Anlisis Microbiolgico de Cereales y Productos Derivados.

Prctica No4 Muestra: Torta marmolada (De Despensa) Analista: Gabriel M. Siegfried N. Fecha: 12/9/12 (Preparacin e inoculacin de la Temperatura: muestra) 25oC Fecha: 14/9/12 (Lectura y anlisis de resultados) Temperatura: 24oC Objetivo del Anlisis Realizar el anlisis microbiolgico de cereales y sus derivados, interpretar los resultados y posterior clculo. Fundamento La microbiota de los granos de cereales y leguminosas es la proveniente del suelo y el ambiente del depsito, adems de la adquirida durante el procesamiento. Aunque tienen alta concentracin de carbohidratos y protenas, su baja actividad de agua restringe el crecimiento microbiano si se almacenan adecuadamente. Las condiciones de almacenamiento, tales como el contenido de humedad de los granos, la temperatura y el tiempo de almacenamiento, son factores crticos en el control de los microorganismos. Las distintas variedades de granos no presentan grandes diferencias entre s, respecto a las poblaciones microbianas. Los mohos, las levaduras y la mayora de las bacterias mesoflicas presentes, son indgenas de las plantas. Algunos tipos de granos estn constantemente contaminados con mohos tales como Cladosporium, mientras que otros contienen Aspergillus, Fusarium, Alternaria y otros. Los contaminantes bacterianos (coliformes, enterococos, E. coli) son aportados por los pjaros, insectos y roedores, los cuales estn ecolgicamente asociados a los granos. Para prevenir el crecimiento de mohos, el contenido de humedad de los cereales debe ser tan bajo como sea posible. Un aumento de 0,5% en el rango de 14,2 a 15,5% eleva la cantidad del desarrollo de Aspergillus amstelodami, A. repensy otros en un perodo de un mes. El ataque fngico de los granos comienza en el campo antes que el grano est maduro. La contaminacin con micotoxinas puede ocurrir en el campo o durante el almacenamiento y no est limitada a una regin geogrfica o climtica particular. La poblacin bacteriana en los granos es alta, pero el nmero de patgenos es bajo y suele incluir B. cereus, C. perfringens, C. botulinum y en algunos casos Salmonella spp. Los niveles de mohos y levaduras tambin son elevados, y si los granos estn secos mueren lentamente. La baja actividad agua de los granos de cereales evita el desarrollo de las Carrillo L85 bacterias, pero estos organismos pueden sobrevivir durante la molienda y contaminar las harinas. El nmero de microorganismos de las harinas de cereales es relativamente bajo debido a los agentes blanqueadores. Cuando las condiciones de humedad favorecen el crecimiento aparecen por lo comn las bacterias del gnero Bacillus y diversos tipos de mohos. Varias especies aerbicas formadoras de endosporos, son capaces de producir amilasa, la que les permite usar la harina y productos relacionados. Con una

humedad algo menor puede haber crecimiento micelial y formacin de esporas fngicas. Los panes caseros pueden presentar una alteracin limosa debida a especies amilolticas de B. subtilis y ocasionalmente B. licheniformis, B. cereus, B. firmus y B. firmus provenientesde la harina. Los panes producidos comercialmente carecen de humedad suficiente para permitir el crecimiento de microorganismos, excepto los mohos. stos aparecen cuando el pan es almacenado en un ambiente hmedo o envuelto mientras an est caliente, los ms comunes son Rhizopusstolonifer que crece a una aw>0,93 y Neurosporasitophila, pero tambin suelen desarrollar especies de Penicillium o Aspergillus cuyas esporas germinan a una aw entre 0,90 y 0,84. Las levaduras amilolticas de los gneros Saccharomycodes e Hyphopichiaproducen el pan yesoso. El deterioro de los productos de pastelera refrigerados, por ejemplo la masa de pizza, es causado principalmente por bacterias lcticas (Lactobacillus, Leuconostoc y en menor proporcin Streptococcus), alcanzando valores de 108 ufc/g en los productos alterados, pero los mohos se hallan en bajo nmero. Las tortas, en cambio, rara vez sufren un deterioro bacteriano debido a la alta concentracin de azcares pero son alteradas por los mohos; stos provienen de cualquiera de los ingredientes. Definicin y Caracterstica dela muestra Torta marmolada: Es una masa dulce que se prepara mezclando en partes Cacao y Vainilla, presenta una consistencia esponjosa; una vez cocida, se diferencian bien la zona de chocolate y de vainilla. Vas de contaminacin de la muestra: Durante el crecimiento de los granos cereales se desarrolla sobre su superficie: Una microflora epfita que se alimenta de las secreciones normales de las clulas de la planta y que recubren la superficie. Secundariamente se da una contaminacin de los granos de cereales y productos procedentes del suelo y del aire sobre todo durante la recoleccin. Durante el almacenamiento de los granos de cereales y productos procedentes de los mismos, si su contenido en agua supera ciertos mrgenes, pueden sufrir ataques microbianos causados generalmente por hongos y bacterias que producen alteraciones importantes: acidificacin, aparicin de gases, degradacin de determinadas sustancias contenidas en los granos y en ocasiones acmulo de metabolitos txicos como micotoxinas. Tambin pueden infectarse los cereales por las heces y secreciones de diversos parsitos. Los microorganismos tienen una singular importancia prctica durante el almacenamiento de los cereales que tan imprescindibles son durante todo el ao. Se calcula que entre los microorganismos y los parsitos animales ocasionan durante el almacenamiento la prdida del 10% de la cosecha mundial de cereales. En cambio, las prdidas producidas por los grmenes fitopatgenos como la roya y tizn; que tan graves daos causaban en otros tiempos, pueden ser erradicados gracias al tratamiento qumico desinfectante de las semillas. Durante el almacenamiento de los granos de los cereales el desarrollo microbiano est ntimamente relacionado con la temperatura y humedad del almacn. Se recomienda que el grano tenga un contenido de agua no mayor que el 14-15%, que la humedad relativa del aire no pase del 75% y que la temperatura est comprendida entre 10 y 18 C. Descripcin

Equipos: Estufa de cultivo microbiolgico: Aparato elctrico utilizado para la incubacin de muestras microbianas: bacterias, hongos, cultivos celulares, con el fin de dar las condiciones necesarias de temperatura a las cuales crezcan satisfactoriamente. Autoclave: Es un recipiente metlico de paredes gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a alta presin para realizar una reaccin industrial, una coccin o una esterilizacin con vapor de agua. La accin conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulacin de las protenas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproduccin de stos, cosa que lleva a su destruccin. Materiales: Mechero: Instrumento que utiliza como fuente de calor la combustin de gas, es utilizado para crear un ambiente asptico en el laboratorio de microbiologa, esterilizar materiales, etc. Micro pipeta: Instrumento de laboratorio empleado para succionar y transferir pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas analticas. Placas de Petri: Es un recipiente redondo, de cristal o plstico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo ms grande de dimetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermtica.Se utiliza en los laboratorios principalmente para el cultivo de bacterias, mohos y otros microorganismos, solindose cubrir el fondo con distintos medios de segn el microorganismo que se quiera cultivar. Erlenmeyer: Es un frasco de vidrio transparente de forma cnica, de base ancha y alargada, cuello muy estrecho, con una abertura en el extremo estrecho, generalmente prolongado con un cuello cilndrico. Es til para realizar mezclas por agitacin y para la evaporacin controlada de lquidos, ya que se evita en gran medida la prdida del lquido; adems, su abertura estrecha permite la utilizacin de tapones. Al disponer de un cuello estrecho es posible taparlo con un tapn esmerilado, o con algodn hidrfobo. Probeta: La probeta o cilindro graduable es un instrumento volumtrico, hecho de vidrio, que permite medir volmenes considerables con un ligero grado de inexactitud. Extensor: Es una esptula triangular que puede ser de vidrio o de acero, es utilizado para distribuir una muestra lquida que se siembra sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Medios de cultivo: Agar PCA: Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aerbicas en aguas, aguas residuales, productos lcteos y otros alimentos. Tambin es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas. Agar Saboraud: Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos. Tambin es til para el cultivo de levaduras. Agua peptonada: Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de inters sanitario. Agar Baird Parker: Medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Salmonella Shigella Agar: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

Bacillus Cereus Selectivo Agar: Medio diagnstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacilluscereus en alimentos. Mac Conkey Agar: Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Reactivos: Agua Destilada estril: Agua sometida a procesos de purificacin tanto qumica como biolgica. Descripcin de metodologa de trabajo: Tcnica de toma de muestra: Con Calador de Bolsa (para granos embolsados): Se introduce totalmente en la bolsa con la parte acanalada hacia abajo y se retira con un movimiento de rotacin hacia arriba para dejar caer el grano. Presenta distintas medidas de acuerdo al tipo de granos a muestrear. Con Calador cilndrico o calador sonda (mercadera a granel): Se introduce en la masa con los compartimientos cerrados, se abre dejando entrar los granos, se cierra y se extrae el calador, volcando luego su contenido sobre un lienzo o catre para su inspeccin. Con Saca muestras cucharn (mercadera a granel y en movimiento): Se introduce en el flujo de granos a intervalos frecuentes y regulares. Transporte de muestra: La muestra no posee muchas exigencias en el transporte, siendo bastante estable dentro de ciertos periodos de tiempo limitados. Debe mantenerse seca, a temperaturas controladas y protegidas del contacto con superficies contaminadas y corrientes de aire que puedan transportar carga microbiana (debe estar empaquetado). Preparacin de la muestra: La muestra debe haberse almacenado segn especificaciones, tomar no menos de 200 g representativos, cerciorarse que estos no posean humedad excesiva que pueda aumentar la carga microbiana. Se homogeniza y se inoculan las muestras en: PCA, BC, BP y McConkey se incuban a 37 C, y Saboraud se incuba a 30C. Anlisis microbiolgico: - Investigacin y recuento de Enterobacteriaceae lactosa positivo (coliformes). - Investigacin y recuento de Aerobios mesfilos totales. - Investigacin y recuento de Hongos y levaduras. - Investigacin y recuento de Bacillus Cereus. - Investigacin y recuento de Coliformes totales y fecales. - Investigacin y recuento de Staphylococcus aureus. - Investigacin y recuento de Salmonella sp. Clculos Agar McConkey: Agar Bacillus - 10-3: 221 -1 - 10 : 0 Cereus: Agar Baird Parker: - 10-2: 1 - 10-1: Ausencia - 10-1: >300 -3 -2 - 10 : Ausencia - 10 : Ausencia - 10-2: >300 -3 Agar PCA: - 10 : Ausencia - 10-3: >300 - 10-1: >300 Agar Saboraud: Agar Salmonella - 10-2: >300 - 10-1: Shigella: - 10-3: >300 Incontable - 10-1: Ausencia -2 - 10 : >300

Las Colonias presentes en el medio PCA y Baird Parker, en todas las diluciones, no se puede calcular, ya que requiere mayor dilucin. En el agar McConkey, las colonias presentes no se consideran representativas ya que son menores a 25 colonias. En el agar Bacilus Cereus no hubo formacin de colonias, tampoco en el Agar Salmonella Shigella Clculo de colonias en Agar Saboraud: - 10-1: Incontable, se visualizaba homogneas las colonias. - 10-2: >300 10-3:

Resultados Nombre de la Bacteria Aerobios mesfilos totales Coliformes Totales Staphylococcus Aureus Salmonella Mohos y Levaduras Bacillus Cereus

Criterio Microbiolgico 1.102 1.105/g 1.102 1.104/g 1 x101 1 x102 /g Ausencia 1.102 1.104/g 1.101/g

Resultado No se puede calcular No se puede calcular No se puede calcular Ausencia 2,2.106 UFC/ml Ausencia

Conclusin Mediante el anlisis microbiolgico del producto derivado de cereales, se pudo observar que la muestra contiene una carga microbiana excesiva. Las muestras en los medios PCA y Baird Parker superan los lmites estadsticos y se considera que la muestra no se ajusta a los criterios establecidos; se sugiere realizar mayores diluciones. El bizcocho exhibi ausencia se Salmonella spp. Shigella spp. y Bacilus Cereus. La carga microbiana de Coliformes es insignificante. Se debera repetir los anlisis por presentar exceso de aerobios mesfilos totales y estafilococos. Bibliografa Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas. Mara del Rosario Pascual Anderson, Vicente Caldern y Pascual http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/aguapep.htm http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/8%20granos%20y %20harinas.pdf http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/bacilcerselagar.htm http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm http://es.scribd.com/doc/28920899/CEREALES http://www.bccba.com.ar/bcc/images/00000651_Anexo%20A.pdf