Chimie des aliments et du got

Pister les fraudes dans les miels

Lapport des microscopies et de la spectromtrie de masse du carbone 13 Christophe B.Y. Cordella et Issam Moussa
Rsum Cet article prsente une tude utilisant deux types de microscopies et la spectromtrie de masse du carbone 13 (SMRI-13C) pour mettre en vidence ladultration de miels par des sirops de sucre industriels. Il dcrit lune des approches possibles pour dtecter les fraudes dans les miels par des mthodes simples consistant rechercher des traceurs spcifiques (cellulaires ou molculaires). La microscopie optique se rvle plus sensible que la SMRI pour dtecter la fraude (respectivement de lordre de 2 et 7-10 %). Alors que la microscopie optique est limite la recherche dlments cellulaires de ladultration et que la SMRI donne ses meilleurs rsultats pour un certain type de sirops industriels, nous avons mis en vidence les possibilits de la microscopie lectronique dans la dtection de sirops ne possdant pas de traceur cellulaire. Cette extension intressante se fait par le biais de ltude morphomtrique des grains damidon ventuellement prsents dans les chantillons. Miel, fraude, microscopie optique, MEB, spectromtrie de masse, carbone 13, traceurs. Identication of fraud in honey: the use of microscopies and mass spectrometry of 13-carbon This article presents a study using two types of microscopy techniques and the mass spectrometry of 13carbon (13C-IRMS) to identify the adulteration of honey by industrial sugar syrups. We present here an approach to detect fraud in honey by simple methods, that consist in seeking tracers (cellular or molecular) of the specific adulteration. We show that optical microscopy is more sensitive than the IRMS to detect fraud (by about 2% and 7-10%). While optical microscopy is limited to the search for cellular elements of adulteration and IRMS gives its best results for a certain type of industrial syrups, we have highlighted the possibilities of electron microscopy in the detection of industrial syrups with no tracer cell. This extension is interesting through the morphometric study of starch grains if present in the samples. Honey, fraud, optical microscopy, SEM, mass spectrometry, carbon-13, tracers.

Mots-cls Abstract

Keywords

a qualit nutritionnelle et organoleptique des aliments est un vaste sujet puisquil commence sur le terrain par le suivi et le soutien scientifique et technique des filires de production (levages, agriculture) et se poursuit jusquau produit fini que nous retrouvons dans notre assiette. Le problme pos ici est celui de ladultration des miels par les sucres exognes , sujet dlicat car il suscita un engouement important de la filire professionnelle apicole. Soucieuse de prserver la qualit et limage de ses produits et notamment du miel, archtype du produit de terroir 100 % naturel, elle sest adresse ladministration europenne puis lAFSSA afin que des solutions lui soient

proposes et que lon puisse notamment dtecter les mlanges de sirops industriels vendus sous lappellation de miel. La falsification ntant pas une pratique spcifique la filire apicole, cette recherche a t dveloppe avec le souci dlargir le champ de la synthse dautres produits alimentaires et dvaluer les diffrentes solutions techniques dont nous disposons pour rpondre au problme [1]. Les tudes ont t organises principalement autour de deux approches analytiques opposes et complmentaires dpendant de la manire dont lchantillon est analys et impliquant une forme adapte de traitement des donnes. Il sagit dune part, de ce quil convient dappeler une approche chimique spcifique, et dautre part, dune approche physique globale. La chronologie des travaux effectus a fait intervenir cinq techniques diffrentes : la microscopie optique (MO) et lectronique balayage (MEB), la spectromtrie de masse des rapports isotopiques (SMRI), la calorimtrie diffrentielle balayage (DSC ou differential scanning calorimetry ) et la chromatographie ionique ampromtrie pulse (HPAEC-PAD). Nous prsentons ici les travaux effectus en microscopie optique et lectronique ainsi quen spectromtrie de masse du carbone 13 (SMRI-13C) [1]. Les principes et les applications de la DSC et de la HPAEC-PAD feront lobjet dun autre article. Il nest jamais inutile de montrer lintrt et la richesse des collaborations scientifiques transversales entre laboratoires et quipes de recherche (surtout par les temps qui courent), puisse cet article y contribuer sa faon.

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Ladultration du miel : un problme vieux comme le monde

linstar des problmes dintoxication (naturels ou non) de labeille qui ne datent pas dhier [2], celui de ladultration des miels est lui aussi trs ancien puisqu lpoque romaine, Pline lAncien(1) parlait dj du miel comme dune substance divine aux proprits merveilleuses, mais que [] la fraude de lhomme falsifie et perd toute chose [3]. Au XVIIIe sicle, Sir John Hill [4] alertait ses contemporains de certaines pratiques consistant incorporer au miel diverses substances telles que la paraffine, le glucose, le saccharose, le malt De nos jours, malgr les efforts importants engags dans les analyses physico-chimiques, la dtection et la quantification de ladultration des miels restent des problmes difficiles. Mme avec ladoption de normes internationales(2), les fraudes sur les appellations et lauthenticit des miels restent une proccupation actuelle. Le contrle de ladultration des miels exige une trs bonne connaissance du produit. Il peut emprunter deux voies souvent complmentaires : la caractrisation du produit pour en connatre les constituants chimiques et mettre en vidence de fortes variations de ceux-ci et la recherche et lidentification danomalies constitutives (traceurs cellulaires ou molculaires). La premire voie donne un point de vue global de lchantillon tandis que la seconde se rapproche dune dmarche la Sherlock Holmes , et donne une information plus locale ou spcifique de la fraude. Chaque miel emprunte certaines caractristiques organoleptiques de la plante butine par labeille (lavande, acacia, pin), avec un got, une texture, un arme, une couleur, etc. qui lui sont propres. Les constituants chimiques et biologiques du miel sont nombreux : glucides, eau, protines, acides amins, acides organiques, polyphnols, pollens, levures, bactries Parmi ces lments, on trouve parfois des grains damidon. Les pages qui suivent visent montrer que deux options efficaces de contrle analytique sont possibles pour dtecter ladultration des miels. La premire consiste rechercher des traceurs cellulaires (microscopie optique) ou des traceurs molculaires (microscopie lectronique). La seconde se base sur la dtermination et la mesure dune proprit naturelle de lchantillon : son contenu isotopique en carbone 13, et sur le calcul du rapport 13C/12C.

Tableau I - Caractristiques morphologiques et physiques de quelques-uns des principaux grains damidon.

Valeur entre parenthses: moyenne en m. Selon [7].

Source Mas Pomme de terre blanche Pomme de terre sucre Tapioca Bl Riz Canne

Taille (m) 4-26 (15) 15-100 (33) 15-55 (37) 5-36 (21) 2-38 (20) 3-9 (5) --- (43)

Temprature de glatinisation (C) 64-71 62-68 82-83 69-70 53-64 65-73

Lamidon : lindice suivre

Lamidon est constitu pour 20-30 % damylose (polymre naturel dunits de D-glucose) et pour 70-80 % damylopectine (galement un polymre naturel de Dglucose mais dont larrangement spatial et lenchanement des units diffrent). Il est lhomologue vgtal du glycogne, macromolcule naturelle permettant le stockage de lnergie et de la brique nutritive de base le glucose dans la cellule. Lamidon est la structure carbohydrate la plus rpandue et la plus abondante dans les plantes. Dans la nature, il est presque toujours sous forme de granules (grains damidon). Dpendants de lorigine de la plante et de sa maturit, les grains damidon varient beaucoup dans leur forme, leur taille et leur temprature de glatinisation ainsi que lillustre le tableau I. La forme et la taille de ses granules sont caractristiques de leur plante dorigine et un microscopiste expriment peut facilement le dterminer [5-6].

Observs par microscopie optique sous lumire polarise, les grains damidon prsentent un motif dinterfrence caractristique : la croix maltaise qui est toujours observable quelle que soit lorigine de lamidon(3). Elle peut cependant disparatre partiellement lorsque lamidon subit des transformations dues un traitement thermique (glatinisation) ou des ractions chimiques ou enzymatiques. Lamidon nest pas considr comme un lment constitutif naturel du miel. Cependant, dans la pratique, des traces damidon y sont tolres. La quantification ou le dnombrement des grains damidon se fait par rapport aux pollens. Gnralement, un chantillon de miel est considr conforme lorsque la quantit damidon ne dpasse pas un quatre grains pour cent pollens. Diffrentes tudes confirment la lgitimit de cette tolrance vis--vis des miels. Lobreau-Callen et Clment dfinissent les miels sales comme ceux qui prsentent toutes sortes de dbris minraux (argiles, cristaux, terre, lss) ou organiques (pidermes, amidon), preuves dune adultration de nature physico-chimique [8]. Dans leurs travaux, Franchi et al. montrent que la plupart des plantes visites par les insectes pollinisateurs tels que labeille appartiennent des familles botaniques bien dfinies(4) qui regroupent des plantes nectarifres et non nectarifres, dont le point commun est davoir peu ou pas damidon dans leurs pollens [9]. En effet, pour ces plantes, les pollens sont dpourvus de rserves en carbohydrate alors que dautres parties de ces vgtaux en contiennent. Par ailleurs, de nombreux auteurs ont montr que le nectar des plantes visites par labeille est une substance aqueuse compose essentiellement de glucose, de fructose et de saccharose [10]. Les nectars ne contiennent donc pas de sucres suprieurs et certainement pas de polymres des sucres tels que lamidon. A contrario, des plantes telles que la canne sucre, la betterave, le riz, le bl, le mas, la pomme de terre contiennent une grande quantit damidon qui reprsente leur principale forme de stockage du sucre. Or ces plantes tant utilises, partiellement ou dans leur totalit, comme matire premire dans la fabrication des sirops de sucre industriels (notamment la betterave sucrire, le mas et la canne sucre), on retrouve invitablement de nombreux grains damidon dans ces sirops. Ainsi, concernant laspect amidon dans les miels, il est maintenant plus clair que cet lment nest pas gage de qualit et quune attention particulire doit lui tre accorde car ce peut tre un moyen de dpistage de ladultration par les sirops de sucre issus ou non de lhydrolyse (toujours plus ou moins totale) de lamidon.

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Microscopie optique et spectromtrie de masse du carbone 13 : comparaison des mthodes

chantillons Afin de cibler les miels o les fraudes par ajout de sucres exognes ont t le plus souvent dcrites, 43 chantillons ont t prlevs dans le circuit de la grande distribution. La mthode applique pour prparer les lames est celle de lanalyse pollinique des miels [11] et nous nous sommes inspirs des travaux de Kerkvliet et al. [12] pour la mise en vidence de ladultration. Lexamen microscopique se fait en lumire blanche et polarise. Microscopie optique La microscopie optique permet de dtecter facilement la prsence de fragments cellulaires (fibres, cellules pidermiques, anneaux sclreux) originaires de la canne sucre. La figure 1 montre le spectre pollinique normal dun miel, cest--dire ne prsentant que des cellules polliniques en nombre et de morphologie attendus. Sur la figure 2, on peut voir un anneau sclreux caractristique dune adultration par un sirop de canne sucre ou un produit driv de la canne sucre. La mthode employe consiste adopter un raisonnement binaire dans la lecture et linterprtation des chantillons [13]. En effet, nous avons considr, aprs la lecture de deux lames par chantillon, que lchantillon tait dclar positif lorsquau moins un anneau sclreux tait observ sur les deux lames, ou de faon plus gnrale, lorsquau moins un lment cellulaire caractristique de la canne sucre y tait prsent. En revanche, tous les chantillons ne prsentant aucun lment cellulaire douteux ont t dclars ngatifs, cest--dire conformes du point de vue de ladultration par des produits drivs de la canne sucre.

Figure 2 - Clichs de microscopie optique dun miel de lavande prsentant un anneau sclreux (cellule issue de la canne sucre).
Microscope Carl Zeiss Axiostar en lumire blanche gauche et en lumire polarise droite, oculaire A-Plan 20x/0,45, grossissement x200. Taille de lanneau : 36 x 24 m.

Figure 1 - Clich de microscopie optique dun miel de lavande non frelat.

Microscope Carl Zeiss Axiostar en lumire blanche, oculaire A-Plan 20x/0,45, grossissement x200.

Spectromtrie de masse : mesure du rapport 13C/12C La spectromtrie de masse du carbone 13, dite SMRI, a longtemps t la technique officielle pour dtecter la falsification des produits alimentaires. Les travaux pionniers dans ce domaine ont t prsents par White et Doner, qui proposrent une mthode pour dtecter dventuelles additions de sirops industriels, issus de plantes de type C4, dans les produits alimentaires et en particulier dans les

miels [14]. Comment cela est-il possible ? Lors de la photosynthse, lassimilation du gaz carbonique par les vgtaux seffectue selon deux principaux types de mtabolismes qui sont les mtabolismes C3 (cycle de Calvin) et C4 (Hatch et Slack). Ces deux mcanismes de photosynthse prsentent un fractionnement isotopique diffrent. Ainsi, les produits issus des plantes C4, tels que les sucres et lalcool driv par fermentation, prsentent des teneurs en carbone 13 plus leves que celles de leurs homologues provenant des plantes C3. La plupart des vgtaux tels que la vigne et la betterave appartiennent au groupe C3. La canne sucre et le mas appartiennent au groupe C4. Ainsi, la mesure de la teneur en carbone 13 permet de dtecter et quantifier le sucre dorigine C4 (sucre de canne ou isoglucose de mas) ajout aux produits drivs du raisin (mots de raisins, vins...) ou au miel. Le principe de la SMRI consiste mesurer le rapport isotopique dun analyte transform en un gaz simple, reprsentant isotopique de lchantillon initial, avant dentrer dans la source dions du spectromtre. Le systme peut mesurer diffrents rapports isotopiques (2H/1H, 15N/14N, 13C/12C, 18O/16O et 34S/32S) en continu respectivement sur des gaz de H2, N2, CO2, CO et SO2. Dans le cas du carbone, le rapport 13C/12C est naturellement constant dans tous les produits biologiques, mais peut varier dune source de carbone lautre (CO2 de latmosphre, plantes C3 et C4, carbone des animaux, etc.). Il est donc facile de dtecter si une de ces diffrentes sources a t mlange une autre car la proportion 13C/12C dans le produit aura chang par rapport celle du produit naturel. Pour plus de dtails thoriques et pratiques, le lecteur est encourag lire MeierAugenstein [15], qui prsente tous les aspects de lutilisation du systme SMRI, dtaillant la prparation de lchantillon, la drivatisation, ltalonnage isotopique, etc., et donne des exemples de nombreuses applications sur les armes et parfums, vins, jus de fruits, huiles vgtales et miels avec plus de 160 rfrences. Le critre isotopique final, appel (delta), calcul et utilis pour dterminer la conformit des chantillons, prend en compte le rapport isotopique 13C/12C des sucres du miel ainsi que les rapports isotopiques 13C/12C des protines du miel : (13C/12C) = (13C/12C)protines - (13C/12C)miel Les articles de rfrence dans ce domaine sont ceux de White, Winters, et Martin [14, 16], la fois pour la mthode

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initiale de dveloppement (13C mesurs sur des miels) et la mise au point de la mthode amliore (mthode du standard interne : mesure de 13C sur le miel et ses protines). Comparaison microscopie optique/SMRI Nous avons montr dans notre tude que la microscopie est beaucoup plus sensible que la SMRI. linstar de la SMRI, la microscopie optique est spcifique des sirops de canne sucre. Cependant, la SMRI est applicable lensemble des sirops dits de type C4. Le temps ncessaire pour raliser une analyse microscopique est infrieur celui ncessaire la mise en uvre de la SMRI car cette dernire fait notamment intervenir une tape de combustion de la matire organique dans un microanalyseur combustion (figure 3). Mais il est vrai que lutilisation de la microscopie en routine nest pas mcanisable. En revanche, les deux techniques ncessitent une lecture experte. Lanalyse microscopique requiert une certaine habitude dans la lecture de la lame de verre sur laquelle est ralis le dpt de lchantillon pour la reconnaissance des lments figurs microscopiques observs, tandis que la SMRI ncessite un spcialiste de lutilisation dun tel spectromtre de masse. Il reste que lorsque les conditions dexpertise sont runies, lanalyse microscopique affiche une sensibilit de lordre de 2 % alors quelle est de 7 10 % pour la SMRI(5). Le tableau II prsente titre dexemple une partie des rsultats obtenus

sur les chantillons analyss : 14 chantillons sur 43 ont t dtects et classs comme adultrs par la SMRI, soit 32,5 % sur lensemble des chantillons analyss, tandis que la microscopie en dtecte 17 sur 43, soit 39,5 %. La comparaison des performances des deux techniques chantillon chantillon indique un accord de 85,7 % pour les miels adultrs et 82,8 % pour les miels conformes. Par ailleurs, la SMRI dtecte deux chantillons adultrs que la microscopie ne met pas en vidence. Cette diffrence peut tre due soit une inhomognit du prlvement de miel, soit au fait que le sirop utilis na pas pour origine la canne sucre. Enfin, la microscopie met en vidence cinq chantillons adultrs pour lesquels la SMRI a t insensible. Aucune explication concernant la prparation de ces chantillons ou leurs caractristiques physico-chimiques nont pu tre avances, indiquant par consquent une sensibilit suprieure de la microscopie par rapport la SMRI.

Microscopie lectronique
Le pouvoir sparateur dun microscope optique (photonique) est limit par la longueur donde de la lumire visible. Aucun dtail infrieur 0,2 m ne peut tre observ et seule lutilisation de particules acclres de plus courte longueur donde permet daugmenter le grossissement. Cest le principe utilis par la microscopie lectronique balayage (MEB). Imagine pour la premire fois dans les annes 30 par Knoll [17] et von Ardenne [18-19], puis dveloppe par Zworykin, Hillier et Snyder [20] dans les laboratoires RCA aux tats-Unis dans les annes 40, la MEB prend son essor entre 1948 et 1965 grce aux progrs techniques de la tlvision et des dtecteurs dlectrons. Dans ce domaine, il faut noter aussi limportante contribution de Ernst Ruska (physicien allemand) qui en 1933 construisit le premier microscope balayage transmission en associant plusieurs lentilles magntiques (quivalent des lentilles optiques mais pour les lectrons) et partagea le prix Nobel de physique en 1986 avec Gerd Binnig et Heinrich Rohrer. Les microscopes lectroniques balayage utilisent donc des lectrons acclrs comme source de rayonnement de courte longueur donde pour plusieurs raisons : - leur faible masse permet de les acclrer et de les focaliser au moyen dun champ lectromagntique, - une source dlectrons est facile mettre en uvre (contrairement une source de particules de plus haute nergie comme les rayons X par exemple), - les lectrons sont plus facilement focaliss que des particules plus lourdes, - linteraction des lectrons avec la matire est plus faible que pour des particules plus lourdes.

Figure 3 - Spectromtre de masse pour la dtermination des rapports isotopiques des sucres et des protines dans le miel.
Finnigan MAT 253 avec introduction DUAL INLET (avec laimable autorisation de J. Savarino, Laboratoire de glaciologie et gophysique de lenvironnement, CNRS/UJF).

Tableau II - Analyse isotopique de diffrents miels du commerce selon la mthode de rfrence utilisant la SMRI.
AS : anneau sclreux, OD : origines diverses, F : France, H : Hongrie. Extraits parmi 43 chantillons.
13

chantillon (origine) Toutes fleurs (F) Acacia (H) Lavande (F) Acacia (OD) Fort (F) Toutes fleurs (OD) Toutes fleurs (OD)

C/12C miel

13 12 C/ C protines

0 - 0,2 0,2 - 1,5 0,1 - 1,2 - 1,2

Examen microsc. AS ----AS --AS AS

SMRI conforme conforme conforme adultr conforme adultr adultr

Microsc. adultr conforme conforme adultr conforme adultr adultr

- 25,7 - 25,2 - 25,9 - 23,9 - 24,9 - 24,4 - 24,7

- 25,7 - 25,4 - 25,7 - 25,4 - 24,8 - 25,6 - 25,8

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Ces avantages font que la microscopie lectronique est utilise dans des domaines aussi varis que les matriaux, lagroalimentaire ou la micro-lectronique. Elle est souvent utilise pour la caractrisation et le contrle des procds de fabrication. Le fort grossissement quil est possible dobtenir combin la grande profondeur de champ en font un outil de diagnostic exceptionnel pour la microfabrication. Il existe deux types de microscopes lectroniques balayage : les microscopes transmission qui permettent lobservation dchantillons dune paisseur suffisamment faible pour tre transparents aux lectrons (quelques dizaines de nanomtres), et les microscopes rflexion qui rendent possible lobservation de la surface dobjets massifs. Dans les deux cas, limage est construite point par point, do lappellation de microscope balayage. Le fonctionnement et la mise en uvre dun appareil de MEB ne seront pas dtaills ici mais le lecteur pourra se rfrer la littrature cite [21-24]. Une variante rcente de la MEB est actuellement de plus en plus utilise : la microscopie lectronique environnementale balayage ou ESEM (de langlais environmental scanning electron microscopy ). Cette technique permet lobservation directe des matriaux (biologiques ou non) sensibles leau, sans ncessiter de longues et fastidieuses prparations des chantillons, en particulier ltape de mtallisation qui consiste revtir les chantillons de faible conductivit lectrique dune mince couche mtallique afin dviter les effets de charge [25-26]. Ces deux techniques (MEB et ESEM) ont t appliques la dtection de ladultration des miels. Lide de base tait de rechercher, de mettre en vidence et de caractriser les grains damidon. En effet, dans la plupart des chantillons de miel que nous avons observs par microscopie optique au laboratoire, nous avons constat la prsence de grains damidon de petite taille (figure 4), peu gonfls, et toujours en quantit extrmement faible par rapport aux pollens (quelques grains damidon pour une centaine de pollens). La littrature spcialise dcrit lamidon comme un contaminant naturel des miels lorsquil ne dpasse pas cette proportion. Or des chantillons en provenance du Mexique et dArgentine notamment contenaient une grande quantit damidon et prsentaient un tat microscopique relativement sale , cest--dire avec un grand nombre de fragments de cellules vgtales, assez peu de pollens, des levures (figure 5).

Figure 5 - Clichs de microscopie photonique dun chantillon de miel prsentant de nombreux fragments vgtaux, des levures, des dbris divers et peu de pollens, en lumire blanche gauche et en lumire polarise droite. Les fragments et dbris vgtaux apparaissent en blanc grce au phnomne de diffraction de la lumire.
Microscope Carl Zeiss, objectif Plan-Neofluor x2,5/0,075, grossissement x250.

Par ailleurs, lanalyse en microscopie lectronique dchantillons damidon de bl et de mas (utiliss par lindustrie comme matire premire pour llaboration de sirops de sucre) montre des grains dont la morphologie est trs diffrente, ce qui autorise une identification assez facile de lorigine botanique de lamidon. Il nous est clairement apparu que la microscopie lectronique(6) pouvait constituer une technique alternative pour mettre en vidence ladultration des miels par des sirops de sucre industriels ne prsentant pas de traceurs cellulaires. Tel est le cas par exemple des sirops issus de lhydrolyse de lamidon du mas ou de la betterave sucrire. Les essais ont t raliss sur un chantillon de miel multifloral du commerce. Ce dernier a t choisi aprs vrification de la prsence damidon par microscopie optique en lumire polarise. Ce miel prsentait galement une cristallinit leve et grossire. Les analyses physico-chimiques, organoleptique et pollinique conduisaient le considrer comme un miel de qualit mdiocre sans pouvoir conclure sa non-conformit. Par ailleurs, des chantillons damidon de bl et de mas ont galement t observs par MEB afin de faciliter la comparaison des images obtenues. Les observations ralises en microscopie environnementale (ESEM), avant toute extraction, sur lchantillon de miel ne nous ont pas donn satisfaction car les conditions dobservation ntaient pas adaptes. Aprs extraction, cest la phase la plus dense (trs riche en sucres) qui contient le plus damidon et une observation en microscopie environnementale montre des grains damidon de tailles varies, de 2 10 m (cf. figure 6), aux contours le plus souvent anguleux. En microscopie lectronique balayage, on constate que le vide de la mtallisation (10-2 torr) et le vide du microscope

Figure 4 - Grain damidon observ dans un chantillon de miel.

Microscope Carl Zeiss sous lumire polarise, objectif A-Plan 40x/0,65, grossissement x400.

Figure 6 - Clich ESEM de grains damidon extraits dun chantillon de miel commercial adultr et de qualit mdiocre.

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pour la mise en vidence dune incorporation de sirops de sucre industriels de type C4 aux miels. Cet outil est admirablement complt par la microscopie lectronique qui permet de dtecter les ajouts de sirop de mas et de faon gnrale de sirops dorigine C3 et C4. La microscopie lectronique balayage a t fort instructive plus dun titre. Tout dabord, elle a permis de rpondre la question : lamidon est-il un constituant naturel des miels ? Nous savons maintenant de faon plus prcise quil nen est rien, et que tout est question de quantit. De plus, la bonne adquation de la technique la reconnaissance et Figure 8 - Clich MEB dun grain damidon lidentification des grains damidon Figure 7 - Clich MEB dun grain damidon prextrait dun miel multifloral adultr et de dans les chantillons biologiques sentant des craquelures de la couche de mtalqualit mdiocre. lisation dues au vide pouss du microscope. tels que le miel, permet denvisager son utilisation pour le contrle et/ou dgradent souvent laspect de la surface des grains la confirmation du diagnostic de conformit des chantillons. damidon : craquelures de la couche de mtallisation au cours Compte tenu des volutions technologiques et de la de lobservation (figure 7). Linfluence de la mtallisation sur dmocratisation de ce type de technique, on est en droit laspect des formes ou lments biologiques observs est un desprer que la microscopie lectronique devienne une point dlicat en microscopie lectronique balayage et peut technique de routine aisment accessible aux laboratoires amener une certaine confusion dans linterprtation de ce qui en charge, entre autres, du contrle de qualit des miels. Elle est observ. Cest la raison pour laquelle la comparaison de reprsente une solution trs intressante lorsque lon est liconographie trouve dans la littrature scientifique spciaconfront une adultration avec des sirops issus de plantes lise et sur de nombreux sites Internet dune part, et des sucres de type C3 telles que lrable, la betterave et images obtenues sur des chantillons damidon de bl et de de nombreux fruits. Rappelons qu lheure actuelle, la mas pur (rfrence Prolabo) dautre part nous a permis spectromtrie de masse du carbone 13 est sans secours didentifier lorigine des grains damidon extraits du miel pour ce type dadultration. multifloral tudi (figure 8). Nous avons constat la prsence de grains damidon de forme anguleuse plus ou moins carre provenant donc damidon de mas, mais galement de grains en forme de cur prsentant une fente de dhiscence(7) centrale assez prononce indiquant une origine probable de plantes de type lgumineuses. En terme quantitatif, il est clairement apparu que la proportion la plus leve tait en faveur des grains de forme anguleuse, tendant prouver la prsence de produit(s) issu(s) du mas. Or comme nous lavons dcrit plus haut, la plupart des plantes visites par les insectes pollinisateurs tels que labeille ne contiennent damidon ni dans le nectar, ni dans les pollens quelles produisent. Ladultration de lchantillon tudi est donc maintenant avre.

Conclusion
Ces deux tudes en microscopie optique et lectronique montrent tout lintrt pour le chimiste de sintresser dautres domaines des sciences. Une approche purement chimique ou physique du problme de ladultration naurait pas pu apporter ce point de vue sur les chantillons et la dtection des fraudes dans le miel naurait pu tre ralise aussi simplement. Nous avons vu que la microscopie optique se rvle plus performante que la spectromtrie de masse des rapports isotopiques qui est encore aujourdhui la technique de rfrence. La recherche de traceurs cellulaires (cellules de canne sucre) constitue une approche trs rapide et simplifie

Notes et rfrences
(1) Pline lAncien (n en 23 aprs J.-C. Cme, mort en 79 Stabies, prs de Pompi, lors de lruption du Vsuve), crivain et naturaliste romain, auteur notamment dune encyclopdie clbre et colossale intitule Histoire naturelle. (2) Alinorm 87/20, amlioration de la directive 74/409/CEE, remplace depuis par la norme 2001/110/CE. (3) Un test chimique classique caractristique de la prsence damidon est la mise en prsence dune solution aqueuse de diiode (lugol, 10 % KI, 5 % I2, complt avec H2O 100 mL). Cette dernire, initialement jaune, vire au violet en prsence damidon par complexation. (4) Boraginaceae, Compositae, Labiatae, Legumonisae, Myrtaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae, Amaryllidaceae, Iridaceae et Liliaceae.

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Chimie des aliments et du got

(5) Une volution importante de la technique augmente nettement cette sensibilit qui est aujourd'hui de lordre de 5 % grce au couplage HPLCSMRI qui permet de dterminer la quantit de carbone 13 dans chaque sucre (glucose, fructose, saccharose, etc.). (6) Les caractristiques techniques des microscopes utiliss dans cette tude sont disponibles sur www.lactualitechimique.org, page lie la prsentation de cet article (fichier pdf tlchargeable gratuitement). (7) La dhiscence est une ouverture superficielle de la surface externe dune cellule gnralement due un effet de scheresse du milieu. Les spores et graines des plantes sont parfois projetes au loin par ce phnomne qui libre une force mcanique suffisante. [1] Cordella C., Microscopie optique et lectronique, Caractrisation des aliments et dtection de ladultration : application aux miels. Intgration doutils chimiomtriques et informatiques aux dveloppements analytiques, Thse de doctorat, Universit de Nice Sophia-Antipolis, 2003. [2] Pangaud C., Revue bibliographique des intoxications de labeille, Premire thse, Facult des sciences de lUniversit de ClermontFerrand, 1960. [3] Gaignebet C., A Plus Hault Sens. Lsotrisme spirituel et charnel de Rabelais, Tome II, d. Maisonneuve et Larose, Paris, 1986. [4] Sanford M.T., Honey Adulteration, Fact sheet ENY-103, 1999, Entomology and Nematology Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, http://edis.ifas.ufl.edu/AA155. [5] Schoch T.J., Maywald E.C., Industrial Microscopy of Starches, Starch, Chemistry and Technology, R.L. Whistler, E.F. Paschall (eds), Academic Press, New York. 1967, Vol. 2, p. 637-647. [6] Wivinis G.P., Maywald E.C., Photographs of starches, Starch, Chemistry and Technology, R.L. Whistler, E.F. Paschall (eds), Academic Press, New York. 1967, Vol. 2, p. 649-685. [7] McCready R.M., Starch and dextrin, Methods in Food Analysis. Physical, Chemical, and Instrumental Methods of Analysis, M.A. Joslyn (ed), 2nd Ed., Academic Press, New York, 1970, p. 541-563. [8] Lobreau-Callen D., Clment M.-C., Les Miels, Techniques de lIngnieur, 2001, F2 Agroalimentaire, F7000-1 F7000-20. [9] Franchi G.G., Bellani L., Nepi M., Pacini E., Types of carbohydrate reserves in pollen: localization, systematic distribution and ecophysiological significance, Flora, 1996, 191, p. 143. [10] Merlet P.Y., Le Miel, Thse de doctorat vtrinaire, Universit Paul Sabatier, Toulouse, 1981. [11] Louveaux J., Maurizio A., Vorwohl G., Methods of mellissopalynology, Bee World, 1978, 59(4), p. 139. [12] Kerkvliet J.D., Shrestha M., Tuladhar K., Manandhar H., Microscopic detection of adulteration of honey with cane sugar and cane sugar products, Apidologie, 1995, 26, p. 131. [13] Antinelli J.-F., Clment M.-C., Moussa I., Cordella C., Faucon J.-P., Dtection de canne sucre dans les miels par analyse isotopique et microscopique : tude et comparaison, Ann. Fals. Exp. Chim., 2001, 94(954), p. 13. [14] White J.W., Internal standard stable carbon isotope ratio method for determination of C-4 plants sugars in honey: collaborative study; Evaluation of improved protein preparation procedure, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1992, 75(3), p. 543. [15] Meier-Augenstein W., Applied gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1999, 842, p. 351.

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Christophe B.Y. Cordella (auteur correspondant) est chimiomtricien et ingnieur de recherche INRA au Laboratoire de chimie analytique dAgroParisTech*.
C.B.Y. Cordella

Issam Moussa est ingnieur dtude CNRS lInstitut des Sciences de lvolution (ISEM), Montpellier**.
* Laboratoire de Chimie Analytique, INRA/INAPG AgroParisTech, UMR 214 Ingnierie Analytique pour la Qualit des Aliments, 75005 Paris. Courriel : christophe.cordella@paris.inra.fr ** ISEM, UMR 5554 du CNRS, Universit Montpellier 2, place E. Bataillon, bt. 22 case courrier 064, 34095 Montpellier Cedex 05.

I. Moussa

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