Preparacion de Medios de Cultivo y Siembra de Bacterias en Medios de Cultivo

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO
FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Laboratorio de microbiologa de los alimentos
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO
I.
Objetivos
relacionar la composicin de los diversos medios de cultivo con sus caractersticas y aplicaciones. Familiarizarse con las tcnicas empleadas en microbiologa para el cultivo y la manipulacin de microorganismo en condiciones de esterilidad
II.
Marco terico
2.1 MEDIOS DE CULTIVO Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se

solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas). 2.2 Tipos bsicos de medios de cultivo Atendiendo a su estado fsico: Lquidos Semislidos Slidos
Atendiendo a su utilidad prctica: Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando la sustancia aadida, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).
2.3 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados

sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilas a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprofitos tienen rangos ms amplios. Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)
2.4 Mtodos de preparacin de medios

Preparacin de un medio solido en placa: 1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos
aadirlo a una concentracin de 15g/l) y rehidratarlo agua destilado en una botella 2. 3. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella en
un bao a 40c al menos durante 30 minutos. 4. Distribuir el medio en las placas de petri que estn estriles dentro de una
campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5. Dejar que el medio solifique.

Preparacin de medio solido en tubo (slant)
1. matraz 2.
Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un
Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. el medio
debe hervir hasta que se vuelve transparente. 3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience a
solidificar para ello se empleara una pipeta y los tubos no se llenaran ms de un tercio de su volumen. 4. 5. Autoclavar Sacar de la autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener Preparacin de medio liquido en tubo (caldo)
tubos con medio de slant.
1. 2.
Pesar y rehidratar el medio Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos ms de 1/3 de su volumen)
3. 4. 5.
Autoclavar Sacar del autoclave y dejar enfriar Todos los medios se guardan en nevera a 4c
2.5 Realizacin de la siembra a) Siembra en medio liquido Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se lleva al tubo estril con medio liquido (agitndolo en el seno del medio)
b) Siembra en placa Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inoculo tomado de los cultivos crecidos .se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inoculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.

c) Siembra en agar inclinado Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inoculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deber realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la poblacin del agar (anaerobiosis).
2.6 Incubacin
De los medios sembrados a 37c hasta que haya habido crecimiento bacteriano.

2.7 Investigacin:
1. AGAR SALMONELLA SHIGELLAM Usos: El Agar Salmonella Shigella, tambin conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas y de alimentos.
Formulacin por litro de agua purificada Extracto de carne Mezcla de peptonas Lactosa Mezcla de sales biliares Verde brillante Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Rojo neutro Agar bacteriolgico 5.0 5.0 10.0 8.5 0.33 8.5 8.5 1.0 0.025 13.5
PH: 6.8-7.2

2. ORANGE SERUM AGAR Usos Medio utilizado para el cultivo y recuento de microorganismos acidricos, particularmente los asociados con el deterioro de jugos de fruta, especialmente de ctricos. Tambin es til para el cultivo de hongos saprfitos y patgenos.
Fundamento En el medio de cultivo, la triptena y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y el suero de naranja le otorga un ambiente cido, favorable para el desarrollo de microorganismos tolerantes a las condiciones de acidez.
formula Agar Suero de naranja Extracto de levadura Tripteina Glucosa Fosfato dipotasico Agua desmineralizada 15g 200nl 3.0g 10.0g 4.0g 2.5g 800ml PH : 5.3-5.7

3. AGAR TCBS Usos Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados. Tambin es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo para Vibrios.
Formulacin(en gramos por litro) Extracto de levadura Peptona de carne Triptena Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Bilis de buey Sacarosa Cloruro de sodio Citrato frrico Azul de bromotimol Azul de timol Agar 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 8.0 20.0 10.0 1.0 0.04 0.04 15.0 PH: 8.4-8.8 Suspender 89 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullicin y hervir de 1 a 2 minutos. NO AUTOCLAVAR. Distribuir en placas de Petri estriles

4. AGAR XLD Usos BD XLD Agar (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) (agar BD XLD [agar xilosalisina-desoxicolato]) es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el aislamiento y la diferenciacin de patgenos entricos gram negativos (Salmonella y Shigella) de muestras clnicas y no clnicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella. REACTIVOS Frmula por litro de agua purificada xilosa L-lisina lactosa sacarosa Cloruro sdico Extracto de levadura Rojo fenol Desoxicolato de sodio Tiosulfato sdico Citrato ferrico0 de amonio Agar PH 7,4 0,2
3.5g 5.0 7.5 7.5 5.0 3.0 0.08 2.5 6.8 0.8 13.5

5. CALDO AZIDA GLUCOSA Usos Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de enterococos en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento El medio permite un enriquecimiento selectivo de Enterococcus spp. La triptena, el extracto de carne y la glucosa constituyen la fuente nutritiva, mientras que la azida sdica es inhibidora de la flora Gram negativa. El cloruro de sodio se usa para mantener el equilibrio osmtico del medio Frmula (en gramos por litro) tripteina Extracto de carne glucosa Cloruro de sodio Azida sdica 15.0 4.8 7.5 7.5 0.2
PH final: 7.2 0.2 6. CALDO EC USO Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua, alimentos y otros materiales. Fundamento El contenido de lactosa en este medio, favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompaante. Frmula (en gramos por litro) TRIPTEINA Lactosa Sales biliares N3 Fosfato dipotasico Fosfato monopotasico Cloruro de sodio PH final: 6.9 0.2 20.0 5.0 1.9 4.0 1.5 5.0

7. LAURIL SULFATO CALDO Uso Medio recomendado por A.P.H.A. para deteccin y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Fundamento Medio rico en nutrientes, que permite un rpido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, an de los fermentadores lentos. La triptosa es la fuente de nitrgeno, vitaminas, minerales y aminocidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompaante. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, ste ltimo se evidencia al utilizar las campanas Durham. Frmula (en gramos por litro) triptosa lactosa Cloruro de sodio Fosfato dipotasico Fosfato monopotasico lauril sulfato de sodio PH final: 6.8 0.2 8. CALDO PURPURA DE BROMOCRESOL Uso Adicionado de carbohidratos se emplea para pruebas de fermentacin en la diferenciacin bioqumica de microorganismos, especialmente del grupo entrico. Formulacin Cloruro de sodio Extracto de carne Peptona especial Purpura de bromocresol PH: 6.8-7.2 5.0 1.0 10.0 0.015 20.0 5.0 5.0 0.1 2.75 2.75

9. CALDO RAPPAPORT Uso Es utilizado para el enriquecimiento de los microorganismos pertenecientes del gnero salmonella, provenientes de diferentes tipos de muestras. Formulacin Cloruro de magnesio hexahidratado Cloruro de sodio Fosfato monopotasico Peptona de casena Peptona de soya verde de malaquita verde de malaquita PH: 5-5.2 10. CALDO SELENITA CISTINA Uso Medio selectivo de enriquecimiento para recuperacin de microorganismos del gnero salmonella a partir de muestras fecales, alimentos farmacuticos, agua, etc. Formulacin Fosfato de potasio lactosa L-cistina Peptona especial Selenito de sodio acido PH: 6.8-7.2 10.0 4.0 0.01 5.0 4.0
29.0 8.0 0.4 4.0 1.0 0.036

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Laboratorio de microbiologa de los alimentos 11. PARKER AGAR
Uso Es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el aislamiento y recuento de staphylococcus aureus de alimentos, muestras ambientales y clnicas Formula por litro de agua purificada Bacto trytone Bacto beef extract Bacto yeast extract Cloruro de litio glicina Piruvato sdico Telrito potsico agar Emulsin de yema de huevo PH: 6.5-7.1 10g 5.0 1.0 5.0 12 10 0.1 20 50.ml

12. AGAR TWEEN Uso Medio recomendado para la deteccin y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de lecitina y tween permite neutralizar la actividad bacteriana, facilitando la investigacin de los grmenes en productos o superficies que contengan: aldehdos, derivados fenolicos o amonio cuaternario. Formulario (por litro) Tween 80 lecitina Peptona de casena Peptona de soja Sodio cloruro agar PH: 7.1-7.5 13. CALDO BRILA Usos Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la tcnica del nmero ms probable. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas. FORMULACION Bilis de buey deshidratada lactosa peptona Verde brillante PH: 7-7.4 20.0 10.0 10.0 0.0133
5.0g 0.7g 15.0g 5.0g 5.0g 20.5g

14. CALDO TIOGLICOLATO USOS Utilizado en procedimientos cualitativos para la prueba de esterilidad y para el aislamiento y cultivo de aerobios como anaerbicos y microaerofilos que no son exigentes en exceso. En microbiologa clnica se puede utilizar como medio de enriquecimiento para muestras clnicas. Formulacin (g/L) tripteina Peptona de soya Glucosa Cloruro de sodio agar L-cistina Sulfito de sodio 17 3 6 2.5 0.5 0.7 0.25 0.1
PH: 6.8-7.2

15. AGAR BPLS Uso Medio de cultivo selectivo para el aislamiento de salmonella excepto S a partir de materiales patolgicos. Heces, orina, alimentos, etc. Formulacin (g/L) Peptona de carne Peptona de casena Extracto de carne Cloruro sdico Hidrogenofosfato disodico lactosa sacarosa Rojo de fenol Verde brillante agar PH: 6.7-7.1 5 5 5 3 2 10 10 0.08 0.0125 12

2.8 Conclusiones Los medios de cultivo estn conformados por nutrientes favorables para la proliferacin de microorganismos. Tenemos que esterilizar los materiales a utilizar para el cultivo de microorganismos para evitar la contaminacin.

Preparacion de Medios de Cultivo y Siembra de Bacterias en Medios de Cultivo

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Preparacion de Medios de Cultivo y Siembra de Bacterias en Medios de Cultivo

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA Laboratorio de microbiologa de los alimentos