Practica # 2: DIGESTION DE NUTRIENTES (AMILASA SALIVAL). UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUIMICA LAB.

METABOLISMO A

Daniel Ernesto Pabn Moreno Valentina Hernndez Espinosa

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RESUMEN: la practica consisti en la determinacin cualitativa de la actividad de la alfa-amilasa salival y los cambios en su actividad cuando es sometida a diferentes PHs y / o temperaturas. Para esto la prctica se dividi en tres partes, en la primera se realizaron pruebas cualitativas con Lugol, Fehling A y B, para ver la reaccin de la alfa amilasa. En la segunda parte se prob la actividad de la alfa amilasa ante los cambios de pH. Finalmente en la tercera parte se midi la actividad a la alfa amilasa al transcurrir el tiempo, cuando es sometida a diferentes temperaturas.

INTRODUCCION: Amilasa: La amilasa, denominada tambin sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilosa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples, se produce principalmente en las glndulas salivares(sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Alfa Amilasa: -Amilasa (Figura 1) (Nombre alternativos: 1,4--D-glucanoglucanohidrolasa; glucogenasa) Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos,

descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6.7 y 7.2.

Figura 1

Almidn: es una mezcla de dos polisacridos: amilosa (10-20%) y amilopectina (80-90%), ambos formados por unidades de glucosa. La amilosa (figura 2) es el producto de la condensacin de D-glucopiranosas por medio de enlaces glucosdicos a (1,4), que establece largas cadenas lineales con 200-2500 unidades y pesos moleculares hasta de un milln; es decir, la amilosa es una a-D(1,4)-glucana cuya unidad repetitiva es la a-maltosa. Tiene la facilidad de adquirir una conformacin tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de hlice consta de seis molculas de glucosa.

El licor de Fehling consiste en dos soluciones acuosas:

Sulfato cprico cristalizado, 35 g; agua destilada, hasta 1.000 ml. Sal de Seignette (tartrato mixto de potasio y sodio), 150 g; solucin de hidrxido de sodio al 40%, 3 g; agua, hasta 1.000 ml.

Ambas se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la precipitacin del hidrxido de cobre (II).

El objetivo del laboratorio fue determinar cualitativamente la actividad enzimtica de la -amilasa salival; asi mismo evaluar los efectos de pH y temperatura sobre esta.

Figura 2
MATERIALES Y METODOS Reaccin de Lugol: la reaccin del Lugol es un mtodo que se usa para identificar algunos polisacridos, como el almidn, el glucgeno y algunas dextrinas. El almidn en contacto con el reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta. Esa coloracin se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. por lo tanto, no es una verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta. - Bao termostatizado - Tubos de ensayo - Bao a 100oC - Papel de filtro - Embudo - Pipetas - Solucin de almidn al 0,2% (preparar en agua destilada calentando) - Solucin de Lugol (comercial) -Fehling A: 17,34 g CuSO4/100 ml agua (comercial) - Fehling B: (comercial) 173 g Tartrato sdico

Reactivo de Fehling: Es
una solucin descubierta por el qumico alemn vander Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores.

1. Pruebas cualitativas Se numeraron 4 tubos de ensayo y a cada uno se le agrego lo siguiente: TUBO TUBO TUBO TUBO 1 2 3 4 2ml de 2ml de 2ml de 2ml de almidn almidn almidn almidn + 4 + 1 ml + + 0,5 gotas de 0,5 ml ml de de Fehling de saliva Lugol A y 1ml saliva (diluido) de Fehling B. Luego de preparados los tubos se procedi a incubar el tubo 2 a 100C, el tubo 3 y 4 a 35C por 15 min, y el tubo 1 solo se observ su coloracin, se anoto resultado. Al tubo 2, se anoto resultado. Pasado el tiempo estipulado sele agrego al tubo 3, 4 gotas de Lugol, se anoto el resultado. Al tubo 4, se le agrego 1 ml de Fehling A y 1ml de Fehling B, sometiendo despus a 100C, hasta cambio de color, se anoto resultado.

pasado este tiempo se realizo pruebas de yodo, Fehling A y B a cada tubo. Se anotaron resultados.

3. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimtica. Se enumeraron tubos del 1 al 8, los cuales se distribuyeron de la siguiente manera: 1 2 3 4 5 6 7 8 saliva

2 ml de almidn

2ml de (diluida)

Agregados estos volmenes en cada tubo se procedi a llevarlos de a pareja a diferentes temperaturas de la siguiente manera: Tubos 1 y 5: Bao de hielo, por 15 min Tubos 2 y 6: Temperatura ambiente, por 15 min. Tubos 3 y 7: 37 C, por 15 min. Tubos 4 y 8: Ebullicin bao Mara, por 15 min.

2 .Efecto del PH sobre la amilasa salival Se enumeraron 3 tubos a los cuales se les agrego: TUBO 1 2ml de HCl + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida TUBO 2 2 ml de NaOH + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida TUBO 3 Agua destilada + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida

Terminado el tiempo estipulado, se procede a verter el contenido del tubo 5 (saliva), en el tubo 1 (almidn); esto se repiti de la misma manera entre cada pareja; luego se procede a dejar a sus respectivas temperaturas. Seguidamente en una placa multipocillo se procede a sacar muestras de cada tubo, cada minuto hasta completar 8 muestras; es decir 8 minutos; Finalmente estas muestras se someten a prueba con Lugol. Se observan los cambios y se anotaron resultados.

Se procedi a agitar y tomar PH de cada tubo, se anoto resultado. Ms tarde se sometieron a bao termosttico a 37 C por 15 min, y

RESULTADOS Y DISCUSIN 1. Pruebas cualitativas

TUBO 1 2ml de almidn + 4 gotas de Lugol (diluido)

TUBO 2 2ml de almidn + 1 ml de Fehling A y 1ml de Fehling B.

TUBO 3 2ml de almidn + 0,5 ml de saliva

TUBO 4 2ml de almidn + 0,5 ml de saliva

2ml de HCl + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida

2 ml de NaOH + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida

Agua destilada + 2ml de almidn + 2 ml de saliva diluida

Toma de pH TUBO 1 TUBO 2 Rojo. 12 TUBO 3 Verde. 7

Tubo 1: Se observo un color morado oscuro con tendencia a negro. Tubo 2: Se observo un color azul marino, sin cambios despus de calentar a 37 C, por 15 min. Tubo 3: Se observo un color amarillo quemado, con presencia de precipitado color marrn. Tubo 4: Se observo un cambio de color muy marcado en donde predominaron varias fases de colores naranjas y con presencia de precipitado. Discusin: en el tubo 1 se pudo verificar cualitativamente la presencia de almidn debido a su coloracin por accin del lugol, en el tubo 2 la prueba para la determinacin de azucares reductores fue negativa pues no se presento el color rojo propio de la oxidacin del yodo; en el tubo 4 por accin de la -amilasa que hidroliza los enlaces glucosdicos del almidn produciendo glucosa se puedo observar la presencia de azucares reductores presentndose un color rojo con precipitado. PEDIR FOTOS

pH

Azul. 1

Resultados despus de incubacin TUBO 1

Yodo Fehling A y Fehling B. Morado oscuro Azul fuerte, sin precipitado

TUBO 2
Morado claro 2 fases: -azul oscuro. -azul claro con precipitado

TUBO 3
Marrn oscuro Azul marino

2. Efecto del PH sobre la amilasa salival.

Discusin: como se pudo observar en el tubo 1 por prueba de yodo se da muestra de la presencia de polisacridos, pero no de azucares reductores pues el reactivo de fehling resulto negativo (color azul) con lo que se infiere que la -amilasa salival fue inhibida a pH 1. En el tubo 2 se comprueba la presencia de almidon por yodo (color morado) y la poca presencia de azucares reductores (fehling color azul claro con precipitado) por lo que la -amilasa salival tuvo una accin cataltica baja a pH 2. En el tubo 3 nuevamente se comprueba la presencia de polisacridos, y la inactivacin de la enzima -amilasa (color azul marino). Segn la teora la -amilasa posee mayor actividad cataltica a pH 7 por lo que este resultado pudo ser consecuencia de un artefacto o de la baja concentracin de -amilasa en la saliva extraida. PEDIR FOTOS

TUBO 1

TUBO 2

TUBO 3

3. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimtica.

BIBLIOGRAFIA Bello, L.A. y O. Paredes (1999) El almidn: lo comemos, pero no lo conocemos. Perspectivas, 50 (3): 2933. Erbil Y, Ozluk Y, Giri M, et al. (June 2007). Effect of lugol solution on thyroid gland blood flow and microvessel density in the patients with Graves' disease. J. Clin. Endocrinol. Metab. 92 (6): pp. 21829 Maton Anthea; Jean Hopkins, Charles William McLaughlin, Susan Johnson, Maryanna Quon Warner, David LaHart, Jill D. Wright. Human Biology and Health. Prentice Hall, 1993. Englewood Cliffs, Jason Mraz, Beyonce, New Jersey, USA. ISBN: 0-13-981176-1