Sunteți pe pagina 1din 17

Universitatea Tehnica Gh.

Asachi, Iasi Facultatea de Inginerie Chimica si Protectia Mediului Specializarea: Materiale moleculare nalt performante

ACIDUL HIALURONIC

Masteranda Dobria Mihaela Gabriela

1. Structura, obtinerea si proprietile acidului hialuronic


Structura
Acidul hialuronic este o polizaharid descoperita de Karl Meyer i J.W. Palmer n 1934. Aceasta polizaharid este compus prin repetarea unor uniti dizaharidice, acidul D-glucuronic (1,3) i N-acetil-D-glucozamin legate prin legturi glicozidice (1,4) (figura 1), care pot fi ntre 200 20 000 uniti glicozidice pe lan.

Fig 1. Structura HA nativ Masa sa molecular poate s ajung pn la 107 gmol-1. n soluie, moleculele de HA formeaz o reea continu, foarte hidratat, posednd proprieti reologice, de rezisten, de presiune osmotic si de excluziune. Aadar, HA este o polizaharid cu mas molecular mare, fcnd parte din marea familie de polimeri numit glicozoaminoglicani (GAG). GAG sunt molecule polizaharidice neramificate formate din uniti dizaharidice repetitive care au pe suprafata lor numeroase sarcini negative date de radicalii sulfat i carboxil. O unitate repetitiv este formata dintr-un glucid aminat (N-acetil-galactozamina sau N-acetil-glucozamina) si un acid uronic. Sarcinile negative au urmatoarele roluri: Atrag ionii de Na+ care vor atrage la rndul lor apa i se va realiza structura de gel puternic hidratat. Sarcinile negative se resping ntre ele si prin urmare, moleculele de GAG ocup un volum mare n raport cu greutatea lor moleculara. n spaii se va gsi faza lichida a gelului, fapt care permite mobilitatea celulelor, proliferarea i nutriia lor. Marea majoritate a GAG, cu exceptia acidului hialuronic, se leag covalent de miezuri proteice, formnd proteoglicani. Clasificarea GAG se face in 5 clase, n funcie de tipul unitii repetitive, numrul de grupri sulfat i localizarea lor. 1. Acidul hialuronic (hialuronan), format din acid glucuronic si N-acetil-glucozamina. Este singurul nesulfatat, deci sarcinile sale negative vor proveni doar de la gruparile carboxil. 2. Dermatan sulfatul, format din acid iduronic si N-acetil-galactozamina 3. Heparina (heparan sulfatul), format din acid iduronic si N-acetil-glucozamina 4. Condroitin sulfatul, format din acid glucuronic si N-acetil-galactozamina 5. Keratan sulfatul este o exceptie, el fiind format din galactoza si N-acetil-glucozamina. Conformaia zaharidelor individuale din HA este un factor de asemenea important contribuind la forma general a macromoleculei. Acidul glucuronic si N-acetilglucozamina din macromolecula de HA apar predominant n forma scaun. Aceasta limiteaza flexibilitatea lanului zaharidic care

este o trstur comun a familiei de polimeri GAG. n funcie de aceste constrngeri , HA poate avea n soluie pe lng segmentele de caten rigide i segmente foarte flexibile. HA este un polimer natural compus din uniti dizaharidice ale acidului glucuronic si Nacetilglucozamina. Masa molecular a HA nativ este de obicei de ordinul milioanelor. Fiecare unitate dizaharidic a HA conine trei poziii posibile pentru modificare: o grupa hidroxilic, una carboxilic i alta acetamidic. Hialuronanul se gsete n matricele extracelulare ale esuturilor vertebratelor, n general, n asociaie cu proteinele, dar cu precdere n lichidul sinovial, umoarea vitroas a ochilor i in cordonul ombilical. Rolul su a fost considerat nainte doar acela de a umple spaiile intracelulare, datorit capacitii sale de a reine apa, ns n prezent este stabilit faptul c HA intervine n numeroase procese biologice fundamentale cum ar fi: reproducerea, adeziunea, diferenierea celular i inflamaiile. El este n aceeai msur cunoscut att pentru proprietile fizico-chimice ct i a celor biologice, proprieti ce depind puternic de lungimea lanului polimeric. Astfel c, n funcie de lungimea lanului de HA, proprietile acestuia pot fi chiar antagoniste.

Obinerea
Acidul hialuronic poate fi obinut, prin extracie din diverse esuturi animale, cum ar fi creasta de coco, cordonul ombilical, umoarea vitroas a ochiului, fermentaii bacteriene avnd ca surs familia Streptococcus. n ambele cazuri el trebuie purificat. HA obinut prin aceste procedee posed o mas molecular foarte mare care i confer o vscozitate ridicat. Studiile recente pe oligozaharide HA n complex cu HA degradat enzimatic au artat c i lanurile scurte de HA pot fi stabilizate ntr-o varietate de conformaii pentru a se lega de proteine. Aceste observaii conduc la ipoteze cum c proteinele pot aciona pentru organizarea HA, fixnd i favoriznd anumii conformeri ai polimerului, ducnd la formarea unor structuri bine ordonate cu funcionaliti specifice. Acest lucru este ilustrat n figura 2 unde trei populaii distincte de HA sunt vizibile pe o singur celula a muchiului neted. Acestea includ fii de HA pe suprafaa celular, care sunt asociate cu receptori de HA tip CD44, dar i fire lungi de HA. Pe suprafaa celulei se mai gsesc i baghete de HA care sunt imunoreactive. Interesant este faptul c leucocitele mononucleare ader la firele de HA (prin receptorii de tip CD44 de pe suprafaa celulei) dar nu se asociaz cu fiile sau fibrele de HA, astfel indicndu-se existena unor populaii de HA diferite din punct de vedere structural i funcional.

Figura 2. Trei populaii diferite de HA ntr-o singur celul de muchi neted 3

Proprietile soluiei de HA
Proprietile HA sunt greu de determinat cu ajutorul metodelor clasice n care au fost dezvoltate analize simple pentru proteine i care cer proprieti apropiate de soluiile ideale Newtoniene. Comportamentul acidului hialuronic nu se apropie nici pe de parte de idealul Newtonian. Sandy Ogston, Torvard Laurent, Endre Balazs i mai trziu Bob Cleland au elaborat teorii i structuri experimentale care stau la baza cercetrii proprietilor biofizice ale HA. n soluie apoas HA este descris ca un ghem statistic cu o rigiditate intrinsec considerabil. Aceast rezisten a fost atribuit legturilor de hidrogen intramoleculare de-a lungul a dou legturi glicozidice. S-a artat ca solventul i lungimea lanului joac un rol important n formarea legturilor de hidrogen.

Fig. 3 Comportamentul acidului hialuronic n soluie diluat i respectiv concentrat Metoda FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) este o metod puternic de determinare a proprietilor soluiilor concentrate de polimeri, cum ar fi HA, de asemenea este i o metod de echilibru care se aplica soluiilor fr gradient de concentraie, n absena curgerii i fortelor de forfecare.

Fluorescence Recovery After Photobleaching Exist cativa factori care pot contribui la propriettile solutiei de HA, cum ar fi: 1. interaciunile electrostatice dintre grupele carboxilice; 2. legturile de hidrogen dintre zaharidele adiacente; 3. domeniul de suprapunere i ncalcire a polimerului; 4. asocierea lan-lan prin mecanisme ce au la baza interaciuni hidrofobe. S-a artat ca metoda FRAP permite calculul concentraiilor soluiilor de HA peste concentraia critic la care are loc suprapunerea lanurilor macromoleculare. Deci, aceast metod este potrivit studiilor de ncalcire i asociere lan-lan. Deoarece proprietile reologice i 4

hidrodinamice ale soluiei depind de efectele electrostatice i ionice ale reelei de HA, s-a studiat sensibilitatea acestora in funcie de tipul i valena contraionului. Influena legturilor de hidrogen a fost studiat prin compararea proprietilor soluiilor n apa deionizat, 0,5 M NaCl si 0,5 M NaOH. S-a artat ca electrolitul a ecranat interaciunile electrostatice iar ioni HO- au influenat rigiditatea lanurilor de HA. Prezena asocierilor lan-lan, care poate implica interaciuni hidrofobe, a fost studiat n condiii fiziologice, n solveni cu polaritate diferit. Asocierile intermoleculare lan-lan au fost deasemenea studiate prin folosirea de oligozaharide HA ca i compusi competitori (cu masa molecular mic).

2. Importan i aplicaii
Exist o familie de enzime numite Hialuronidaze (HA-ze), care sunt capabile s hidrolizeze HA dup diverse mecanisme. O importan deosebit a cuplului HA/HA-ze a fost demonstrat n unele boli, ca artrita reumatic, dar mai ales n cancer. n decursul timpului, HA a fcut posibile diverse aplicaii n domeniul medical, farmaceutic i cosmetic. Datorit proprietilor fizico-chimice unice, el este folosit pentru aplicaii ca lubrefiani (pentru articulaii i oftalmologie), pentru construirea de biomateriale pentru ingineria esuturilor, pentru elaborarea de dispozitive cu eliberare controlat a principiilor active si pentru fabricarea de produse cosmetice de nfrumuseare cu proprieti de hidratare a pielii.

Figura 3. HA utilizat n domeniul cosmetic 5

Aplicaii posibile ale HA nemodificat Oftalmologie


Picturile apoase de pus n ochi au dezavantajul c mai mult de 75% din soluia aplicat se pierde prin drenaj n primele 2 minute. De aceea se adaug polimeri soluiei cu rolul de a mri vscozitatea si de a creste astfel timpul de stationare al medicamentului. Gurny si colaboratorii au aratat ca solutiile de HA au capacitatea unica de a prelungi timpul de stationare al pilocarpinei in apropierea precorneei. Acestia au sugerat ca HA interactioneaza direct cu membrana celulara a tesutului corneal.

Eliberarea controlat de medicamente


n unele experimente s-a observat ca HA marcat izotopic s-a deplasat din fluidul sinovial n nodulii limfatici. Dup injectarea intravenoas n oarece a unei cantiti mari de HA marcat s-a observat ca dup un timp HA se gsete n nodulii limfatici. Aceast observaie a artat potenialul HA de a fi folosit ca purttor de medicamente prin sistemul limfatic ctre locul int pentru tratarea diferitelor tumori maligne.

Dermatologie
Datorita permeabilitii slabe si naturii lipofilice a pielii umane, foarte puine medicamente pot fi livrate transdermal pentru atingerea nivelelor terapeutice n piele. n ultimii ani s-au obinut rezultate promitoare n tratamentul artritei i cancerului de piele cu ajutorul unor medicamente pe baz de HA. Rezultate foarte bune obinndu-se n cazul diclofenacului.

Chirurgie
Prevenia formrii postoperatorii a adeziunilor este o problem mereu actual. S-a artat c soluiile de HA reduc adeziunile dup chirurgia abdominal i ortopedic. Mitchell i colaboratorii au artat c adeziunile pericardice postoperatorii sunt mult diminuate dac se administreaz animalului o solutie de 0,4% HA in timpul pericardiotomiei. Mecanismul real prin care soluiile de HA previn formarea adeziunii este nc necunoscut.

Implanturi
Bioincompatibilitatea unor implanturi mamare, cum ar fi gelurile siliconice, a dus la cutarea de noi alternative. Lin i colaboratorii au studiat posibilitatea folosirii HA ca material de umplere. S-a artat c implanturile pe baz de HA au aceeai consisten ca gelurile siliconice, dar permit o mai bun vizualizare a structurii snului n jurul implantului. Dup primul an de la implantare n animal nu s-a observat nici o reacie advers. Viscosuplimentarea reprezint o tehnic relativ recent i const n injectarea unui lichid coninnd acid hialuronic n articulaia genunchiului. Acidul hialuronic reprezint o substan natural, component a lichidului sinovial (lichidul care se gsete n articulaie) i care are efect de lubrefiere, pentru a permite extremitilor oaselor s alunece una pe cealalat, absoarbind ocurile transmise n articulaie prin ncrcare.

3. Biodegradarea acidului hialuronic


Biodegradarea acidului hialuronic este un process treptat. n spaiul extracelular a majoritii esuturilor se gsete HA cu mas molecular mare. mpreun cu alte structuri macomoleculare HA contribuie la proprietile mecanice ale reelei. Prin urmare, pentru a fi eliberat din aceast reea solid, polimerul trebuie s fie cel puin parial degradat prin mecanisme mediate de receptori sau prin endocitoz. n compartimentul lizozomal, acidul hialuronic este hidrolizat la oligozaharide de ctre hialuronidazele intracelulare, fragementele fiind n cele din urm degradate la monozaharide de ctre exo-glucozidazele aflate n lizozomi. n esuturile tari, cum ar fi osul sau cartilajul, cu sau fr drenaj limfatic, HA este degradat "in situ", mpreun cu alte molecule ECM (colagen i proteoglacani). n pielii i articulaii, doar o fraciune minor (aproximativ 20-30%) de HA este stocat i degradat n esuturi Aproximativ 50% din HA din organism se gsete n esuturile pielii.

Fig. 4 Principalele ci de catabolizare a acidului hialuronic

Degradarea enzimatic
Cea mai important degradare a HA n mediul biologic este catalizat de enzimele numite hialuronidaze sau liaze. Conform mecanismului de degradare, hialuronidazele sunt mprite n trei categorii: (1) hialuronat-4-glicanohidrolaze, care hidrolizeaz legturile -N-acetilglucozaminice; (2) hialuronat-3-glicanohidrolaze; (3) hialuronat-liaze.

Asemntor hidrolizei acide, HA este hidrolizat enzimatic de ctre hialuronidaze printr-un mecanism statistic de degradare.
CH2OH HO O AcNH HOOC O O HO OH AcNH HO O CH2OH O O

CH2OH HO O AcNH

HOOC O OH HO O HO AcNH

CH2OH O O

OH

Fig 4. Aciunea hialuronidazei bacteriale asupra hialuronanului (Ac = acetat). Degradarea enzimatic a hialuronanului are loc de obicei n soluie tampon de acetat de sodiu la care se adaug acid acetic pentru a se obine un pH 4,8-6,0, unde majoritatea acestor enzime sunt active. Temperatura de degradare este de obicei 37 oC. Degradarea prin metode non-enzimatice n ciuda faptului c HA este un compus stabil n condiii normale, scindarea lanurilor de polimer se pot face i prin intermediul unor metode non-enzimatice fie prin reacii cimice dar i prin metode fizice n condiii critice precum: uscarea prin congelare; forfecare amestecare, agitare Celulele formeaz specii reactive de oxigen (ROS) ca o consecin a respiraiei anaerobe normale. Rspunztori de scindarea lanului polimeric al acidului hialuronic sunt doar cateva dintre aceste specii precum: anioni superoxid - -radical liber de oxigen care are un electron in plus, fiind foarte reactiv si toxic; radicalul hidroxil - acest radical are un electron nepereche n orbita sa electronic cea mai ndeprtat, care se unete cu ali electroni, formnd legturi chimice; Ion hipoclorit est ClO- ; Specii derivate din peroxinitrii. Aceste specii reactive de oxigen sunt implicate n cteva procese biodegenerative i inflamatorii precum artrita. Depolimerizarea acidului hialuronic n fluidul sinovial n timpul debutului precoce al artritei este considerat a fi cauzat de ROS i nu de hialuronidaz. Fluidul sinovial normal este vscoelastic datorit prezinei de HA de masa molecular mare. Sinoviocitele secret continuu macromolecule n fluidul sinovial, inclusiv HA. Fluidul este mpins n afara cavitii articulaei n microcapilare integrate n sinoviu, pe msur ce presiunea crete. Pe aceast cale moleculele de HA ies prin pori interstiiali de drenaj n cptueala sinovial (garnitura articular de 30 90 nm), scznd motilitatea asemenea moleculelor de HA mai mici (Fig. 5).

Fig. 5 Drenarea HA-ului din fluidul sinovial n sistemul limfatic

Concluzii
Metabolizarea HA-ului este dinamic. Unele celule, precum condrocitele sintetizeaz i catbolizeaz HA astfel nct s menin o concentraie constant n organism. Alte celule, de exemplu, celulele cutanate, sintetizeaz HA mai mult dect catabolizeaz. Hialuronidaza i ROS pot depolimeriza HA+ul suficient de mult pentru a putea fi eliberat din matricea extracelular. Apoi, acesta este fie imediat absorbit n celule i degradat de lizozomi fie este transferat n sistemul limfatic i condus spre ficat, glande limfatice sau rinichi spre a fi catabolizate. Produi finali de degradare, acidul glucuronic i N acetilglucozamina pot fi reutilizai pentru biosinteza de HA. n aceast manier, acidul hialuronic din organismul uman este ndepartat metabolic i nlocuit zilnic.

4. Metode de degradare i modificare a HA


HA poate fi degradat la fragmente mai mici prin: metode chimice (condiii acide sau alcaline), fizice (agitare cu vitez mare, forfecare), sonicare, clivaj radicalic enzimatice. Clivajul radicalic al HA are o mare importan n artrit i mbtrnire. S-a artat c radicalii hidroxil sunt factorul esenial n iniierea degradrii HA prin scindarea legturii glicozidice. Cu ct concentraia n radicali liberi este mai mare cu att scderea masei moleculare a HA este mai mare.

Degradarea cu ultrasunete
Soluiile de HA sunt degradate de ultrasunete. Mecanismul i cinetica degradrii nu sunt nc pe deplin cunoscute. S-a observat o relaie liniar ntre inversul ptratului Mw i timpul de reacie. Sonicarea degradeaz HA ntr-un mod nestatistic, care duce la o distribuie bimodal a masei moleculare medii gravimetrice. S-a sugerat c lanurile mari de HA sunt degradate mai lent dect cele mici. S-a ajuns la concluzia c oricare ar fi energia ultrasunetelor, lanurile de HA nu pot fi degradate la monomeri. n urma procesului de degradare cu ultrasunete se obin lanuri cu mas molecular mai mare de 10 kDa.

Degradarea termic i n funcie de pH


Prin metoda difuziei luminii s-a artat c soluiile de HA se degradeaz statistic att n mediu acid ct i n mediu bazic. La pH alcalin legturile de hidrogen care stau la baza organizrii structurale a lanurilor de HA sunt distruse, ceea ce duce la pierderea rigiditii intrinseci i formarea unui ghem mai compact i mai flexibil. S-a artat c vscozitatea hialuronatului de sodiu, chiar i n ap distilat, scade n funcie de timp si exponenial n funcie de temperatur. n procesul de uscare prin ngheare a HA s-a observat depolimerizarea radicalic a probei. La temperaturi nalte n prezena tiolilor sau metalelor tranziionale, HA se degradeaz datorit radicalilor reactivi hidroxil. Degradarea HA n prezena ionului Fe2+ se bazeaz pe procesul de oxidare n prezena oxigenului i a Fe2+, proces n care se genereaz anionul-radical superoxid, O2.

Fe2+ O2 HO2

+ + +

O2 H H +

Fe3+ HO2

O2

O2

H2O2

O2

Ca agent reducator, O2 regenereaz Fe2+, iar agentul oxidant H2O2 este produs n reacia cu un hidroperoxid (HO2).

10

Reacii chimice de modificare a HA


Hilanii
Derivaii reticulati ai HA sunt denumii hilani. Laurent i colaboratorii au folosit 1,2,3,4diepoxibutan pentru reticularea lanurilor de HA. O metod general de reticulare a HA se bazeaz pe reacia dintre formaldehida (sau ali agenti, cum ar fi dimetilureea, etilenoxid, poliaziridina sau poliizocianat) i HA la pH neutru, care implic grupele hidroxil ale polizaharidei i grupele aminice ale proteinei. Legturile dintre protein i HA sunt demonstrate de comportamentul de jeleu al soluiei. n condiii favorabile, dou pn la opt lanuri de HA sunt conectate. Masa molecular a hilanilor obinui prin aceast metod variaz ntre 8 x 106 si 24 x 106 kDa, iar coninutul de protein este de 0,4-0,8%.

Ali derivai de HA
De asemenea au fost studiai i derivai nereticulai ai HA. Pentru sinteza esterilor carboxilici ai HA s-a propus reacia dintre srurile cuaternare de amoniu a HA i ageni de alchilare n solveni aprotici. Gradul de esterificare variaz ntre 0 si 100%. Esterii HA sunt insolubili n ap, iar proprietile fizico-chimice difer de ale HA original. HA poate fi modificat cu polimeri sintetici, cum ar fi poliuretanii, polielefinele, poli(alcoolul vinilic), polimeri acrilici, poliamide, poliesteri si polisiloxani.
O (CH2)n C O HA

C H

C H

C O

HA

NH

a)

b)
O H3 C NH

O(CH2)n

C O

HA
HA

O C C H2

N CH2

c)

d)
H2C N H2 C O O HA

H 2C NC N

H2 C

O O

HA

Cl3C O

NH

NH O

e)

f)

11

H2C ClCH2 N

H2 C

O O

HA

H2 C Cl3C N

H2 C

O O

HA

NH O

NH O

g)

h)

Figura 5. Cromofori fotoreactivi legati de HA pentru reticulare: (a) acid cinamic; (b) 1carboxialchil-uracil; (c) 7-carboxialcoxil-cumarina; (d) 1,2-O-etanotimina; (e) 1,2-O-etano-5triclorometil-uracil; (f) 1,2-O-etano-6-cianouracil; (g) 1,2-O-etano-6-clorometiluracil; (h) 1,2-Oetano-6-triclorometiluracil. Prezena unei grupe hidrazidice permite cuplarea unor medicamente.

12

H 2N NH O

O HN O NH O O O HO OH HO O NH OH OH O O O OH O NH CH3 HN O HO O HO NH CH3

O NH H2 N

Fig. 6. Unitatea dizaharidic a HA funcionalizat cu hidrazide

14

3. Depolimerizarea hialuronatului de sodiu n faz eterogen


n ultimii ani crete fr ncetare cererea pentru lanuri de HA de mrimi foarte variate, n funcie de aplicaia urmrit dar care sunt inferioare HA-ului obinut prin fermentaie bacterian. Pentru a obine lanuri de HA de mrimi dorite, se va folosi o reducere controlat a mrimii HA bacterian. Pentru aceasta se pot folosi numeroase procedee: metode enzimatice, metode chimice i metode fizice. Datorit specificitii ridicate ale enzimelor, metodele enzimatice prezint avantajul de a nu provoca alterarea structurii chimice a polimerului. Enzimele utilizate sunt de origine animal. Studiului const n exploatarea posibilitilor folosirii metodelor chimice i/sau fizice pentru obinerea HA de mrimi dorite (Mw < 50 kDa), cu o slab polimolecularitate i mai ales, cu o structur chimic nealterat. Datorit proprietilor vsco-elastice, HA-ul de mrime mare este utilizat n special n aplicaiile vscozometrice. Dou criterii importante n acest domeniu sunt biodegradabilitatea slab a HA-ului i o vscozitate a produsului compatibil cu modul de utilizare al acestuia, spre exemplu, injectarea produsului cu o sering. Biodegradabilitatea HA-ului este n general diminuat n funcie de modificarea chimic a acestuia. Totui, utilizarea acestui tip de produs duce la introducerea n organism a unui compus care nu este n totalitate natural iar vscozitatea HA-ului modificat chimic nu este cu mult mai mic dect a celui nemodificat.

Realizarea i urmrirea studiului


Diverse metode chimice i fizice de degradare a HA-ului fac deja obiectul multor studii. Metodele chimice sunt: hidroliza acid sau bazic sau, n plus, degradarea prin aciunea diverilor oxidani cum ar fi apa oxigenat, acidul hipocloros sau ionul peroxinitrat. Ca metode fizice amintim: tratamente termice, ultrasunetele, tratamentele cu microunde, iradieri cu raze UV sau . Totui, n cele mai multe cazuri, dac aceste metode duc la diminuarea mrimii lanului polimeric ele conduc n aceeai msur i la alterarea structuri chimice a acestuia. n anumite cazuri ns aceste degradri chimice sunt minore sau aproape inexistente, dar acest lucru presupune condiii experimentale bine delimitate i rezutate cu o slab reducere a mrimii lanului polimeric. n urma studiilor efectuate asupra diverselor polizaharide cele mai bune rezultate n degradarea nonezimatic s-au obinut n cazul combinrii metodelor chimice cu cele fizice, cum ar fi tratamentele cu ultrasunete a soluiilor de HA care conin ioni hipoclorit. S-a urmrit combinarea hidrolizei acide n mediu eterogen cu un tratament termic moderat. Utilizarea mediului eterogen prezint avantajul de a uura aplicaia, dar mai ales, recuperarea produsului final. n protocolul de baz, HA de mrime mare este dispersat sub agitare ntr-un amestec (ap/solvent organic miscibil n ap) acidulat i termostatat la o temperatur moderat. La un anumit timp, reacia este oprit prin neutralizarea amestecului, iar produsul recuperat dup decantare i filtrare. Dac este necesar, aceast etap se repet de mai multe ori. Dup aceast etap, produsul este cltit de cte ori este nevoie pentru a elimina acidul i sarea utilizate n amestec. Produsul final este uscat. Hidroliza acid, hidroliza bazic i oxidarea cu H2O2, sunt trei reacii foarte cunoscute pentru depolimerizarea HA n mediu apos. n ceea ce privete cinetica, hidroliza bazic este comparabil cu hidroliza acid. Oxidarea cu H2O2 este o reacie foarte lent, care dup literatura de specialitate, poate fi catalizat de cationii metalelor tranziionale. n acest caz s-a demonstrat c reacia poate fi catalizat de ionii de Cu2+. Pe parcursul studiului realizat am observat c depolimerizarea oxidativ a HA-ului cu H2O2 necesit efectiv prezena ionilor de Cu2+. Att polimolecularitatea ridicat a produselor, ct i dificultatea de a filtra aceste produse face susceptibil prezena complecilor HA-Cu2+. Trebuie urmrit coninutul de cupru n produsul final

pentru a nu depai normele n vigoare. n acest scop am aprofundat studiul modificnd pH mediului de reacie, ceea ce a dovedit c pH-ul este un parametru determinant, att n plan cinetic, ct i n plan calitativ. n termeni de cinetic de reacie, hidroliza acid este comparabil cu cea bazic, n timp ce, n plan calitativ hidroliza acid este mai favorabil n condiiile unei bune neutralizari. O variant a acestei metode este deja brevetat. Hidroliza bazic este mult mai degradant i implic folosirea unui tratament suplimentar al produsului final. Oxidarea cu peroxid de hidrogen este preferabil celorlalte dou metode, singura problem, de altfel foarte important, fiind coninutul de cupru din produsul final.

16

Bibliografie
1. Chemistry and Biology of Hyaluronan, H.G. Garg and C.A. Hales; 2. http://en.wikipedia.org/wiki/Hyaluronan 3. Inhibition of hyaluronidase at high substrate concentration, Trias ASTERIOU, JeanClaude VINCENT and Brigitte DESCHREVEL. 4. Studiul depolimerizrii hialuronatului de sodiu n faz eterogen realizat n laboratorul Polimeri, Biopolimeri, Suprafee (FRE 3101 CNRS Universitatea Rouen) de ctre: Friel AMAR doctorand n anul doi la Universitatea Rouen, Sanda BUCTARIU (ROTAR) student Socrates/Erasmus, sub coordonarea tiinific a doamnei profesoare Brigitte DESCHREVEL

17