geloza MuellerMediu folosit pentru testarea sensibilitii microorganismelor la Hinton cu snge antibiotice, cu coninut de snge i cu concentraie foarte sczut de (Blood II tiamin i timidin precum i cu nivel corespunztor de Ca i Mg. NCCLS) Medii selective i diferniale Mediul Chapman- Mediu selectiv pentru izolarea i identificarea prezumptiv a Mannitol Salt speciilor de stafilococi manito-pozitive Agar MRSA Screen Mediu diferenial pentru identificarea prezumptiv a stafilococului Agar meticilino-rezistent (MRSA), este indicat pentru depistarea portajului Mediul Levine Mediu selectiv pentru izolarea i diferenierea enterobacteriilor Eosin Methylene precum i pentru identificarea E. coli Blue Agar MacConkey Agar Mediu selectiv pentru izolarea i diferenierea enterobacteriilor MacConkey Mediu selectiv i diferenial pentru identificarea bacteriei E. coli Sorbitol Agar enterohemoragic (EHEC) Drigalski Glucose Mediu selectiv i diferenial pentru cultivarea i identificarea Agar enterobacteriilor Drigalski Lactose Mediu selectiv i diferenial pentru cultivarea i identificarea Agar germenilor coliformi Mediul Leifson Mediu selectiv i diferenial pentru izolarea patogenilor enterali. modificat Este mai selectiv dect mediul Hynes. Conine fenilalanin care Desoxycholate permite diferenierea speciilor Salmonella de Proteus Citrate Agar Salmonella Mediu selectiv i diferenial pentru izolarea patogenilor enterali, n Shigella (SS) special Salmonella i o parte din speciile Shigella. Conine Agar fenilalanin care permite diferenierea speciilor Salmonella de Proteus Brilliant Green Mediu selectiv cu verde briliant pentru izolarea speciilor de Agar, Uman Salmonella din probele clinice Hektoen Enteric Mediu selectiv i diferenial pentru izolarea patogenilor enterali, mai Agar ales Salmonella i o parte din speciile Shigella XLD Agar Mediu selectiv pentru izolarea i diferenierea patogenilor enterali, mai ales a speciilor de Shigella TCBS Agar Mediu selectiv pentru izolarea microorganismelor patogene din genul Vibrio Medii pentru hemocultur Hemocultura pentru aerobi Hemocultura pentru anaerobi Hemocultura pentru aerobi (pediatric mini) Hemocultura pentru anaerobi (pediatric mini) Medii de transport repartizate n tuburi cu tampoane de recoltare Amies cu crbune Mediu semisolid mbuntit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenioi. Asigur supravieuirea prelungit a (conine agar,

tioglicolat de sodiu, crbune neutru i o soluie tamponat de sruri anorganice) Amies

microorganismelor ntre recoltare i nsmnare, pstreaz raportul dintre specii. Permite supravieuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae

Mediu semisolid mbuntit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenioi. Asigur supravieuirea prelungit a microorganismelor ntre recoltare i nsmnare, pstreaz raportul dintre specii. Cary-Blair Mediu semisolid, recomandat pentru transportul microorganismelor Gram negative i anaerobe, pstreaz raportul dintre specii Stuart cu crbune Mediu semisolid, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenioi. Asigur supravieuirea prelungit a microorganismelor, pstreaz raportul dintre specii Stuart Mediu semisolid mbuntit, recomandat pentru transportul germenilor patogeni pretenioi. Asigur supravieuirea prelungit a microorganismelor, pstrnd raportul dintre specii Medii de mbogire repartizate n tuburi Bulion selenit Pentru realizarea mediului de mbogire pentru speciile de cistin Salmonella si unele specii de Shigella. L - cistina mbuntete dezvoltarea salmonelelor Trichomonas Mediu de cultur utilizat pentru cultivarea Trichomonas vaginalis Medium Medii pentru identificare biochimica repartizate n tuburi SIM Medium Mediu pentru diferenierea enterobacteriilor pe baza mobilitii precum i a producerii de hidrogen sulfurat i indol (necesit reactiv Kovcs) Simmons Citrat Mediu pentru diferenierea bacteriilor Gram negative pe baza Agar utilizrii citratului Phenylalanine Mediu pentru diferenierea enterobacteriilor pe baza dezaminrii Rhamnose Agar fenilalaninei i fermentrii ramnozei Geloz uree Pentru realizarea unui mediu ce permite diferenierea microorganismelor pe baza producerii de ureaz Motility Agar Mediu pentru studiul mobilitii enterobacteriilor Indole Motility Mediu pentru diferenierea enterobacteriilor pe baza producerii de Ornithine Agar indol, a mobilitii i a activitii ornitin decarboxilazei Lysine Iron Agar Mediu pentru diferenierea enterobacteriilor pe baza producerii lizin(LIA) decarboxilazei i a hidrogenului sulfurat TSI (Triple Sugar Mediu pentru diferenierea enterobacteriilor Gram negative pe baza Iron) Agar fermentrii zaharurilor i a producerii de hidrogen sulfurat Esculin Mediu pentru diferenierea bacteriilor pe baza descompunerii Agar(ABE)BE esculinei Salt Bulion Mediu selectiv pentru identificarea prezumptiv a enterococilor prin determinarea toleranei la sare Bulion uree-indol Pentru evidenierea activitii ureazei i a producerii de indol

(necesit reactiv Kovcs) LowensteinMediu utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis. Jensen (conine o Se repartizeaz n tuburi nclinat i coagulat n pant soluie de sruri i amidon, soluia de verde malachit i omogenizat de ou) Metode de nsmnare: Cerine ce trebuie respectate la nsmnare: - s se realizeze steril; - s se evite diseminarea n mediu bacteriilor; - s s realizeze n timp scurt; - s se foloseasc pipete Pateur sau ansa bacteriologic; - s se foloseasc medii de cultur sterile solide sau lichide. Pe medii solide: - nsmnare prin epuizare (se obin colonii izolate); - nsmnare n sector (se obin colonii confluente); - nsmnare prin nepare. Pe medii lichide - omogenizarea unei colonii n mediu lichid. nsmnarea prin epuizare Obinerea culturii primare: - se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic; - se descarc ansa pe mediu de cultur: - se nsmneaz un prim sector; - se sterilizeaz ansa; - din primul sector nsmnat se traseaz cteva striuri paralele n sensul acelor de ceasornic; - se continu nsmnarea prin striuri paralele, terminndu-se printr-un striu n zigzag. n ultimul sector bacteriile sunt dispersate, astfel nct dup incubare se vor forma colonii izolate. Obinerea culturii pure: - se replic o singur colonie din cultura primar pe un mediu de cultur proaspt, fie prin epuizare, fie prin nsmnare n sector. nsmnarea n sector: - se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs patologic; - se descarc ansa pe mediu de cultur sub forma unui sector de cerc. Pe o plac pot fi nsmnate mai multe specii bacteriene. Prin nsmnare n sector nu se obin colonii izolate.

nsmnarea pe medii n coloan nclinat: - se ncarc ansa de platin sterilizat cu produs; - se descarc ansa pe partea nclinat a mediului de cultur sub forma unui striu. Nu se obin colonii izolate, bacteriile cresc sub diferite modele. nsmnarea prin nepare: - se practic pentru nsmnarea mediilor solide turnate n coloan dreapt; - se ncarc acul de inoculare cu produs; - se neap mediul n direcie vertical pe o distan de din nlimea coloanei; - se poate utiliza i pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini considerate importante, a tulpinilor de colecie, a tulpinilor de referin, pentru nsmnarea unor medii multitest (TSI, MIU); - se prefer utilizarea unei anse-fir sau a unei anse cu o bucl foarte mic; - se utilizeaz tuburi (eprubete) de dimensiuni diferite i o cantitate diferit de mediu. Pentru cultivare pe mediul TSI: - se utilizeaz tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuor); - se nsmneaz partea dreapt" prin nepare, fr a se atinge baza tubului; - se nsmneaz apoi partea nclinat" prin realizarea unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa mediului. nsmnarea n medii lichide Tehnica nsmnrii cu ansa bacteriologic: - se introduce ansa cu firul nroit n flacr n recipientul ce conine produsul patologic; - se rcete alipind ansa de peretele recipientului; - se recolteaz o poriune din produs; - se scoate dopul recipientului cu mediu; - se flambeaz gura acestuia; - se descarc materialul luat pe bucla ansei din prelevat n mediul din recipientul deschis sub protecia flcrii pe peretele recipientului; - se agit uor lichidul; - se flambeaz din nou gura recipientului i dopul cu care apoi se astup recipientul; dup nsmnare, ansa se sterilizeaz din nou prin nclzire la rou. Tehnica nsmnrii cu pipeta: - se scoate pipeta gradat din ambalajul steril; - se introduce rapid n flacr att captul ct i toat lungimea ei; - se controleaz apoi rcirea ei prin flambare;

- dac se lucreaz cu pipeta Pasteur, se rupe vrful efilat al pipetei, dup care se flambeaz captul; - pipeta flambat i rcit se introduce n recipientul cu produsul prelevat; - se aspir de la cteva picturi pn la 1 sau mai muli ml, n raport cu materialul de nsmnat i cantitatea de mediu de cultura; - pipeta se manipuleaz cu grij pentru a nu uda dopul de vat; - se nsmneaz materialul aspirat n pipet n recipientul cu mediu nutritiv; - dup nsmnare se flambeaz gtul recipientului i dopul; - pipeta folosit se pune ntr-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirndu-se din amestec pn la aproximativ 1 cm sub dop; - tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descrcate direct n mediu, dup care vor fi introduse n tub i puse n gleata de infecte. n funcie de specie, bacteriile cresc difuz n tot volumul mediului la suprafa sau la fundul eprubetei.

Identificarea bacteriilor pe baza caracterelor de cultur, biochimice i de metabolism Pe baza caracterelor de cultur n acest caz se studiaz aspectul macroscopic al coloniilor bacteriene izolate: a. colonii de tip S (smooth - netede): - rotunde; - bombate cu margini circulare, regulate; - translucide cu suprafaa neted; - uor detaabile de pe mediu; - suspensionate n ser fiziologic produc suspensii omogene; - produc tulburare n mediu lichid; - germenii capsulai pstreaz capsula; - virulena este conservat. Tipul de colonie S reprezint forma normal pentru majoritatea bacteriilor patogene (S. aureus, S. pyogenes, E. coli), fiind dotat cu caliti optime de structur antigenic i de patogenitate; b. colonii de tip R (rough - rugos, aspru, grunjos): - colonii cu margini neregulate; - plate, uscate; - cu suprafaa zbrcit;

- aderente la mediu; - aglutineaz spontan n ser fiziologic; - structura antigenic nu este caracteristic; - nu pstreaz capsula; - n mediu lichid produce depozit cu supernatant clar. Tipul R de colonie este caracteristic, n general, bacteriilor nepatogene, cu 3 excepii: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae; c. forme intermediare: S-R, R-S; d. colonii de tip M: - cu aspect mucos; - foarte mari; - foarte bombate; - foarte lucioase; - cu tendin de curgere i de confluare. Tipul M de colonii este caracteristic bacteriilor care posed capsul (Klebsiella); e. fenomen de crare (invazie, migrare, roire): Pe medii simple, creterea se exprim ntr-un strat continuu, sub forma unor valuri succesive, fenomen caracteristic pentru Proteus spp. Bacillus anthracis produce colonii n "cap de meduz"/"coam de leu" (mari, alb-cenuii, de tip "R", la periferia coloniei, se pot observa prelungiri ondulate). Exemple de cretere pe medii de cultur lichide: - mediul este tulburat omogen (Staphylococcus spp.) - mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (S. pyogenes) - mediul este clar, cu vl la suprafa (V. cholerae n ap peptonat alcalin) - dezvoltarea culturii se realizeaz ca un "inel" aderent de pereii tubului, la suprafaa mediului (E. coli) - mediul este clar cu dezvoltarea unei membrane uscate, la suprafa (Bacillus subtilis) - mediul este clar cu apariia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. anthracis) - mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (M. tuberculosis). Pe baza caracterelor biochimice i de metabolism n acest caz se studiaz metabolismul bacterian i prezena diferitelor enzime specifice. Studierea caracterelor biochimice i de metabolism permit ncadrarea bacteriilor n specie. a. Metabolismul glucidic - se studiaz pe medii de cultur difereniale sau selectiv-difereniale; - urmrete descompunerea diferitelor zaharuri de ctre bacterii (glucoz, lactoz, zaharoz, manitol); - prin descompunerea zahrului de ctre bacterii mediul se acidific, iar indicatorul schimb culoarea mediului de cultur.

b. Metabolismul proteic: - se studiaz pe medii de cultur difereniale; - prin descompunerea proteinelor de ctre bacterii se elibereaz metabolii precum indol, H2S sau amoniac; - indolul i H2S se evideniaz cu ajutorul unor hrtii de filtru mbibate n reactiv specific (reactiv Kovacs pentru indol i sruri de Pb pentru H2S); - prezena amoniacului se evideniaz cu ajutorul unui indicator de culoare.

c. Enzimele bacteriene hemolizinele: - enzime care lizeaz hematiile (altereaz hemoglobina); - prezena acestei enzime se evideniaz pe mediu geloz - snge; - principalele tipuri de hemoliz: - alfa () - apare ca o zon verzuie n jurul coloniei; - beta () - sngele este descompus total, n jurul coloniei este o zon clar, transparent. -Hemolizina sintetizat de Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae) produce liza incomplet a hematiilor, culoare verzuie; -hemolizina sintetizat de Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes produce liza complet a hematiilor, zona de hemoliza este clar; y-hemolizina produs de

Staphylococcus spp. lizeaz hematiile, dar nu produce zone de hemoliza pe agar-snge (la streptococi, "y-hemoliza" indic absena hemolizei). catalaza (Staphylococcus spp): - descompune apa oxigenat n ap i oxigen; - oxigenul eliberat se evideniaz prin formarea bulelor de gaz; coagulaza: - determin coagularea plasmei recoltate pe anticoagulant; oxidaza (N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, V. cholerae): - enzime oxidative; - acioneaz asupra unor substane producnd compui colorai. gelatinaza (Clostridium perfringens): - lichefiaz gelatina; lecitinaza (Bacillus anthracis, Clostridium spp.); nitrat-reductaza (Mycobacterium spp.); Alte caractere metabolic: - tolerana la un anumit pH (V. cholerae se multiplic la pH alcalin); - tolerana la o anumit concentraie de NaCl (Staphylococcus aureus); sensibilitatea la optochin (S. pneumoniae) sau la bacitracin (S. Pyogenes). d. Alte teste Mobilitatea: - bacteriile flagelate sunt mobile i migreaz ntr-un mediu de cultur semisolid, deviaz de la locul de inoculare (traiectul de neptur). Mirosul: - la multe specii, coloniile au miros caracteristic: Producerea de pigment: - pigmeni nedifuzibili - nu difuzeaz n mediu, vor colora doar colonia (Staphylococcus aureus - pigment auriu); - pigmeni difuzibili - difuzeaz n mediu, coloreaz i mediul (Pseudomonas pigment verde). Teste de identificare Testul sensibilitii la bacitracin Principiu: Bacitracina (antibiotic sintetizat de Bacillus licheniformis) inhib multiplicarea streptococilor de grup A. Mai puin de 1% din tulpinile de Streptococcus pyogenes rezist la aciunea bacitracinei. Materiale colonii P-hemolitice izolate pe geloz - snge; necesare: microcomprimate de bacitracin cu 0,04 U i cu 0,1 U. Tehnica de lucru: se preleveaz 3-4 colonii P-hemolitice; - se nsmneaz omogen pe 1/2 de plac Petri cu gelozsnge.; - se plaseaz n centrul ariei nsmnate un microcomprimat cu bacitracin; se incubeaz pentru 18-24 ore la 35-37C. Test pozitiv:

Interpretare:

- cnd se constat inhibarea creterii bacteriene n jurul microcomprimatului cu 0,04 U bacitracin (indiferent de diametru); - cnd se constat o inhibare a creterii bacteriene n jurul microcomprimatului cu 0,1 U bacitracin cu diametrul>11 mm. Control de Martor pozitiv: Streptococcus pyogenes calitatea: Martor negativ: Streptococcus agalactiae. Testul bilolizei (Neufeld) Principiu: Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulai sunt lizai n prezena bilei sau a srurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice. Materiale - colonii ct-hemolitice izolate; necesare: - soluie de dezoxicolat de sodiu 10%; - soluie izotonic; - ap distilat. Tehnica de lucru: - se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie de colonii cthemolitice izolate; - se repartizeaz n 2 eprubete de sticl cte o,5 ml suspensie; - se adaug n prima eprubet 0,5 ml dezoxicolat de sodiu; - se adaug n a doua eprubet 0,5 ml ap distilat - se incubeaz probele 2 ore la 35-37oC. Interpretare: Testul este pozitiv (bacterii lizate - pneumococi): - dac suspensia din eprubeta n care s-a adugat dezoxicolat s-a clarificat i nu s-a clarificat n cealalt eprubet; Testul este negativ: dac ambele tuburi au rmas opace. Controlul calitii: Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniae Martor negativ - Streptococcus viridans. Testul producerii de catalaz Principii: Se testeaz capacitatea bacteriilor de a elibera oxigen din peroxidul de hidrogen (H2O2) prin aciunea catalazei. Materiale - colonii dezvoltate i izolate pe medii fr snge; necesare: - soluie de peroxid de hidrogen 3%; - ap distilat. Tehnica de lucru: se realizeaz o suspensie bacterian dens n 1-2 ml ap distilat; se adaug 1-2 picturi de peroxid de hidrogen 3%; se observ imediat i dup 5 minute apariia bulelor de oxigen. Interpretare: Test pozitiv: apariia bulelor de gaz, bacteria sintetizeaz catalaz; Test negativ: absena bulelor de gaz, bacteria nu sintetizeaz catalaz. Martor pozitiv - Staphylococcus aureus; Control de calitate: Martor negativ - Streptococcus pyogenes. Testul coagulazei Principiu: Stafilococii coagulazo-pozitivi (Staphylococcus aureus) produc o enzim care activeaz coagularea plasmei. Exist 2 tipuri de coagulaz: coagulaza liber i coagulaza legat de peretele celular (dumping factor). Coagulaza liber i legat convertesc fibrinogenul din plasm la fibrin cu formarea unui coagul.

Materiale necesare

- colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s fie testat; - plasm de iepure; - lame; - tuburi. Tehnica de lucru: - se depune pe lam o pictur de ap distilat; Testul coagulazei - se suspensioneaz i omogenizeaz 1-2 colonii n pictura de ap pe lam distilat (tulbure omogen); coagulaza legat - se ateapt 10 secunde; - se urmrete apariia eventualelor autoaglutinri; - dac apare fenomenul de autoaglutinare se trece la efectuarea testului coagulrii n tub; - dac pictura se menine tulbure omogen se adaug 1 pictur de plasm; se urmrete apariia coagulilor timp de 10-15 secunde Interpretare: Test pozitiv: apariia coagulilor n 10-15 secunde; Test negativ: absena coagulilor (5% din Staphylococcus aureus dau reacii fals negative). Testul coagulazei se pipeteaz 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril; n tub - coagulaza se preleveaz o colonie care se descarc n plasma din tub; liber se incubeaz tubul timp de 4 ore la 35-37C; - se recomand examinarea, prin nclinarea tubului, din 30 n 30 de minute, n primele 4 ore; - dac reacia este negativ la 4 ore, se reincubeaz tubul pn la 24 ore. Interpretare: Test pozitiv: formarea unui coagulului; Test negativ: absena coagulului. Control de Martor pozitiv - Staphylococcus aureus calitate: Martor negativ - Staphylococcus epidermidis Medial multitest MIU (mobilitate indol uree) Principiu: MIU conine uree, triptofan, rou fenol (indicator de pH) i este condiionat n tuburi de dimensiuni mici. Geloza moale permite mobilitatea microorganismului nsmnat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare mediului (culoarea vireaz de la galben la rou); producerea de indol din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich. tuburi cu mediul MIU; Materiale hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich; necesare: - colonii izolate de identificat; - ans fir. Tehnica de lucru: - se preleveaz prob pentru nsmnare din colonia, izolat pe mediu neselectiv, cu ajutorul ansei fir; - se nsmneaz mediul prin nepare astfel nct s se realizeze o nsmnare n linie dreapt - se fixeaz de dop hrtiua indicator n aa fel nct s ajung deasupra coloanei de mediu, fr ca acesta s fie atins; - se incubeaz la 35-37C, timp de 24 ore;

- se reincubeaz tubul pn la 48 de ore dac nu s-a constatat virarea culorii mediului. Mobilitatea: Interpretare: - bacterie imobil - dac opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare; - bacterie imobil - dac opacifierea este uniform n coloana de mediu. Ureaz: bacterie ureaz negativ - dac culoarea coloanei rmne galben; bacteria ureaz pozitiv - dac culoarea devine roie; - apariia unui inel de culoare roie la suprafaa mediului nu semnific un test pozitiv. Indol: - bacterie indol pozitiv - dac apare schimbarea culorii hrtiei la rou-violet; - bacterie indol negativ, dac hrtia rmne alb. Martor pozitiv - Proteus mirabilis: M+, U+, 1+; Control de Martor negativ - Shigella spp.: M-, U-, I-. calitate: Mediul multitest TSI (triple sugar iron - trei glucide i fier ) Examinarea concomitent a mai multe teste de identificare a Principiu: bacteriilor pe un singur mediu de cultur. Materiale - tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI de culoare rou necesare: deschis [mediul TSI conine glucoz (1/10 din cantitatea celorlalte zaharuri), lactoz i zaharoz, citrat feric i un indicator de pH (rou neutru)]. Mediul se solidific n poziie nclinat astfel nct s rmn n partea inferioar a tubului o poriune de mediu nenclinat de 1-2 cm. Partea dreapt (coloana) nu vine n contact cu aerul i ofer condiii relative de anaerobioz; partea nclinat (panta) ofer condiii de multiplicare n aerobioz; - colonii izolate de identificat; - ansa fir. Tehnica de lucru: - se preleveaz prob din colonia izolat pe mediu neselectiv cu ajutorul ansei fir; - se nsmneaz coloana prin nepare; - se retrage ansa i se nsmneaz partea nclinat prin striuri paralele (sau n zig-zag); - se incubeaz tubul la 35-37oC, timp de 24 ore. Interpretare: - fermentarea glucozei este pozitiv dac n poriunea dreapt culoarea vireaz la galben; - dac culoarea coloanei rmne roie, glucoza nu este fermentat (i nu este o enterobacterie); - dac fermentarea a avut loc cu producere de gaze, bulele sunt vizibile; - fermentarea lactozei/zaharozei este considerat pozitiv dac n poriunea nclinat culoarea vireaz la galben;

- producerea de hidrogen sulfurat este pozitiv dac ntre poriunea dreapt i cea nclinat se nnegrete zona. Control de Martor pentru pH acid la nivelul coloanei i pantei, fr producere de calitate: fbS - E. coli; Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei i producere de H2S - Salmonella typhimurium Testul producerii de citocrom oxidaza Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidaz, enzim care lipsete la bacteriile strict anaerobe. Aceasta acioneaz asupra tetra-metil pfenilendiaminei cu formarea unui compus de culoare purpurie. Sunt oxidazo-pozitive bacteriile: Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) i Micrococcus spp. (dintre germenii Gram pozitivi). Materiale - soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1% conservat necesare: n sticl de culoare brun la frigider sau fii de hrtie indicator impregnate n reactiv; - hrtie de filtru; - ans cu fir de platin sau pipet Pasteur (cudat); - colonii izolate dezvoltate pe agar-snge, agar-chocolat sau agar Mueller Hinton. Tehnica de lucru: - se preleveaz cu un tampon steril 2-3 colonii; - se realizeaz o nsmnare pe jumtatea unei plci cu agar-snge, n aa fel nct s rezulte o cultur confluent, - se plaseaz un disc cu optochin n centrul zonei nsmnate; - se preseaz uor pentru ca discul s adere uniform; - se incubeaz timp de 18-24 ore la 35-37C n atmosfer de 5% CO2. Interpretare: Test pozitiv: apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde; Test negativ: absena culorii purpurie. Apariia zonei colorate mai trziu nu permite interpretarea testului (posibile rezultatul este negativ). Martor pozitiv - Pseudomonas aeruginosa; Control de calitate: Martor negativ - Escherichia coli. Testul sensibilitii la optochin (ethyl hydrocuprein hydrocloride) Testul optochin ajut la diagnostic prin diferenierea pneumococilor Principiu: de Streptococcus viridans. Optochin este inhibitor pentru dezvoltarea pneumococilor (Streptococcus pneumoniae) chiar la concentraii < 5 g/ml de optochin, pe cnd ali streptococi se dezvolt bine sau prezint o zon mai slab de inhibare. Materiale - discuri cu optochin (5 g/disc), cu diametrul de 6 milimetri; necesare: - plci cu agar-snge; - tampoane sterile; - colonii -hemolitice izolate, care urmeaz a fi testate. Tehnica de lucru: - se Preleveaz cu un tampon steril 2-3 colonii; - se realizeaz o nsmnare pe jumtatea unei plci cu agar-snge, n aa fel nct s rezulte o cultur confluent;

Interpretare:

Control de calitate:

- se plaseaz un disc cu optochin n centrul zonei nsmnate; - se preseaz uor pentru ca discul s adere uniform, - se Incubeaz timp de 18-24 ore la 35-37C n atmosfer de 5% CO2. Test pozitiv: apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14 mm, Test negativ: absena inhibiiei n jurul discului semnific un test negativ. Martor pozitiv - Streptococcus pneumoniae; Martor negativ - Streptococcus viridans.

Testarea sensibilitii/rezistenei la antibiotice i chimioterapice Testarea sensibilitii la medicamentele antimicrobiene este strict necesar datorit apariiei i extinderii rezistenei microorganismelor la aceste medicamente. Se aplic: a. metode de testare a sensibilitii in vitro; b. metode de testare a sensibilitii in vivo, care in cont de relaia agent terapeuticinfecie. Metode de testare a sensibilitii in vitro Antibiograma reprezint metoda de laborator prin care se apreciaz, sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltai de la bolnavii cu infecii bacteriene, dup cultivare pe medii speciale (agar Mueller-Hinton). Pentru testare trebuie s folosim culturi pure. Principiul metodei: O cantitate de substan antimicrobian este depus pe suprafa unui mediu de cultura agarizat, prensmnat cu bacteria testat. Concomitent se produc doua fenomene: difuzarea substanei antimicrobiene i creterea bacteriei. n zonele n care substana antimicrobian realizeaz concentraii mai mari dect concentraia minim inhibitoare, bacteria nu crete. Antibiograma este util n: - instituirea unui tratament intit de ctre medicul clinician; - evidenierea acelor tulpini ce posed enzime capabile s inactiveze aciunea antibioticului in vivo; - supravegherea epidemiologic a rezistenei bacteriene; - compararea fenotipurilor de rezisten a tulpinilor responsabile de infecii nosocomiale. Se pot folosi: Tehnici calitative: - antibiograma difuzimetric comun; - antibiograma difuzimetric comparativ; - antibiograma difuzimetric standardizat; Tehnici cantitative: - metoda diluiilor n mediu lichid; - metoda diluiilor n agar, metoda microdiluiilor n agar; - metoda punctelor de ruptur - testul E; - metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare.

Antibiograma difuzimetric comun: - germenul de testat se nsmneaz pe mediul solid (agar Mueller-Hinton) turnat n plci Petri prin inundarea plcii, urmat de aspirarea (aseptic) excesului de inocul; - se aplic dup circa 20 minut microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice cu ajutorul unei pensete sau a unui aplicator automat la distane de minim 30 mm ntre ele i la 15 mm de marginea plcii. Se aplic 5 antibiotice diferite pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm. Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, de aceea trebuie presate uor; - dup nc 20 minute, plcile se incubeaz peste noapte n termostat, la 35-37C pentru majoritatea bacteriilor. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu i realizeaz zone de inhibiie n care coloniile microbiene nu se dezvolt (dac populaia bacterian este sensibil). Cu ct diametrul zonei de inhibiie este mai mare, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n interiorul zonei de inhibiie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvolt colonii (mutani rezisteni), germenul va fi considerat rezistent. Antibiograma difuzimetric comun este o tehnic nestandardizat care permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal): - se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Pentru cocii gram pozitivi se alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. care are o sensibilitate cunoscut la antibioticele utilizate (CMI cunoscut; CMI reprezint cea mai mic concentraie de agent antimicrobian, n mg/ml, cu aciune bacteriostatic asupra germenului testat); - pe o plac de form ptrat (mprit n 3 zone egale) se inoculeaz n treimea medie microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru a fi testate. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente; - se plaseaz microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi; - se incubeaz peste noapte la 35-37C. Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se examineaz comparativ). Poate fi apreciat i CMI. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer): se procedeaz ca n cazul Antibiogramei difuzimetric comun; metoda este standardizat i recunoscut pe plan internaional; rezultatele ntre laboratoare sunt reproductibile i corelabile. Elementele necesare standardizrii sunt: mediul de cultur (agar Mueller-Hinton), cu elemente minerale specifice testrii unor anumite microorganisme (Mg2+ i Ca2+, Pseudomonas aeruginosa, pentru sensibilitatea la aminoglicozide); pH-ul mediului (frecvent ntre 7,2-7,4); cu suplimente nutritive procurate comercial; grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm;

inoculul trebuie s aib o turbiditate corespunztoare standardului 0,5 McFarland (circa 10 uniti formatoare de colonii/ml) n multe dintre cazuri; timpul de incubare, atmosfera de incubare; concentraia substanelor din microcomprimate i dimensiunea acestora (6 mm diametru); alegerea substanelor antimicrobiene pentru care se face testarea; utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate; interpretarea rezultatelor (rezultatul obinut se compar cu rezultatele din tabele. Nu permite aprecierea CMI sau CMB (concentraia minim bactericid). Metoda diluiilor n mediu lichid: - ofer informaii cu privire la CMI pentru fiecare antibiotic studiat; - pentru fiecare antibiotic testat se utilizeaz mai multe tuburi cu bulion MuellerHinton n concentraii descresctoare (diluii binare) de la 64 g/ml pn la 0,125 g/ml, n total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor; - n final, se adaug n fiecare tub cte 1 ml de antibiotic; - se prepar inoculul standardizat turbidimetric; - se inoculeaz toate cele 11 tuburi, cu cte 1 ml de inocul; - se agit pentru omogenizare; - se incubeaz cele 9 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 3537C, al doilea tub martor se pstreaz la frigider; - pentru controlul de calitate se utiliz i un ir de tuburi care sunt inoculate cu o tulpin de referin corespunztoare; - rezultatul se citete n ziua urmtoare i se interpreteaz. Concentraia final de antibiotic se va njumti (n tubul n care diluia iniial a fost de 64pg/ml, diluia final va fi 32 pg/ml). n tubul martor meninut la +4C nu trebuie s existe cretere, n timp ce n tubul martor la 35-37C creterea trebuie s fie evident. n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatele corespunztoare datelor oferite de productor. n tuburile test, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului este CMI. Se consider (cu diferene ntre specii diferite) c microorganismele n cazul crora CMI este < 2 pg/ml pot fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid): - se cunoate rezultatul CMI; - se folosete ca surs de inocul tuburile n care dezvoltarea microbian a fost inhibat; - se mparte o plac Petri (agar Mueller-Hinton) n sectoare (4 sectoare dac inhibiia a avut loc n ultimele 4 tuburi); - se nsmneaz (aseptic) din fiecare tub fr cretere microbian, n sectorul de plac corespunztor; - se incubeaz 16-18 ore la 35-37C; - CMB corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii); - se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB;

Determinarea CMI i CMB se face: - pentru aprecierea eficacitii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene; - n tratamentul infeciilor severe (endocardite, meningite, septicemii); - pentru imunodeprimai, la care efectuarea acestei metode este indispensabil. Determinarea CMI prin testul E (Etest) Testul E reprezint o metod cantitativ de testare in vitro care permite determinarea valorii CMI. Principiu: Tehnica de lucru: - se scot plcile cu mediu de cultur i benzile Etest din congelator; - se menin la temperatura camerei pentru echilibrare termic, timp de 20 minute; - se scot benzile din folie cu ajutorul unei pensete i se pun n plci Petri sterile; - benzile nefolosite se conserv n tuburi, mpreun cu o substan desicant; - tuburile se pstreaz la -20C; - dup obinerea inoculului standard i dup ce se verific dac mediul de cultur nu mai prezint condens, se transfer inoculul pe mediu (cu un tampon) avnd grij s fie acoperit complet suprafaa mediului; - se ls placa timp de circa 10 minute, nainte de a aplica benzile Etest; - se ia cu grij o band i se aplic pe suprafaa mediului de cultur, cu captul ce conine concentraia cea mai mare aproape de marginea plcii (pot fi aplicate 2 benzi Etest ntro plac de 90 mm i maxim 6 benzi dac se lucreaz cu plci cu diametrul de 150 mm); - banda trebuie s fie n contact perfect cu suprafaa mediului. Dac banda a fost aplicat greit, aceasta nu trebuie deplasat n alt poziie, deoarece eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca i n cazul microcomprimatelor de la antibiogram; - se incubeaz la 35-37C, timp de 16-18 ore. Interpretarea - rezultatul se citete atunci cnd cultura este rezultatelor: confluent sau aproape confluent; - valoarea CMI corespunde liniuei n care creterea bacterian intersecteaz banda Etest; - pe geloz - snge se citete zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a hemolizei; - dac nu apare nici o zon de inhibiie se raporteaz valoarea CMI ca fiind mai mare dect cea mai mare concentraie notat pe band; - dac zona de inhibiie nu intersecteaz banda, valoarea

CMI este mai mic dect concentraia cea mai sczut menionat pe band; - se raporteaz rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce se verific rezultatul obinut pentru tulpina de referin (control de calitate).

Metode de testare a sensibilitii in vivo i aprecierea eficientei terapeutice - determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori; - determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori (capacitatea diluiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul coninnd germenul infectant); - determinarea nivelul de antibiotic realizat n snge, LCR sau n alte umori.

Metode serologice
Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea epitopului (de pe Ag) cu paratopul Ac. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt: - complementaritatea structural (reacia este specific); - complementaritatea electrochimic, consecin a complementaritii structurale (intr n aciune fore intermoleculare, necovalente, precum legturile de hidrogen, forele electrostatice, legturile van der Waals i legturile hidrofobe). Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile. Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri: Afinitatea (msoar fora de legare dintre epitop i paratop): o interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de respingere; Aviditatea (rezult din multivalena Ag): cele mai multe Ag posed mai mult dect un epitop, energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop; complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente. Exist, totui, i reacii ncruciate datorit faptului c anumite Ag posed anumii epitopi comuni (serul imun anti-Escherichia coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B). Etape reaciilor antigen-anticor sunt: interaciunea primar dependent de cantitatea i afinitatea Ac; poate fi pus n eviden doar prin nefelometrie (nu n diagnosticul obinuit) deoarece complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desface uor; interaciunile secundare apar dup 30 de minute. Ag poate avea mai muli epitopi iar Ac are minim 2 paratopi; complexele primare se reunesc, formeaz complexe secundare i respectiv un complex Ag-Ac ca o reea tridimensional, insolubil, care devine vizibil. Reacia de precipitare

Principiu: prin punerea n contact a unei antigene (sub form solubil, macromolecular) cu anticorpul corespunztor, se formeaz complexe imune antigen - anticorp, care precipit n momentul n care componentele se afl ntr-o anumit proporie. n reaciile de precipitare, antigenele sau anticorpii se pot utiliza ca atare sau marcai (fluorocromi, enzime, izotopi). Reaciile de precipitare pot avea loc n mediu lichid sau n mediu solid (reacii de difuzie). Formarea precipitatului imun depinde de o serie de variabile: - masa molecular, numrul determinanilor antigenici i concentraia antigenului; - tipul, heterogenitatea, aviditatea i concentratia anticorpului; - temperatura, pH, volumul de reacie. Compoziia precipitatului imun i proporia de combinare a antigenului cu anticorpii variaz n funcie de zona n care a avut loc precipitarea: exces de antigen, echivalen sau exces de anticorp. Reacia de precipitare este foarte sensibil i specific, n ceea ce priveste decelarea antigenului (reacia evideniaz cantiti foarte mici de antigen, acesta participnd la formarea agregatelor, n cantiti mult mai mici dect anticorpii). Reacii de precipitare: 1. Mediu lichid: precipitare n amestec (floculare): metoda Ramon; precipitare n inel: reacia Uhlenhuth i reacia Ascoli; precipitarea n tub capilar: decelarea proteinei C reactive; pe lama: test Ferreira: 2. Mediu solid: difuzie simpl: unidimensional (metoda Oudin) i bidimensional (metoda Mancini- Carbonara- Heremans); difuzie dubl: unidimensional (Oakley - Fulthorpe) i bidimensional: radial (Ouchterloni) i linear: n unghi de 90 (Elek); difuzie combinat cu migrare n cmp electric: - imunelectroforeza; - contraimunelectroforeza, - electroimunodifuzia. Aplicabilitate n domeniul imunologiei: - studierea unor antigene de provenien bacterian (toxine, componente proteice sau polizaharidice bacteriene); - antigene virale (antigen HBs); - evidenierea unor antigene (proteine patologice) n serul bolnavilor, cu afeciuni inflamatorii (proteina C reactiv), neoplazice (alfa feto proteina). Reacia de precipitare n mediu lichid: 1. Reactia de precipitare n amestec (R. de floculare): Metoda Ramon: - se pun n contact, n amestec, cantiti fixe de antigen cu cantiti variabile de anticorp; - metoda se aplic n scopul stabilirii puterii antigenice a unei toxine (titrul), utiliznd cantiti variabile de anticorp cu titrul cunoscut;

- din serul antidifteric (anticorpi), cu titrul cunoscut (100 UA/mL), se fac diluii succesive n ser fiziologic steril, n volum de 1 mL; - peste aceste diluii se adauga toxina difteric, n cantitate fix: 1 mL; Exemplu: Stabilirea titrului toxinei difterice, pentru obinerea de seruri imune/antidifterice, n tratamentul difteriei. Metoda de lucru: titrarea toxinei difterice: Tub 1 Tub 2 Tub 3 Tub 4 Tub 5 Tub 6 Ser antidifteric 0,1 mL 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 100 UA/mL NaCl 8,5% 0,9 mL 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Toxina difteric de titrat 1 mL 1 1 1 1 1 - se folosesc pipete diferite pentru fiecare reactant; - se agit eprubetele i se introduc n baie de ap la 52C; - se urmrete reacia la fiecare 3 min pentru a prinde momentul pozitivrii ei: prima eprubet unde a aparut reacia de floculare: unirea unor cantiti echivalente de antigen i anticorp; - dac flocularea a aprut n tubul nr. 4, amestecul de reacie conine 0,4 mL ser antidifteric, adic 40 UA (uniti antitoxice). n acest tub, 1 ml de toxin conine o cantitate echivalent de 40 U (uniti floculante Limes). Deci titrul toxinei difterice este de 40 uniti floculante Limes. 2. Reacia de precipitare n inel: Principiu: antigenul i anticorpul se pun n contact astfel nct s nu se amestece; la interfaa ntre cele 2 lichide, unde se creeaz o proporie optim ntre concentraia de antigen i anticorp, apare un inel de precipitare. Reacia Uhlenhut: - reacia se folosete pentru identificarea naturii, provenienei unor proteine (rol de antigen), n medicina legal; - se poate preciza dac o pat de snge este de proveniena uman sau nu; - n industria alimentar, pentru stabilirea provenienei crnii; - antigenul se extrage din sngele recoltat (de pe rufe, haine etc), prin splare n ser fiziologic, centrifugare; - ntr-o serie de eprubete se repartizeaz antigenul n diluii diferite i se adaug ser antiprotein uman, astfel nct cele dou componente s nu se amestece; - se folosesc tuburi martor: martor sigur (+)/ser uman i martor sigur (-)/ser de cal: Tub nr Antigen nediluat Antigen diluat 1/100 Antigen diluat 1/5000 Ser normal de cal diluat 1/1000 Ser normal de om diluat 1/1000 Ser precipitant anti- protein uman 1 0,7 0,3 2 0,7 0,3 3 0,7 0,3 4 M(-) 0,7 0,3 5M(+) 0,7 0,3

Reacia Ascoli: - reacia se utilizeaz pentru diagnosticul retrospectiv al antraxului; - din organele animalului suspectat a fi decedat de antrax se extrage antigenul; - antigenul este format dintr-o fraciune proteic termostabil, din compoziia bacilului crbunos (Bacillus anthracis). Extragerea antigenului: - fragmentul de organ se mojareaz n soluie de ser fiziologic steril, n proporie de 1/5; - se adaug cteva picturi de acid acetic i se fierbe timp de 5- 10 min; - se decanteaz i se neutralizeaz supernatantul cu cteva picturi de NaOH; - se filtreaz prin hrtie de filtru, - filtratul conine toxina termostabil, care se folosete drept antigen: Nr. tub 1 2 M(-) 3 M(-) Ser anticarbunos 0,5 0,5 Antigen preparat 0,5 0,5 Ser fiziologic 0,5 Ser normal de cal 0,5 - se menin eprubetele 5 - 10 min la temperatura camerei, dup care se face citirea reaciei: - reactie (+): apariia unui inel de precipitare n tubul nr. 1; - n eprubetele 2 i 3, ca martori negativi, inelul lipsete. Determinarea grupului streptococic: Izolarea din exsudat faringian (sau alte produse patologice) a altor streptococi beta hemolitici (test bacitracin negativ) dect streptococul beta hemolitic de grup A (test bacitracin pozitiv, Streptococcus pyogenes), necesit o reacie de determinare a apartenenei de grup, a acestora. Metoda Lancefield implic: - extracia acid a antigenului streptococic de grup (fraciunea polizaharidic specific de grup) prin tratarea cu HCl a sedimentului culturii n bulion a tulpinii de testat; - punerea n contact a antigenului preparat (fr s se amestece) cu antiseruri specifice de grup (A, B, C, F, G, preparate pe iepuri), n tuburi cu lumen foarte ngust. - meninerea tuburilor la temperatura camerei, timp de 10 min, pn cnd va aprea un inel de precipitare la interfaa dintre antigen i anticorpul corespunzator. Tubul n care va aprea inelul de precipitare va indica apartenena de grup a streptococului, cunoscnd antiserul respectiv. 3. Reacia de precipitare n tuburi capilare Principiu: reacia se execut punnd n contact antigenul cu anticorpul n tuburi capilare (vrfuri de pipete Pasteur). Determinarea tipului M streptococic: - anumite tipuri M de streptococ beta hemolitic grup A, determin complicaii renale i cardiace, secundare unei infecii acute streptococice; - antigenul proteic M din peretele bacterian se obine prin tehnica extraciei acide (HCl) la cald, din sedimentul culturii n bulion glucozat 2%o;

- extractul proteic se pune n contact (prin absorbie) cu cantiti egale de seruri antistreptococice de tip M (preparate pe iepuri), n tuburi capilare; - capetele se etaneizeaz cu plastilin; - se termostateaz 2 ore la 37C, apoi se las peste noapte la frigider; - apariia unui precipitat abundent la baza unuia din tuburi, indic apartenena de tip (antiserul respectiv, cunoscut). Determinarea unor proteine patologice n serul bolnavilor (proteina C reactiv): - n faza acut a unui proces inflamator; - ntr- un proces necrotic sau proces neoplazic. n serul bolnavilor apare o protein cu caracter patologic, numit proteina C reactiv. Aceasta este pus n eviden prin reacia de precipitare: se pun n contact, n tuburi capilare, cantiti egale de ser de bolnav i ser antiproteina C reactiv. Prezena unui precipitat indic o reacie pozitiv, cantitatea de precipitat fiind proporional cu intensitatea reaciei. Reacii de precipitare n mediu gelifiat (metode cantitative) Principiu: reacia are loc ntr- un mediu gelifiat (0,8 - 1,25% agar), n care moleculele de antigen i anticorp pot migra prin porii gelului, cu coninut mare de ap. La locul de ntlnire a unor anumite cantiti de antigen i anticorp corespunztor, apare o linie vizibil de precipitare. a. Difuzia simpl (metoda Mancini) Aplicaii: - imunograma (determinarea cantitativ n serul bolnavilor a unor fraciuni proteinice, cum ar fi IgA, IgM, IgG); - determinarea fraciunilor complementului n serul uman. Tehnica de lucru: - n plci de polistiren cu diametrul de 5 cm, se toarn gel de agar n care a fost nglobat, ntr-o cantitate optim, antiserul (Ac) corespunzator tipului de component proteic (Ag) care se dorete a fi identificat (ser anti- IgA, anti- IgM, anti- IgG, anticomplement); - n agar se efectueaz godeuri de 2 mm (cu un tub metalic) n form de rozet, respectnd distana optim ntre ele; - n godeuri se introduc cte 5 l din preparatul proteic de identificat (seruri de bolnav, ce conin cantiti necunoscute de Ag corespunztor Ac nglobat n gel), cu ajutorul unei micropipete; - n godeul central se introduc 5 l de ser uman de referin (cantitate cunoscut dintrun Ag cunoscut, al carui Ac corespunztor este nglobat n gel); - placuele se termostateaz la 37C timp de 24 ore pentru IgG, complement i 48 ore pentru celelalte componente (Ig A, IgM); - din godeuri va migra antigenul (cantitate cruia se dorete a fi calculat), care va ntlni anti-serul corespunztor, nglobat n gel; - dupa termostatare, n jurul godeurilor apar cercuri concentrice, de diametre variabile, formate din linii de precipitare;

- se masoar diametrul zonelor de precipitare i se compar cu diametrul dat de serul standard, cu concentraie cunoscut, din centrul plcii; - astfel se poate stabili cantitatea de Ag (IgA, IgG, IgM sau complement), utiliznd tabele ntocmite pe baza unor experimentri pe numeroase seruri, care stabilesc raportul dintre diametrul zonelor de precipitare i cantitatea de Ig sau complemnt corespunztoare. b. Difuzia dubl b.1. Difuzia dubl radial (metoda Ouchterlony) Principiu: antigenul i anticorpul se introduc n godeuri fa n fa, vor migra n gel i la locul de ntlnire se formeaz linii de precipitare vizibile (metod calitativ nu i cantitativ) Tehnica de lucru: - gelul de agaroz se aplic pe lame de sticla, bine degresate; - n godeul central se pune Ac cunoscut, corespunztor Ag cunoscut din godeurile martor, dispuse fa n fa; - n godeurile marginale, dispuse n rozet, se introduce antigenul (2 martori cu Ag cunoscut, corespunztor Ac din godeul central i 6 seruri de bolnav, de verificat dac conin sau nu, acelai Ag, ca i martorii); - la locul de ntlnire (Ag - Ac corespunztor) se formeaz o linie de precipitare; - este dubl difuzia, deoarece migreaz i Ac (godeu central) i Ag (godeuri marginale); - godeul care conine serul de bolnav, prezint sau nu linie de precipitare la mijlocul distanei fa de godeul central (Ac), dac conine sau nu Ag similar godeului martor (Ag cunoscut i corespunztor Ac din godeul central). Aplicatii: - determinarea tipului M streptococic; - proteina C reactiv, - - feto- proteina. b.2. Difuzia dubl (metoda Elek) Metoda se aplic n bacteriologie pentru determinarea toxinogenezei bacililor difterici, izolai din exsudate nazo - faringiene. Tehnica delucru: - n plac Petri cu geloz se practic un san de 6/1,5 cm n centrul acesteia; - se scoate geloza, se toarn un strat subire de geloz cald, se rcete; - se toarn n san ser anti - toxin difteric; -se acoper sanul cu geloz cldu, far a inactiva termic serul antidifteric, se rcete geloza; - se nsmneaz tulpini de bacil difteric (Corynebacterium diphteriae) perpendicular pe direcia sanului, oprindu-se la 0,5 cm de marginea acestuia; - se nsmneaz i un martor sigur (+): tulpina de bacil difteric sigur productoare de toxin difteric (tulpina toxigen); - se termostateaz la 37C, 24 ore; - tulpinile de bacil difteric toxigene, vor sintetiza toxina, la cald, aceasta va difuza n gel; - din sanul practicat n geloza, vor difuza anticorpii specifici anti - toxin difteric;

- la locul de ntlnire a antigenului cu anticorpul, se formeaz linii de precipitare, sub forma de musti/specifice; - apariia n unghiul format ntre tulpina de testat i sanul cu ser antitoxin difteric a liniilor de precipitare, arat c tulpina este toxigen, la fel cu tulpina martor, sigur productoare de toxin difteric. Imunelectroforeza (IEF) Principiu: asocierea electroforezei n gel (separarea antigenelor n funcie de ncrctura lor electric) cu difuzia dubl (precipitarea specific a antigenelor de ctre anticorpi) are ca rezultat formarea unor arcuri de precipitare specifice, corespunztoare antigenelor din proba migrat. IEF permite: - separarea i determinarea numrului de constitueni dintr-un amestec de antigene; - definirea antigenelor pe baza mobilitii electroforetice; - izolarea din gel a antigenului urmrit pentru a realiza o analiz imunochimic mai amanunit. Contraimunelectroforeza (CIE) Principiu: proteinele cu migrare anodic sunt precipitate ntr-un cmp electric de ctre anticorpii specifici. CIE reprezint o dubl difuzie la care deplasarea antigenului i anticorpului este accelerat de un cmp electric. La pH 8,2 - 8,6 n gelul de agar, anticorpii ncrcai slab negativ se deplaseaz spre catod, iar antigenele cu sarcin electric mai mare spre anod. Aceste deplasri se fac n sens contrar, iar difuzia n alte direcii dect cea a cmpului electric este impiedicat. Indicaii: - decelarea sau identificarea unor proteine serice patologice (alfa - feto - proteina, produii D i E de degradare ai fibrinogenului); - antigene bacteriene Electroimunodifuzia (EID) Se realizeaz prin electroforeza Ag n strat de gel ce conine Ac monospecifici. Precipitatul Ag - Ac apare sub form de rachet (con) a crui nlime este direct proporional cu concentraia de Ag i invers proporional cu cea de Ac. Reacii de aglutinare Aglutinarea reprezint agregarea de particule prin Ac. Ac reacioneaz cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex) i determin aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valena Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinani dect cei care aparin clasei IgG), densitatea determinanilor antigenici de la suprafaa particulei, fora ionic a mediului n care are loc reacia. Aglutinarea se datoreaz scderii forelor de respingere electrostatice dintre particule i creieri unor puni de legtur prin intermediul Ac. Reacia de aglutinare are sensibilitatea mai mare dect reacia de precipitare (Ag este o particul i nu o molecul solubil), excesul de Ag nu inhib reacia, concentraiile mari de Ac pot inhiba reacia i produce fenomenul de prozon, raportul ntre Ag - Ac este tot n favoarea Ac (ca i la

precipitare). Ac reacioneaz numai cu determinantul Ag specific. Alturi de Ac aglutinani exist Ac neaglutinani (blocani sau incomplei) i Ac care aglutineaz numai la rece (+4oC). Reacia de aglutinare direct Aglutinarea direct (aglutinarea simpl, clasic) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de ctre Ac specifici (determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacterian). Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescut prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reaciei n mediul cu vscozitate crescut. Reacia de aglutinare indirect Aglutinarea indirect (pasiv) este o reacie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii formolizate, stafilococ, protein A, latex, cristale de colesterol) ncrcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de ctre Ac, respectiv Ag omolog din prob. Hemagluinarea pasiv este o metod deosebit de sensibil de cercetare a Ac serici, imaginat de Gzegibes i Sehon. Ac care nu pot produce reacii vizibile cu Ag, deoarece se gsesc n ser n cantiti reduse, pot fi evideniai prin metode de aglutinare pasiv, crescnd cantitatea de Ag prin absorbia acestora pe un substrat inert. n acest fel, cantiti mici de Ac produc aglutinri vizibile. Reacia de inhibare a aglutinrii Reacia de aglutinare a particulelor ncrcate cu Ag solubil este inhibat n cazul n care Ac reacioneaz n prealabil cu Ag omolog (diagnosticul imunologic de sarcin prin inhibarea aglutinrii hematiilor sau prin inhibarea aglutinrii latexului). Diferena principal ntre hemaglutinarea pasiv i tehnica de inhibare a hemaglutinrii este aceea c n prima metod (hemaglutinarea) se investigheaz prezena Ac, n timp ce n a doua (inhibarea) se investigheaz prezena Ag. Reacia de aglutinare mediat de anticorpi anti-imunoglobuline Ac anti-imunoglobuline aglutineaz particule ncrcate (natural sau artificial) cu Ac (decelarea FR prin reacia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incomplei fixai la suprafaa hematiilor prin reacia coombs). Reacia de aglutinare poate fi calitativ de screening (latex-FR, reacia coombs) sau cantitativ (reacia Waaler-Rose, reacia Coombs). Reacia Latex-FR este mai sensibil, iar reacia Waaler-Rose este mai specific. Reaciile de aglutinare utilizate n microbiologic Aglutinarea reprezint agregarea de particule prin Ac. Ac reacioneaz cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex) i determin aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valena Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinani dect cei care aparin clasei IgG), densitatea determinanilor antigenici de la suprafaa particulei, fora ionic a mediului n care are loc reacia. Aglutinarea se datoreaz scderii forelor de respingere electrostatice dintre particule i creieri unor puni de legtur prin intermediul Ac. Reacia de aglutinare are sensibilitatea mai mare dect reacia de precipitare (Ag este o particul i nu o molecul solubil), excesul de Ag nu inhib reacia, concentraiile mari de Ac pot inhiba reacia i

produce fenomenul de prozon, raportul ntre Ag - Ac este tot n favoarea Ac (ca i la precipitare). Ac reacioneaz numai cu determinantul Ag specific. Alturi de Ac aglutinani exist Ac neaglutinani (blocani sau incomplei) i Ac care aglutineaz numai la rece (+4oC). Exist mai multe tipuri de aglutinare. Reacia de aglutinare direct Aglutinarea direct (aglutinarea simpl, clasic) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de ctre Ac specifici (determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacterian). Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescut prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reaciei n mediul cu vscozitate crescut. Reacia de aglutinare indirect Aglutinarea indirect (pasiv) este o reacie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii formolizate, stafilococ, protein A, latex, cristale de colesterol) ncrcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de ctre Ac, respectiv Ag omolog din prob. Hemagluinarea pasiv este o metod deosebit de sensibil de cercetarea Ac serici, imaginat de Gzegibes i Sehon. Ac care nu pot produce reacii vizibile cu Ag deoarece se gsesc n ser n cantiti reduse, pot fi evideniai prin metode de aglutinare pasiv, crescnd cantitatea de Ag prin absorbia acestora pe un substrat inert. n acest fel, cantiti mici de Ac produc aglutinri vizibile. Reacia de inhibare a aglutinrii Reacia de aglutinare a particulelor ncrcate cu Ag solubil este inhibat n cazul n care Ac reacioneaz n prealabil cu Ag omolog (diagnosticul imunologic de sarcin prin inhibarea aglutinrii hematiilor sau prin inhibarea aglutinrii latexului). Diferena principal ntre hemaglutinarea pasiv i tehnica de inhibare a hemaglutinrii este aceea c n prima metod (hemaglutinarea) se investigheaz prezena Ac, n timp ce n a doua (inhibarea) se investigheaz prezena Ag. Reacia de aglutinare mediat de anticorpi anti-imunoglobuline Ac anti-imunoglobuline aglutineaz particule ncrcate (natural sau artificial) cu Ac (decelarea FR prin reacia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incomplei fixai la suprafaa hematiilor prin reacia coombs). Reacia de aglutinare poate fi calitativ de screening (latex-FR, reacia coombs) sau cantitativ (reacia Waaler-Rose, reacia Coombs). Reacia Latex-FR este mai sensibil, iar reacia Waaler-Rose este mai specific. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul microbiologic direct Aglutinarea pe lam sau n tuburi pentru confirmare se face: - pentru identificarea tulpinii bacteriene implicate etiologic n respectiva boal infecioas ndeosebi pentru identificarea unei tulpini de enterobacteriaceae (Shigella spp., E. coli etc.) sau Vibrio spp, dup cultivarea p.p. pe diferite medii. Materiale necesare: - colonii izolate (colonii de tip S);

soluie salin fiziologic; - Ac cunoscui fa de Ag pe care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz); - lame de microscop; amestec dezinfectant etc. Tehnica de lucru: - pe o lam se pune o pictur de soluie salin fiziologic; - se descrc n aceasta un fragment din colonia de identificat; - se amestec pn se obine o suspensie tulbure; - dac pictura devine limpede, cu grunji, nseamn c apare autoaglutinare" i nu mai poate s fie identificat tulpina prin reacie Ag - Ac (ar putea fi, de ex. o tulpin din colonie de tip R, care i-a modificat structura); - dac suspensia rmne tulbure, pe aceeai lam, la cealalt extremitate, se pune o pictur de ser cu Ac cunoscui (polivaleni); - se descrc un fragment din colonia de identificat n pictura de ser cu Ac i se amestec pn se obine o suspensie tulbure; - prin nclinare, n mai multe direcii, se favorizeaz contactul dintre Ag - Ac mici i apar complexe mici, apoi reele de complexe Ag Ac, apar grunji de aglutinare; - se citete reacia pe un fond negru; - lamele pe care a fost executat reacia de aglutinare conin microorganisme vii, de aceea trebuie s fie introduse n amestec dezinfectant, dup examinarea rezultatelor reaciei. Pentru identificarea grupului streptococic putem face reacii de aglutinare indirect, la fel ca i pentru detectarea unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirect se pot identific i exotoxinele. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile de aglutinare utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de cercetat dar i stabilirea titrului. Totui, exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative. Aglutinarea pe lam Reacia de aglutinare pe lam (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat n istoria medicinii. Materiale necesare: lame de microscop; Ag brucelos inactivat (colorat n violet); ser de cercetat. Tehnica de lucru: pe lam de microscop se depune o pictur din soluia de Ag brucelos i o pictur de ser de cercetat; se amestec i se omogeniz cei 2 reactani. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor. Reacia pozitiv pe lam trebuie confirmat prin aglutinare n tuburi. Aglutinarea n tuburi

Tehnica poate fi folosit n diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), diagnosticul serologic al infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul serologic al febrei tifoide (reacie Widal). Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice sunt necesare: seruri de la pacieni (recoltate n dinamic, la 7-10 zile distan"); baie de ap; Ag cunoscute (Ag O i Ag H); - 4 iruri de eprubete (2 iruri pentru anti-O, pentru serul recoltat de la pacient astzi" i dou iruri pentru titrarea Ac anti-H, cte dou variante, n dinamic, pentru fiecare Ag, respectiv pentru fiecare tip de Ac); se dilueaz serul de cercetat (diluii binare: 1/40; 1/80, 1/180); se pregtete pentru fiecare ir un tub martor (tampon pentru diluie + Ag, fr ser); - se incubeaz cele 2 iruri de tuburi cu Ag - O timp de 20 ore la 52C iar cele 2 iruri de tuburi cu Ag - H 2 ore la 52C plus 10 minute la temperatura camerei; - evaluarea se face pentru fiecare tub n parte, ncepnd de la diluiile mari, prin examinare i uoar agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezint aglutinare vizibil stabilete titrul reaciei (pentru fiecare ir de tuburi, n parte). Un titru care crete de 4 ori n dinamic" stabilete diagnosticul. - n cazul unor pacieni care se afl n convalescen sau n cazul persoanelor care ar putea fi purttori se ncerc s se stabileasc titrul Ac anti-Vi (prin aglutinare sau prin hemaglutinare pasiv). Reacii antigen-anticorp care nu sunt vizibile, direct In Reaciile Ag-Ac care nu pot fi evaluate direct, implic fr utilizarea unui artificiu tehnic" (utilizare de sistem hemolitic, alt sistem indicator, marcare cu enzime). Reacia de neutralizare Antigenul este reprezentat de un imunogen cu proprieti biologice (toxin, enzim, virus). Ac specifici determin (in vivo sau in vitro) blocarea acestor proprieti. Reacia de neutralizare depinde de aviditatea Ac, adic de viteza cu care Ac se poate combina cu Ag i de gradul de stabilitate a legturii Ag - Ac. Neutralizarea efectelor biologice ale Ag se constat numai n cazul n care situsul (toxic sau enzimatic) responsabil de activitatea biologic a Ag este identic cu situsul Ag. n laborator, acest tip de reacie se utilizeaz pentru determinarea Ac anti-streptolizin O prin reacia ASLO (etapa final de vizualizare este hemoliza) i pentru identificarea unor virusuri. Testul ASLO este o reacie de neutralizare (inhibare a hemolizei). Se bazeaz pe proprietatea streptolizinei de a produce liza hematiilor de diverse specii. Reacii ce utilizeaz complement n laboratorul clinic se execut patru reacii de acest tip: Reacia de fixare a complementului Reacia de fixare a complementului (RFC), hemoliz direct. J. Bordet a imaginat o metod de vizualizare indirect a unei reacii Ag - Ac, folosind complement (C) i un sistem indicator (hemolitic).Complexul Ag - Ac fixeaz C, iar hematiile sensibilizate adugate ulterior rmn intacte (absena hemolizei nseamn reacie pozitiv), n lipsa

complexului Ag - Ac specific (iniial), C se fixeaz pe hematiile sensibilizate (sistemul indicator) producnd hemoliza (hemoliza nseamn reacie negativ). Fixarea C pe complexul Ag - Ac este evideniat indirect prin absena hemolizei sistemului indicator din a doua etap a reaciei (ser anti - hematii berbec-hematii berbec). Activitatea anticomplement se datoreaz prezenei complexelor Ag - Ac preformate, agregatelor de Ig i a altor substane care pot activa calea clasic sau calea alternativ de activare a C. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive n prezena complementului Testul este analog testului de inhibare a hemaglutinrii, deosebirea esenial const n desfurarea reaciei n prezena C. n cazul n care n prima etap a reaciei se formeaz complexul Ag - Ac nu mai rmn disponibili Ac care s reacioneze cu hematiile sensibilizate, astfel nct n ultima etap, C nu este cuplat cu hematiile sensibilizate i acestea nu sunt lizate. n acest caz rezultatul testului este considerat pozitiv. n situaia n care nu se formeaz complexul Ag - Ac, Ac liberi reacioneaz cu hematiile sensibilizate i are loc liza acestora, rezultatul testului este considerat negativ. n testul de imunohemoliz pasiv, interpretarea rezultatului se face n funcie de gradul hemolizei obinute, lundu-se n considerare dimensiunile sedimentului de hematii i intensitatea culorii supernatantului. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive n prezena C investigheaz prezena Ag n ser, n timp ce testul clasic investigheaz prezena Ac n ser. Testul de imunohemoliz pasiv n prezena complementului Ca i n cazul testului de hemaglutinare pasiv, Ag este fixat pe hematie i reacioneaz cu Ac specific, formndu-se n acest fel complexe Ag - Ac. Realizarea acestui complex n prezena C determin liza hematiilor sensibilizate cu Ag. Determinarea imunohemolitic a complementului Se refer la reacia Ag - Ac numai n msura n care se folosete ca indicator sistemul hemolitic (hematii de berbec sensibilizate cu ser anti-hematii berbec). Reacia msoar activitatea hemolitic total a sistemului complement. Metoda are ca punct final hemoliza 50%. Citirea se face la spectrofotometru. Reacii cu reactivi marcai Detectarea, localizarea i identificarea antigenelor se poate realiza utiliznd anticorpi care recunosc i se leag specific de antigenele respective. Vizualizarea complexului Ag - Ac format poate fi realizat prin marcarea Ac. Marcarea Ac trebuie s ndeplineasc dou condiii: s permit detectarea unor cantiti infime de substan; s nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunztoare. n aceste reacii se utilizeaz Ag sau Ac marcai: izotiocianatul de fluorescein (produce strlucire caracteristic la examenul microscopic n lumina ultraviolet), izotopi radioactivi i enzime (au activitate asupra unui substrat-cromogen specific. Reacia de imunofluorescen n reacia de imunofluorescen (IF) unul dintre reactani (Ag sau Ac de cercetat) trebuie s constituie o parte dintr-o structur biologic (celul sau esut), reactivul marcat cu fluorocrom relevnd reacia Ag - Ac. Vizualizarea complexului Ag - Ac format poate fi realizat prin marcarea Ac. Substanele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina

incident de diferite lungimi de und i emit o lumin vizibil care este n funcie de fluorocromul utilizat: albastr, verde, galben, roie sau alb. Reacia se poate realiza direct, indirect, cu fixarea complementului Reacia de imunofluorescen direct Metoda direct (Coons) permite identificarea Ag specifice n preparate cu ajutorul conjugatului fluorescent anti-Ac. Se folosesc seciuni de esuturi, seruri fluorescente antiIg i anti-C. Principiu: identificarea antigenelor necunoscute montate pe lam cu ajutorul anticorpilor cunoscui marcai fluorocrom Fluorocromii: - emit fluorescen dac se expun la raze UV; - izotiocianatul de fluorescein (galben-verzui), rodamina (portocalie); - preparatul se examineaz la microscopul cu fluorescen; - puncte fluorescente pe fond ntunecat: n preparatul examinat au fost prezente antigenele cutate (rezultat pozitiv); - absena punctelor fluorescente: n preparat nu au fost prezente antigenele cutate (rezultat negativ). Dezavantaje: - preparatele sunt instabile; - nu pot fi pstrate n timp; - este necesar microscop special. Metoda imunoperoxidazic (IPO) - marcare enzimatic - peroxidaz (descompune peroxidul de hidrogen); - vizualizarea se realizeaz prin adugarea substratului cromogen - rezult un precipitat maroniu, insolubil, vizibil la microscopul optic; - se realizeaz la fel ca si RIF. Avantaje: - preparatele pot fi pstrate n timp; - nu este necesar microscop special. Reacia de imunofluorescen indirect Reacia de imunofluorescen indirect (IFI) vizualizeaz reacia Ag - Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac. Se folosete pentru detectarea Ac fixai pe Ag. Serul de bolnav se pune n contact cu un substrat celular (tisular). Urmeaz incubarea preparatului cu un ser antiglobulin uman marcat cu izotiocianat de fluorescein care vizualizeaz n lumin ultraviolet reacia Ag - Ac. Testul poate fi folosit att pentru determinarea Ag necunoscut cu ser imun cunoscut ct i pentru detectarea Ac necunoscui cu Ag cunoscut. Reacia de imunofluorescen cu fixarea complementului Complexul Ag - Ac fixeaz C. Metoda fixrii C pe seciuni de esut este derivat din metoda indirect prin adugarea C, apoi a serului marcat care va vizualiza complexul Ag - Ac - C.

Analiza radioimunologic Analiza radioimunologic (RIA) este o tehnic de determinare cantitativ a unui numr mare de substane prezente n lichidele biologice n cantitate foarte mic. RIA este o tehnic obiectiv, cu mare sensibilitate, parial automatizat, aparatur costisitoare (echipament nuclear), reactivi scumpi, cu durat de utilizare scurt, personal cu calificare special, supus unei legislaii speciale (radioizotopi). Analiza imunoenzimatic n 1966, Avrameas i Uriel introduc n histochimie marcarea enzimatic cu peroxidaz, iar n 1971, Van Weemen i independent Engwall i Perlmann utilizeaz enzimele ca marker pentru reaciile Ag - Ac. Analiza imunoenzimatic (EIA) se poate realiza n sistem omogen sau eterogen. Reacia imunoenzimatic n sistem omogen const n competiia pentru Ac ntre Ag marcat enzimatic i Ac de determinat (din prob). Activitatea enzimatic este invers proporional cu concentraia Ag din prob; Reacia imunoenzimatic n sistem eterogen poate fi utilizat att pentru determinarea Ac ct i a Ag. Activitatea enzimatic a conjugatului nu este influenat de reacia Ag - Ac i necesit o etap de separare. Avantajele EIA: obiectiv, poate fi automatizat, folosete reactivi cu valabilitate convenabil, aparatura este simpl, are sensibilitate crescut, nu este supus unei legislaii restrictive ca RIA. Tehnica ELISA n cazul utilizrii sistemelor de faz solid pentru separarea moleculelor libere i acelor marcate, tehnica este denumit ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatic ELISA este bazat pe reacia Ag - Ac. Sistemul de analiz const din mai multe reacii: - Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plci de plastic cu godeuri); - Ag sau Ac din proba de testat se leag specific de reactantul imobilizat; - reactantul marcat enzimatic reacioneaz cu complexul reactant imobilizat; - Ag (sau Ac) din prob. Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzim este activ att imunologic ct i enzimatic i reacioneaz att cu Ag (sau Ac) din prob imobilizat pe suportul solid ct i cu substratul corespunztor enzimei. Vizualizarea reaciei dintre reactantul enzimatic i complexul Ag - Ac iniial se realizeaz prin adugarea unui substrat corespunztor enzimei utilizate. Formarea complexului este identificat prin reacia de culoare care apare la adugarea substratului specific (pnitrofenil fosfat disodic pentru fosfataza alcalin i tetrametilbenzidin pentru peroxidaz). Intensitatea culorii indic prezena sau absena Ag, respectiv Ac din prob (se citete spectrofotometric folosind un cititor de plci ELISA: Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenierea Ac (boli infecioase, autoimune) sau a Ag (boli infecioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie). Tehnica Western Blot

Tehnica cuprinde trei etape: separarea Ag prin electroforez, transferul Ag, testarea probei de ser utiliznd tehnica RIA sau ELISA. Numai partea a treia este efectuat n laboratoarele clinice. Tehnica WB este disponibil sub form de truse comerciale.
Reacia ASLO

Se poate utiliza: - n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice; - pentru confirmarea etiologiei bolilor poststreptococice; - pentru determinarea titrului Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dac n serul pacientului exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Prin diluii efectuate n mai multe tuburi, se determin titrul ASLO. Materiale necesare: seruri de "cercetat (recoltate la interval de 7-10 zile); SLO liofilizat, snge defibrinat de iepure; soluie salin izoton; soluie de rivanol 0,3%; eprubete; pipete gradate foarte curate; baie de ap; centrifug Tehnica de lucru: se omogenizm se omogenizeaz suspensia de hematii; se dilueaz serul 1/10; se menine 30 minute la 56C; se fac diluiile necesare i se repartizeaz serul diluat n tuburi.; se adug o cantitate constant de SLO; rezultatul reaciei nu se vizualizeaz reaciei n aceast etap, n etapa a doua se agit tuburile (pentru omogenizare); se in 15 minute la 37C; se adug suspensia de hematii (0,5 ml n fiecare tub); se agit pentru omogenizare; se incubeaz 45 minute, la 37C; se centrifug i se menin tuburile la frigider, pn a doua zi. Interpretare: Prin respectarea protocolului, titrul potenial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333 etc. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. n ara noastr se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist i alte teste serologice care pot fi utilizate. Testarea imunitii de tip celular Investigarea pacientului RIC include: discuia cu pacientul i anamnez (medicaie primit, momentul debutului suferinei, vaccinri efectuate, infecii n antecedente);

examenul clinic; examenul de laborator (numrul elementelor figurate, formula leucocitar, frotiul din sngele periferic, VSH, ali reactani de faz acut etc., studiul subpopulaiilor limfocitare din punct de vedere numeric i funcional, determinarea numrului de celule formatoare de Ac fa de Ag timo-dependente, studiul funciei celulelor fagocitare, evaluarea activitii citotoxice a celulelor NK i K, studiul secreiei de citokine etc.), teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimuleaz RIC; este recomandat o baterie" de Ag, patru-cinci din Ag prezentate n parantez (extras din virusul urlian, fitohemaglutinin, lizat din cultur de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitin, tuberculin). IDR la PPD (IDR Mantoux) Testu IDR este destinat depistrii tuberculozei. Principiu: Tuberculina reprezint un amestec de Ag proteice micobacteriene, utilizat pentru identificarea gazdelor infectate. Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR la PPD (derivat proteic purificat de tuberculin), mpreun cu alte IDR (cu alte Ag, provenind de la alte microorganisme cu care presupunem c respectiva gazd s-a ntlnit", deja), pentru evaluarea reactivitii n cadrul RIC. Dac o persoan este infectat cu germeni din grupul Mycobacierium tuberculosis, urmeaz sensibilizarea i proliferarea LT. IDR la PPD stimuleaz LT i RIC (inclusiv hipersensibilitatea de tip IV). Rezult vasodilataie, edem i infiltrat cu LT, bazofile, monocite, neutrofile. Se cunoate c reacia maxim este la circa 48 ore. Aria induraiei reflect HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacie pozitiv. Materiale i reactivi necesari: seringi cu gradaii la 0,1 ml; PPD n fiole cu 2 UI/doz (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doz; antiseptic. Tehnica de lucru (IDR Mantoux): - se controleaz fiola; - se agit energic pentru omogenizarea PPD; - se pregtete seringa i se aspir o cantitate suficient de produs pentru a putea elimina bule de aer i a fi siguri c vom injecta i.d. 0,1 ml, fix; - se antiseptizeaz cu alcool medicinal (3 minute) o zon situat pe faa anterioar a antebraului stng, n treimea medie; - se ptrunde acul aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul n sus, pentru a ne situa n derm; - se injecteaz strict 0,1 ml; - dac injectarea a fost corect, apare o bul uor denivelat cu diametru de circa 5 mm. Citirea rezultatului: La persoanele infectate, la locul injectrii poate aprea o reacie (eritem-edem-induraie) dup circa 6 ore, fiind maxim la 48-72 ore. Totui, cel mai frecvent, citirea rezultatului se face la 72 ore, la lumina natural. Se recomand o prim citire la cel trziu 24 ore (pentru a surprinde HS de tip umoral fa de Ag inoculat, structur proteic), o a doua citire la 48 ore i citirea final la 72 de ore.

Se Msoar diametrul maxim" al zonei de infiltraie (induraie). Citirea reaciei este subiectiv, cu posibile variaii individuale, totui rmne un element important, care nu trebuie neglijat. Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o baterie" de Ag), dac de ex. rezultatul este negativ" (nu apare induraie) pentru oricare dintre cele 4-5 Ag folosite, presupunem faptul c subiectul respectiv este anergic n ceea ce privete RIC. Pentru investigarea infeciei cu M. tuberculosis, n ara noastr se consider drept pozitive reaciile cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistic a distribuiei valorilor pe eantioane reprezentative de subieci a artat c plasarea limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel mai bine pe cei neinfectai de cei infectai). O valoare mai mare de 10 mm recomand analize suplimentare i investigaii care s elimine riscul tuberculozei-boal, care necesit tratament. Interpretarea corect, n context clinic i epidemiologie revine membrilor reelei de pneumoftiziologie, conform algoritmului stabilit n Programul Naional de prevenire i control al TB. O induraie de 5 mm sau mai mult este considerat pozitiv la: - persoane infectate cu HIV; - un contact recent cu o persoan bolnav de TBC; - persoane cu modificri radiologice pulmonare de tip fibros ca rezultat al unei TBC anterioare; - pacienii transplantai; - persoane care sunt imunosupresate din alte cauze (cei care primesc echivalentul a 15 mg prednison/zi timp de 1 lun sau mai mult, cei care primesc tratament cu antagoniti de TNF-alfa.