INHIBICION ENZIMATICA

La actividad enzimtica se puede inhibir, es decir, reducir o eliminar la actividad enzimtica o cataltica de enzimas especficas. La inhibicin puede ser: Irreversible - el inhibidor se une covalentemente a la enzima, casi siempre a un grupo de la cadena lateral de los amino cidos en el foco activo. La enzima queda inactiva permanentemente. Por ejemplo, la aspirina o cido acetilsaliclico (ASA) inhbe irreversiblemente la accin de la sintetasa de prostaglandina:

Algunas prostaglandinas producen dolor e inflamacin. Al quedar bloqueada su sntesis se reduce la inflamacin y se alivia el dolor. Reversible: el inhibidor puede disociarse de la enzima porque no se une por enlaces covalentes. Esta inhibicin puede ser competitiva o no-competitiva. (a)Inhibicin Competitiva - el inhibidor competitivo es muy similar al sustrato normal de la enzima. Dada esa similitud estructural, este tipo de inhibidor se une reversiblemente al foco activo de la enzima.

El inhibidor forma un complejo enzima-inhibidor equivalente al complejo enzima-sustrato:

Como hay un equilibrio, entonces la rapidez de ambas reacciones se iguala: R1 = R-1 por lo que: k1[ E ][ I ] = k-1[ EI ] de aqu que:

donde KI es la constante de disociacin de EI (o constante de inhibicin). Esta constante se usa para describir cun fuerte se une el inhibidor a la enzima. De acuerdo a esta expresin,

por lo que [ EI ] es directamente proporcional a [ I ] e inversamente proporcional a KI. O sea, a mayor valor de KI , ms dbil la unin del inhibidor con la enzima, el complejo EI se disocia fcilmente, y el foco activo vacante puede estar disponible para unirse a su sustrato. No hay reaccin productiva mientras el inhibidor se une a la enzima,por lo que la actividad de la enzima declina. El efecto del inhibidor competitivo en la actividad enzimtica se revierte por un aumento en la concentracin del sustrato: a altas concentraciones todos los focos activos se combinan con el sustrato y la actividad enzimtica se normaliza. La Vmax se mantiene constante con o sin inhibidor competitivo. Sin embargo, cuando est presente el inhibidor Km aumenta y Vmax nunca se alcanza:

Por la grfica de Lineweaver Burk observamos que, como la inhibicin competitiva no afecta la Vmax: el intercepto en "y" (1/Vmax) es identico para todas las posibles concentraciones del inhibidor competitivo; todas la lneas intersectan el el mismo punto en el eje de "y":

A baja [S] ([S] <<Km), la enzima est predominantemente en la forma libre, E. El inhibidor competitivo puede combinarse con E, por lo que la presencia del inhibidor disminuye la rapidez cuando [S] es baja. A estas condiciones la expresin de rapidez es: vo = Vmax[S]/Km.

Como la rapidez inicial es proporcional a Vmax/Km, la presencia del inhibidor afecta la pendiente de la lnea de la grfica de Lineweaver-Burke, que es precisamente el recproco de Vmax/Km,o sea,(Km/Vmax). El valor de la pendiente aumenta. Tambin hay un aumento en Km segn aumenta [ I ]. Aumentando [ I ] causa un aumento en Km/Vmax. Por lo tanto, en la inhibicin competitiva se afecta la pendiente pero no hay efecto en Vmax. (b) Inhibicin No-Competitiva: el inhibidor se combina con la enzima en un lugar distinto al foco activo. Tanto EI como EIS se forman:

La unin del inhibidor afecta la configuracin tridimensional de la enzima y bloquea la reaccin. Este tipo de inhibidor no compite directamente con el sustrato para unirse a la enzima (no afecta la unin ES), por lo tanto, este tipo de inhibicin no es reversible cuando aumenta la concentracin del sustrato. Esta inhibicin disminuye la Vmax segn aumenta [ I ], pero no afecta Km (la enzima puede unirse al sustrato):

Esto implica que se afecta la pendiente Km/Vmax y el intercepto en "y" en la grfica de Lineweaver Burk:

Las lneas de diferentes [ I ] intersectan en puntos distintos en "y". Sus pendientes son diferentes, pero es el mismo Km en todos los casos (intersectan el mismo punto en "x"). Inhibicion Incompetitiva: el inhibidor se combina slo con ES (no con la enzima), por lo que el inhibidor ejerce su efecto slo a altas concentraciones de sustrato en las que hay gran cantidad de complejo enzima-sustrato (ES). Por lo tanto, variando la [S] no afecta o evita la unin con el inhibidor. Por otro lado, es evidente que el sustrato y el inhibidor se combinan con la enzima en lugares diferentes.

A bien baja concentracin de sustrato ( [S]--->0), la enzima est libre (E). Como el inhibidor no se combina con E, ste no afecta la velocidad, asi como tampoco la pendiente Km/Vmax, por lo que las pendientes son independientes de la concentracin del inhibidor. Slo se afectan los interceptos en "y" (1/Vmax) y en "x" (-1/Km) . Como resultado se obtienen una serie de lneas paralelas cuando se usan diferentes concentraciones del inhibidor.

Resumen: Efecto cintico en reaccin inhibida relativas a la reaccin sin inhibir:

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Sabiendo que las enzimas son proteinas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. La fosfatasa cida es ms activa a pH 5,0, mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen mxima actividad cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8. El pH per se no afecta la actividad enzimtica, sino la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. ENZIMA Pepsina Tripsina Catalasa Arginasa Fumarasa Ribonucleasa pH OPTIMO 1,5 7,7 7,6 9,7 7,8 7,8

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EFECTO DE LA TEMPERATURA

Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 45 0 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 370 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 00 C. Ir al principio

EFECTO DE ACTIVADORES

Ciertas enzimas se encuentran como aproenzimas o zimogenos que son inactivos. El tripsingeno es convertido en tripsina por la misma accin de la tripsina, que remueve un hexapptido.
Tripsina

Tripsingeno

Tripsina + Val (Asp)4 lisina

Otra forma de activacin consiste en mantener los grupos SH reducidos. Estos grupos pueden formar parte de centros activos de ciertas enzimas. Si se oxidan estos grupos a -S-S- la enzima se inactiva. As tenemos que la enzima papaina, se inactiva despus de exponerla al oxgeno; pero cuando se le aade un reductor apropiado la enzima se reactiva. Los grupos -S-S- se convierten en -SH, activndose la enzima. Otra forma de activacin requiere la presencia de otra sustancia que se enlaza al sitio alostrico, el compuesto que se enlaza se denomina un efector alostrico. El centro alostrico es bien especfico para el efector o modulador alostrico. Ir al principio

ESPECIFICIDAD ABSOLUTA
Oxgeno

L-aminocido
L-aminocido oxidasa

a -cetocido + NH3 + H 2 O 2 .

Oxgeno

D-aminocido
D-aminocido oxidasa

a -cetocido + NH3 + H 2 O 2

En este ejemplo se muestra la estereo-especificidad. Una enzima puede tener una especificidad ptica para isomeros D o L. Hay enzimas que muestran especificidad absoluta como la aspartasa, que cataliza la adicin reversible de amonaco al doble enlace del cido fumrico, pero no al de otros cidos insaturados. HOOC CH = CH COO + NH4
+

HOOC CH2 - CHNH2 - COO + H

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ESPECIFICIDAD RELATIVA
Ciertas enzimas muestran especificidad relativa, ya que actan sobre muchos compuestos que poseen un rasgo estructural comn. Por ejemplo, la fosfatasa del rin cataliza la hidrlisis de esteres fosfato del cido fosfrico a diferentes velocidades, la amilasa hidroliza el almidn independiente de su origen. Las proteasas y lipasas hidrolizan proteinas y lpidos.

Del estudio de la especificidad del substrato que exhiben las enzimas, surge la idea de una complementaridad, o relacin semejante a la de una llave y una cerradura, entre la molcula del substrato y una zona determinada de la superficie de la molcula de la enzima, la cual recibe el nombre de centro activo o centro cataltico.

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INHIBICIN ENZIMATICA

Mediante el uso de inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin muy valiosa sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas. a. Inhibicin irreversible: Este tipo de inhibidores forman un enlace covalente con las enzimas cerca del centro activo. Un ejemplo son los gases nerviosos, como el

fluorofosfato de diisopropilo (DFP) que forma un complejo con la enzima acetilcolinesterasa. Los animales envenenados con este gas quedan paralizados, debido a la imposibilidad de transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos.

Ester di-isopropil fosfrico de la enzima (inactivo) b) Inhibicin competitiva: Es cuando el inhibidor compite con el substrato por la unin con el centro activo de la enzima. Este tipo de inhibicin puede reducirse si se aumenta la concentracin de substrato.
-

OOC - CH2 - CH2 - COO Succinato Succinato

OOC - CH Deshidrogenasa

CH - COO- + 2H + Fumarato

COO I

CH2
I

Malonato (inhibidor competitivo)

COO En la inhibicin competitiva la enzima se combina con el inhibidor para formar un complejo enzima-inhibidor: E+I EI en competencia con la reaccin normal E +S ES

La sulfanilamida (bactericida) interfiere con la sntesis del cido flico compitiendo con el cido p-aminobenzoico, de una forma competitiva.

HOOC-- NH2 cido p- amino benzoico = fenil a. Inhibicin no competitiva.

NH2 SO2 - - NH2 sulfanilamida

Esta inhibicin se caracteriza por que no se puede revertir el efecto del inhibidor, aumentando la concentracin del substrato. Por ejemplo la inhibicin de la deshidrogenasa del gliceraldehido-3-fosfato por la yodoacetamida:

Enzima-SH + I-CH2 CONH2

Enzima-SCH2 CONH2 + IH

La deshidrogenasa del gliceraldehido-3 fosfato puede ser inhibida tambin por el cido iodo-actico: Enzima-SH + ICH2 COOH c) Inhibicin por metales. Ciertos metales como el plomo, mercurio y arsnico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos -SH libres Enzima-SCH2 COOH + IH

Enlace Recomendado ENZIMAS: http://www.arrakis.es/~lluengo/biologia.html

Reacciones multisustrato Hay muchas enzimas de este tipo en la clula (1S * 2P; 2S * 1P; 2S * 2P; 3S). Hay que tener en cuenta que los coenzimas se contabilizan como sustratos, as veremos anlisis de reacciones con NAD, por ejemplo. Reacciones bisustrato Dentro de todas estas, nosotros analizaremos de forma cintica las reacciones bisustrato. Principalmente trataremos de los mecanismos de reaccin con la terminologa de Cleland. El estudio cintico de estos modelos es sencillo si las enzimas se ajustan a una cintica micaeliana. Podemos determinar este comportamiento mediante un estudio de velocidad anlogo a los realizados anteriormente, salvo que ahora, al tener varios sustratos, hacemos que vare uno de ellos, dejando el resto constante y saturante. La velocidad entonces se hace independiente de la concentracin de los dems sustratos, dndonos si es el caso, un cintica hiperblica. Hay varios modelos, pero estudiaremos estos dos, los mayoritarios.

Mecanismo ping"pong, o de desplazamiento doble. Consiste en la formacin de dos complejos binarios, presentando la caracterstica de no requerir que primero entren los sustratos y luego los productos. Se trata, por tanto, de la entrada de uno de los sustratos, quedndose la enzima con alguna parte del sustrato, saliendo el resto como un primer producto. Una vez tengamos E', se une el segundo sustrato, que recibe esa parte que tom la enzima, resultando un segundo producto. Hay que tener en cuenta que ese algo que se lleva la enzima para luego pasrselo al segundo sustrato puede ser desde un grupo funcional relativamente grande, hasta un electrn, como ya veremos. Mecanismo secuencial, o de desplazamiento simple. Se caracteriza por la formacin de un complejo ternario y dos binarios, adems, de por la entrada de los dos sustratos primero y la salida a continuacin de los dos productos. As como en el modelo anterior no es difcil encontrar un orden, ya que aquel sustrato que posea el grupo a transferir deber ser el

primero, en este caso se complica bastante. De hecho, existen dos tipos. El modelo secuencial ordenado, en el que siempre los sustratos y los productos presentarn un mismo orden de entrada y salida y uno al azar, en el cual podrn entrar y salir los sustratos y productos de forma aleatoria, pudiendo la enzima escoger el camino deseado para escoger sustrato independientemente de la salida que tendrn los productos, que tambin ser aleatoria. En definitiva, podr elegir el mecanismo de accin.
Estos tres modelos son los mayoritarios y los que estudiaremos. Cintica de las reacciones bisustrato Antes de presentar la ecuacin de Alberty, que cumplen todos los modelos, hay que hacer hincapi en la cintica micaeliana de estas reacciones. Como ya hemos dicho, si hacemos un sustrato variable manteniendo el otro constante y saturante, obtendremos una hiprbola rectangular correspondiente al modelo M&M (siempre que tratemos con una enzima micaeliana, si es alostrica evidentemente no nos dar esta representacin). En esa curva o mediante linearizaciones podremos determinar las constantes Vmax y Km, pero estas sern aparentes si la concentracin del sustrato constante no es saturante. Esto es lgico, ya que entonces la velocidad mxima no podr alcanzarse al no estar ocupada toda la enzima con el sustrato (complejo que consideraramos Ea). Teniendo esto claro, veamos ahora la ecuacin general de Alberty.

Como dato, decir que el termino entra parntesis del denominador, no aparece en el mecanismo Ping"Pong. Esto nos permitir en el futuro discriminar un tipo del otro. En esta ecuacin aparecen trminos, que aunque se entiende de forma conceptual, es conveniente que los describamos:

KmA: Se trata de la constante de Michaelis para el sustrato A cuando mantenemos constante y saturante [B]. KmB: Se trata de la constante de Michaelis para el sustrato B cuando mantenemos constante y saturante [A]. KsA: Se trate de la constante de disociacin del primer complejo binario EA, el cual obtenemos en el modelo secuencial ordenado). KsB: Se trata de la constante de disociacin del complejo primario EB, el cual obtenemos en el modelo secuencial al azar. En el modelo ordenado no tiene ningn sentido describirlo, slo nos servir como medio para determinar el orden, aunque habr otros. Como nota, hay que apuntar que en el mecanismo secuencial al azar se cumple la siguiente relacin: KsA KmB = =KsB KmA. Por tanto, podramos sustituir un producto por el otro en la ecuacin general de Alberty, evidentemente, slo en los casos correspondientes a un modelo secuencial al azar. Vmax: Ser igual determinada con A o con B variable, siempre y cuando, el otro est en condiciones constantes y saturantes.

Para asegurar esta representacin hiperblica a [B] constante, realizamos la transformacin de la ecuacin general de Alberty, al igual que lo habamos hecho en otras ocasiones. El resultado nos muestra claramente la dependencia de V'max de la concentracin de sustrato al igual que K'mA. Estas constantes corresponderan a las obtenidas cuando el sustrato constante no llega a la saturacin. Si hacemos [B] constante y saturante:

 KmB del denominador (para V'max) se hace despreciable frente a [B], de modo, que podemos eliminarla. El resultado, . El producto KsA KmB (para K'mA) y KmA del numerador y K'mA del denominador se hacen despreciables frente a [B], pudiendo eliminar esta concentracin. El resultado,