UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS
TTULO: Caracterizacin de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo de arroz (Oryza sativa).

AUTORES:

MUOZ CIEZA, Harold ngel

PATROCINADOR:

Msc. Carmen Rosa Carreo Farfn

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO

MIEMBRO SECRETARIO

MIEMBRO VOCAL

JEFE CENTRO INVESTIGACION

JEFE DEPARTAMENTO

DECANO

Lambayeque, Febrero del 2008

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TTULO

: Caracterizacin de cepas nativas de Azospirillum spp y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo del arroz (Oryza sativa).

AUTORES

: GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio MUOZ CIEZA, Harold ngel

ASESOR

Msc. Carmen Rosa Carreo Farfn

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS OFICINA DE GRADOS Y TITULOS

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES 1. Ttulo del Proyecto Caracterizacin de cepas nativas de Azospirillum spp y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo del arroz (Oryza sativa). 2. Personal investigador 2.1 Autores: GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio MUOZ CIEZA, Harold ngel 2.2 Asesor: Msc. Carmen Rosa Carreo Farfn 3. Carrera profesional / Especialidad Biologa/ Microbiologa Parasitologa 4. Tipo de investigacin 4.1. De acuerdo al fin que se persigue Aplicada 4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin Experimental 5. Rgimen de investigacin Libre 6. Localidad e Institucin donde se desarrollar el Proyecto Lambayeque, Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas. Invernadero de la Facultad de Agronoma. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 7. Duracin del Proyecto 9 meses 8. Fechas probables de inicio y terminacin 8.1. Inicio: Noviembre 2008 8.2. Terminacin: Julio 2009

9. Cronograma de actividades 2008 - 2009 NOV FASE DE PLANEAMIENTO Revisin bibliogrfica Elaboracin del Proyecto Presentacin del Proyecto Aprobacin del Proyecto Implementacin del Proyecto FASE DE INVESTIGACIN Recoleccin de muestras Procesamiento de muestras Registro de datos Anlisis estadstico de datos FASE DE COMUNICACIN Anlisis de Interpretacin Elaboracin del informe Presentacin y sustentacin X X X X X X X X X X X X X X X X X X X DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL

ACTIVIDADES

10. Recursos disponibles 10.1 Personal Se contar con el personal encargado del servicio tcnico del Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 10.2. Equipos e Instrumentos
-

Autoclave marca FANEN, autoclave vertical mod. 415. Biorreactores tipo tanque Batch en flujo de aire descendente. Estufa marca PRECISIN SCIENTIFICO P.S 30 -110C. Horno marca THELCO. Temp Range to 200C. Microscopio L200 elctrico binocular marca ZEIS. Balanza analtica marca EXCELL BH 150. Cap: 150g DIv: 0.005g. Cocina elctrica marca CHARITO de una hornilla. Moledor manual marca CORONA. Acero inoxidable. pHmetro BIOCHEMICALS INSTRUMENTS S.R.L. Porttil con

compensacin automtica de Temperatura. Rango 0.0 a 14,0 pH, margen de error +/- 0.1.
-

Espectrofotmetro marca Gnesis Cmara Digital Pentax 8.2 megapixeles Memoria USB KINGTONS, 4 Gb. Computadora Pentium IV.

10.3. Material y Reactivos

-

Matraces de 250 mL Asas bacteriolgicas Reactivos para la tincin de Gram Tubos de vidrio (13 x100 mm y 15x 150 mm) Placas de Petri Pipetas de 1 mL y 10 mL Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Solucin salina fisiolgica estril. Viales Jeringas de 1 mL y 5 mL Esptula

10.4. Local Laboratorio de Microbiologa Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

11.0 Presupuesto
02.00 Bienes 02.06 Material de escritorio
-

S/. 2050,00 S/. 130,00

04 juegos de etiquetas 03 lpices marcador 04 millares de papel Bond A4 75 g 06 lapiceros 06 lpices 02 correctores de tinta 04 rollos de pabilo 03 cuadernos 03 cintas de embalaje 02.09 Material de Laboratorio S/. 570,00

Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) Agar medio infusin de papa (BMS) Agar nutritivo Agar Solucin salina fisiolgica estril Perxido de hidrgeno Placas de Petri Frascos de boca ancha Tubos de dilucin Tubos para pruebas bioqumicas Pipetas de 1 mL, 10 mL 04 asas bacteriolgicas Agitadores de Vidrio Caja de Lminas portaobjetos Caja de Lminas cubreobjetos Algodn Jeringas de 5 mL, 1 mL

02.14 Material de impresin

-

S/. 450,00

04 cartuchos de tinta para impresora en negro y a colores Memoria USB Kingston 4GB 02.16 Material fotogrfico S/. 900,00

Cmara digital Fotografas S/. 2000,000 S/. 800,00

03.00 Servicios 03.01 Pasajes y subvenciones

-

Movilidad a Lambayeque, 4 das por semana Movilidad a Chiclayo Pomalca y viceversa Internet Impresiones: tipeos en computadora, copias fotostticas Encuadernacin

03.15 Publicaciones
-

S/.300,00

Publicacin informacin total 6 ejemplares 03.24 Otros S/. 900,00

Procesado revelado de pelculas: Fotografas y diapositivas Biorreactor tanque aireado con flujo descendente Anlisis fsico-qumico del suelo S/. 4050,000

TOTAL 12. Financiacin

El Presente proyecto de investigacin ser autofinanciado con el apoyo de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Departamento Acadmico de Microbiologa y Parasitologa de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

II.

PLAN DE INVESTIGACIN

1. REALIDAD PROBLEMTICA

El arroz (Oryza sativa L.) es el alimento bsico para ms de la mitad de la poblacin mundial, y representa el segundo cereal con ms hectreas sembradas a nivel mundial despus del trigo. El Per ocupa la posicin 14 en produccin a nivel mundial con 1 664 700 Tm de arroz al ao, superado por Colombia (2 100 000 Tm) y Brasil (10 940 500 Tm), siendo China el mayor productor del mundo con 592 873 253 Tm anuales (Infoagro, 2008). La forma ms conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrgeno de los cultivos de arroz es la fertilizacin qumica, la cual representa una manera rpida de reponer el nitrgeno perdido, sin embargo, bajo un manejo inadecuado representa un riesgo ecolgico por contaminacin del suelo y del agua. Existe discrepancia entre la cantidad de fertilizante nitrogenado aplicado y la que es realmente utilizada por la planta (bajo coeficiente de utilizacin). Se ha determinado que el nitrgeno aplicado a un cultivo est expuesto a prdidas hasta del 67 %, quedando un exceso de compuestos nitrogenados en el ecosistema lo que representa la mayor fuente de contaminacin por nitrgeno, tanto en la atmosfera (xidos de N), como en las aguas superficiales y profundas (nitratos).

La utilizacin de biofertilizantes constituidos por microorganismos que fijan el nitrgeno, solubilizan nutrientes, producen hormonas y estimulan la proteccin frente al ataque de plagas y patgenos, representa una alternativa para disminuir el uso de fertilizantes qumicos. Estos microorganismos denominados promotores del

crecimiento vegetal (PGPR) incluyen a bacterias del gnero Azospirillum spp. , de vida libre, presentes en suelos a nivel mundial y capaz de fijar nitrgeno molecular del medio ambiente, producir fitohormonas e incrementar la productividad agrcola.

A pesar de que existen productos comerciales de Azospirillum, su aplicacin no siempre es efectiva, por lo cual se prefiere el uso de microorganismos nativos, adaptados a las condiciones climticas y que puedan competir exitosamente con la biota nativa.

1.1. Identificacin del Problema Uso irracional de fertilizantes qumicos en gramneas. 1.2. Delimitacin del Problema Caracterizacin de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz. 2. PROBLEMA CIENTFICO Cul son las caractersticas de las cepas nativas de Azospirillum spp. y cul es su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz ?

3. HIPOTESIS Cepas nativas de Azospirillum spp. fijan nitrgeno asimbiticamente, producen cido indolactico e incrementan el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz.

4. JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA

Una

de

las

principales

actividades

econmicas

en

la

regin

Lambayeque es la agricultura, contando con 70,000 hectreas de cultivo como el arroz (MINAG, 2008). Para lograr rendimientos notables se requiere el uso de fertilizantes qumicos que suplementen su crecimiento pero a la vez su uso desmedido y prolongado ocasiona graves consecuencias como infertilidad de suelos y por ende una disminucin en el potencial agrcola. Ante la problemtica y buscando alternativas se ha prestado especial atencin al estudio de los microorganismos promotores del crecimiento vegetal y a sus beneficios para la agricultura. Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal como Azospirillum spp tienen la capacidad de fijar elementos nutritivos para la planta como nitrgeno y producir metabolitos fitohormonales de inters agrcola, entre los que destaca el cido indol actico (AIA), que desempea un papel fundamental en el crecimiento de los cultivos, manteniendo la calidad de los suelos agrcolas por ms tiempo, promoviendo de esta manera el crecimiento de las plantas, y evitando la infeccin del tejido vegetal por patgenos. Una vez que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal han sido aisladas, deben ser caracterizadas en laboratorio e investigadas en su efectividad

sobre el desarrollo vegetativo en invernadero como requisito indispensable para su inoculacin y comercializacin principal en campos, como biofertilizantes. 5. OBJETIVOS 5.1. Aislar cepas nativas de Azospirillum spp. de la rizsfera de Oryza sativa L. arroz en campos agrcolas comerciales de Lambayeque. 5.2. Identificar fenotpica y bioqumicamente cepas nativas de Azospirillum spp. 5.3. Cuantificar el nitrgeno fijado por cepas nativas de Azospirillum spp. 5.4. Cuantificar el acido Indolactico producido por cepas nativas de Azospirillum spp. 5.5. Determinar en condiciones de invernadero el efecto de la inoculacin de cepas nativas seleccionadas de Azospirillum spp. fijadoras de nitrgeno y productoras de cido indol actico en el desarrollo vegetativo Oryza sativa L. arroz. 6. ANTECEDENTES

6.1. El Nitrgeno como nutriente

Todos los seres vivos necesitan nitrgeno (N2) para formar aminocidos, protenas y cidos nucleicos, pero el nitrgeno en la atmsfera no est presente de forma que se pueda utilizar (Gardnier, 2005). El crecimiento del cultivo de arroz depende de factores como el clima, agua y nutrientes accesibles a la planta (Murillo y Gonzlez, 1982). El nitrgeno es el nutriente ms importante, y casi todos los suelos son deficientes en este elemento (Cordero, 1993). Este elemento es absorbido en forma de amonio (NH4+) o nitratos (NO3-) por las races vegetales, y es utilizado en el interior de los tejidos para la sntesis de aminocidos, que son translocados a las hojas en donde se sintetizan las protenas (Murillo y Gonzlez, 1982). La forma ms conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrgeno de los cultivos de arroz es la fertilizacin qumica, la cual representa una manera rpida de reponer el nitrgeno perdido. Sin embargo, bajo un manejo inadecuado representa un riesgo ecolgico por contaminacin del suelo y del agua (Vergara y Rangel, 1990). La dosis recomendada de nitrgeno vara segn la variedad y el sistema de cultivo empleado, pero en promedio es de 120 kg N/Ha. Se sugiere aplicar el 40-50 % de la dosis en la fase de macollamiento, y el resto (50-60 %) en la poca de diferenciacin del primordio floral. Para la fertilizacin del arroz de secano se puede utilizar urea, sulfato de amonio o nitrato de amonio (Cordero, 1993).

Se conoce que el nitrgeno aplicado a un cultivo est expuesto a prdidas hasta del 67 %, por lo que para mejorar la eficiencia de la fertilizacin sta se fracciona entre dos y cuatro aplicaciones, durante el macollamiento, o sea cuando las plntulas presentan cuatro hojas completamente desplegadas, y durante la formacin de la pancula, para favorecer la fase reproductiva (etapa de diferenciacin del primordio floral). No se recomienda fertilizar a la siembra, pues durante la fase de plntula la absorcin de nitrgeno es casi nula (Conitta, 1991). Los sntomas de carencia de nitrgeno en los vegetales son: amarillamiento de las hojas ms viejas, empezando por el pice y avanzando hasta la base , crecimiento lento, tallos delgados, races con escaso desarrollo, floracin restringida con notable reflejo en la fructificacin siendo los frutos pequeos y la maduracin acelerada. Los vegetales ahjan poco y deficientemente as como son ms susceptibles al ataque de plagas, enfermedades y heladas (Horticasa, 2008). 6.2. Acido Indol actico como promotor del crecimiento vegetal.

El nombre de auxina es dado a un grupo de compuestos que estimulan la elongacin vegetal. El cido indol actico (AIA) es la forma predominante, sin embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indlicas naturales en las plantas. Aunque las auxinas estn en toda la planta, las mayores concentraciones se localizan en las regiones meristemticas en crecimiento activo. Se les encuentra tanto como molculas libres o en formas conjugadas inactivas. La concentracin de auxina libre en planta vara de 1 a 100 mg/Kg peso fresco. Las auxinas han sido implicadas en la regulacin de procesos fisiolgicos como promocin del crecimiento y diferenciacin celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta, estimulacin del crecimiento y maduracin de frutos, floracin, senectud, geotropismo, fototropismo, retardo de cada de hojas, flores y frutos jvenes y la dominancia apical (Gonzales et al., 1999). La dominancia apical est relacionada con el transporte de auxina por medio de un mecanismo dependiente de energa alejndose en forma basiptala desde el punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical (Arteca, 1996). Las auxinas son producidas en las pantas a partir del catabolismo de triptfano lo cual se observ en ensayos en donde al colocar triptfano ste era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentracin en el mismo (Salisbury et al., 1994; Taiz y Zeiger, 2006).

6.3.

Azospirillum como promotor del crecimiento en gramneas

El gnero Azospirillum fue descubierto por Beijerinck, quien lo nombr como Spirillum lipoferum en 1925 (Dbereiner, 1980), y fue caracterizado por Dbereiner y Day en la dcada de 1970 (Okon et al., 1976, citados por Vergara y Rangel, 1990). En 1978 fue reclasificado por Tarrand, Krieg y Dbereiner, quienes basados en estudios de homologa del ADN describieron el nuevo gnero Azospirillum, con dos especies: A. lipoferum y A. brasilense. El gnero Azospirillum, comprende bacterias del suelo de vida libre, rizobacterias consideradas promotoras de crecimiento vegetal por su capacidad de fijacin de nitrgeno atmosfrico y produccin de fitohormonas, siderforos y

mejoramiento del sistema de absorcin radical y relacin agua/planta (Tarrant, 1978; Dobereiner, 1991; Okon y Labandera, 1994; Baldani, 1999; Cassn, et al., 2003) Azospirillum es una -proteobacteria, Gram negativa que utiliza como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, nitrito, aminocidos y nitrgeno molecular. En condiciones desfavorables como desecacin y carencia de nutrientes, pueden enquistar, recubrindose de una capa de polisacridos, produciendo una acumulacin de grnulos de -hidroxibutirato, que sirven a la bacteria de reserva de fuente carbonada. Presenta quimiotaxis positiva hacia cidos orgnicos, azucares, aminocidos, compuestos aromticos y hacia exudados radicales. Esta capacidad de migracin es altamente dependiente de la actividad del suelo. Este gnero tiende a dirigirse hacia lugares donde la concentracin de oxigeno es la adecuada (aerotaxia). Su comportamiento le permite a la bacteria dirigirse hacia un nicho ecolgico apropiado en la rizsfera donde realiza la fijacin biolgica de nitrgeno y sustancias estimuladoras del crecimiento. (Collados, 2006). Glick et al., (1999) sostienen que en la microbiota del suelo conviven distintos gneros bacterianos. Estos se encuentran preferentemente interactuando con las races de las plantas y su accin puede ser benfica, perjudicial o neutral desde el punto de vista del desarrollo y crecimiento vegetal. Aquellas bacterias rizosfricas como Azospirillum spp. capaces de impactar positivamente sobre el crecimiento de cualquier especie vegetal, son comnmente conocidas como Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). Las bacterias del gnero Azospirillum han sido, a la fecha, las ms estudiadas entre las PGPR. Segn una revisin de Okon y Labandera Gonzlez (1994) que rene informacin de 20 aos de experimentacin a campo, el porcentaje de xito debido a la inoculacin con Azospirillum es de 60 a 70%. Estos ensayos fueron realizados en diferentes suelos y regiones climticas, y con distintos cultivos de importancia agronmica, logrando incrementos en rendimiento del orden del 5 a 30%. Asimismo

Motsara et al. (1995) determinaron que en cultivos como arroz, maz, trigo y caa de azcar, Azospirillum puede incrementar el rendimiento entre 15 y 30 %. Azospirillum produce sustancias promotoras del crecimiento, como cido indol actico, citocininas, giberelinas (Monzn de Asconegui, 2003; Cacciari et al, 1989), sustancias que estimulan la densidad y largo de los pelos radicales, la aparicin de races laterales y el volumen radical; permitiendo que el potencial de absorcin de nutrientes y agua se eleve, beneficio que en el caso de los cultivos de zonas ridas y semiridas constituye una ventaja an mayor (Di Barbaro et al. 2005). Se ha demostrado que las plantas inoculadas con Azospirillum spp. absorben ms rpido minerales de la solucin y, consecuentemente, acumulan ms materia seca, N, P y K en tallos y hojas (Puente y Peticari, 2006). Las fitohormonas podran ser las responsables del mejor crecimiento de la raz y de la parte area de las plantas debido a que los efectos de la inoculacin son similares a los que se observan cuando las plantas son tratadas con estas sustancias.( Tien et al., 1979) 7. MATERIAL Y MTODOS

7.1. Material 7.1.1 Material biolgico - Muestras de rizsfera de Oryza sativa L. arroz obtenidas de campos agrcolas Lambayeque. - Semillas de arroz Oryza sativa L. arroz 7.1.2 Material de laboratorio - Placas de Petri - Lminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos - Tubos de vidrio (13 x 100 mm y 15 x 150 mm) - Pipetas de 1 mL y 10 mL. - Asas bacteriolgicas - Agitador de vidrio - Bolsas de algodn de 500 g del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, regin de

7.1.2. Medios de Cultivo (Anexo 1) - Agar Nutritivo - Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) semislido - Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) slido - Medio Rojo de Congo Acido mlico

-Caldo extracto de suelo 10% -Caldo tripticasa de soya suplementada con triptofano 7.1.3. Reactivos y Colorantes - Colorantes para tincin de Gram. - Perxido de hidrgeno. - Tiras reactivas para oxidasa. - Azul de bromotimol. - Reactivo de Salkowski - Solucin Oxidante para determinacin de Amonio - Solucin salina fisiolgica estril - Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5% - Solucin acuosa de Rojo de Congo (1:400) 7.1.4. Otros - Semillas de Oryza sativa L. arroz - Extracto de levadura. - Fertilizante nitrogenado: Urea (46% N) - Macetas. - Biorreactor tanque tipo Batch con flujo de aire descendente. - Tamizador. - Esptulas. - Bolsas plsticas.

7.2. Mtodos

7.2.1 Poblacin y muestra de estudio

La poblacin estar constituida por bacterias del genero Azospirillum presentes en la rizsfera de Oryza sativa L. arroz, de campos agrcolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo en la regin de Lambayeque y la muestra estar constituida por 96 cepas de Azospirillum spp.; nmero que fue calculado segn la frmula mencionada por Alvitres (Alvitres, 2000)

n= n=

Z2 (p.q) T2 3,84 (0,20 x 0,80)

0,0064
T2 n= Donde: n = tamao de muestra Z = 1,96 ( = 0,05), valor estndar p = 0,20, presencia de Azospirillum spp. en la rizsfera de arroz. q = ausencia, 1 p: 0,80 T = error permitido: 8% 7.2.2. Primera Fase: Aislamiento, identificacin y seleccin de cepas nativas de Azospirillum spp. fijadoras de nitrgeno. 96

a. Zona de muestreo Para aislar cepas nativas de Azospirillum sp. fijadoras de nitrgeno se tomarn muestras de races de cultivos de arroz, establecidos en campos agrcolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, regin de Lambayeque. El distrito de Pomalca est comprendido entre los paralelos 6 45 y 6 46 de latitud sur y los meridianos 79 46 y 79 48 de longitud oeste. La zona presenta un clima subtropical rido, con un rango de temperatura media de 35,7C hasta mxima absoluta de 32,5 C. b. Obtencin de muestras de rizsfera Cada muestra consistir en extraer todas las races de plantas de arroz, cultivadas en campos comerciales del distrito de Pomalca, regin de Lambayeque y que se encuentren al final del ciclo vegetativo poco antes de la cosecha. Cada una de las muestras ser depositada en bolsas plsticas debidamente etiquetadas e inmediatamente sern transportadas para su procesamiento en el laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque.

c. Aislamiento de (Dobereiner, 1980)

cultivos puros de bacterias fijadoras de nitrgeno.

Se tomarn las races de las plantas de arroz y se lavarn generosamente con agua potable hasta eliminar el suelo remanente. A continuacin se cortarn secciones de races de aproximadamente 5 cm de longitud (desde el extremo final hacia arriba), se depositarn en un vaso de precipitacin y desinfectarn superficialmente con hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 % durante 5 minutos y luego se enjuagarn dos veces consecutivas con agua destilada estril. Despus se depositarn las races en una maylica desinfestada con alcohol, y se cortarn en fragmentos de un tamao aproximado de 2 cm de longitud y luego se enjuagarn con agua destilada estril.

Se realizar el enriquecimiento de cada una de las muestras para favorecer el crecimiento de microorganismos fijadores de nitrgeno para lo cual las races se depositarn (con pinza o con asa bacteriolgica en anillo) de 10 a 15 mm por debajo de la superficie en tubos con 6 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (NFb) semislido, a razn de un fragmento por tubo. La incubacin se realizar en aerobiosis a 28 C por 1 semana y se seleccionaran los tubos donde se observe el viraje del color del medio de verde a azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina ubicada entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se tomar una alcuota de la pelcula y se preparar una suspensin en 1 mL de solucin salina fisiolgica estril, y luego se sembrar por agotamiento y estra en placas con medio NFb slido complementado con 20 mg/L de extracto de levadura y se incubarn a 28 C durante 5 das, transcurrido los cuales en caso positivo se observarn colonias blanquecinas y pequeas con viraje del medio del verde al color azul. A continuacin, se realizar tincin de Gram y en caso de que se observen bacilos pequeos Gram negativos, se seleccionar la colonia y se sembrar (puntura) en medio NFb semislido en aerobiosis a 28 C por 1 semana hasta que se observe el viraje del color del medio de verde al azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. En caso positivo se tomar una alcuota y se sembrar por agotamiento y estra en placas de Petri que contengan medio Rojo Congo cido mlico por 48 a 72 h a 28C. Luego se seleccionaran las colonias rojo escarlata, y se realizara tincin de Gram para confirmar la morfologa y reaccin, y se sembrarn en placas de Petri con agar nutritivo y posteriormente en viales con la finalidad de obtener cultivos puros para su posterior caracterizacin.

d. Identificacin a nivel de gnero de Azospirillum spp. La identificacin a nivel de gnero de las bacterias nativas fijadoras de nitrgeno se realizar en funcin de las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas segn el Manual de Bergey de Bacteriologa Determinativa (Holt et al., 1994)

e. Deteccin y cuantificacin de cido Indolactico, AIA in Vitro

Se obtendr una suspensin celular en solucin salina fisiolgica 0.85% estril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustar su concentracin en 1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cmara de Neubauer. A continuacin se inocular 1mL de cada suspensin bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de 15 x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptfano (0,01 g L -1), a 30 C durante 72 horas. Luego se centrifugar a 1000 rpm durante 15 minutos. Se transferirn 0,4 mL del sobrenadante hacia tubos de 13 x 75 mm y se agregarn 1,6 mL de reactivo Salkowski modificado (relacin 4:1). Se mezclarn y dejarn en reposo en oscuridad durante 30 minutos, posteriormente se observar una coloracin violcea y se medir la absorvancia en el espectrofotmetro a 530 nm. Las concentraciones se calcularn ajustando la curva de calibracin. f. Cuantificacin de la fijacin biolgica de nitrgeno, FNB in vitro. Se obtendr una suspensin celular en solucin salina fisiolgica 0.85% estril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustar su concentracin en 1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cmara de Neubauer. A continuacin se inocular 1mL de cada suspensin bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de 15 x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo al 10% a 30C durante 72 horas en agitacin constante (150 rpm). Luego se transferirn 5 mL del caldo cultivado a frascos de penicilina de 50 mL y se agregarn 15 mL de KCl 2M, y se dejarn en agitacin constante (150 rpm) durante 1 hora y luego se dejarn en reposo durante 1 hora adicional.

Posteriormente se tomarn 10 mL del sobrenadante y se centrifugarn (2000 rpm) durante 20 minutos. Luego se verter el sobrenadante hacia tubos de dilucin (la biomasa quedar en el fondo del tubo de centrfuga), se aadirn

0,4 mL de solucin alcohlica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solucin oxidante, y se agitarn para mezclar. Se dejarn en reposo durante 1 hora. Finalmente se leern las absorvancias en

espectrofotmeto a 632,9 nm y se calcularn las concentraciones en una recta patrn construidas a partir de diluciones sucesivas de un patrn de 100 ppm de cloruro de amonio. 7.2.3 Segunda Fase: Efecto de cepas nativas de Azospirillum spp. fijadoras de nitrgeno y productoras de cido indolactico en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz en condiciones de invernadero.

Para determinar el efecto de la inoculacin de Azospirillum spp. en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz, se obtendr una suspensin bacteriana en solucin salina fisiolgica de cada una de las cuatro cepas nativas de Azospirillum spp. seleccionadas, y se har dos inoculaciones una al momento de la siembra y la segunda 35 das despus de la siembra.

a. Siembra

de

semillas

de

Oryza

sativa

L.

arroz

var. INIA 508-Tinajones.

Se utilizar un suelo de textura franco arcillosa procedente de un campo comercial de arroz, ubicado en el distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, regin Lambayeque. Despus de la caracterizacin fsico qumica, el suelo se esterilizara en autoclave a 121C, 15 libras de presin durante 3 horas y se repartir en macetas de 2,5 Kg de capacidad a razn de 2 Kg por maceta. A continuacin se realizar un riego hasta la saturacin del suelo y se sembrarn semillas de arroz var. INIA 508-Tinajones (diez por maceta), aproximadamente a 0.5 cm de profundidad. A los 35 das despus de la siembra, las plntulas sern raleadas eliminando las ms pequeas y dejando las cuatro ms vigorosas por maceta.

b. Fertilizacin nitrogenada
La dosis utilizada para la fertilizacin qumica ser de 120 kg N/Ha (100%), que en el experimento equivaldr a 0,817 g de urea por maceta y se aplicar en forma de disolucin acuosa. La fertilizacin se fraccionar en dos partes, la mitad a la siembra y la otra mitad 35 das despus.

c. Inoculacin de las cepas de Azospirillum spp.

Cada una de las cuatro cepas nativas de Azospirillum spp. que presenten los valores mayores en la produccin de cido indol actico y en la fijacin de nitrgeno ser cultivada en agar nutritivo (placas de Petri) a 30 C por 48 horas. La biomasa desarrollada se cosechar con solucin salina fisiolgica estril y se estandarizar su concentracin entre 600 y 900 millones de clulas/mL. Se realizaran dos inoculaciones, la primera a la siembra, aadiendo 20 mL de la suspensin de bacterias a cada una de las macetas y la segunda inoculacin se realizar 35 das despus de la siembra, aplicando 10 mL de la suspensin en la base de cada una de las plantas.

d. Determinacin del peso de la biomasa seca area y radicular.

Transcurridos 70 das despus de la siembra, las plantas sern extradas cuidadosamente y se separar el sistema areo del sistema radicular. Las races se lavaran para eliminar el suelo adherido y para determinar el peso de la biomasa seca, races y follaje sern introducidas en bolsas de papel y secadas a 80 C por 48 horas en el caso del follaje, y a 100 C por 24 horas en el caso de las races. Transcurrido el tiempo de secado las muestras se pesaran en una balanza analtica y se calcular el promedio g/planta en cada maceta. 7.2.4. Anlisis estadstico de los datos Los datos obtenidos se sometern a un Anlisis de Varianza (ANAVA), para determinar las diferencias estadsticas entre tratamientos y se emplear la prueba discriminatoria de Tukey ( = 0.05) para determinar su nivel de significancia entre ellos (Padrn, 1996). 7.2.5. Tipo de estudio y Diseo de contrastacin de hiptesis El trabajo de investigacin ser realizado en dos fases: en la primera fase descriptiva se ejecutar el aislamiento, identificacin a nivel de gnero, deteccin y cuantificacin de cido indolactico y de la fijacin biolgica de nitrgeno in vitro. En la segunda fase correspondiente a una investigacin experimental se determinar el efecto de la inoculacin de cepas nativas fijadoras de nitrgeno y productoras de cido indolactico en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. arroz en condiciones de invernadero. Se utilizar un diseo clsico experimental completamente aleatorio (DCA), con 15 tratamientos y tres repeticiones, totalizando 45 unidades experimentales.

Los tratamientos correspondern a: 4 cepas de Azospirillum spp. nativas fijadoras de nitrgeno (cepa 1, cepa 2, cepa 3, y cepa 4), dos testigos qumicos (fertilizante nitrogenado con 50% de urea y 100% urea ), 9 tratamientos que combinan cada cepa con fertilizante nitrogenado al 50% y al 100% ( cepa 1 ms 50% de urea , cepa 1 ms 100% de urea, cepa 2 ms 50% de urea, cepa 2 ms 100% de urea, cepa 3 ms 50% de urea, cepa 3 ms 100% de urea, cepa 4 ms 50% de urea y cepa 4 ms 100% de urea) y un testigo absoluto (sin inculo y sin fertilizante).

8. Referencias bibliogrficas Puente, M. y A. Peticari, (2006) Promotores del crecimiento vegetal: Caractersticas y uso potencial en el agro argentino en Revista de los CREA. [En Lnea] N. 304. Febrero 2006, disponible en:

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ANEXO 1 MEDIOS DE CULTIVO Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol, NFb (Motsara et al., 1995.) COMPOSICIN cido mlico KOH K2HPO4 FeSO47H2O MnSO47H2O MgSO47H2O NaCl CaCl2 Na2MoO4 Azul de bromotimol (0,5 % m/v en etanol) Biotina Agua destilada g/L 5 4 0,5 trazas 0,01 0,01 0,02 0,01 0,002 2 ml 0,1 mg 1000 ml

Ajustar el pH a 6,8 - 7,0 (color verde) con NaOH. Para medio semislido aadir 2 g de agar. Para medio slido aadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar. Medio rojo de Congo cido mlico COMPOSICIN cido mlico K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Extracto de levadura FeCl3.6H2O KOH Solucin acuosa de Rojo de Congo (1:400) Agua destilada g/L 5,0 0,5 0,2 0,1 0,5 0,015 4,8 15 mL 1 000 mL

Colocar la solucin acuosa de Rojo de Congo al final, y ajustar el pH a 7,2. Para medio solido aadir 20g de Agar.

Agar nutritivo (AN) COMPOSICIN Peptona Extracto de carne Agar Agua destilada Ajustar el pH a 7,0 g/L 5 3 15 1000 ml

Caldo tripticasa soya suplementado con triptfano

COMPOSICIN Peptona de casena Peptona de harina de soya D(+)Glucosa (o dextrosa) Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Triptfano Agua destilada g/L 17.0g 3.0g 2.5g 5.0g 2.5g 0.01g 1000 ml

Disolver por calentamiento y agitacin, ajustar a pH 7,3. Caldo extracto de suelo

COMPOSICIN K2HPO4 MgCl2 MgSO4.7H2O FeCl3 CaCl2 Triptona Extracto de levadura Extracto de suelo al 10% Agua destilada g/L 0,4 0,1 0,05 0,01 0,1 1,0 1,0 250 mL 750 mL

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz

250 g de suelo agrcola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500 mL con agua destilada y filtrar. Tomar sobrenadante 25 mL del filtrado y completar a 250 mL con agua destilada

ANEXO 2

Reactivo de Salkowski COMPOSICIN H2SO4 Concentrado Agua destilada FeCl3 0.5 M en H2O destilada g/L 150 mL 250 mL 7.5 mL

4 mL de reactivo + 1 mL de muestra

Solucin oxidante para determinacin de Amonio COMPOSICIN g/L

Citrato de sodio Hidrxido de sodio Hipoclorito de sodio al 5% Agua destilada

20g 1g 2mL (Leja comercial) 100mL

_____________________________ Msc. Carmen Rosa Carreo Farfn Firma asesora

_____________________________ Franklin Ignacio Garca Pastor Firma autor (s)

_____________________________ Harold ngel Muoz Cieza Firma autor (s)

_____________________________ Fecha de Presentacin