Diagnosticul molecular in virusologie

AMPLIFICAREA TINTEI
PCR NASBA (nucleic acid sequenced based amplification)

AMPLIFICAREA SEMNALULUI
B-DNA (branched DNA)

B-DNA
Amplifies signal

PCR
Amplifies a Targeted Sequence

Target Sequence DNA Strand Double Helix DNA Strand

Chromosome

Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

No. of Cycles Target 1 2 3 4

No. Amplicon Copies of 2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,822

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

5 6

7 cycle = 128 Amplicon

20 30

PCR: Componentele Master Mix

ADN tinta Mg2+ Mn2+

Taq DNA Polimeraza

dNTP

Primeri Sens Antisens

The central dogma

RT- PCR
Reverstranscriere

+ PCR

DETECTIA AMPLICONULUI
Electroforeza in gel de agar colorare cu bromura de ethidiu si comparare cu markeri de GM cunoscuta Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare si apoi detectie (+/- spectrofotometrica)

Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare

Southern blot (more formally called an DNA blot)

Hibridizare
Avidin-horseradish peroxidase (Av-HRP conjugate)
AMPLICON

Biotin Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate

Hydrogen Peroxide
AMPLICON

BSA

Microwell Plate

Addition of Substrate

Capture Probe
BSA

Detectie spectrofotometrica

Add Stop Solution and Measure Absorbance

Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV

Fereastra serologica Nou-nascuti din mame seropozitive HIV Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN HIV/ml la 24 sapt

Diagnosticul infeciei VHC

TESTE SEROLOGICE EXEMPLE ELISA RIBA / Western Blot TESTE CALITATIVE RT-PCR APLICATII Nu pot diferenia ntre o infecie acut, cronic sau vindecat Diagnosticul infectiei active COMENTARII ELISA-sensibilitate mare, n populaii cu risc sczut de infecie are valoare predictiv mic Detecia timpurie a infectiei O singur determinare negativ-neconcludent

MOLECULARE

TESTE CANTITATIVE -Rt-PCR -b-DNA TESTE DE GENOTIPARE

Aprecierea Nu exclude diagnosticul rezultatelor terapiei infeciei

Secveniere Genotipuri nucleotidic, RFLP,Subtipuri LiPA Qvasispecii

Apreciaz durata tratamentului i prognosticul rspunsului virusologic susinut

 Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B

Riscul de ciroza creste cu nivelul VL, atat pt persoanele AgHBe negative, cat si pt cele AgHBe pozitive

Initiere tratamentului pt hepatita cronica B

Tratamentul este initiat pe baza
PBH VL Transaminaze serice La persoanele AgHBe negative, iv >10.000 copii/ml indica infectie activa (marker de infectivitate virala).

Diagnostic HPV 1. Detectia prezentei virusului / Demonstrarea infectiei active - detectia ADN-ului viral din leziune 2. Decelarea genotipului de virus implicat in infectie

Genotipare HPV : Inno lipa (Microgen) 26 genotipuri

Genotipare HPV :
Linear Array HPV (CE-IVD); Roche 37 genotipuri
6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, and CP6108. Inregistrat in UE bazat pe PCR urmat de hibridizarea acizilor nucleici