Sunteți pe pagina 1din 131

LUCIANA DOBJANSCHI

BIOCHIMIE FARMACEUTIC

EDITURA UNIVERSITII DIN ORADEA

2007

Biochimie farmaceutic

Refereni tiinifici: Conf.dr. Murean Mariana Conf.dr. Micle Otilia

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei DOBJANSCHI, LUCIANA Biochimie farmaceutic / Dobjanschi Luciana. Oradea : Editura Universitii din Oradea, 2007 Bibliogr. ISBN 978-973-759-422-8 577.1:615

EDITURA UNIVERSITII DIN ORADEA ESTE ACREDITAT DE CNCSIS CONFORM POZIIEI 149.

Tipar: METROPOLIS SRL Oradea, str. Nicolae Jiga nr.31 Tel.: 0729 845 160, 0788 845 160 Tel./ Fax: 0259 472 640 e-mail: metropolis@rdslink.ro

Luciana Dobjanschi

CUPRINS

I. Introducere II. Compoziia chimic a organismului uman III.Nucleotide i structura covalent a acizilor nucleici IV. Proteine IV.1. Aminoacizii IV.2. Peptide IV.3. Proteine V. Vitamine V.1. Vitaminele liposolubile V.2. Vitaminele hidrosolubile VI. Enzime VII. Metabolism VIII. Ciclul acizilor tricarboxilici IX. Enzime transportoare de electroni X. Metabolismul glucidic X.1. Glicoliza X.2. Calea pentozofosfatic X.3. Degradarea glucozei pe calea acizilor uronici X.4. Gluconeogeneza X.5. Metabolismul glicogenului X.6. Glicoproteine i proteoglicani. X.7. Metabolismul altor hexoze XI. Metabolismul lipidic XI.1. Structura i proprietile acizilor grai saturai XI.2. Metabolismul acizilor grai saturai XI.3. Biosinteza acizilor grai XI.4. Metabolismul lipidelor simple XI.5. Metabolismul lipidelor complexe XI.6. Metabolimul sfingolipidelor XI.7. Metabolismul colesterolului XI.8. Acizii grai eseniali (AGE) XI.9. Metabolismul corpilor cetonici XII. Metabolismul proteinelor XII.1. Digestia i absorbia proteinelor XII.2. Metabolismul intermediar al aminoacizilor XII.3. Metabolismul amoniacului XII.4. Ciclul ureogenetic 4

Biochimie farmaceutic

XII.5. Utilizarea scheletului de atomi de carbon ai aminoacizilor XII.6. Biosinteza aminoacizilor XIII. Metabolismul nucleotidelor XIV. Metabolismul hemoglobinei XV. Bibliografie

Luciana Dobjanschi

I. Introducere Scopul principal al biochimiei de astzi este s determine cum interacioneaz grupele de molecule nevii din organismele vii pentru a constitui, menine i perpetua starea vie. Biochimia este o tiin foarte tnr. Pn acum cteva zeci de ani puine universiti o recunoteau ca tiin n toate drepturile ei. Exist dou izvoare distincte n genealogia biochimiei actuale. Unul provine din medicin i fiziologie i este rezultatul unor vechi preocupri de a cunoate compoziia chimic a sngelui, a urinii, i a esuturilor, precum i modificrile acestora n stare normal i patologic. Cellalt deriv din chimia organic, din vechi studii asupra compuilor organici naturali. Mult vreme, biochimia a fost privit pur i simplu, fie ca o ramur a fiziologiei, fie ca o ramur a chimiei. Pn la nceputul ultimului sfert de secol, ea nu a fost o tiin bine conturat, de sine stttoare, cu o solid metodologie experimental i cu posibilitatea de aprofundare a fenomenelor biologice. Dou descoperiri mai nsemnate au contribuit la schimbarea situaiei. Una a fost recunoterea sistemelor multienzimatice ca uniti catalitice pentru majoritatea cilor metabolice i dezvoltarea unei ipoteze unitare pentru transferul de energie n celula vie. Cealalt, a avut o inflen mult mai adnc i mai puternic, a fost recunoaterea faptului c ereditatea, unul din aspectele cele mai importante ale biologiei, are o baz real, molecular. Biochimia de astzi face investigaii spectaculoase ntr-o serie de ramuri fundamentale ale biologiei diferenierea celulelor i a organismelor, originea vieii i evoluia, comportamentul i memoria, patologia uman cercetri ce au demonstrat c aceste probleme fundamentale pot fi eficient abordate prin metode biochimice. ntr-adevr, succesul biochimiei n explicarea multor procese celulare a fost att de mare nct muli oameni de tiin au ajuns la concluzia c biologia este chimie. Unii biologi nu accept acest punct de vedere, ei susin c esena sau caracterul complex al organismelor vii nu poate fi redus, acum i niciodat, la nivelul moleculelor sau al interaciilor moleculare. Astzi este probabil mai logic s presupunem, ca o filozofie curent, c toate fenomenele biologice au n cele din urm o baz molecular i s abandonm aceast idee numai atunci cnd nu va mai fi util pentru proiectarea experimentelor cheie sau pentru explicarea datelor experimentale. Nu trebuie totui s privim biologia numai ca pe o ramur a chimiei clasice, cum este chimia organic, chimia fizic sau chimia 6

Biochimie farmaceutic

anorganic. Dac biologia este chimie, ea este un fel de suprachimie care include, dar n acelai timp depete chimia clasic. Aceasta deoarece moleculele din organismele vii nu numai c se supun principiilor fizice i chimice obinuite, care guverneaz comportarea tuturor moleculelor, dar interacioneaz i ntre ele conform altui grup de principii pe care l vom numi logica molecular a strii vii. Aceste principii nu includ n mod necesar fore sau legi fizice noi, nedescoperite nc. Mai curnd ele trebuie privite ca un grup de reguli fundamentale care guverneaz natura, funcia i interaciile tipurilor specifice de molecule din organismele vii, proprieti ce confer acestora capacitatea de a se autoorganiza i autoreplica. Pn n prezent nu au fost identificate nc toate principiile cuprinse n logica molecular a strii vii, iar unele dintre ele sunt vag nelese. De fapt, este probabil mult mai potrivit s considerm aceste principii ca axiome, deoarece unele dintre ele sunt intuitive i nu pot fi demonstrate nc. Biochimia studiaz procesele chimice care condiioneaz viaa i structurile ce i corespund. Biochimia apare i dezvolt ca tiin de grani ntre chimie i biologie, fr a se putea realiza ns o demarcaie net ntre cele dou. nceputurile Biochimiei ca tiin dateaz din sec.XVIII, dar empiric unele procese biochimice se cunosc cu mult timp nainte. Contibuii din domeniul chimiei, biologiei i medicinei se afl ntr-o relaie de reciprocitate cu dezvoltarea biochimiei. Astfel a aprut biochimia modern care studiaz procesele biochimice care se desfoar la nivel celular i molecular. n ceea ce privete profesia de farmacist, Biochimia este o disciplin indispensabil, deoarece ea ne ofer bazele moleculare pentru studiul medicamentului n ceea ce privete aciunea principal, efectele secundare, biotransformarea medicamentului i toxicitatea sa. Deasemenea n terapie sunt cunoscute un numr mare de produi biologici cum ar fi: vitaminele, hormonii, enzimele, aminoacizii, glucidele, compuii purinici i pirimidinici precum i derivaii lor de sintez. Prin inginerie genetic se obin : hormoni, enzime, anticorpi, inetrferon, antitripsina. Deci, se poate concluziona c Biochimia studiaz totalitatea proceselor biochimice din organism (procese catabolice i anabolice), precum i procesele de biotransformare a medicamentelor ajunse n organism.

Luciana Dobjanschi

II. Compoziia chimic a organismului uman 1. Compoziia elementar a organismului uman Au fost identificate un numr de peste 60 de elemente care intr n compoziia chimic a organismului uman. Acestea au fost clasificate n funcie de proporia n care se gasesc n organism. Dintre acestea majoritatea se gsesc n urme. Astfel ele au fost clasificate n: macroelemente, oligoelemente i microelemente. Tabelul 1. Repartiia elementelor n organismul uman. Element carbon oxigen hidrogen azot calciu fosfor Procent ( %) 50 20 10 8,5 4 1 Element sulf sodiu clor magneziu fier iod Procent (%) 0,8 0,4 0,4 0,1 0,01 0,00005

Dintre acestea primele patru ( C,O, H i N) reprezint peste 95% i sunt considerate macroelemente. Ele sunt principalele bioelemente ale majoritii biomoleculelor datorit tendinei lor mrite de a forma legturi covalente. Oligoelementele se gsesc n proporie mai mic n organism i la fel ca i macroelementele intr n structura biomoleculelor. Microelementele se gsesc n urme, dar cu toate astea ele au un rol esenial pentru via. 2. Compoziia fundamental a organismului uman Bioelementele enumerate mai sus se gsesc n organism grupate n categorii de componeni i anume: componeni organici i componeni minerali. Componenii organici care intr n compoziia organismului uman sunt: proteinele, glucidele, lipidele i acizii nucleici. Aceti compui sunt molecule complexe, care sunt alctuite din molecule simple. Astfel, proteinele se formeaz prin policondensarea aminoacizilor, glucidele sunt formate din monozaharide, lipidele sunt formate din acizi grai i ali componeni, iar acizii nucleici sunt formai din ribonucleotide i dezoxiribonucleotide.

Biochimie farmaceutic

Tabelul 2. Principalele biomolecule din organismul uman Biomolecula ADN ARN proteine glucide lipide Uniti strucurale dezoxiribonucleotide ribonucleotide aminoacizi monozaharide Acizi grai componeni Funcii Material genetic Model pentru sinteza proteinelor Funcii multiple Rezerv de energie ali Funcii multiple

Componenii minerali prezeni n organismul uman sunt apa i electroliii. Apa este constituientul major al tuturor organismelor vii. Organismul uman conine ntre 58 i 66% ap. O influen remarcabil asupra coninutului de ap al organismului o are vrsta. Coninutul de ap variaz i n funcie de sex, astfel femeile au un coninut de ap mai redus n comparaie cu brbaii. Apa din organism este repartizat n vasele sanguine i limfatice, spaiile intercelulare i celule nsi. Apa din organism se gsete repartizat n dou compartimente i anume: compartimentul extracelular, care reprezint aproximativ 50% din greutatea corpului i compartimentul intracelular, care reprezint aproximativ 20% din greutatea corporal.

Luciana Dobjanschi

Figura 1

Electroliii sunt reprezentai de cationi i anioni. Ei ndeplinesc n organism rol fizico- chimic, structural i catalitic. Distribuia cationilor n compartimentele intra i extracelulare este diferit.

10

Biochimie farmaceutic

Tabelul 3. Distribuia cationilor intra- i extracelular n mEg/l. Cationi Na+ K+ Ca+2 Mg+2 intracelular 10 150 2 15 extracelular 145 5 2 2

O clas diferit de biocompui sunt vitaminele care sunt indispensabile pentru funciile lor biologice, dar pe care organismul nu le poate sintetiza.Ele reprezint componenii nutritivi eseniali. Hormonii sunt o alt clas de biomolecule cu rol major n procesele endocrine, care au loc n organism.

11

Luciana Dobjanschi

III. Nucleotide i structura covalent a acizilor nucleici Acidul dezoxiribonucleic (ADN) i ribonucleic (ARN) sunt macromolecule tip lan, care au funcia de a depozita i transmite informaia genetic. Acetia sunt componente majore n toate celulele, reprezentnd 5-15% din masa uscat a acestora. Acizii nucleici se gsesc i n virusuri, care sunt complexe infecioase protein-acid nucleic, capabile s se autoreplice n celula gazd. Dei denumirea acizilor nucleici vine de la faptul c ADN a fost izolat prima dat din nucleii celulari, ei se gsesc totui i n alte compartimente ale celulei. La fel cum aminoacizii sunt elementele constitutive ale proteinelor, aa nucleotidele sunt componenii de baz a acizilor nucleici. Structura general a nucleotidelor Unitile monomere ale ADN se numesc dezoxiribonucleotide, iar cele ale ARN se numesc ribonucleotide. Nucleotidele sunt formate din 3 componente caracteristice i anume: o baz azotat, o pentoz i molecul de acid fosforic. Bazele azotate care intr n structura nucleotidelor sunt de dou tipuri: baze purinice i baze pirimidinice. Bazele purinice prezint un nucleu de baz numit purina, de la care deriv cele dou baze purinice: adenina i guanina. N N NH2 N N adenina N N H guanina H H2N N N O N N H N N H bazpurinic

12

Biochimie farmaceutic

Bazele pirimidinice prezint un nucleu de baz numit pirimidina, de la care deriv 3 baze pirimidinice, care int n structura acizilo nucleici, i anume: citozina, uracilul i timina. N N bazpirimidinic NH2 H N O N H citozina O N N H uracilul O H O N N H timina O CH3

Bazele azotate sunt compui slabi bazici, care pot exista n 2 sau mai multe forme tautomere n funcie de pH. Uracilul, de exemplu, exist n form de lactam i lactim. O H O N N H lactam HO N N lactim OH

Aceste forme, n special cea lactam, este responsabil de formarea legturilor cu celelalte componente din structura nucleotidei.

13

Luciana Dobjanschi

Pe lng bazele obinuite, descrise mai sus, n acizii nucleici se mai gsesc n cantiti mici i alte baze, numite baze rare sau minore. NH N N CH3 N N H N6 metiladenina O H HC 3 HN N N N N H O N N H 5 hidroximetilcitozina O N N H 5 metilcitozina NH2 CH2 OH NH2 CH3

N3 metilguanina

A doua component care intr n structura nucleotidei este reprezentat de pentoz. Aceasta poate s fie D - riboza sau 2 dezoxi D riboza.

HO

HC 2 H

O HH

H OH

HO

HC 2 H

O H H

H OH

OH OH
D riboza

OH H
2 dezoxi D riboza

14

Biochimie farmaceutic

Prin ataarea unei pentoze la baza azotat rezult o nucleozid, care n funcie de natura pentozei poate s fie ribonucleozid sau dezoxiribonucleozid.

NH2 N HO N HC 2 H N N O H H H OH H
2 dezoxiadenozina

NH2 N HO N HC 2 H N N O H H H OH OH
adenozina

Prin ataarea unei molecule de acid fosforic la structura unei nucleozide se formeaz un nucleotid. NH2 N OH HO P O O OH P O O OH P O O N HC 2 H N N O H H H OH H AMP ADP AT P

15

Luciana Dobjanschi

Deci, prin ataarea unei molecule de acid fosforic la o nucleozid se formeaz nucleozid monofosfatul (NMP), prin ataarea a 2 molecule de acid fosforic se formeaz nucleozid difosfatul (NDP), i prin ataarea a 3 molecule de acid fosforic se formeaz nucleozi trifosfatul (NTP). Componentele majore ale ADN sunt 4 dezoxiribonucleotide, care se deosebesc ntre ele prin baza azotat, care le d i numele. Cele 4 baze specifice dezoxiribonucleotidelor din ADN sunt: adenina i guanina (baze purinice) i citozina i timina (baze pirimidinice). Similar, pentru ribonucleotide, care sunt componente fundamentale pentru acizii ribonucletidici (ARN), bazele azotate care intr n compoziia lor sunt: adenina i guanina (baze purinice), citozina i uracilul (baze pirimidinice). Deci, timina se gsete numai n ADN, nu i n ARN, iar uracilul se gsete numai n ARN i nu i n ADN. O alt diferen ntre compziiile celor dou tipuri de acizi nucleici este dat de pentoza din structura nucleotidului: - dezoxiribonucleotidele conin: 2 dezoxi D riboza - ribonucleotidele conin: D riboza.

OH HO P O O HC 2 H baza azotat O HH H OH H
dezoxiribonucleotid

OH HO P O O HC 2 H baza azotat O HH H OH OH
ribonucleotid 16

Biochimie farmaceutic

Nucleozidtrifosfaii prezint o serie de funcii importante. ATP este un transportor de grupri fosfat i pirofosfat n cteva recii enzimatice implicate n transferal energiei chimice. ADP ul rezultat prin defosforilarea ATP ului este refosforilat la ATP n procesul respiraiei. Sistemul ATP ADP este sistemul principal pentru transferul gruprilor fosfat n celul, dar i ceilali nucleozidtrifosfai, i anume: GTP, UTP i CTP au rolul de a canaliza energia chimic pe anumite biosinteze specifice. A doua funcie major a NTP i NDP este cea de transportori de energie, energie pe care o nmagazineaz sub form de legturi macroergice. NTP i d NTP sunt precursori bogai n energie n procesul de biosintez enzimatic a ADN i ARN. n acest proces NTP i d- NTP i pierd gruprile pirofosfat terminale, transformndu se n resturi de nucleozid monofosfai, care sunt elemente constitutive ale acizilor nucleici. O alt funcie major a NTP i NDP este cea de transportori energizani de tip coenzim ai anumitor elemente constitutive. De exemplu: UDP este un transportor pentru glucide n procesul de biosintez a polizaharidelor. n toate cele 3 funcii ale NTP i d NTP, energia chimic a legturilor fosfat i este folosit pentru formarea unor legturi covalente noi. Pe lng nucleozid 5 fosfaii descrii, n natur mai exist i nucleotide cu gruprile fosfat n alte poziii. Dou nucleotide foarte importante au un rol cheie n aciunea biochimic a unor hormoni: 3, 5 ciclic adenozin fosfatul (AMP ciclic) i guanozin 3,5 ciclic fosfatul (GMP ciclic). NH2 N N O H2C O H H N N

H O P OH O OH

AMPc 17

Luciana Dobjanschi

OH N H2N O N H2C O H H N N

H O P OH O OH

GMP c

AMPc se formeaz n celulele eucariote, din ATP prin aciunea unei enzime din membrane celular, adenilat ciclaza, stimulat de anumii hormoni adui pe cale sanguin. AMPc mai este denumit i al doilea mesager, ntruct el transmite i amplific n celul semnalele chimice transmise pe calea sngelui de ctre hormoni, care sunt primii mesageri. ADN ul este format din lanuri de dezoxiribonucleotide legate covalent, iar ARN ul este compus din lanuri de ribonucleotide. Acizii dezoxiribonucleici i acizii ribonucleici prezint o serie de propriti fizice i chimice commune, ntruct n ambele molecule, nucleotidele succesive sunt legate covalent prin puni fosfodiesterice ntre gruparea 5 hidroxil a unei nucleotide i gruparea 3 hidroxil a urmtoarei nucleotide.

18

Biochimie farmaceutic

baz azotat H2C 5' O H H H 3' O O H P O 5' CH2 baz azotat O H H 3' H O H P O ADN O OH

HO

19

Luciana Dobjanschi

baz azotat H2C 5' O H H H 3' O O OH P O 5' CH2 baz azotat O H H 3' H O OH P O O OH

HO

ARN Astfel catena principal a ADN i ARN const n grupri fosforice alternnd cu radicali de pentoz, legtura fosfodiesteric asigurnd continuitatea covalent. Bazele purinice i pirimidinice din unitile nucleotidice nu fac parte din catena principal, ele formeaz catene distincte n acelai mod n care radicalii R ai aminoacizilor sunt catenele laterale distinctive ale polipeptidelor. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) a fost izolat pentru prima dat din celulele i sperma de somon de ctre Friedrich Miesscher (1869). El a denumit produsul izolat nuclein, dat fiind prezena lui n nucleii celulari. De atunci au trecut peste 70 de ani de cercetri pn la definirea complet a elementelor constitutive i a structurii catenei principale a acizilor nucleici. 20

Biochimie farmaceutic

Moleculele de ADN din diferite celule i virusuri se deosebesc prin raportul dintre cele 4 tipuri de monomeri nucleotidici, prin secvena nucleotidelor i prin masa molecular. Pe lng cele 4 tipuri de baze majore, n anumite tipuri de ADN, n deosebi de origine viral se gsesc cantiti mici de derivai metilai ai acestor baze. Acizii dezoxiribonucleici izolai din diferite organisme i virusuri au dou lanuri dispuse ntr-un aranjament complementar dublu elicoidal. n majoritatea celulelor moleculele de ADN sunt att de mari, nct este greu s le izolm sub form intact. n celulele procariote, care conin un singur cromozom, ntreaga cantitate de ADN este prezent ca unic macromolecul, o singur elice dubl, cu masa molecular de peste 2 x 109. n celulele eucariote, ce conin mai muli cromozomi, exist mai multe molecule de ADN. n bacterii, molecula de ADN care reprezint 1% din greutatea celulei se afl zona nuclear; de obicei ea este ataat printr-un singur punct de un pliu al membranei celulare, numit mezozom. Uneori, n citoplasma celulelor bacteriene se gsesc molecule mici de ADN extramitocondrial; aceste molecule de ADN, care poart doar cteva gene, se numesc plasmide sau epizomi, n funcie de relaia lor genetic cu ADN -ul cromozomial. n celulele eucariote diploide, aproape ntreaga cantitate de ADN se gsete n nucleu, combinat prin legturi ionice cu proteine bazice, numite histone. Pe lng ADN ul din nucleu n celulele eucariote diploide mai gsim cantiti foarte mici de ADN n mitocondrii, care difer de ADN ul nuclear prin bazele coninute i prin masa molecular. Acizii ribonucleici Cele 3 tipuri majore de acizi ribonucleici din celule sunt: ARNm, ARNr i ARNt. Toate cele 3 tipuri de ARN sunt lanuri monocatenare poliribonucleotidice, dar se deosebesc ntre ele prin domenii caracteristice de mase moleculare i de coeficieni de sedimentare. Fiecare dintre cele 3 tipuri majore de ARN exist n forme moleculare multiple. ARNr exist n cel puin 3 forme majore, ARNt exist n 60 de forme, iar ARNm exist n sute i poate mii de forme distincte. Majoritatea celulelor conin de 2- 8 ori mai mult ARN dect ADN. n celulele bacteriene, cea mai mare parte a ARN se afl n citoplasm, dar o anumit cantitate este ataat necovalent de ADN, pe msur ce se formeaz n procesul de transcripie. n celulele eucariote diferitele forme de ARN au o distribuie intracelular distinct. 21

Luciana Dobjanschi

ARNm conine doar cele 4 baze majore. El se sintetizeaz n nucleu n procesul de transcripie, prin care secvena bazelor dintr-un lan de ADN cromozomial este copiat enzimatic n lanul de ARNm. O anumit cantitate de ARNm se sintetizeaz i n mitocondrii. Secvena bazelor din lanul de ARNm este complementar celei din lanul de ADN ce se transcrie. Dup transcripie, ARNm trece n citoplasm i apoi la ribozomi, unde servete ca matri pentru ordonarea secvenial a aminoacizilor n procesul de biosintez a proteinelor. ARN ul mitocondrial reprezint doar o mic parte din ARN ul total din celul, dar el se afl n foarte multe forme distincte, care se deosebesc prin masa molecular i secvena bazelor azotate. Fiecare din miile de proteine diferite sintetizate n celula este codificat de ctre un ARNm. ARNm din celulele eucariote se caracterizeaz prin prezena la captul 3 terminal a unei secvene lungi de cca 200 de radicali adenilici, care pare s aib un rol n prelucrarea sau transportul ARNm de la nucleu la ribozomi. ARNt sunt molecule relativ mici, care funcioneaz ca transportori specifici ai cte unei molecule de aminoacizi n procesul de biosintez a proteinelor pe ribozomi. Ei au o mas molecular de 23000 28000 i un coeficient de sedimentare de 4S. Ei conin 75 90 de nucleotide. Fiecare dintre cei 20 de aminoacizi din proteine are cel puin un ARNt coerspunztor, iar unii au chiar mai muli ARNt. De exemplu: n celulele de Escherichia coli exist 5 ARNt diferi pentru transferul leucinei. Mai mult, n celulele eucariote unui anumit aminoacid i corespund ARNt mitocondriali diferii de ARNt citoplasmatici. Moleculele de ARNt prezint cteva trsturi comune. Toate tipurile de ARNt au la un capt al lanului polinucleotidic un acid guanilic terminal, iar la cellalt capt secvena terminal citidil citidil adenil (CCA). Gruparea 5 hidroxil a acidului adenilic terminal este legat de gruparea 3 hidroxil a acidului citidilic precedent print-o punte fosfodiesteric. Gruaprea hidroxil liber din acidul adenilic terminal este acilat enzimatic cu -aminoacidul specific, formnd aminoacil ARNt. Acest aminoacid este transferat enzimatic la captul lanului polipeptidic n curs de formare pe suprafaa ribozomilor, n procesul de biosintez proteic. ARNr reprezint 65% din masa ribozomilor. El se poate obine din ribozomii de E.coli ca molecule lineare, monocatenare, prezente n 3 forme caracteristice, cu coeficienii de sedimentare de 23S, 16S i respectiv 5S. Aceste 3 forme se deosebesc prin secvena i raportul bazelor. n celulele eucariote, care au ribozomi mai mari 22

Biochimie farmaceutic

dect celulele procariote, exist 4 tipuri de ARNr: 5S, 7S, 18S i 28S. Dei ARNr reprezint o mare parte din ARN celular total, funcia lui n ribozomi nu este nc, bine elucidat. Complexe supramoleculare acizi nucleici - proteine Unii acizi nucleici se afl n celule asociai necovalent cu proteine specifice, formnd complexe supramoleculare. Dintre aceste sisteme acid nucleic proteine, cu structuri i funcii biologice foarte complexe; ribozomii i virusurile sunt cele mai cunoscute. Cele mai complexe sisteme acid nucleic protein sunt probabil cromozomii din celulele eucariote. Ribozomii sunt particule ribonucleoproteice care se gsesc n toate tipurile de celule. Ei sunt eseniali n biosinteza proteinelor. Virusurile sunt structuri subcelulare la limit ntre lumea biotic i abiotic. Virusurile au capacitatea de a se antagoniza atunci cnd intr ntr-o celul gazd specific. Implicaiile terapeutice ale nucleotidice Unele nucleotide naturale, precum i derivaii lor obinui prin sintez pot fi utilizate n terapie, fiind utilizate n: chimioterapia bolii maligne, tratamentul hiperuricemiei i gutei, n afeciuni virale, n hipertiroidism sau ca ageni imunosupresori, hipogliceminai, antifungici i antiparazitari. Mecanismul lor de aciune este variat: - nhib enzimele implicate n biosinteza acizilor nucleici, blocnd procesul - nhib enzimele care catalizeaz conversia xantinei n acid uric.

23

Luciana Dobjanschi

IV. Proteine Proteinele sunt compui macromoleculari, respectiv biopolimeri rezultai din policondensarea aminoacizilor legai ntre ei prin legturi peptidice. Diferena ntre proteine i polipeptide se face pe baza dimensiunii moleculare, limita de delimitare fiind stabilit arbitrar la o greutate molecular de 8 x 10 Kd. Lanurile de peptide alctuite din sub 10 resturi de aminoacizi se numesc oligopeptide, iar cele de pn la 50 60 de resturi de aminoacizi se numesc polipeptide. Proteinele sunt formate din sute de resturi de aminoacizi, iar masa lor molecular poate urca la sute de mii de daltoni. IV.1. Aminoacizii Aminoacizii sunt unitile structurale de baz din molecula proteinelor. Aminoacizii conin dou grupri funcionale comune tuturor aminoacizilor: o grupare aminic i o grupare carboxilic. Capacitatea unui aminoacid de a se condensa cu ali aminoacizi pentru a forma peptide este dependent de propritile chimice ale acestor dou grupri funcionale. Cea mai important proprietate a aminoacizilor este aceea de a servi ca subuniti monomerice pentru proteine, dar ei prezint i alte roluri importante pentru celul. De exemplu, glutationul este o tripeptid cu funcii importante, alte peptide mici au funcii de hormoni, sau n unele organisme au rol de antibiotice. Acidul glutamic are rol de neuro transmitor. Aminoacizii sunt precursorii unei variti de biomolecule (de exemplu: hitidina pentru histamin). Unii aminacizi sunt metabolizai i utilizai pentru producerea de glucoz (gluconeogenez). Deoarece nu exist rezerve de aminoacizi, cu excepia celor implicai n structura proteinelor, atunci cnd gluconeogeneza are nevoie de aminoacizi, acetia sunt eliberai prin decompunerea proteinelor. Structura aminoacizilor n proteinele tuturor speciilor procariote i eucariote a fost identificat un set de cca 20 de aminoacizi, marea majoritate aprinnd seriei sterice L. Toi aminoacizii, cu excepia prolinei, prezint aceeai strucutur general n sensul c atomul de carbon este legat de o grupare COOH, de una NH 2 i de un rest R rspunztor de proprietile diferite ale diferiilor aminoacizi. Formula general a unui aminoacid:

24

Biochimie farmaceutic

CH COO-

NH3+ n toi - aminoacizii, cu excepia glicinei, carbonul este optic activ. Izomerii posibili aparin seriei D sau L. S-a constatat c toi izomerii existeni n mod natural n constituia proteinelor aparin seriei sterice L. Sarcinile aprute n formulele aminoacizilor sunt cele care apar la pH 6-7. Ca urmare, la pH 6-7, un aminoacid poate s aib caracter acid sau bazic. Clasificare aminoacizilor Din punct de vedere structural aminoacizii se pot clasifica astfel: - aminoacizi alifatici HC 2 COOH H3C CH COOH

NH2 glicina ( glicocol, Gly) H3C CH CH COOH

NH2 alanina (Ala)

CH3 NH2 H3C CH CH3 valina (val) H3C CH 2 CH CH NH2 COOH CH2 CH NH2 leucina (leu) COOH

CH3 Izoleucina (ile) -

aminoacizi hidroxilai

25

Luciana Dobjanschi

HO

CH2

CH NH2

COOH

H3C

CH OH

CH NH2

COOH

serina (ser) - aminoacizi cu sulf HS CH2 CH COOH NH2 H3C S CH2 CH2 CH NH2 cisteina (cys) aminoacizii dicarboxilici i amidele lor CH2 CH NH2 H2N CO CH2 COOH COOH

treonina (thr)

metionina (met)

HOOC

acidaspartic(asp) CH COOH NH2

asparagina ( asn) HOOC CH2 CH2 CH NH2 acid glutamic (glu) HN 2 CO CH2 CH2 CH NH2 glutamina (gln) COOH COOH

26

Biochimie farmaceutic

aminoacizi cu dou grupri bazice

H2N CH2 lisina (lys) H2N C NH arginina (arg)

CH2

CH2

CH2

CH NH2

COOH

NH CH2

CH2

CH2

CH COOH NH2

CH2 N NH

CH NH2

COOH

histidina (his) aminoacizi aromatici

CH2

CH NH2

COOH

fenilalanina (phe) HO CH2 CH NH2 tirozina (tyr)

COOH

27

Luciana Dobjanschi

CH2 N H triptofan (trp) COOH N H prolina (pro)

CH NH2

COOH

n funcie de polaritatea radicalului, aminoacizii se clasific, astfel: - aminoacizi neutri: Gly,Ala, Ser, Cys, Thr, Asn, Gln care au radicalul polar, dar lipsit de sarcin electric la pH=7. - aminoacizi hidrofili, cu caracter acid: Asp, Glu, Tyr care sunt aminoacizi ncrcai negative la pH fiziologic. - aminoacizi hidrofili cu caracter bazic: Arg, Lys, His aminoacizi care la pH fiziologic sunt ncrcai cu sarcin pozitiv. - aminoacizi hidrofobi: Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp. Exist proteine care pe lng aceti 20 de aminoacizi eseniali sau de baz, conin i ali aminoacizi. Acetia pot s ia natere prin modificri ulterioare sintezei lanului polipeptidic, determinnd astfel caracteristici noi ale activitii biologice. Exemplu: - acetilarea captului N-terminal, crete rezistena la degradare - prin hidroxilarea resturilor de prolin i lizin se formreaz: hidroxiprolina i hidroxilizina, cu rol n stabilizarea fibrei de colagen - carboxiglutamatul are legtur cu aciunea vitaminei K - fosforilarea resturilor de: Ser, Thr, Tzr, se folosete ca mecanism de reglare a multor procese celulare. o Ali aminoacizi modificai se ntlnesc n structura unor peptide biologic active. Pe lng aminoacizii prezeni n proteine, exist aminoacizi, care liberi sau n combinaii ndeplinesc funcii importante n metabolism. De exemplu: - alanina, din stuctura coenzimei A i a unor peptide - homoserina i homocisteina sunt intermediari metabolici - citrulina i ornitina apar n biosinteza ureei 28

Biochimie farmaceutic

- acidul - aminobutiric (GABA) este un mediator chimic nervos - 3,4 dioxifenilalanina (DOPA) este precursor al adrenalinei - acidul p- aminobenzoic intr n structura acidului folic. Proprietile aminoacizilor Aminoacizii sunt substane solide, cristaline i au puncte de topire sau de descompunere peste 2000C. Ei sunt mult mai solubili n ap dect n solveni nepolari. n reeaua cristalin, moleculele de aminoacizi sunt atrase prin fore electrostatice. Dac aminoacizii ar cristaliza ntr-o form neionic, datorit atraciei Van der Waals, atunci ar avea puncte de topire mult mai sczute. Toate acestea duc la concluzia c aminoacizii se gsesc n soluii apoase i n reeaua cristalin sub form de ioni dipolari sau amfioni. H2N R COOH HN 3
+

COO-

Datorit caracterului lor amfoter, aminoacizii formeaz sruri att cu acizii ct i cu bazele. HN HN 3
+

R R

COO- +H+ COO+ H2O

HN 3

R R

COOH COO- + H2O

HN 2

Deci, n mediu acid, aminoacizii se comport ca baze, iar n mediu bazic se comport ca acizi. Datorit faptului c aminoacizii posed grupri carboxilice i grupri bazice, ei prezint proprieti datorate gruprilor carboxil i proprieti datorate gruprii aminice precum i proprieti determinate de ambele grupri.

29

Luciana Dobjanschi

IV.2. PEPTIDE Cea mai important proprietate a aminoacizilor, este aceea de condensare, care duce la formarea de peptide. Peptidele se formeaz prin eliminarea unei molecule de ap ntre gruparea carboxil a unui aminoacid i gruparea aminic a unui alt aminoacid.
H2N CH R1 COOH + H2N CH R2

COOH

H2N CH R1

CO

NH

CH COOH +H2O R2

Prin convenie, un lan polipeptidic se scrie ncepnd cu extremitatea ce are gruparea aminic liber, numit capt N- terminal i se ncheie cu captul C terminal, reprezentat de gruparea carboxilic a ultimului aminoacid. H2N CH R1 CO NH CH R2 CO ....... NH CH COOH Rn

n unele cazuri aceste capete sunt derivatizate. Oligopeptidele se clasific n di-, tri-, tetra- pn la decapeptide, n funcie de numrul de resturi de aminoacizi prezeni n structura peptidei. Ca exemple de peptide cu rol biologic cunoscut amintim: - Dipeptidele: carnozina i anserina, cu rol n metabolismul muscular. CH2 N N R CH NH COOH CO CH 2 CH2 NH2

R = H carnozina = CH3 anserina - Tripeptide. Glutationul este o tripeptid format acid glutamic, cistein i glicin, motiv pentru care se numete i - glutamil-cisteinil-glicin.

30

Biochimie farmaceutic

HOOC CH NH2

CH2

CH2

CO

NH

CH CH2 SH

CO

NH

CH2

COOH

Glutationul se ntlnete n celulele animale, unde se gsete n concentraie ridicat. El funcioneaz ca un sistem redox i servete n transportul intercelular de aminoacizi. - 2H 2 Glu Cys Gly Glu Cys Gly +2H SH S S (GSH) glutation redus Glu Cys Gly

(GSSH) glutation oxidat

Interconversiunea formelor reduse i oxidate are loc sub aciunea unor enzime i servete n biosinteza eicosanoizilor, a dezoxiribonucleotidelor, n biotransformarea insulinei circulante, precum i n alte procese. Deoarece glutationul redus protejeaz gruprile tiol ale proteinelor, el este esenial pentru integritatea eritrocitului i deasemeni pentru meninerea Fe din hemoglobin n stare bivalent. Mecanismul implicat privete neutralizarea potenialului agresiv al peroxizilor rezultai n metabolismul aerob. glutation peroxidaza

2 GSH + R- O- OH

H GSSH + R- OH + 2O

Formarea unor astfel de peroxizi este favorizat de un numr de medicamente, la care pot s apar ca efecte adverse anemia hemolitic i methemoglobinemia. O alt tripeptid este hormonul de eliberare a tirotropine (TRH) de origine hipotalamic, care are ambele capete derivatizate. 31

Luciana Dobjanschi

TRH se mai numete: piroglutamil- histidil- prolinamida. Glutamatul N-terminal apare ciclizat sub forma acidului piroglutamic, iar captul C terminal este reprezentat de prolinamid. Exist dou grupe de oligopeptide formate din 7- 10 resturi de aminoacizi cu aciune asupra musculaturii netede, care rezult din hidroliza enzimatic a unor proteine plasmatice. Angiotensinele provin din angiotensigen, o protein format din cca. 400 de aminoacizi. Angiotensinogen renina Angiotensina I (decapeptid) (proteina plasmatic) captopril enzima de conversie Angiotensina II (octapeptid) aminopeptidaza Angiotensina III (heptapetid) Angiotensinele acioneaz asupra vaselor, mai intens pe artere stimulnd secreia de aldosteron i eliberarea de prostaglandine. Angiotensina II este socotit cel mai puternic agent presor present n circulaia general. Aceasta pare a fi implicat n patogeneza hipertensiunii arteriale eseniale, dei sunt cazuri cu activitate reninic normal sau chiar sczut. Inhibitorii sistemului reninangiotensin, n care rolul central l are enzima de conversie, se utilizeaz n tratamentul hipertensiunii arteriale: de exemplu captoprilul. Un alt grup de polipetide este reprezentat de kininele plasmatice, formate din kininogeni sub aciunea enzimelor numite kalikreine. Plasmakininele, considerate i hormoni locali, produc vasodilataie arterial (efect hipotensor), dar determin contracia vaselor, musculaturii uterine, a intestinului i bronhoconstricie. Alte oligopeptide cu activitate biologic sunt encefalinele i hormonii neurohipofizari.

32

Biochimie farmaceutic

Un alt exemplu de polipeptide naturale este reprezentat de vasopresin i oxitocin, care sunt peptide ciclice alctuite numai din aminoacizi. Aceste dou polipeptide au o structur foarte apropiat, fiind alctuite din 9 resturi de aminoacizi, dar prezint funcii fiziologice diferite. Vasopresina are efect antidiuretic, iar oxitocina acioneaz asupra musculaturii netede a uterului, producnd contracia uterului. Oxitocina stimuleaz i contracia musculaturii din jurul alveolelor mamare, determinnd astfel eliminarea laptelui din canalele glandei mamare, avnd aciune lactagog.

33

Luciana Dobjanschi

IV.3. PROTEINE Proteinele i funciile lor biologice. Proteinele sunt cele mai rspndite molecule organice din celul. Masa molecular a proteinelor este foarte mare, dar prin hidroliz acid toate se transform n compui organici simpli, i anume L-aminoacizi. Proteinele se mpart, n funcie de compoziia lor n dou clase principale: - proteine simple - proteine conjugate Proteinele simple sunt acelea care prin hidroliz formeaz numai aminoacizi i nici un alt compus organic sau anorganic. Proteinele conjugate sunt acelea care prin hidroliz pun n libertate pe lng aminoacizi i ali compui organici sau anorganici. Partea conjugat a proteinei, care nu este aminoacid se numete grupare prostetic. n funcie de natura gruprii prostetice, proteinele conjugate se mpart n: Tipul proteinei care se gsesc - nucleoproteine mozaicului tutunului - lipoproteine lipoproteinele plasmatice - glicoproteine globuline Gruparea prostetic acizi nucleici: - ADN - ARN fosfolipide lipide membranare glucide: - hexozamine - galactoz - manoza - acid sialic fosfai esterificai cu radicali ai sernei hem Locul n ribozomi virusul

- fosfoproteine - hemoproteine hemoglobina citocromul C - flavoproteine dehidrogenaza 34

cazeina

FAD

succinat

Biochimie farmaceutic

- metaloproteine

metale

feritina

Masa molecular a proteinelor se poate determina prin metode fizice i poate fi cuprins ntre 5000 i cteva milioane. Exemplu: - insulina: greutatea molecular de 5700 daltoni - virusul mozaicului tutunului: greutatea molecular de 40000000 de daltoni. Diversitatea funcional a proteinelor Proteinele ndeplinesc n organism multiple funcii, dintre care amintim urmtoarele: 1. Enzimele sunt proteine ce catalizeaz diverse reacii biochimice. Exemplu: hexokinaza, lactat dehidrogenaza 2. Proteinele de rezerv Exemplu: - ovalbumina proteina din albuul de ou - cazeina proteina din lapte - feritina proteina de depozitare a Fe n splin - zeina proteina din semine de porumb - gliadina proteina din gru 3. Proteine de transport Exemplu: - hemoglobina proteina ce transport oxigenul n sngele vertebratelor - hemocianina proteina ce transport oxigenul din sngele nevertebratelor - mioglobina proteina ce transport oxigenul n celulele musculare - albumina seric proteina ce transport acizii grai n snge - 1-lipoproteina proteina ce transport lipidele n snge - ceruloplasmina proteina ce transport cuprul n snge Aceste proteine sunt capabile s lege i s transporte pe calea sngelui anumite tipuri de molecule. 4. Proteinele contractile sunt proteine cu rol esenial n fenomenul de contracie i n micare. Exemplu: - actina filamentele subiri din miofibrile - miozina filamentele groase din miofibrile - dineina proteinele din cili i flageli. 35

Luciana Dobjanschi

n muchi, actina i miozina sunt aezate n iruri paralele, alunecnd unele pe lng altele n timpul contraciei. 5. Proteinele cu rol de protecie n sngele vertebratelor Exemplu: - anticorpii formeaz compleci cu proteinele strine - sistemul complement formeaz complexe cu anumite sisteme antigen-anticorp. - Fibrinogenul precursor al fibrinei n coagularea sngelui - Trombina particip la procesul de coagulare. Unele proteine au rol de aprare sau de protecie. Proteinele sanguine (trombina i fibrinogenul) particip la coagularea sngelui oprind astfel pierderile de snge n sistemul vascular al vertebratelor. Cele mai importante proteine cu rol de aprare a organismului sunt anticorpii sau globulinele imune, care se combin cu proteinele strine sau cu alte substane strine intrate ntmpltor n organism, neutralizndu-le. 6. Toxinele Exemplu: - toxina din Clostridium botulinum - toxina difteriei - veninul de arpe - ricinul - gossipina Toxinele sunt substane foarte toxice pentru organismul animalelor superioare, chiar i n cantiti foarte mici. 7. Hormoni Exist proteine care funcionez ca i hormoni. Exemplu: - insulina este secretat de anumite celule specializate din pancreas i regleaz metabolismul glucozei. - Hormonul adrenocorticotrop: hormonul de cetere sau somatotropina este un hormon al glandei hipofizare anterioare, care regleaz sinteza corticosteroizilor. 8. Proteinele structurale Exist o clas de proteine care servesc ca i elemente structurale. Exemplu: - proteinele din nveliul viral - glicoproteinele - - keratina - sclerotina 36

Biochimie farmaceutic

fibroina colagenul elastina mucoproteinele.

Anticorpii i rspunsul imun. Specificitatea de specie a proteinelor. Anticorpii sau imunoglobulinele au o importan foarte mare n demonstrarea faptului c proteinele sunt specifice pentru fiecare specie. Moleculele de anticorpi apar n serul sanguin sau n anumite celule de vertebrate ca rspuns la introducerea unei proteine sau a unei alte macromolecule strine acelei specii. O astfel de macromolecul strin speciei respective se numete antigen. Moleculele specifice de anticorpi produse n acest mod se pot combina cu antigenul care a determinat formarea lor pentru a forma complexul antige-anticorp. Aceast reacie, numit rspuns imun, este baza ntregului domeniu al imunologiei. Imunitatea fa de o anumit boal infecioas poate fi adesea realizat prin injectarea unei cantiti foarte mici de componeni macromoleculari din microorganisme sau virusuri care provoac boala respectiv. Ca rspuns la antigenul strin se formeaz anticorpul specific, sau o imunoglobulin, care rmne n snge un timp ndelungat. Dac microorganismul va ptrunde mai trziu n snge sau n limf, aceti anticorpi specifici l vor putea inactiva sau chiar omor prin combinare cu componenii lor antigenici. Rspunsul imun este dat numai de vertebrate. Anticorpii sunt foarte specifici pentru moleculele strine care le produc. Un anticorp format de un iepure injectat cu ou de gin, de exemplu, se va combina cu acesta, dar nu i cu alte proteine, cum ar fi hemoglobina uman. Mai mult ei sunt specifici pentru structura tridimensional a albuminei native din oul de gin, astfel nct dac aceasta este denaturat prin nclzire sau prin alt mijloc, cu deplierea lanurilor polipeptidice componente sau este modificat chimic, anticorpii nu se vor mai combina cu ea. De aici putem trage urmtoarele concluzii: 1. Proteine cu funcii diferite aparinnd unei singure specii determin formarea unor anticorpi diferii. Astfel cnd se imunizeaz un iepure cu hemoglobin de cal, anticorpii vor precipita hemoglobina de cal i nu celelalte proteine de cal. 37

Luciana Dobjanschi

2. Proteine omoloage de la specii diferite nu sunt identice imunologic. 3. Specificitatea anticorpilor reflect relaia filogenetic. Exemplu: Proteinele omoloage a speciilor foarte nrudite sunt mult mai asemntoare ntre ele dect ale speciilor foarte ndeprtate. Astfel, anticorpii produi de iepure fa de hemoglobina de cal reacioneaz cel mai bine cu hemoglobina de cal. Ei reacioneaz, de asemenea puternic cu hemoglobina altor specii nrudite cu calul (zebra, vaca, porcul sau alte copitate) dar sunt mult mai puin reactivi cu hemoglobina roztoarelor, psrilor sau amfibienilor. Astfel cu ct dou specii sunt mai apropiate cu att mai asemntoare sunt i secvenele de aminoacizi ale proteinelor lor omoloage. Deci, secvena de aminoacizi ale proteinelor omoloage poate da informaii preioase despre evoluia diferitelor organisme i pentru legtura lor filogenetic. Structura proteinelor Lanurile polipeptidice ale proteinelor se pliaz n diferite moduri, att n cadrul propriului lan, dar i ntre lanurile vecine, adic intracatenar i intercatenar. Acest mod de pliere este esenial pentru activitatea biologic a proteinelor i aceast organizare complicat este cea care trebuie conservat pe parcursul procedurilor implicate n purificarea proteinelor. Dei mult timp s-a considerat c modurile de pliere ale lanurilor polipeptidice sunt determinate numai de secvena aminoacizilor din lan, astzi s-a stabilit c proteinele avnd aceeai secven a aminoacizilor pot exista n forme diferite de mpachetare i c astfel de plieri pot fi influenate de prezena altor proteine. Structura proteinelor a fost imaginat ca avnd 4 nivele de organizare, i anume: structura primar, secundar, teriar i cuaternar.

38

Biochimie farmaceutic

Fig. 2. Principalele tipuri de structuri ale proteinelor Structurile proteice sunt stabilizate de dou tipuri de legturi puternice: legtura peptidic i puntea disulfidic, precum i de trei tipuri de legturi slabe. Legtura disulfidic se stabilete ntre dou resturi de cistein, aparinnd sau nu aceluiai lan polipeptidic i este la fel de rezistent ca i legtura peptidic la aciunea agenilor denaturani uzuali ai proteinelor. Aceast legtur poate fi distrus prin oxidare cu acid performic sau prin reducere cu betamercatoetanol. Legturile disulfidice sunt prezente de obicei n proteinele extracelulare i aproape c lipsesc din cele intracelulare. Legturile slabe sunt reprezentate n general de legturile necovalente, i anume: legturi de hidrogen, ionice i hidrofobe. Legturile de hidrogen se stabilesc ntre grupri CO i NH aparinnd unitilor peptidice diferite, aflate n poziie adecvat. 39

Luciana Dobjanschi

R C O H N CH CH N H legtur de hidrogen O C

R Forele electrostatice se formeaz prin atracia gruprilor cu sarcin opus ce aparin aminoacizilor ionizai. Exemplu: - ntre un aminoacid dicarboxilic i gruparea aminic a lizinei. Un rol semnificativ n meninerea structuri l au deasemeni interaciunile hidrofobe prin care radicalii nepolari ai aminoacizilor hidrofobi tind s se asocieze. Proteinele n stare natural au o structur tridimensional unic, ce se exprim prin conformaia, care i determin de astfel i funcia. Structura primar n structura oricrei proteine sau peptide se distinge un element comun, reprezentat de axul covalent, care se formeaz prin repetarea gruprii peptidice i o parte a variabilei reprezentat de radicalii aminoacizilor constituieni. H2N CH R1 CO NH CH R2 CO ....... NH CH COOH Rn

Structura primar este definit ca secvena resturilor de aminoacizi ce deriv din policondensarea lor prin legturi - peptidice. Exist mai multe argumente n favoarea acestei structuri, dintre care amintim: - proteinele au puine grupri amino- i carboxil titrabile, iar numrul lor crete dup hidroliz - dau uor reacia biuretului - sinteza de proteine este posibil excusiv prin interaciuni peptidice - proteinele sunt substrate pentru peptidaze

40

Biochimie farmaceutic

identificarea aminoacizilor componeni prin difracie cu raze X i spectroscopie n infrarou (IR). Cunoaterea structurii primare a proteinei const n stabilirea naturii radicalilor, n ordinea nlnuirii i localizarea eventualelor puni disulfidice i stabilirea tuturor conexiunilor dintr-un lan polipeptidic. Pentru determinarea compoziiei, proteina este supus hidrolizei n cataliz acid, bazic sau enzimatic, urmat de separarea i identificarea aminoacizilor rezultai. Hidrolizatul obinut n urma reaciei de hidroliz este analizat prin cromatografie sau alte tehnici automatizate. Dup separarea aminoacizilor, cuatentificarea lor se face prin reacia de culoare cu ninhidrina sau fluoresceina, care sunt reacii de mare sensibilitate. Pentru determinarea succesiunii aminoacizilor dintr-un lan se folosesc tehnici manuale i automate bazate pe procese chimice i enzimatice. Dac catena polipeptidic este relativ scurt, se identific mai nti capetele N i C terminale i apoi secvena cuprins ntre ele. Pentru lanuri mai lungi, dup identicarea capetelor N i C terminale, fragmentul rmas ntre ele se scindeaz n fragmente de pn la 50 de resturi, care se separ prin cromatografie sau electroforez. Se determin structura primar a fiecrui fragment i apoi se potrivesc n ordinea lor iniial, fcndu-se reconstituirea lanului. Numrul de grupri terminale gsite ofer informaii asupra numrului de lanuri ce compun proteina. Captul N terminal se poate identifica prin marcarea sa cu un compus care formeaz o legtur covalent, stabil n condiiile n care legturile peptidice sunt hidrolizate. n acest scop s-au utilizat 2,4 dinitrofluorbenzenul, clorura de Dansyl i clorura de Dabsyl. O alt metod enzimatic folosete aminopeptidaza, care hidrolizeaz legtura peptidic n care este cointeresat aminoacidul N terminal. Astfel, enzima va detaa pe rnd cte un aminoacid ce ajunge n poziie terminal. Dezavantajul acestei metode este c aciunea enzimei este foarte lent n cazul unor aminoacizi. Captul C terminal poate fi stabilit prin aciunea carboxipeptidazei, enzim ce scindeaz lanul peptidic cu un rest, ncepnd dinspre aminoacidul cu gruparea carboxilic liber. Dup un timp de reacie se separ i se identific aminoacizii eliberai. Odat ce fragmentele rezultate din lanul iniial au structura primar descifrat, urmez rezolvarea succesiunii lor n lan, pentru care se folosete tehnica peptidelor suprapuse. Lanul peptidic original se scindeaz prin dou sau mai multe metode diferite de hidroliz specific i din compararea seturilor de peptide obinute se deduce integral secvena iniial. Pentru proteinele mari, cu peste 1000 de resturi de aminoacizi, secvenarea lanului devine o operaie dificil i care cere 41

Luciana Dobjanschi

mult timp. A aprut ns, tehnologia ADN-ului recombinat, care a permis o nou modalitate de abordare experimental n chimia proteinelor. Semnificaia structurii primare Prima protein a crei structur primar a fost identificat este insulina. S-a dovedit c structura primar a proteinelor este determinat genetic i c proteinele din toate organismele sunt sintetizate printr-un mecanism comun.S-a constatat c secvena de aminoacizi este veriga ntre mesajul genetic cuprins n ADN i structura tridimensional responsabil de funcia biologic a proteinei. Cunoaterea secvenei de aminoacizi aduce informaii eseniale pentru descifrarea conformaiei i mecanismului de aciune, cu privire la nrudirea proteinelor, n legtur cu evoluia filogenetic a speciilor precum i cu domeniul patologiei moleculare. Activitatea biologic a unei proteine poate depinde direct i indirect de structura ei primar. Modificri minore, ca nlocuirea, pierderea sau inseria unui aminoacid se traduc biochimic prin polimorfismul proteinelor n cadrul speciei conferind individualitate organismelor prin specificitatea de specie i prin boli genetice consecutive alterrii sau pierderii funciei. Structura secundar a proteinelor Structura secundar a proteinelor se refer la dispunerea spaial a resturilor de aminoacizi nvecinai n secvena liniar, ce poate fi ordonat sau dimpotriv cu puine neregulariti. Prin difracie cu raze X a fost confirmat existena conformaiilor ordonate i au fost observate structuri ce se repet periodic. Tot prin tehnica cristalografic cu raze X a fost stabilit caracterul planar, rigid al legturii peptidice, datorat conjugrii.

Figura 3.

Coplanaritatea celor 4 atomi 42

Biochimie farmaceutic

Consecinele formrii acestui sistem puternic conjugat sunt coplanaritatea celor 4 atomi, ceea ce presupune imposibiliatea rotirii i existenei formelor cis i trans. S-a observat c izomerul trans este favorizat, deoarece este mai srac n energie. Scheletul lanului polipeptidic apare, deci ca o succesiune de planuri rigide unite prin atomii de C ai aminoacizilor constitutivi. Dou treimi dintre atomii lanului poilpeptidic se afl n poziii fixe unul fa de altul, dar de o parte i de alta a fiacrei legturi peptidice exist o libertate de micare. Astfel 2 planuri succesive se pot roti n jurul aceluiai C. Prezena unor radicali mai mult sau puin voluminoi va impune amplitudinea rotaiilor, astfel c unghiurile nu pot avea valori ntmpltoare, ci sunt caracteristice diferitelor tipuri de structuri secundare. Structura secundar prezint 2 modele, i anume: modelul -helix i foaie pliat. Modelul -helix Modelul -helix reprezint un tip de structur secundar ce presupune ca lanul s se nfoare strns pe o direcie spiralat, formnd un cilindru cu interiorul aproape plin, din care radicalii aminoacizilor apar nt-o dispunere helicoidal.

Figura 4. Modelul de -helix

43

Luciana Dobjanschi

Ca sens de rsucire n proteine a fost identificat -helix pe dreapta. Stabilitatea -helixului este meninut prin legturi de H ce se formeaz ntre gruprile carbonil i aminice din lanul spiralat aflate fa n fa la o distan adecvat. La -helix fiecare aminoacid avanseaz spirala cu 1,5A0 la o rotire de 1000, pe fiecare spiral existnd 3,6 resturi, deci pasul spiralei este de 5,4A0. Aceste dimensiuni arat formarea legturii de H ntre gruprile CO i NH din cadrul lanului polipeptidic. Exist unii aminoacizi care sunt nefavorabili structurii de helix. Acetia sunt aminoacizi ce stabilizeaz structura de -helix. Exemplu: - prolina poate s rup spirala. Aminoacizii cu resturi laterale voluminoase (arg, ile, lys, asp, glu) destabilizeaz helixul prin interferne fizice sau electrostatice. Coninutul de -helix n proteine cu structur spaial este variabil. Lungimea i repartizarea segmentelor de -helix depinde de distribuia resturilor favorabile sau destabilizatoare n lungul lanurilor. n mioglobin i hemoglobin apare ca motiv structural major, iar n altele lipsete chimotripsina. La majoritatea proteinelor se gsete ca helix singular pe distane scurte (40 A0), rar pe zone extinse de 1000A0. Dou sau cteva -helixuri se pot mpleti ca uviele unui nur, aa cum apar n proteinele fibroase: -keratina din pr, miozina, fibroina, care ndeplinesc un rol mecanic de formare a mnunchiurilor rezistente de fibre. Moelul sau foia pliat Structura de foaie pliat a fost studiat tot de Pauling i Corey, curnd dup -helix, de aceea au numit-o structura . Cele 2 modele difer n primul rnd prin faptul c lanul polipeptidic n conformaia este mai relaxat, fiind aproape complet extins. Distana axial ntre dou resturi succesive este de 3,5A0 fa de 1,5A0 n -helix, cu o periodicitate decorespunznd la cca 7A0. Lanurile polipeptidice sunt aezate n foi pliate, care sunt legate ntre ele prin legturi de hidrogen. Radicalii aminoacizilor se situeaz deasupra i dedesubtul planului foii. Dac sensul de desfurare a lanului n poriunile adiacente coincide, foaia este numit paralel. Aranjamentul alternativ n foaia antiparalel este favorabil, succesiunea gruprilor CO i NH fiind complementare.

44

Biochimie farmaceutic

Figura nr.5. Strucura de foaie pliat. Aminoacizi mici: gly, ala, avantajeaz foaia pliat, iar cei cu radical mare sau cu sarcin stnjenesc aranjamentul. Ca i modelul de -helix, structura se ntlnete n multe proteine globulare sau fibroase. Asocieri de lanuri paralele apar n fibroina (mtase) i antiparalele apar n -keratina. Un exemplu de protein fibrilar prezent la animlaele superioare este colagenul din esutul conjunctiv, fiind cea mai rspndit protein dintre proteinele vertebratelor superioare. Cu ct un animal este mai mare i mai greu, cu att proporia de colagen este mai mare. Fibrele de colagen sunt aranjate n moduri diferite, depinznd de sarcina biologic pe care o are de ndeplinit proteina. Structura teriar a proteinelor Structura teriar a proteinelor reprezint aranjamentul spaial general al moleculei, rezultat prin asocierea dintre diferite regiuni ale aceluiai lan, a cror structur secundar poate sau nu varia. Aranjamentul spaial al proteinelor s-a studiat cu raze X. Printre proteinele globulare ale cror structur teriar este binecunoscut sunt: mioglobina, hemoglobina, lizozomii, ribonucleaza, citocromul c, lactat dehidrogenaza. Reprezentantul clasic al structurii teriare este mioglobina. Mioglobina este o protein globular relativ mic, care conine un singur lan polipeptidic format din 153 resturi de aminoacizi, a cror secven nc nu se cunoate. Mioglobina conine o feroprotein, sau hem, grupare identic cu cea a hemoglobinei, fiind i ea capabil s se oxigeneze i s se deoxigeneze. Mioglobina se gsete n celulele muchilor scheletici i este deosebit de abundent la mamiferele acvatice, cum ar fi: balena, foca 45

Luciana Dobjanschi

sau morsa, a cror muchi sunt att de bogai n mioglobin nct sunt colorai n brun nchis. Scheletul moleculei de mioglobin este format din opt segmente aproximativ drepte, unite prin poriuni curbate. Fiecare segment drept este un -helix, cel mai lung fiind constituit din 23 de aminoacizi, iar cel mai scurt este format din numai 7 aminoacizi i toi au sensul de rsucire spre dreapta. Aceste regiuni - helicoidale reprezint 70% din aminoacizii din molecul. Dei structura mioglobinei pare neregulat i asimetric, ea nu este deloc ntmpltoare. Toate moleculele de mioglobin au aceeai configuraie.

Figura nr. 6. Structura mioglobinei Alte aspecte structurale legate de structura mioglobinei sunt urmtoarele: 1. Molecula este foarte compact, n interiorul ei rmne spaiu pentru patru molecule de ap. 2. Toate gruprile R polare ale resturilor de aminoacizi sunt localizate pe suprafaa extern a moleculei i sunt hidratate. 3. Aproape toate gruprile R nepolare sau hidrofobe se afl n interiorul moleculei, ferite de expunerea la ap. 4. Resturile de prolin se gsesc numai n zonele de curbur, care conin, deasemenea aminoacizi care nu formeaz cu uurin helix, de exemplu: izoleucina i serina.

46

Biochimie farmaceutic

5. Conformaia de ansamblu a lanului polipeptidic este aparent aceeai la mioglobina tuturor speciilor speciilor studiate, dei ele difer oarecum n compoziia de aminoacizi. Astfel, resturile constante de secven pot fi implicate n determinarea poziiei curburilor i a direciei segmentelor drepte. Ribonucleaza, este o enzim pancreatic ce depolimerizeaz molecula de ARN i exemplific un model diferit de mpachetare tridimensional a lanului. Catena ei este format din 124 de aminoacizi i este organizat n proporie de 40% ca foaie pliat antiparalel, 15% n -helix, restul lanului gsindu-se sub form de bucle. n structura teriar forma general a moleculei amintete de cochilia unui melc, la a crei stabilitate contribuie i 4 puni disulfidice. Structura cuaternar Structura cuaternar apare la proteinele alctuite din dou sau mai multe lanuri polipeptidice care se asociaz formnd o unitate de sine stttoare, cu form spaial bine definit i posednd o anumit activitate biologic. Structura cuaternar se refer la felul, numrul i aranjamentul lanurilor polipeptidice ncluznd i natura contactelor dintre ele. Cele mai multe proteine oligomer sunt formate dintr-un numr mic i par de lanuri, care se numesc subuniti sau protomeri. Subunitile identice sau diferite au fiecare structura sa spaial; ele se pot aeza succesiv pe direcie liniar, circular sau mai compact suprapuse n forme geometrice diferite. Aceste posibiliti de aranjare se refer la protomeri identici sau foarte puin diferii. Ansamblul prezint simetrie, suprafeele de contact sunt complementare, sugernd gradul nalt de specificitate al structurii cuaternare. Monomerii realizeaz interaciuni slabe: (legturi saline, legturi de hidrogen, fore Wan der Waals, legturi hidrofobe), proteina putnd astfel disocia reversibil. Lanurile izolate sunt lipsite de activitate, funcia fiind rezultatul ansamblului cu structur cuaternar. Exemple de proteine cu structur cuaternar: - creatin kinaza, lactat dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, enzime, proteine neenzimatice: hemoglobina , imunoglobulina G. Alte exemple de proteine cu structur cuaternar sunt enzimele allosterice. 47

Luciana Dobjanschi

Noiunea de structur cuaternar se poate extinde i la unele heteroproteine. Printre cele mai simple proteine oligomere este hemoglobina, care este format din 4 lanuri polipetidice. Hemoglobina conine 2 lanuri formate din 141 de resturi de aminoacizi i 2 lanuri formate din 146 de resturi de aminoacizi; fiecare dintre acestea avnd ataat printr-o legtur necovalent cte un radical hem. Molecula a fost studiat n forma sa oxigenat, care are o structur sferic, compact, cu dimensiuni de: 6,4/5,5/5,0mm. n hemoglobin, ntre cele 2 lanuri , ca i ntre cele dou lanuri exist foarte puine contacte, n schimb, numeroase grupri R fac legtura ntre perechile de lanuri care nu sunt asemenea.

Figura nr.7. Structura hemoglobinei Un inters deosebit l prezint aezarea pe fiecare subunitate a cte uneia dintre cele 4 grupri hem, care leag cele 4 molecule de oxigen. Aceste grupri hem, molecule plane, n care atomii de fier formeaz compleci de coordinare plan-ptrai, sunt destul de ndeprtate ntre ele i sunt situate la anumite ungliuri unele de altele.

48

Biochimie farmaceutic

n molecula hemoglobinei rmne o cavitate cental, mrginit de grupri cu radical R polare.

Figura nr.8. Formarea hemoglobinei Denaturarea proteinelor Denaturarea proteinelor reprezint perturbarea structurii lor native, nalt organizate, trecerea la o form ntmpltoare cu creterea entalpiei sistemului, astfel c activitatea biologic este compromis. Denaturarea proteinelor are loc sub aciunea unor ageni denaturani. Agenii denaturani sunt: temperatura, acizii, bazele, oxidanii, unele metale, ureea, guanidina, solvenii organici. Agenii denaturani acioneaz distrugnd legturile ce dau stabilitate structurii tridimensionale. Fenomenul de denaturare privete nivelele de structur secundar, teriar i cuaternar, meninute prin legturi slabe, fr afectarea structurii primare. Procesul de denaturare poate s fie pn la un punct reversibil. ns, dac agentul denaturant acioneaz mai energic, proteina se denatureaz ireversibil. n cazul unui proces reversibil, dup ndeprtarea agentului cauzant, proteina se renatureaz, redobndind structura nativ. Aceasta se explic prin dependena structurii spaiale de cea primar. 49

Luciana Dobjanschi

Figura nr.9. Procesul de denaturare i renaturare a proteinelor Proteinele denaturate i schimb proprietile fizice, cum ar fi: activitatea optic i vscozitatea. Deasemenea solubilitatea n ap scade producnd precipitarea lor. Acest fenomen de precipitare este exploatat n biochimia analitic la cercetarea proteinelor din lichidele biologice n scopul deproteinizrii. Alte aplicaii ale fenomenului de denaturare sunt: procedeele de purificare a proteinelor i operaia de sterilizare.

50

Biochimie farmaceutic

V. VITAMINE Vitaminele sunt biomolecule indispensabile vieuitoarelor pentru creterea, ntreinerea troficitii i funciei esuturilor. Organismul uman nu le poate sintetiza sau produce n cantiti insuficiente. Vitaminele sunt necesare organismului n cantiti mici de ordinul miligramelor sau mai puin, cu excepia vitaminei C care este necesar n cantiti de aproximativ 75 mg pe zi. Deci, vitaminele pot fi considerate factori eseniali. Carena unei vitamine genereaz stri patologice, cu manifestri specifice. Deficienele vitaminice reflect dezechilibru dintre aport i necesiti. Ele sunt cauzate: Primar : - prin lipsa de aport alimentar - de afeciuni digestive ce se repercut asupra absorbiei - datorit disbiozei pentru vitaminele ce sunt produse de flora intestinal, aceasta este afectat prin administrarea oral de antibiotice sau sulfamide. Secundar : - datorit cerinelor crescute ce apar n anumite stri. Necesarul pentru o vitamin sau alta depinde de: - vrst - de starea fiziologic, de exemplu: sarcina - de starea de sntate - efortul fizic - temperatura ambiant - administrarea unor medicamente. Strile careniale sunt numite avitaminoze (apar astzi la populaia malnutrit din rile subdezvoltate) i hipovitaminoze, cu manifestri policareniale. Unele vitamine au provitamine, care sunt compui nrudii structural, inactivi sau slab activi, pe care organismul i transfer n forma activ n forma activ de vitamin. Au mai fost identificai i ali compui numii antivitamine, care sunt capabili s-i diminuie sau s-i suprime activitatea unei anumite vitamine. Unele antivitamine au utilizri terapeutice, dar prezin dezavantajul de a induce simptome careniale. Clasificarea vitaminelor Exist o clasificare care are la baz criteriul solubilitii n ap sau solveni nepolari. Astfel vitaminele se mpart n: - vitamine hidrosolubile: B1, B2, B6, B12, PP, acid folic, C, biotina, acidul pantotenic. 51

Luciana Dobjanschi

vitamine liposolubile: A,D,E,K. Unii autori admit i o categorie de pseudovitamine care cuprind compui care au parial trsturi de vitamine (vitaminoide). De exemplu: - flavonoizii numii i vitamina P - acizii grai eseniali sau vitamina F - mezoinozitolul - colina

Mecanismul de aciune al vitaminelor Multe vitamine acioneaz dup o prealabil biotransformare, iar altele rmn nemodificate i funcioneaz ca i coenzime, participnd la o multitudine de procese biochimice. Alte vitamine ca de exemplu vitaminele A sau D folosesc ci de aciune ce amintesc de mecanismele hormonale. Vitaminele E sau tocoferolii funcioneaz ca sisteme antioxidante fa de agresiunea peroxidic. Exist, deasemenea i modaliti particulare de aciune, cum ar fi de exemplu: retinalul i acidul retinoic. n general vitaminele prezint i un important rol catalitic. Implicaii terapeutice n terapie, vitaminele sunt utile ca medicaie specific pentru combaterea sau profilaxia strilor careniale. Preparatele pot s conin o singur vitamin sau asocieri de vitamine. n doze terapeutice vitaminele sunt n general bine tolerate. Supradozarea poate provoca tulburri grave, numite hipervitaminoze, mai ales la vitaminele liposolubile, care sunt mai greu eliminabile. Exemplu: - n literatur se semnaleaz c vitamina A ar prezenta risc teratogen, fiind astfel contraindicat n primele luni de sarcin. n terapie se folosesc unii derivai vitaminici ca sruri, esteri, reprezentnd forme optimizate sub raportul eficacitii sau al posibilitii de adminidtrare.

52

Biochimie farmaceutic

V.1. Vitaminele liposolubile Vitaminele liposolubile sunt molecule apolare derivate din izopren. Ele sunt relativ stabile la temperatura operaiilor culinare, dar uor inactivate de radiaiile UV i substanele oxidante. Digestia i absorbia lor decurge n condiii proprii lipidelor, cu participarea enzimelor specifice i a bilei. Ficatul poate depozita vitaminele A,D,K, iar vitamina E se acumuleaz mai ales n esutul adipos. n circulaia sanguin vitaminele liposolubile sunt vehiculate de ctre proteinele plasmatice. Vitaminele liposolubile se elimin n bil, urmeaz un circuit enterohepatic i se excret n fecale. Unii metabolii pot s treac n urin. Vitaminele A Vitaminele A mai sunt cunoscute i sub denumirea de retinoide. Surse de Vitamina A Vitamina A se gsete n alimenia carnal ca atare sau n produsele vegetale sub form de provitamine. Organismul uman nu poate sintetiza vitamina A, dar are capacitatea de a transforma provitaminele n forme active. Provitaminele A sunt pigmeni de culoare galben-portocalie sau roie. Structur Pigmenii vegetali au o structur polizoprenic format din 40 de atomi de carbon i au nite inele ciclohexenil (cicluri iononice). n grupa provitaminelor A intr hidrocarburi (caroteni) i derivaii lor oxigenai (xantofile, carotenoide). Condiia structural obligatorie este prezena a cel puin a unui nucleu -iononic. Exemplu:

- caroten 53

Luciana Dobjanschi

caroten n mucoasa intestinal, - carotenul sufer o scindare oxidativ a legturii duble din poziia 15 (proces enzymatic) n urma creia se formeaz vitamina A1 (retinalul).
O2 dioxigenaza

CH
2

vitamina A1 (retinalul) Tot n mucoasa intestinal mai au loc dou transformri i anume: - reducerea gruprii carbonilice la grupare alcoolic n prezena enzimei alcool dehidrogenazei sau retinol dehidrogenazei.

54

Biochimie farmaceutic

CH

alcool dehidrogenaza CH2OH

retinol

oxidarea gruprii aldehidice la acid carboxilic, n prezena aldehid dehidrogenazei, cu formare de acid retinoic.

CH

aldehid dehidrogenaza COOH

acid retinoic

Forma alcolic i cea de aldehid reprezint formele de absorbie intestinal. Dup absorbie vitamina A se esterific cu acizii grai (acid palmitic) i se depoziteaz n ficat. De acolo se mobilizeaz dup necesiti. Vitamina A este transportat de o protein plasmatic specific la esuturile int. Majoritatea esuturilor au capacitatea de a realiza conversia: 55

Luciana Dobjanschi

ol

al

oic

Se mai cunosc i alte vitamine A, i anume. A2, A3.

CH O

vitamina A2 (3-dehidroretinal) Vitamina A2 se gsete sub 3 forme, i anume: 3- dehidroretinal , -ol i oic i se gsete n ficatul petilor. CH2 CH O

Vitamina A3 n cazul vitaminei A3 are loc deplasarea legturii duble din poziia 13-14 n poziia 13-20. Toate cele trei forme ale vitaminei A1 (retinol, retinal i acid retinoic) sunt active biologic, dar sunt inechivalente ca aciune. Acidul retinoic Acidul retinoic este capabil s ntrein dezvoltarea i diferenierea diferitelor esuturi. Acidul retinoic particip n biosinteza glicoproteinelor, datorit capacitii sale de a proteja pielea i mucoasele (aciune epitelotrop) i mrete rezistena organismului la infecii. Retinolul n celula int retinolul este captat de o protein specific citoplasmei, diferit de cea seric i l transloc n nucleul celulei, unde este preluat de o protein nuclear. Se presupune c vitamina A sub forma alcoolic acioneaz asemntor hormonilor. Retinolul influeneaz funcia de reproducere, acionnd asupra hormonilor. 56

Biochimie farmaceutic

Retinalul Retinalul particip direct n procesul vederii, fiind elementul cromofor al tuturor pigmenilor vizuali coninui n celulele fotoreceptoare din retin. Celulele fotoreceptoare din retin conin dou tipuri de celule ca form: bastonae i conuri. Pigmenii vizuali sunt instrumente moleculare ale vederii. Ca structur sunt cromoproteine, proteine complexe formate din proteina propriu-zis plus o grupare micromolecular colorat. Celula bastona este implicat n procesul vederii i este format din dou segmente, i anume unul extern i unul intern. Segmentul extern este format din aproximativ 1000 de discuri ce conin pigmeni vizuali de tipul rodopsinei. Rodopsina este o cromoprotein format din dou componente: o parte proteic, numit opsina i cromoforul, care este izomer al vitaminei A: 11- cis retinalul. Cele dou componente sunt legate printr-o legtur de tip baz Schiff ce se realizeaz ntre funcia carbonil a cromoforului i funcia aminic a unui rest de lizin din structura opsinei. R CH N+ H cromofor ( 11- cis retinal ) Rodopsina are capacitate mare de a absorbi lumina, ceea ce face ca celula bastona s fie un receptor foarte sensibil, fiind necesar energia unui singur foton pentru a fi fotoexcitat. Rodopsina face parte dintr-un sistem senzor. Fenomenul primar al procesului de excitare vizual este izomerizarea 11-cis retinalului din structura rodopsinei, consecutiv absorbiei luminii. ( CH2 )4 CH NH CO opsina

57

Luciana Dobjanschi

izomerizare HC
11 cis -

lumina NH
+

opsina

retinal

CH

NH

opsina

all trans retinal Prin izomerizare se schimb geometria structurii polienice a rodopsinei, are loc o deplasare a legturii aldiminice cu 5A0 n raport cu inelul - iononic. Aceast deplasare va antrena structura proteinei i apar astfel modificri constante ale opsinei, modificri ce duc la desprinderea cromoforului de opsin. Procesul de fotoliz a pigmentului are loc n etape care se succed cu vitez foarte mare. Rodopsina activat va declana o serie de interaciuni n cascad care explic fenomenul de excitaie vizual.
R lumina intuneric

R* (rodopsina fotoexcitata)

all trans retinal izomeraza dehidrogenaza all trans retinol


11 cis

opsina

retinal

58

Biochimie farmaceutic

Procesul de excitare vizual. Carena de viatmina A mbrac diverse forme. La nivelul ochilor: - se instaleaz tulburri funcionale, scderea acomodrii n lumin crepuscular, apar dificulti n vedere. - Pot s apar leziuni ale conjunctivei (xeroftalmie) - Obstrucia canalelor vasculare, cheratomalacie, suprainfectare cu Bacillus xerosus La nivelul pielii: - apar leziuni trofice ale epidermei i mucoasei Tot n caren de vitamina A pot s apar tulburri ale creterii i sterilitate. Supradozarea cu vitamina A duce la hipervitaminoz, care se manifest prin creterea tensiunii intracraniene, cefalee, prurit, hepato-splenomegalie, descuamare cutanat, anorexie, iritabilitate. n condiii obinuite necesarul zilnic de vitamina A este de 1,7mg pentru adult i 1 mg pentru copii. El poate s creasc n sarcin, lactie, pneumonie, nefrit. Indicaii Vitamina A este indicat n special n: oftalmologie, dermatologie, dar i n boli infecioase febrile, boli renale, ciroze hepatice, hipertiroidism, diabet i n pediatrie. n scop terapeutic se folosesc esterii de retinol i anume: acetatul i palmitatul. Vitaminele D ( calciferolii) Prin origine, structur i mod de aciune vitaminele D se apropie mult de hormonii steroizi. Necesarul n raia alimentar este evaluat n jur de 150 UI la adult, ntre 300- 500UI la copil, cu condiia unui aport adecvat da Ca i P. Necesitile de aport exogen crescut sunt reclamate n sarcin, alptare, la sugari i la persoanele private constant de lumina solar. Surse de vitamina D: - din alimente sub form de provitamine - endogen prin biosintez - suplimentar sub form de medicamente n caz de sarcin, la sugari, persoanele ce triesc i lucreaz mult n ntuneric Provitaminele D sunt compui sterolici cu 19 atomi da carbon n structura tetraciclic de baz. Conversia provitaminelor D n vitamine D este un proces fotochimic ce are loc sub influana radiaiilor UV. Procesul are loc n etape cu deschiderea inelului B. Se 59

Luciana Dobjanschi

cunosc 6 vitamine D, care se noteaz de la D2 la D7. D1 este considerat preparat impur de D2.

lumina

HO

HO

7- dehidrocolesterol (D3)

colecalciferol

lumina

HO

HO

ergosterol (D2)

ergocalciferol

Provitamina D2 se ntlnete n sclerotul de secar, S.cereviceae, esuturi animale.

60

Biochimie farmaceutic

Sursa endogen de vitamina D sinteza endogena alimente

colesterol mucoasa intestinala


7

dehidrocolestrol lumina

HO colecalciferol Prin aciunea radiaiilor UV 7-dehidrocolesterolul format n mucoasa intestinal i depozitat n piele sufer un process de fotoliz neenzimatic, trecnd n precolecalciferol, care se izomerizeaz spontan n colecalciferol. Transformarea este direct proporional cu intensitatea expunerii i invers proprional cu gradul de pigmentare a epidermei. Procesul de conversie se diminu cu vrsta. Calciferolii se absorb din intestinul subire proximal. Metabolismul vitaminei D Vitamina D sufer un proces de hidroxilare la fel ca i hormonii. Au fost pui n eviden cca 20 de derivai hidroxilai. Astfel, n microzomii hepatici o hidroxilaz specific introduce gruparea hidroxil n poziia 25. 25- hidroxicalciferolul sub aciunea unui complex de trei enzime duce la hidroxilarea n poziia 1, cu formare de 1, 25 calciferol sau calcitriolul, care este metabolitul cel mai activ, fiind considerat i hormonul D. Perturbarea procesului de obinere a calcitriolilor duce la cauzele de producere a carenei de vitamina D. Astfel, medicaia antiepileptic (fenobarbital, fenitoina) administrat timp ndelungat 61

Luciana Dobjanschi

induce enzime capabile s produc produi hidroxilai preponderent inactivi.


calciferol hidroxilaza OH
25 hidroxicalciferol

OH

1,25 calciferol

(calcitriol)

24,25 calciferol

HO calcitriol

1,24,25 calciferol

62

Biochimie farmaceutic

Rolul biochimic al vitaminei D Vitamina D alturi de hormonul paratiroidian intervine n metabolismul Ca i al fosfailor. Astfel, reacia de hidroxilare a calcifediolului este stimulat direct de scderea fosfatului i indirect de scderea calciului. hipofosfatemie

hipocalcemie
+

PTH
+

calcifediol

calcitriol

Calcitriolul i stopeaz propria sintez prin mechanism feedback. Calcifediolul s-a putut localiza n intestine, n esutul renal, osos; acestea find deci principalele esuturi int a hormonului D. Aciunea biologic principal a hormonului D este de a facilita absorbia intestinal de Ca i fosfat. La nivelul tubilor renali produce retenie de fosfai i crete sinergic cu PTH reabsorbia Ca. n corelaie cu PTH asigur concentraiile sanguine optime de Ca i fosfai, n vederea mineralizrii normale a osului. Dup unele preri, calcitriolul ar stimula sinteza de osteocalcin, o protein transportoare de Ca, a crei formare depinde i de vitamina K. Aciunea parathormonului i a hormonului D este de a ridica nivelul de Ca n fluidul extracelular i de a menine sau scdea concentraia de fosfat. Cnd exist un deficit de Ca n os, creterea calcemiei sub influena vitaminei D va produce inhibiie feed-back a secreiei PTH, permind mineralizarea. Dozele mari de vitamina D stimuleaz osteoclatii i mobilizeaz Ca din oase. Aceste micri ale Ca pot fi puse n legtur cu proteinele transportoare din celulele respective. 63

Luciana Dobjanschi

n concluzie, hormonul D este produs printr-o serie complex de reacii enzimatice i neenzimatice, ce implic transportul moleculelor precursor la esuturi. n organele int hormonul D acioneaz dup modelul hormonilor steroizi, interceptnd n final un numr de procese biologice. Hormonul D are o contribuie esenial la homeostazia calciului. Acest bioelement este important nu numai n metabolismul osos, ci i n excitabilitatea neuromuscular, stimuleaz producerea unor hormoni i neurotransmitori, intervine i n procesul de coagulare. Carena de vitamina D Carena de vitamina D se manifest n primul rnd prin tulburri n metabolismul osos. La adult, demineralizarea osului provoac osteoporoza, care evolueaz spre osteomalacie. La copii, carena de vitamina D duce la apariia rahitismului. Semnele biuochimice sunt creterea fosfatazei alcaline serice, hipocalcemia i hipofosfatemia. Tabloul clinic al rahitismului include: deformri ale scheletului, modificri osoase vizibile radiologic, hipotonie muscular i ligamentar, uneori spasmofilie. Deformrile osului se instaleaz n primii ani de via. Exemplu: - fontanela defectuos suturat, craniu ovalar, dentiie ntrziat, toracele cu sternul proiectat nainte, bazin strmtat. La maturitate apare bazin distocic, membrele inferioare se curbeaz, iar abdomenul devine voluminos. Indicaii n terapie se utilizeaz vitaminele D2 i D3, calcifediolul i calcitriolul asociate cu preparate de Ca i fosfat. La sugari se face profilaxie cu vitamina D. Exist forme de rahitism, numite rahitism pseudocarenial, rezistente la vitamina D. Aceste boli sunt congenitale, datorate incapacitii transformrii vitaminei D n calcitriol i a absenei receptorului pentru hormonul D. Toate preparatele cu vitamina D sunt toxice prin supradozare, provocnd mobilizarea Ca din os, osteoporoza, hipercalcemia, depuneri n esutul renal ducnd la calculoza renal. La administrarea prelungit a vitaminei D se recomand controlul nivelului de Ca i fosfat din snge. A fost obinut un analog sintetic al vitaminei D , compusul dihidrotachisterolul ( AT10, tachystin), prin hidrogenarea parial a tachisterolului, unul din produii secundari din procesul de fotoliz a provitaminei D. Acest compus este folosit la combaterea de urgen a tetaniei paratireoprive, datorit efectului rapid de corectare a hipocalcemiei. 64

Biochimie farmaceutic

Vitamina E (tocoferolii) Vitamina E este cunoscut sub denumirea de vitamina antisterlitii, deoarece este necesar pentru fertilitate la unele mamifere i psri. Denumirea de tocoferol vine din limba greac *tokos = a nate, pherein = a purta*. Vitamina E se gsete exclusiv exogen n plantele verzi, uleiuri vegetale, alimente de origine animal, mai ales viscere. Structura vitaminei E Tocoferolii sunt derivai metilai ai nucleului, numit tocol. Se cunosc 4 tocoferoli naturali notai: -, -, -, - tocoferol. Compusul posed activitatea vitaminic cea mai marcat i este cel mai larg rspndit.

HO CH3 O
tocol

CH3

CH3

CH3 CH3

tocoferol: 5,7,8 trimetiltocol tocoferol: 5,8 dimetiltocol tocoferol: 7,8 dimetiltocol tocoferol: 8 metiltocol Metaboliii acestei vitamine nu se cunosc, neidentificndu-se nici un metabolit activ. Rolul biologic al vitaminei E Vitamina E prezint dou funcii biochimice: - una legat de calitatea sa puternic antioxidant - cealalt privind metabolismul Se. Vitamina E este un puternic antioxidant n vivo sau n vitro. Vitamina E este activ la presiuni mari de oxygen i protejeaz astfel acizii grai nesaturai, vitamina A, carotenii i gruprile tiolice ale enzimelor. Vitamina E este bine distribuit n membranele eritrocitelor i ale celulelor din teritoriul arborelui respirator. n vivo joac un rol important n protecia fosfolipidelor membranare, contribuind astfel la conservarea structurii celulare, fa de agresiunea peroxidic a diverilor ageni.

65

Luciana Dobjanschi

Relaia vitamina E Se este una de reciprocitate. Rolul legat de Se este specific i insuficient precizat. n ce privete Se, se arat c el este necesar pentru funcionarea normal a pancreasului (digestia lipidelor i deci a vitaminei E). Se contribuie la reinerea vitaminei E n lipoproteinele plasmatice. Se are o aciune sinergic antioxidant ca i component al unei enzime numite glutation peroxidaz.
2G

SH

H2O2 glutation peroxidaza

G S

2 H2O

Necesarul de viatamina E este de 10 mg /zi, iar n sarcin i alptare ajunge la 15 mg/zi. Carena de vitamina E Stri de caren E se pot instala n cadrul sindromului de malabsobie lipidic, cauzate de disfuncia pancreatic, colecistopatii, boli inflamatorii intestinale, cnd se produce steatoree (pierderea de lipde n scaun). Pn n prezent lipsesc dovezi sigure c vitamina E ar fi necesar funciei reproductive la om. Carena se manifest prin tulburri neurovegetative, apariia de edeme, fragilitate eritrocitar, anemia hemolitic, care apare n special la nou-nscuii prematur. Vitamina E se indic n sarcin i alptare, la prematuri, la vrstnicii cu tulburri de circulaie periferic. n avort, sterilitate i distrofii musculare eficiena este ndoielnic.

66

Biochimie farmaceutic

Vitamina K Vitaminele K naturale se gsesc n diferite alimente, ca: lapte, ou, uleiuri vegetale. Sursa major de vitamina K este flora saprofit intestinal (B.coli), astfel c n mod obinuit nu este necesar aportul exogen. Vitaminele K sunt derivai de 2- metal- 1,4-naftochinona. Compusul printe este considerat vitamina K3, numit i menadiona. O CH3

O vitamina K3 , menadiona Se cunosc 7 vitamine K, dintre care: K1K3 sunt liposolubile (vitamine naturale), iar K4..K7 sunt hidrosolubile (vitamine de sintez).

O CH3 CH2 O
fitomenadiona , vitamina K1 O CH3 CH2 O vitamina K2 ( n= 6,7,8) 67 CH CH3 C CH2 H n

CH3 CH C CH2 CH2

CH3 CH2 CH CH2 H 3

Luciana Dobjanschi

OH CH3

OH

vitamina K4 NH2HCl CH3

OH vitamina K5 NH2HCl CH3

NH2HCl vitaminaK 6 OH CH3

NH2HCl vitamina K7

68

Biochimie farmaceutic

Biotransformarea vitaminei K are loc n microzomii hepatici. Metabolitul cel mai activ al vitaminei K este derivatul hidrochinonic. Acesta sufer un proces de glicuronoconjugare, iar produii rezultai se elimin pe cale biliar i renal. acid carboxiglutamic CO2 monooxigenaza

Acid glutamic

O2 OH CH3 R OH O CH3 R O Acidul -carboxi- glutamic fixeaz calciul cu afinitate mare pentru glutamat, care este un chelator slab, permind interaciunea specific protein Ca+2 fosfolipide, esenial pentru procesul de coagulare. Rolul biologic al vitaminei K Vitamina K are rol n procesul de coagulare a sngelui. Vitamina K este esenial pentru asigurarea nivelului optim pentru 4 din factorii coagulrii sngelui: II, VII, IX, X. Aceti factori sunt proteine care se sintetizeaz i se elibereaz n circulaie sub form de precursori inactivi: zimogeni (precursori enzimatici). Conversia zimogenilor la forme active este un proces vitamino K dependent. 69 O O CH3 O R

epoxid reductaza

Luciana Dobjanschi

Rolul biochimic al vitaminei K a fost pus n eviden prin experiene cu antivitamine K. Astfel, s-a demonstrat c dicumarolul introdus n alimentaia animalelor produce hemoragii letale, deoarece sngele acestor animale conine o protrombin anormal, incapabil s lege calciu, ntruct ea nu conine resturi de acid carboxiglutamic. Compuii de tip cumarinic sunt folosii n terapia anticoagulant, pentru tratamentul i profilaxia afeciunilor tromboembolice, acionnd asupra epoxid reductazei pe care o nhib. Carena de vitamina K Deficitul de vitamina K se poate instala n sindromul malabsorbiei lipidice, n boli hepatice, prin disbioza intestinal indus de antibiotice sau sulfamide, abuz de laxative, tratament cu anticoagulante cumarinice, supradozare cu vitamina A. Carena de vitamina K duce la hemoragii, epistaxis, hemoragii subcutane, digestive, hematurie. Deasemenea carena de vitamina K poate s mai apar n boala hemoragic a sugarului, la care intestinul este relativ steril, sistemul de sintez hepatic a factorilor de coagulare este imatur, iar bariera placentar este greu accesibil la vitamina K. Terapia cu vitamina K Vitamina K face parte dintre hemostaticele folosite sistemic n hemoragii de diverse etiologii. Preparatele farmaceutice de vitamina K sunt: fitomenadiona, menadiona solubil i derivaii si hidrosolubili, menadion sodiu sulfat i menadiol sodiu fosfat. Fitomenadiona este lipsit de toxicitate, celelate fiind contraindicate la nou-nscui i sugari putnd provoca anemie hemolitic i hiperbilirubinemie. Dozele terapeutice sunt mai mari dect cerina fiziologic, care este apreciat la 2 mg/zi.

70

Biochimie farmaceutic

V.2. Vitaminele hidrosolubile Vitaminele hidrosolubile sunt molecule polare cu structur chimic foarte variat. Ele se ntlnesc asociate n produse naturale ca: drojdia de bere, cortexul gramineelor, ficat. Din aceast cauz lipsa de aport prin alimentaie provoac stri de policaren i nu o hipovitaminoz anume. De exemplu: alcoolismul cronic produce policarena vitaminic B, cu preponderen a carenei de vitamina B1. Vitaminele hidrosolubile se absorb n circulaia portal, se stocheaz n cantiti mici, eliminndu-se cu uurin pe cale renal. Vitamina B1 Vitamina B1 se mai numete tiamina sau aneurina i apare larg rspndit n esuturile vegetale i animale, n drojdia de bere. Necesarul zilnic pentru un adult sntos este de cca 2 mg/zi. Necesiti crescute pot s apar n sarcin i alptare, n cretere i n stri patologice ca boli nervoase, alcoolism, boli infecioase. Structura n structura moleculei de tiamin intr 2 nuclee heterociclice: unul pirimidinic i unul tiazolic. Cele dou nuclee sunt unite print-o punte metilenic. N H3C N CH2
+ N

CH3 CH2 CH2 OH

Vitamina B1 este uor absorbit din intestine, n esuturi unde este fosforilat i transformat n tiaminpirofosfat (TPP), care apoi poate fi hidrolizat cu eliminarea gruprii pirofosforice.

71

Luciana Dobjanschi

ATP

AMP

TPP Tiamina pirofosfattransferaza pirofosfataza P P H2O

N H3C N

CH2

+ N

CH3 CH2

OH CH2 O P O O

OH P OH O

TPP TPP (cocarboxilaza) este forma metabolic activ, care servete drept coenzim n reacii ce transfer uniti de aldehid activat. Asemenea transferuri au loc n reacia de decarboxilare oxidativ a - cetoacizilor i n reacia de transcetolare. Ambele tipuri de reacii sunt ntlnite n cadrul metabolismului glucidic. n aceste reacii de transfer, rolul propriu-zis al coenzimei TPP este de a servi la eliberarea din anumite molecule a unitilor aldehidice care urmeaz a fi transferate pe alte molecule. Carena Carena de tiamin apare atunci cnd cresc necesitile. Sindromul tipic pentru carena de tiamin este cunoscut sub numele de boala beri-beri. Sindromul beri-beri prezint 3 forme: - Beri-beri uscat (paralitic), se manifest prin atonie muscular, caecsie, polinevrit periferic degenerativ. - Beri-beri edematos (umed), care se manifest prin tahicardie, cardiomegalie, dispnee, edem generalizat - Beri-beri difuz , ce se manifest cu dureri musculare de tip reumatismal, astenie. Sindromul beri-beri rmne cauza esenial a mortalitii neonatale n Asia de S-E. O alt form de hipovitaminoz este sindromul Wernicke, care se manifest cu fenomene de encefalopatie (afeciune a sistemului nervos). 72

Biochimie farmaceutic

La alcoolici carena apare frecvent evolund cu polinevrita, crampe dureroase ale membrelor inferioare, tulburri senzitive, apoi motorii. Indicaii Vitamina B1 este indicat n tratamentul strilor careniale, n neurologie, reumatologie, alcoolism, boli infecioase, diabet zaharat. Vitamina B2 Vitamina B2 sau riboflavina este sintetizat de plante i microorganisme. Ea se gsete n cantiti mari n: lapte, ou, ficat, legume verzi. Este relativ termostabil, dar se descompune n prezena luminii. Structura Riboflavina este reprezentat de nucleul izoaloxazinic substituit cu doi radicali metil n poziiile 6 i 7, i cu un rest ribitil n poziia 9. CH2 H3C N N O Riboflavina la nivelul mucoasei intestinale este fosforilat cu ajutorul mATP rezultnd o structur ce amintete e un nucleotid, i anume: FMN. FMN reprezint forma de absorbie intestinal. n diferite esuturi, FMN este nglobat ntr-o structur mai complex, prin legare de un rest de AMP, transferat de pe o molecul de ATP cu formare de FAD. CHOH 3 CH2 OH N O NH

H3C

73

Luciana Dobjanschi

CH2 H3C N N

CHOH 3 CH2 OH N O NH O
+ ATP

flavokinaza
2 Mg+

H3C

CH2 H3C N N

CHOH 3 CH2 N O NH O

PO3H2

H3C

FMN CH2 CHOH 3 CH2 OPO3H2 H3C N N O CH2 CHOH 3 CH2 O H3C N N O FAD Dintre aceste dou forme FAD reprezint 80%, FMN 20%, iar riboflavina liber rmne ntr-o proporie neglijabil. N O NH HO OH N O NH
+ ATP

flavokinaza Mg+2 NH2 OH P O O OH N N P O CH2 N O O N

H3C

H3C

74

Biochimie farmaceutic

Rol biochimic Ambele flavin-nucleotide (FMN, FAD) sunt coenzime care fac parte din sisteme enzimatice implicate n diverse procese de oxido-reducere din organism. Datorit structurii coenzimelor respective, aceste enzime se mai numesc flavoenzime sau flavoproteine. n structura lor se remarc o legtur strns (necovalent) ntre coenzim i partea proteic. Deasemenea, majoritatea flavoproteinelor conin metale cu rol de cofactori adiionali, de aceea enzimele respective sunt cunoscute i sub numele de metaloflavoproteine. n reaciile de oxido-reducere catalizate de flavoproteinele active, participantele directe la procesele redox sunt tocmai coenzimele constituente, FMN sau FAD. Astfel, ciclul izoaloxazinic poate suferi reduceri reversibile prin fixarea temporar la atomii de azot din poziiile 1 i 10 a doi atomi de hidrogen preluai de la substratele cu care intr n reacie i care se oxideaz. R H3C N N O R H3C N N H H N N O NH
+ SH 2

H3C

O NH
+ Sox

H3C

n acest fel, FMN sau FAD trec din formele lor oxidate n formele reduse FMNH2 sau FADH2 . Formele oxidate sunt pigmeni galbeni, fluoresceni, iar cele reduse apar ca leucoderivai. Aceste flavoproteine pot fi utilizate n oxidarea unor substrate ca: aminoacizi, amine, glucoza, etc. Necesarul de vitamina B2 este de aproximativ 1,5 mg n 24 de ore i este acoperit din alimente i prin aportul florei intestinale, astfel c o caren de B2 este destul de rar ntlnit. 75

Luciana Dobjanschi

Carena Cnd aportul de riboflavin este insuficient apar simptomele avitaminozei i anume: ragade la colurile gurii, leziuni ale buzelor, colorarea n rou intens a limbii, oboseal ocular, dilatarea pupilei, sensibilitatea ochiului la lumin, modificri ale vascularizaiei la nivelul corneei, tremurturi, tulburri digestive, dificulti la urinare. Toate aceste simptome dispar prin includerea sistematic n alimentaie a unor alimente bogate n vitamina B2 sau prin administrarea de produse farmaceutice ce conin riboflavin. Indicaii Vitamina B2 este indicat n dermatologie, oftalmologie i neurologie. Ea se administreaz n asociaie cu alte vitamine din grupul B. Vitamina PP Vitamina PP (niacina, nicotinamida, vitamina B3 ) este vitamina antipelagroas. Vitamina PP se sintetizeaz n plantele verzi i la animale pornind de la triptofan. Ea se gsete n cantiti mari n: carne, legume i cereale. Necesarul zilnic de vitamina PP este de cca 15 mg /zi. Din punct de vedere structural vitamina PP este acidul nicotinic. COOH N acid nicotinic N nicotinamida CONH2

Vitamina PP este constituientul a 2 nuleotide ce reprezint formele sale biologic active: NAD+ i NADP+.

76

Biochimie farmaceutic

NH2 CONH2 O N + O CH2 O O O CH2 O N N N N

P O P OH OH

OH OH R: H = NAD PO3H2 = NADP

OH O R

n celulele animale NAD+ este prezent n cantiti mult mai mari dect NADP. Coninutul de NADP+ al esuturilor este proporional cu activitatea lor biosintetic. NAD+ i NADP+ au rol de coenzime i servesc unor enzime de oxido-reducere, numite dehidrogenaze. Astfel NAD+ este considerat principalul colector de hidrogen al substratelor. AH2 A CONH2 N + ( NAD+) R H
+

H+ H CONH2

N R ( NADH )

B BH2

H+

77

Luciana Dobjanschi

Aceste reacii implic transferal reversibil de perechi de atomi de H. Rolul dehidrogenazelor piridinice: transfer de H i electroni ntre substrate fie n reacii cuplate aparinnd aceleai ci metabolice, fie ntre ci metabolice diferite. - NADH ofer hidrogen n etapa final a oxidrii celulare reprezentat de lanul respirator mitochondrial - NAD+ este principalul colector de H a substratelor. El funcioneaz mai cu seam n cile metabolice oxidative. Enzimele NAD dependente se mai numesc reductaze i servesc n procese de hidroxilare ce privesc substane endogene i xenobiotice. Carena de vitamina PP provoac pelagra. Timp ndelungat pelagra a fost considerat ca o form tipic de caren PP. Ulterior s-a constatat c pelagra este o stare policarenial cauzat prin absena aportului de viatamina PP i B6, precum i de triptofan. Ea apare la populaii malnutrite, mai ales consumatoare de porumb, din care lipsete triptofanul i proteinele cu valoare biologic ridicat. Pelagra mai poate s apar i secundar n cazul sindromului de malabsorbie, al sindromului carcinoid, cnd o cantitate mare de triptofan este sustras biosintezei de acid nicotinic, la alcoolici, n aminoacidurii (ca boala Hartnup) i sub tratament cu izoniazid. Pelagra se manifest printr-o erupie caracteristic pe pielea expus soarelui, care devine atrofic, aspr i fisurat, prin inflamaia mucoaselor digestive (stomatite, glosite, enterite). Simptomelor dermice li se asociaz i tulburrile de tranzit, diaree apoas, uneori sanguinolent, tulburri ale SNC, insomnie, confuzie, delir, com, tulburri hematologice i de circulaie periferic. Utilizarea n terapeutic Preparatele cu vitamina PP corecteaz eficient o bun parte din simptome, ncepnd cu cele digestive i mai trziu cu dermatita. Pentru administrare se prefer nicotinamida. Acidul nicotinic poate s produc fenomene adverse chiar i n doze terapeutice. Administrarea cantitilor mai mari de niacin (pn la 100mg /zi) nu determin fenomene de toxicitate. Cantitile excesive provoac ns prurit, roirea pielii i, n general, modificri circulatorii deoarece vitamina PP determin dilatarea lumenului vaselor sanguine. -

78

Biochimie farmaceutic

Vitamina B6 Vitamina B6 , numit i piridoxina sau adermina, apare sub trei forme biologic active interconvertibile. Vitamina B6 se gsete n principal n grne, ficat, drojdie, legume verzi i n cantiti mici n lapte i ou. Din punct de vedere structural are la baz nucleul piridinic, substituit. CH2OH HO H3C piridoxina CH2 HO H3C N NH2 CH2OH N CH2OH HO H3C N CHO CH2OH

piridoxal

piridoxamina Piridoxina i analogii si se absorb din intestine. n citoplasma celulelor derivaii vitaminei B6 sunt fosforilai la gruparea alcoolic din poziia 5, rezultnd piridoxal-fosfatul (PALPO).

79

Luciana Dobjanschi

CHO HO H3C N CH2OH piridoxal kinaza HO H3C

CHO

O CH2 P OH OH PALPO

ATP ADP

CH2NH2 HO H3C N

O OH OH PMP

CH2 P

PALPO i PMP (piridoxaminfosfat) sunt formele active ale vitaminei B6. Ele funcioneaz ca i coenzime n metabolismul aminoacizilor. PALPO intervine n procesul de transaminare a aminoacizilor.
E CHO
+

R1 CH COOH NH2

H2O E CH

N CH R1 COOH

R1 C N COOH

CH2 E

baza Schiff I
+H O 2

baza Schiff II

R1 C COOH O

CH2 NH2

R2 C COOH + E O
+H O 2

CH2NH2

H2O

R2 C COOH N CH2 E baza Schiff III

R2

CH COOH N CH E

baza Schiff IV

R2 CH COOH + E CHO NH2

80

Biochimie farmaceutic

Deci, ntr- un proces de transaminare are loc transferul funciei aminice de pe un aminoacid pe un alfa- cetoacid acceptor, astfel c aminoacidul donor devine alfa- cetoacid, iar alfa-cetoacidul acceptor devine aminoacid.. n cursul procesului catalitic are loc transformarea reversibil a PLP n PMP. Vitamina B6 este foarte bine rspndit n rndul produilor alimentari, astfel c o alimentaie normal i aportul florei intestinale acoper necesitile de vitamina B6 n condiii obinuite. Astfel strile careniale de vitamina B6 de origine nutriional apar foarte rar la om. Principalele manifestri ale carenei de vitamina B6 sunt dermatita seboreic, polinevrita, apariia de convulsii (n special la sugari), anemia. Anemia apare ca urmare a perturbrii etapelor iniiale din biosinteza hemului. Alte posibiliti de instalare a deficienei de vitamina B6 sunt: alcoolismul cronic, sarcina, insuficiena renal i unele boli genetice. Deasemenea, unele medicamente, ca: izoniazida (HIN), cicloserina, penicilamina, contraceptivele orale, administrate timp ndelungat pot s induc carena de vitamina B6. Necesarul de vitamina B6 este n jur de 2 mg/zi la adult. Aportul excesiv poate determina efecte toxice pe sistemul nervos. Acidul pantotenic (vitamina B5 ) Acidul pantotenic poart acest nume pentru c este foarte mult rspndit n esuturile vegetale i animale. El este vitamin pentru om, dar i factor de cretere pentru microorganisme. Cele mai bogate surse de acid pantotenic sunt: drojdia de bere, boabele cerealelor, glbenuul de ou, carnea. n organism acidul pantotenic provine i prin sintetizarea sa de ctre flora bacterian intestinal. n structura acidului pantotenic intr acidul pantoic i alanina legate printr-o legtur amidic. CH3 HO CH2 C CH CO NH CH2 CH2 COOH

CH3 OH acid pantoic beta- alanina 81

Luciana Dobjanschi

Acid pantoic este absorbit uor n intestine, i apoi fosforilat n poziia a acidului pantoic, urmnd astfel o cale metabolic prin care este transformat n 2 cofactori enzimatici : fosfopantoteina i coenzima A.
O HO P OH CH3 O CH2 C CH CO CH3 OH NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH

fosfopanteina
O HO P O O P OH O CH2 O CH3 O CH2 C CH CO NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH

CH3 OH NH2 N N N N

O OH O P OH OH

Coenzima A Dup cum se observ coenzima A are o structur nucleotidic ce include fosfopantoteina de care este legat un rest adenilic fosforilat n poziia 3 a ribozei. Fosfopantoteina servete ca grupare prostetic transportoare de radicali acil, numit Acyl carrier Protein (ACP). ACP face parte dintr-un system multienzimativ implicat n procesul de biosintez a acizilor grai. Coenzima A este deasemenea implicat n diverse reacii enzimatice din diferite ci degradative sau biosintetice cum ar fi: 82

Biochimie farmaceutic

oxidarea acizilor grai, decarboxilarea oxidativ a alfa- cetoacizilor, degradarea aminoacizilor, n procesul de iniiere a ciclului Krebs, n biosinteza diferitelor lipide, precum i n procesele de acetilare a unor compui endogeni sau xenobiotici ( de ex. acetilarea HIN). Coenzima A se leag de resturile acil prin intermediul funciei tiolice, formnd astfel tioesteri macroergici de tipul : R- CO- SCoA. Formarea legturilor macroergice presupune consum de energie, care poate s fie cedat de ATP. Alimentele pot s ofere cantiti mari de acid pantotenic, astfel nct nu a fost semnalat carena spontan. Deficiena specific s-a putut induce experimental prin administrare de antagoniti. Simptomele sunt variate: digestive, predispoziie la infecii, crampe musculare, modificri cutanate, hipoglicemie, depresii nervoase. Deficitul de pantotenat alturi de cel al vitaminei B6, acizilor grai eseniali i de proteine contribuie la instalarea steatozei hepatice. Acidul pantotenic este indicat n stri de policaren B. Biotina (Vitamina H) Biotina este un derivat imidazolic cu structur biciclic care conine ca lan lateral un rest de acid valerianic la -biotina sau izovalerianic la -biotina. O HN NH

CH2 4 COOH

n natur, biotina se gsete liber sau combinat fie cu lisina (biocitina), fie cu proteine. n intestin biotina este eliberat de biotinaz pancreatic i absorbit printr-un proces activ Nadependent. Biotina funcioneaz ca grupare prostetic pentru enzimele ce catalizeaz reaciile de carboxilare, servind astfel drept cru pentru CO2 activat. 83

Luciana Dobjanschi

Biotin- enzima + HCO + AT P 3

CO2

biotin- enzima + ADP + a P

substrat

substrat carboxilat

Astfel, biotin-enzima ncarc gruparea carboxil pe biotin rezultnd carboxi-biotin-enzima, care transport gruparea carboxil pe un substrat acceptor. Exemle de enzime biotin-dependente: - piruvat carboxilaza, care catalizeaz carboxilarea piruvatului la oxalil-acetat. - acetil- CoA carboxilaza, care catalizeaz formarea malonil- CoA. La om necesarul de biotin este de 150- 300 g pe zi i este n mare msur asigurat de flora intestinal. Cantiti suficiente se gsesc alimentaia carnat, glbenu, cereale i legume. Carena provocat experimental se manifest prin dermatit seboreic, anorexie, oboseal, insomnii, parestezii. Stri careniale se cunosc la sugarii cu deficit genetic privind enzima responsabil de ataarea biotinei la componenta carboxilazic. Semnele clinice sunt:cetoza metabolic, cu creterea lactocidemiei i o eliminare anormal de acid propionic n urin. n terapie, biotina este de obicei inclus n preparatele polivitaminice. Acidul folic (folacina) La fel ca i alte vitamine din complexul B, acidul folic este factor de cretere pentru microorganisme. Denumirea de acid folic se datoreaz faptului c prima substan descoperit din acest grup de vitamine a fost izolat din frunze de spanac i s-a dovedit c are caracter acid. 84

Biochimie farmaceutic

Din punct de vedere structural acidul folic conine n structura sa acid pteroic i un lan -glutamil peptidic.
OH N H2N N N N CH2 NH COOH CO NH CH CH2 CH2 CO COOH NH CH CH2 CH2 COOH

Acizii folici pot s fie: - acizi pteroil monoglutamic - acizi pteroil poliglutamici La plantele exist sub form de complex heptaglutamic, iar n ficat predomin conjugatul pentaglutamic. Spre deosebire de plante i microorganisme, organismul animal este incapabil s sintetizeze acid pteroilmonoglutamic. n intestine acizii pteroil poliglutamici sunt hidrolizai cu enzime specifice rezultnd derivatul monoglutamic, care se absorbe n circulaia mezenteric. n celulele intestinale acidul folic este n mare parte redus la THF (FH4). Aproximativ 2/3 din folatul absorbit se leag de proteinele plasmatice. Hidrogenarea acidului folic sub aciunea folat-reductazei NADPHdependente are loc n 2 etape, intermediar formndu-se DHF.

85

Luciana Dobjanschi
OH N H2N N N N CH2 NH R folat reductaza NADP + H2N N N OH N N H OH N H2N N H N N H THF H DHF CH2 NH R H CH2 NH R H folat reductaza

NADPH + H+

NADPH + H+ NADP +

THF reprezint metabolitul activ i servete drept coenzim n reaciile de transfer sau interconversiunea gruprilor cu un C, numite i fragmente C1 active. Donorii de grupri C1 active sunt: serina, histidina, acidul formic. Acidul folic particip la biosinteza nucleotidelor i a acizilor nucleici, care au un rol important n biosinteza proteinelor. Deasemenea acizii folici controleaz procesul de cretere i hematopoeza. Organismul uman este dependent de aportul de folat furnizat de legumele cu frunze i carne. Acidul folic nu rezist la temperatura de preparare culinar. Necesarul zilnic este de 400 g, care crete n sarcin i alptare, n sindroame de malabsorbie intestinal la alcoolici, la bolnavii cu anemie hemolitic sau cancer cu evoluie rapid. Carena poate fi indus medicamentos prin administrare de antifolice sau la tratament ndelungat cu: fenobarbital, fenitoina, primidona, care cresc nevoia de folat. Deficiena folic acut cuprinde manifestri digestive i dermice. Carena cronic se caracterizeaz prin tulburri de cretere, dereglri de hematopeoz ce conduc la anemia megaloblastic, leucopenie, trombocitopenie. Acidul folic se administreaz ca biostimulator general, ca factor antianemic n diferite forme de anemie, mai ales macrocitar, n leucopenia secundar, chimio- sau radioterapia bolii maligne. Acidul folic este contraindicat persoanelor peste 60 de ani deoarece poate stimula un process neoplazic latent. Uneori acidul folic se asociaz cu vitamina B12 sau cu preparate pe baz de fier.

86

Biochimie farmaceutic

Antifolice ( Antagoniti folici) Antifolicele sunt substane care se aseamn structural cu acidul folc i sunt inhibitori ai unor enzime implicate n biosintez. Multe antifolice i-au gsit aplicabilitate terapeutic. Exemple: - Sulfamidele i sulfonele sunt utilizate ca antibacteriene i interfereaz inserarea PAB n structura acidului folic, acionnd asupra dihidropteroat sintetazei, care catalizeaz etapa intermediar n sinteza de folat. - Trimetoprimul este inhibitor al folat reductazei - Metotrexatul este folosit n leucemie i psoroazis. n tratamentul ndelungat cu antifolice apare o caren folic. Carena poate fi compensat prin administrare de acid folinic, care se administreaz oral sau parenteral sub form de folinat de Ca. Vitamina B12 Vitamina B12 sau ciancobalamina ndeplinete rol de vitamin pentru om i este factor de cretere pentru microorganisme. Poart indicele 12 deoarece este al 12-lea compus izolat din complexul B. Din punct de vedere structural vitamina B12 are o structur foarte complex. Asfel, ea conine o parte intern,reprezentat de un schelet tetrapirolic numit corrina. Nucleul corinic din partea central difer de cel al hemului prin urmtoarele elemente: - n centru se afl ionul Co+ - sistemul tetrapirolic este mai saturat - dou nuclee pirolice sunt unite direct ntre ele - are un numr mai mare de substituieni, majoritatea lor cu grupri amidice. Deasemenea vitamina B12 mai conine i o parte extern reprezentat de un nucleotid cu riboz. El este unit prin dou legturi cu regiunea central: una direct ntre unul din atomii de N ai benzimidazolului i ionul monovalent de cobalt, iar a doua legtur se realizeaz prin intermediul restului de acid fosforic al nucleotidului cu riboz i o caten ataat la unul din cele patru nuclee pirolice.

87

Luciana Dobjanschi

R R: CN- , OH, CH3 N N N N

Co+

nucleotid Vitamina B12 este sintetizat exclusiv de ctre bacterii anaerobe, dar se gsete i n esuturile animale, mai ales n ficat. Absorbia ei este mediat de receptori specifici din ileum, dup prealabila cuplare cu un factor intrinsec (CASTLE). Acesta este o glicoprotein cu specificitate absolut pentru vitamina B12, secretat de celulele parietale din mucoasa gastric. Dup desprindere de factorul intrinsic cobalamina trece n circulaia portal, unde se leag de o protein plasmatic transportoare, numit trancobalamina II. n esuturi se elibereaz ca hidroxicobalamina, fiind apoi transformat n metilcobalamin. Ficatul stocheaz cantiti de ordinul mg, pentru lungi perioade, graie legrii de o alt protein, numit transcobalamina I. Funciile biochimice ale vitaminei B12 Enzimele cobalaminice funcioneaz n metabolimul gruprilor cu un C, fiind ntlnite n 3 tipuri de reacii: 1. reacii de rearanjament intramolecular 2. reacii de metilare 3. reacii de reducere a ribonucleotidelor la dezoxiribonucleotide. n esutul mamiferelor se cunosc dou procese dependente de cobalamine: - izomerizarea metal-malonil CoA la succinil CoA

88

Biochimie farmaceutic

COOH CH2 H CH CO SCoA mutaza CH2 CH2 COOH

CO SCoA

transformarea homocisteinei n metionin CH2 S NH2 CH3 metionina

N5 metil THF

HO

Cbl

CH2 CH COOH

THF

Me

Cbl

CH2 CH2 CH

SH homocisteina NH2

COOH Deficitul de cobalamin se repercut negativ asupra sintezei de metionin, cu consecine privind biosinteza proteic i regenerarea de THF. Vitamina B12 este esenial alturi de folat, pentru creterea i maturarea celulelor, mai cu seam a celor cu ritm intens de proliferare. Deasemenea cobalamina este necesar pentru funcia mduvei hematogene, a aparatului digestiv i a sistemului nervos. Prin participarea la sistemul metioninei este un factor lipotrop, protejnd ficatul de ncrcarea cu grsimi. Carena cobalaminic apare rar, deoarece alimentaia carnal ofer necesarul (cca 10 mg/zi), existnd avantajul termostabilitii. Cauza principal este absena factorului intrinsec datorit incapacitii mucoasei gastrice de a-l produce n afeciuni gastrice, rezecii sau constituional prin defect genetic de sintez, ori prin mecanism autoimun. Carena este rar provocat prin lips de aport, n regim exclusiv vegetarian prelungit, n sindrom de malabsorbie intestinal, dup 89

Luciana Dobjanschi

tratament cu neomicin, metformin, antiepileptice, n disbioz intestinal. Maladia produs n carena de vitamina B12 este anemia pernicioas (anemia Biermer). Clinic aceasta se manifest prin: paloare, astenie (sindrom anemic), inapeten, grea, emez, balonri, tulburri de transit (sindrom de transit), neuropatie. Anemia biermerian face parte dintre anemiile megaloblastice, majoritatea cauzate prin deficiena vitaminei B12 i/sau a acidului folic, ce determin perturbri n sinteza acizilor nucleici, implicnd suferina tuturor sistemelor celulare. Apare astfel hematopoeza ineficient cu deviaie megaloblastic, consecina fiind producerea insuficient a elementelor liniilor celulare ale sngelui i n special a seriei roii. Astfel n sngele periferic se evideniaz: pancitopenia, megalocitoza, magaloblastoza, celule cu alte modificri morfologice, fragile. Diagnosticul diferenial n anemia megaloblastic se face prin dozarea cobalaminei n plasm, prin testarea absorbiei intestinale, administrarea de vitamina B12 marcat i msurarea radioactivitii n urin. n anemia pernicioas tratamentul ncepe cu doze de atac de vitamina B12, parenteral, care pe msura ameliorrii simptomelor se reduce la doze de ntreinere administrate cu intermiten toat viaa. Alte indicaii ale viatminei B12 sunt n : neuropatii, ciroz, hepatite, stri de malnutriie. n terapie se folosesc ciancobalamina i hidroxicobalamina. Vitamina C Vitamina C poart i numele de acid ascorbic deoarece este o substan cu caracter acid, iar carena sa n organism provoac scorbut. Din punct de vedere structural vitamina C este numit i lactona acidului 2,3-dienol- L- gulonic. Structura sa este extrem de labil prin expunere la aer, iar n soluii alcaline trece n acid dehidroascorbic. Ambele forme sunt active i apar n esuturi.

90

Biochimie farmaceutic

O C HO HO H HO C C C C H O O O H HO

O C C C C C H O

CH2OH acid L ascorbic

CH2OH acid L dehidroascorbic

Transformarea acidului L-ascorbic n acid L-dehidroascorbic poate fi efectuat de L-ascorbat oxidaza, enzim ce conine Cu. Vitamina C este una din cele mai rspndite vitamine, fiind sintetizat de majoritatea speciilor vegetale i animale din glucoz. Excepie sunt primatele, cobaiul i alte cteva specii, posesori ai unor enzimopatii genetice, fiind incapabili s efectueze etapa final din lanul metabolic de biosintez, adic conversia L-gulono-lactonei n acid ascorbic. Acizii ascorbic i dehidroascorbic se absorb aproape n totalitate n intestin i se distribuie extra- i intracelular. La un aport adecvat rezervele satisfac necesitile cteva luni consecutive lipsei de alimentaie. Dozele foarte mari de vitamina C satureaz depozitele i depete pragul renal de eliminare. Deci dozele mari de vitamina C sunt excretate urinar, astfel c administrarea excesiv este inutil. n esuturi vitamina C este transformat n mic msur prin oxidare.

91

Luciana Dobjanschi
O C HO HO H C C C H O O O H HO O C C C C C H CH2OH CH2OH acid L dehidroascorbic acid 2,3 diceto gulonic H HO O O C OH C C C C O O OH H HO H COOH COOH O C C C OH OH H Ca+2 oxalat de Ca

HO C

CH2OH acid L ascorbic

CH2OH acid L treonic

Vitamina C se elimin urinar, n proporie mare netransformat, cantitatea de acid ascorbic excretat normal fiind pn la 1%. Oxalatul de calciu poate ns precipita n cile renale cauznd litiaza oxalic. Rolul vitaminei C Acidul ascorbic are un potenial reductor destul de mare, fiind astfel capabil s reduc oxigenul molecular, nitraii, citocromii a i c, methemoglobina. Cuplul ascorbat-dehidroascorbat funcioneaz ca sistem redox activ ntr-o serie de procese biochimice. Exemplu: - n reaciile de hidroxilare din: - metabolismul aminoacizilor aromatici o metabolismul prolinei, lisinei o biosinteza noradrenalnei o biotransformarea medicamentelor Dozele mari de vitamina C stimuleaz absorbia Fe, reducndu-l la ion feros, forma favorabil absorbiei, iar concentraiile fiziologice cresc ncorporarea Fe n feritina. Se consider c acidul ascorbic este necesar procesului de cretere, pentru integritatea tegumentelor, n buna funcionare a aparatului cardiovascular. De asemenea i se atribuie un rol n procesul de aprare imunitar, n mrirea rezistenei la efort, n hematopeoz. Necesarul de vitamina C este de 1mg/kgcorp/zi la adultul sntos i este asigurat n primul rnd de vegetalele proaspete, crude. Cerinele sunt crescute n sarcin, alptare, frig, condiii de munc grea, boli infecioase, cancer i dependent de vrst. Carena este reprezentat de scorbut. Pot s apar stri de subcaren, n special la sfritul iernii. Se manifest prin: tendina la 92

Biochimie farmaceutic

hemoragii, n special gingivale, echimoze, hiperkeratoza folicular, dureri articulare (osteoporoza), anorexie, tulburri de tranzit intestinal, anemie, astenie. Acidul ascorbic este necesar formelor active ale unor enzime (dioxigenaze cu enzime), acionnd probabil prin meninerea metalului la valena sa inferioar. Indicaiile vitaminei C sunt profilactice i de corectare a simptomelor careniale, n boli infecioase, n pediatrie, n methemoglobinemie, astenie, asociat preparatelor cu Fe. Nu se cunosc efecte toxice, dar n caz de supradozare poate fi duntoare la subiecii cu predispoziie la oxaloz sau deranjeaz absorbia unor vitamine ca: B12 sau a altor medicamente simultan ingerate.

93

Luciana Dobjanschi

VI. Enzime Enzimele sunt proteine ce posed o funcie nalt specializat i anume aceea de biocataliz i se deosebesc de catalizatorii din lumea nevie prin cteva proprieti care le definesc. Enzimele se caracterizeaz prin urmtoarele proprieti: - capacitatea catalitic mare, eficiena catalitic crete cu un factor de 106 1012 fa de reacia necatalizat. - Specificitatea superioar de reacie elimin formarea de produi secundari - Activitile catalitice enzimatice sunt reglate prin mecanisme diferite, care privesc fie aciunea lor, fie cantitatea de enzim sintetizat. Controlul enzimatic are semnificaie major pentru reglarea metabolismului celular. - Enzimele acioneaz n condiii foarte blnde i anume la temperatura celulelor vii, la pH aproape neutru i la presiune atmosferic. Nomenclatur i clasificare Mult vreme enzimele au fost denumite prin adugarea sufixului aza la numele substratului. Ex. Amilaza, ureeza, alcool dehidrogenaza. Unele denumiri ns nu includeau nici substratul, nici reacia catalizat. Ex. Tripsina, pepsina, catalaza. Datorit faptului c numrul de enzime este n continu cretere, nomenclatura veche crea confuzii, astfel c s-a impus introducerea unei terminologii unitare i a unei clasificri adecvate. n 1961, Comisia de Enzime a Uniunii Internaionale de Biochimie, adopt o claisficare i o nomenclatur sistematic, bazat pe natura reaciei chimice catalizate. Astfel, enzimele au fost clasificate n 6 clase, fiecare cuprinznd un numr de subclase i, respectiv subsubclase. 1. Oxidoreductaze enzime ce catalizeaz reaciile de oxidoreducere. 2. Transferaze enzime ce catalizeaz reaciile de transfer de grupri funcionale. 3. Hidrolaze enzime ce catalizeaz reaciile de hidroliz. 4. Liaze enzime ce catalizeaz reaciile de descompunere a substratului prin alte mecanisme dect cele de oxidare i hidroliz. 94

Biochimie farmaceutic

5. Izomeraze enzime ce catalizeaz reacii de interconversiune a izomerilor. 6. Ligaze enzime ce catalizeaz reacii de formare a legturii C-O, C-C, C-S, C-N, cuplat cu scindarea unui compus macroergic (ATP). Pentru a defini o enzim, fiecruia i se atribuie un numr sistematic format din numele substratelor, urmat de cuvntul ce indic tipul de reacie catalizat, la care adaug sufixul aza. Deasemenea, fiecrei enzime i se atribuie un cod determinat de poziia pe care enzima o ocup n sistemul zecimal. Exemplu: Acest numr de clasificare este alctuit din iniialele EC (Comisia de enzime) i 4 cifre. Prima cifr indic clasa din care face parte enzima, a doua indic subclasa, determinat de felul gruprii implicate n reacie, a treia cifr reprezint subsubclasa , adic natura particular a substratelor din grupul respectiv, iar a patra cifr reprezint poziia ocupat de enzim n subsubclas. - alcool dehidrogenaza: E.C. 1.1.1.1. - glucozooxidaza: E.C. 1.1.3.4. Structura enzimelor n cea mai mare parte, enzimele sunt proteine globulare. Excepie face ribonucleaza P. O mic proporie de enzime sunt proteine simple (pepsina, chimotripsina, lizozim), iar celelalte sunt heteroproteine (metaloenzime, dehidrogenaze piridinice). Unele enzime sunt alctuite sunt alctuite dintr-un singur lan polipeptidic (ribonucleaza), altele din mai multe lanuri identice sau diferite. Masa molecular a enzimelor este extrem de variabil datorit lungimii lanurilor polipeptidicre componente, ct i datorit asocierii unui numr diferit de subuniti, ca n cazul enzimelor oligomer. Pe lng aceste aspecte legate de structur, la enzime mai apar anumite caracteristici specifice lor: - identificarea centrului catalitic, i, la enzimele allosterice i a centrilor allosterici. - Cunoaterea cofactorilor enzimatici ct i locul lor n ansamblul structural enzimatic. Cofactorii enzimatici sunt componente micromoleculare indispensabile activitii unui numr mare de enzime. 95

Luciana Dobjanschi

Cofactorul poate s fie un ion metalic sau o molecul organic specific, uneori sunt cerui ambii i foarte rar cofactorul este un anion anorganic. 1. Metalele n cataliza enzimatic Un numr mare de enzime cer pentru a-i manifesta activitatea ioni metalici.Zn+2 , Mn+2 , Mo+2 , Co+3 , Fe+3 , Cu+2 , Mg+2 , K+ , Na+ , Ca+2 . Unele enzime care conin o cantitate definit de ion metalic funcional, fiind strns legat n structura lor se numesc metalo-enzime, iar altele care leag slab metalu se numesc enzime metalo-activate. Exemple: - anhidraza carbonic: Zn+2 - enzimele heminice: Fe+3 - piruvat kinaza : Mg+2 , K+ 2.Cofactorii de natur organic sunt sisteme conjugate n care mobilitatea electronic este foarte mare, ceea ce explic puterea lor catalitic. Cofactorii slab legai de enzim sau ataai temporar se numesc coenzime. Exemplu: acid lipoic, coenzima Q, biopterinele, NAD+, NADP+, FAD, CoA. Centrul activ al enzimei ( centrul catalitic) Centrul activ al enzimei este o zon restrns din structura enzimei responsabil direct de funcia ei catalitic, aceea de legare i transformare a substratului. Aceast regiune reprezint la majoritatea enzimelor cca 5% din total. Ca entitate tridimensional centrul activ poate cuprinde o poriune sau mai multe din acelai lan, ori din lanuri diferite, apropiate spaial. Exemplu: Din centrul activ al ribonucleazei fac parte: His12, His119, Lys41. Aceti aminoacizi dei sunt situai la distan n structura liniar, sunt apropiai n structura teriar, datorit plierii lanului. Centrii activi conin resturi de aminoacizi i eventual cofactori cu rol de a recunoate i lega substratul sau care particip n transformarea lor chimic, uneori aceti aminoacizi ndeplinind ambele funcii. Ali aminoacizi aflai la distane variabile de centrul activ contribuie la stabilitatea structurii proteice, sunt resturi structurale, considerate alturi de resturile catalitice i de legare ca eseniale pentru activitatea enzimei. 96

Biochimie farmaceutic

De fapt, n procesul catalitic particip indirect ntreaga molecul. Activitatea este condiionat de existena conformaiei native a structurii enzimatice. Aminoacizii care nu particip n nici un fel la actul catalitic sunt numii resturi neeseniale, ele conferind moleculei anumite proprieti fizico- chimice. Mecanismul de aciune al enzimelor Procesul catalitic const n formarea complexului cu substratul sau substratele, ceea ce determin o scdere a energiei strii de tranziie, transformarea chimic i eliberarea produilor. Se cunosc urmtoarele mecanisme de aciune ale enzimelor: 1. Cataliza prin distorsie implic interaciuni care deformeaz legturile i unghiurile acestora n molecula substratului. n unele cazuri, contorsia, poate fi consecina atarii covalente a substratului de enzim. 2. Cataliza acido-bazic se datoreaz radicalilor aminoacizilor din centrul activ care pot funciona ca acizi sau baze Bronsted sau ca acizi sau baze Lewis. 3. Cataliza prin orientarea reactanilor. Enzima are rolul de a dispune substratele ntr-o poziie favorabil reaciei. Specificitatea catalizei enzimatice Specificitatea unei enzime reprezint capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un numr de compui substratul particular i a-l transforma printr-o reacie de un anume tip. Se distinge : specificitatea de aciune ( de reacie), i specificitatea de substrat. Specificitatea de recie. Spre deosebire de catalizatorii neproteici, care accelereaz o varietate de reacii, o enzim catalizeaz, de regul, un singur tip de reacie. Exemplu: - o reacie de hidroliz - o reacie redox - formarea unei legturi. Exist, ns unele proteine, puine la numr, cu activiti polienzimatice. n acest caz proteina posed centri catalitici independeni, responsabili de reacii diferite ce decurg prin mecanism deosebit. 97

Luciana Dobjanschi

Specificitatea de substrat reprezint calitatea enzimei de a forma complexul enzim-substrat ca prima etap obligatorie n transformarea acestuia. Dac enzima acioneaz asupra unei varieti de compui avem de-a face cu o specificitate relativ (de grup), n care caz enzima are capacitatea de a transforma un numr de substrate nrudite chimic. Exemplu: - hidrolaze: - esteraze - peptidaze - glicozidaze - proteaze: - exopeptidaze - endopeptidaze. Specificitatea relativ are importan n biochimia analitic, deoarece permite introducerea de substrate artificiale la determinri enzimatice. Se cunosc i enzime cu specificitate absolut. Acestea sunt inactive fa de analogii structurali ai substratului, ceea ce presupune recunoaterea integral a unei molecule, precum i o rigiditate a centrului activ, n conformitate cu modelul cheie- broasc. Exemplu: - ureaza - arginaza - anhidraza carbonic - fructozo-1,6-difosfataza. Stereospecificitatea enzimelor. Stereospecificitatea enzimelor este un caz de specificitate absolut. Exist un numr mare de substrate care se caracterizeaz prin asimetrie structural, iar n procesele metabolice adeseori se ntlnete unul din izomerii posibili. Exemplu: - L i D aminoacid oxidazele sunt specifice pentru stereoizomerii respectivi. - Alte enzime recunosc numai izomerii geometrici: succinat dehidrogenaza, fumaraza.

98

Biochimie farmaceutic

Factorii care influeneaz activitatea enzimatic n reaciile enzimatice viteza de reacie se msoar fie prin cantitatea de substrat transformat, fie prin cantitatea de produs format, exprimat n molaritate, iar timpul se exprim n minute. Viteza unei reacii enzimatice poate fi influenat de un numr de factori, dintre care amintim: concentraia de enzim, concentraia de substrat, temperatura, pH, inhibitori. 1. Influena concentraiei de enzim Viteza unei reacii enzimatice arat o dependen liniar de concentraia enzimei, n condiiile n care concentraia de substrat este fix.

[ E] Dependena vitezei de reacie de concentraia de enzim Abaterile de la liniaritate se datoreaz erorilor tehnice sau existenei unui inhibitor ce acioneaz numai la o anumit concentraie.

99

Luciana Dobjanschi

2. Influena concentraiei de substrat.teoria Michaelis-Menten De exemplu s presupunem urmtoarea reacie catalizat de enzim: E+S k1 k2 ES k3 E+P

Pentru enzimele michaeliene, dependena vitezei de reacie de concentraia de substrat este descris ca o hiperbol, la o concentraie de enzim constant. Astfel viteza de reacie crete la nceput rapid i liniar, dup care dependena nu mai este liniar, iar la o anumit concentraie de substrat curba tinde spre o valoare maxim. V Vmax

Vm/2

Km

[ S]

V0 = Vmax = [S] / [S] + Km V - viteza iniial de reacie Vmax capacitatea catalitic maxim a enzimei viteza maxim realizat [ S ] concentraia de substrat Km Constanta lui Michaelis Menten, reprezint concentraia de de substrat pentru care viteza de reacie atinge jumtatea valorii maxime. 10

Biochimie farmaceutic

Dozrile de activitate enzimatic se efectueaz la concentraii mari, saturante de substrat pentru a asigura o cinetic de ordinul zero. Ecuaia Michaelis-Menten este fundamental n studiile de cinetic enzimatic, permind analiza cantitativ a majoritii reaciilor enzimatice. Pe lng utilitatea la interpretarea mecanismului reaciilor enzimatice i a aciunii inhibitorilor, cei doi parametri cinetici ( Vmax, Km ) au importan la determinarea de enzime, inclusiv n laboratorul clinic. 3. Inhibitorii enzimelor Inhibiia reprezint scderea parial sau pierderea activitii enzimatice ca urmare a legrii de enzim a unui compus numit inhibitor. Inhibiia poate s fie un proces reversibil sau ireversibil. a. Inhibiia reversibil n cazul inhibiiei reversibile inhibitorul se combin cu enzima sau cu complexul ES, iar prin ndeprtarea inhibitorului activitatea enzimei se restabilete. E+I k1 k2 ES + I Ki EI Ki = ESI [ E] [ I] [ EI]

Eficiena unui inhibitor se msoar prin Ki. Cu ct valoarea Ki este mai mic cu att inhibitorul este mai efficient. Inhibiia reversibil este de dou tipuri competitiv i necompetitiv. Inhibiia competitiv n cazul inhibiiei competitive inhibitorul intr n competiie cu substratul pentru acelai loc de legare la situsul activ al enzimei. E+P E+P

E+S E+I

ES EI

Ki =

[E][I] [ EI]

10

Luciana Dobjanschi

n cazul inhibiiei competitive inhibitorul este un analog structural al substratului. Exemplu:

CH2 CH2

COOH COOH

+ FAD -

HC HOOC CH

COOH

FADH2

Enzima succinat dehidrogenaza, care catalizeaz aceast reacie, este inhibat competitiv de analogi structurali, ca de exemplu: acid malonic, acid oxalilacetic, acid oxalic. Aceti acizi dicarboxilici se pot lega de centrul activ al enzimei la fel ca i succinatul. Inhibiia necompetitiv are loc prin legarea inhibitorului la un loc diferit de centrul activ al enzimei, rezultnd un complex ternar ESI. Inhibitorul poate interaciona fie cu enzima liber, fie cu complexul ES.

E+S + I Ki EI + S

ES + I Ki ESI

E+P

V 'max =

V max 1 + [I]/Ki

Pe de alt parte substratul se poate lega i de complexul EI. Spre deosebire de inhibiia competitiv efectul inhibitorului necompetitiv nu este influenat de creterea concentraiei de substrat.

10

Biochimie farmaceutic

1/v Inhibiie competitiv inhibiie necompetitiv 1/Vm Reacie fr inhibitor

1/Vm

-1/Km

-1/Km

1/S

Un alt tip de inhibiie reversibil este inhibiia necompetitiv (incompetitiv ), care are loc atunci cnd se formeaz complexul ternar ESI, ca urmare a interaciunii I cu complexul ES, cnd are loc scderea valorii Km i Vmax. b. Inhibiia ireversibil Inhibiia ireversibil este consecina legrii covalente a inhibitorului de enzim sau de complexul ES, el neputnd fi ndeprtat. E+P ES E+S + I + I

EI inactivi

ESI

10

Luciana Dobjanschi

Capacitatea inhibitorului ireversibil este msurat printr-o constant de vitez care exprim fraciunea de enzim inhibat ntr-o perioad definit de timp la o anumit concentraie de inhibitor. Inhibitorii ireversibili sunt toxici, fiind numii i otrvuri enzimatice. Exemplu: metalele grele, agenii oxidani, organofosforicele, compui ai arseniului. Semnificaia i importana practic a inhibiiei enzimatice 1. Inhibiia enzimatic este o modalitate important de control metabolic. 2. Unele toxice i exercit aciunea datorit calitii lor de inhibitori enzimatici ireversibili. Exemplu: insecticidele 3. Inhibitorii enzimatici au aplicabilitate n toxicologia clinic, servind ca antidoturi. Exemplu: etanolul este folosit ca antidot n intoxicaiile cu metanol i etilenglicol. 4. Utilizarea inhibitorilor n enzimologie pentru identificarea mecanismului de aciune i a centrilor activi. 5. Inhibiia enzimatic este un instrument terapeutic polivalent. Exemplu: agenii chimioterapici, antiinflamatoarele nesteroidiene. 4. Influena temperaturii asupra activitii enzimatice Viteza reaciei enzimatice crete odat cu temperatura, n intervalul n care enzima respectiv este stabil, datorit creterii energiei cinetice a reactanilor. n multe procese biologice o cretere a temperaturii cu 100 C duce la dublarea sau triplarea vitezei de reacie. Temperatura optim pentru majoritatea enzimelor este temperatura celulelor n care acestea se gsesc. Peste temperatura de 50 600 C majoritatea enzimelor sunt inactive. Excepie fac unele microorganisme termofile ale cror enzime sunt active i la 800C.

10

Biochimie farmaceutic

5. Efectul pH-ului asupra activitii enzimatice. Enzimele sunt stabile ntr-un domeniu relativ ngust de pH, domeniu n care se gsete o valoare, numit pH optim, pentru care activitatea unei enzime este maxim. Majoritatea enzimelor au pH-ul optim n jurul pH-ului fiziologic de 7,4. Excepii fac enzimele digestive pentru care pH-ul optim este cel acid, monoaminooxidazele din membrana mitocondrial extern care au pH optim aproximativ 10. Exist unele enzime a cror activitate este independent de pH ( pepsina ). Reglarea activitii enzimatice Reglarea activitii enzimatice este o component esenial a procesului de control i de coordonare a metabolismului, n direct legtur cu meninerea homeostaziei. Fluxul reaciei enzimatice poate fi influenat prin 3 mecanisme generale: - variaii n cantitatea absolut de enzim - modificarea fondului metabolic celular de substrate i cofactori, condiionate i de transportul prin membrane - schimbri n eficiena catalitic a enzimelor. Enzimele allosterice Enzimele allosterice sunt alctuite din subuniti care interacioneaz n cursul procesului catalitic, fenomen ce se numete cooperativitate. Activitatea acestor enzime este controlat prin legarea necovalent a unor metabolii specifici n locuri distincte de centrul activ, locuri ce se numesc centri alosterici. Deci, proteinele (enzimele) allosterice sunt oligomeri alctuii din monomeri identici sau nu, aflai n numr par. Fiecare monomer posed un centru activ i locuri separate i diferite de situsul activ numite centri alosterici. O enzim allosteric catalizeaz de obicei o etap iniial din secvena multienzimatic a unei ci metabolice. Reaciile enzimelor allosterice sunt ireversibile sau cu grad redus de reversibilitate, reprezennd astfel puncte de control pentru ntregul lan de reacii. Astfel, cnd produsul final al cii metabolice se acumuleaz peste concentaia necesar, el funcioneaz ca modulator negativ al 10

Luciana Dobjanschi

enzimei. Acest efect se numete inhibiie prin produs final, inhibiie feedback sau retroinhibiie. Exemplu: E1 S1 E2 S2 P

P inhiba enzima aspartat transcarbamilaza, enzim ce catalizeaz prima reacie din procesul de sintez a ribonucleotidelor pirimidinice.

Importana biomedical i farmaceutic Enzimologia aduce un aport important att n problemele de diagnostic ct i n ceea ce privete terapia cu enzime. I. Diagnosticul enzimatic Diagnosticul enzimatic se bazeaz pe informaiile furnizate de dozarea enzimelor din ser. Determinrile enzimatice din hematii i leucocite, precum i din material bioptic sunt mai puin abordate. Se mai urmresc unele enzime i n urin, suc gastric i suc duodenal. n funcie de locul de producere i modul n care ajung n snge, enzimele serice se clasific astfel: 1. Enzime secretate activ; se produc n ficat i se elibereaz n plasm, unde ndeplinesc un anumit rol fiziologic. Exemplu: lipoproteinlipaza, pseudocolinesteraza, lecitin colesterol- acil- transferaza. 2. Enzime ale secreiilor exocrine. Acestea se produc n diferite organe i difuzeaz pasiv n plasm. Exemplu: amilaza salivar i pancreatic, lipaza pancreatic, fosfataza acid prostatic, fosfataza alcalin. 3. Enzime celulare. Aceste enzime se gsesc n plasm n cantiti de sute de ori mai mici dect n esuturi. Exemplu: lactat dehidrogenaza, creatin kinaza, transaminazele. 10

Biochimie farmaceutic

4. Enzimele inductibile, sintetizate n exces ca rspuns la un agent imductor, i ca atare mbogesc plasma. Exemplu: - glutamil transpeptidaza, enzimele de hidroxilare, glicuronozil-transferaza. Izoenzimele Izoenzimele sunt enzime ce ndeplinesc acelai rol catalitic, dar difer prin proprietile structurale, fizice, chimice, cinetice i imunologice. Din punct de vedere structural sunt oligomeri alctuii din subuniti identice sau diferite. Exemplu: 1. lactat dehidrogenaza prezint 5 izoenzime LDH, care se deosebesc prin proporia n care sunt distribuite. Cele 5 izoenzime rezult prin combinarea difert a 2 tipuri de lanuri, notate cu H (subunitate de origine miocardic) i M (subunitate ce provine din muchi). LDH1 : H4 LDH2 : H 3M LDH3: H 2M2 LDH4 : HM3 LDH5 : M4 Aceste enzime se dozeaz n studiul leziunii de organ i anume n boli cu citoliz. 2. Creatin kinaza prezint 3 izoenzime, i anume: CK1 : BB CK2. BM CK3 : MM Aceste izoenzime sunt dozate n infarctul miocardic II. Terapia cu enzime.

Pentru multe medicamente att aciunea principal ct i efectele secundare sunt n legtur direct cu diferite activiti enzimatice. Enzimele sunt ageni terapeutici unici ce produc efecte importante i specifice. Enzimele sunt introduse n terapie din aproximativ 1930. Medicamentul enzimatic apare n diferite forme solide, soluii buvabile, soluii injectabile precum i preparate destinate uzului local. Terapia cu enzime este indicat n afeciuni digestive i boli genetice, boli cardio-vasculare, neoplazii sau ca medicamente 10

Luciana Dobjanschi

antiinflamatoare n dermatologie, oftalmologie, ORL, reumatologie, afeciuni bronice. Metode i surse de obinere a enzimelor terapeutice: - Extragerea din diferite esuturi sau lichide biologice umane (placenta, snge, urin) sau animal i purificarea corespunztoare. - Culturi de celule mamifere sau bacterii din sol. - Surse vegetale - n ultimul timp tehnologia ADN-ului recombinat. Exemplu: - streptokinaza, urokinaza, enzime ce se obin prin biotehnologie. Aceste enzime reduc mortalitatea prin infarctul de miocard.

10

Biochimie farmaceutic

VII. METABOLISM Metabolismul reprezint totalitatea transformrilor de substan, energie i informaie, care au loc ntr-un organism viu. Metabolismul general prezint dou aspecte eseniale: catabolismul i anabolismul. Catabolismul reprezint totalitatea reaciilor de degradare din organism, iar aceste reacii sunt frecvent procese de oxido-reducere, care au loc cu eliberare de energie. Energia eliberat este conservat sub forma legturilor macroergice din ATP. Energia nmagazinat n ATP este utilizat n procese de biosintez a biomoleculelor, care sunt substane cu molecul mare. Cu mare specificitate i cu nivel nalt de organizare. Totalitatea proceselor de biosintez din organism constituie anabolismul. Spre deosebire de procesele catabolice, procesele anabolice decurg cu consum de energie, fiind endergonice. Energia necesar proceselor de biosintez este asigurat de hidroliza legturii macroergice din ATP. Pe lng procesul cu caracter catabolic sau anabolic, n celule mai au loc transformri ale constituenilor si, care au concomitent att caracter catabolic ct i anabolic. Acestea se numesc procese amfibolice. n cadrul acestor procese pot rezulta compui care pot fi catabolizai sau care pot fi utilizai n procese de biosintez. Totalitatea transformrilor pe care le sufer anumii compui de la ingestia sau biosinteza lor pn eliminarea lor din organism se numete metabolism intermediar. Degradarea constituenilor organici fundamentali ai celulei vii (proteine, glucide i lipide) se desfoar n mai multe stadii: Moleculele mari a acestor compui sunt degradate cu eliberarea unitilor lor structurale fundamentale; II. Produii rezultai n primul stadiu sunt transformai pe ci specifice ntr-un numr mic de molecule simple, printre care predomin acetil-CoA; III. Compuii rezultai n al doilea stadiu sunt transformai n dioxid de carbon i ap pe o cale numit ciclul citratului; IV. Echivalenii de hidrogen preluai de la metaboliii din stadiile anterioare sunt oxidai cu formare de ap prin intermediul lanului respirator. Stadiile I i II sunt specifice pentru fiecare categorie de compui, iar stadiile III i IV sunt caracteristice transformrii glucidelor, lipidelor i proteinelor. 10 I.

Luciana Dobjanschi

Cea mai important cale de formare de dioxid de carbon n celul este ciclul citric sau ciclul acizilor tricarboxilici sau ciclul lui Krebs.
I proteine polizaharide lipide

aminoaacizi

monozaharide

acizi grasi glicerina

II acetil-CoA

III

CAT
CO2 2H 2H 2H 2H

IV O2 lantul respirator H2O oxidare biologica CO2

11

Biochimie farmaceutic

VIII. CICLUL ACIZILOR TRICARBOXILICI Respiraia este procesul prin care celula aerob obine energie n urma oxidrii moleculelor de combustibil de ctre oxigenul molecular. Ciclul acizilor tricarboxilici este calea metabolic central cea mai obinuit pentru degradarea resturilor de acetil-CoA rezultate prin catabolizarea glucidelor, acizilor grai i aminoacizilor. Ciclul acizilor tricarboxilici este o secven ciclic, care are loc n toate celulele aerobe. Se mai numete i ciclul acidului citric sau ciclul lui Krebs. Aceast secven de reacii este catalizat de un sistem multienzimatic care primete gruparea acetil de la acetil-CoA drept combustibil i o descompune n dioxid de carbon i echivaleni reductori. Acetia sunt apoi condui printr-un lan de proteine transportoare de electroni la oxigen, care este redus pentru a forma ap. Din schema prezentat mai sus se constat c acetil-CoA rezultat n urma procesului de catabolizare a principalelor biomolecule, intr n ciclul acizilor tricarboxilici. n unele cazuri, ns, n urma procesului de catabolizare a acestor biomolecule nu rezult acetil-CoA, ci piruvat. Piruvatul ca s poat intra n ciclul acizilor tricarboxilici trebuie s se transforme, n prealabil, n acetil-CoA. Oxidarea piruvatului la acetil-CoA. Oxidarea piruvatului la acetil-CoA este un proces complex catalizat de complexul multienzimatic piruvatdehidrogenaz.
CH3 - C - COOH + NAD+ + CoA O
piruvatdehidrogenaza

CH3 - CO - CoA + NADH + H+ + CO2

Aceast reacie, care este ireversibil n esuturile animale, nu reprezint o parte din ciclul acizilor tricarboxilici, dar este obligatorie pentru participarea tuturor hidrailor de carbon la ciclul acizilor tricarboxilici. Decarboxilarea oxidativ a piruvatului la acetil-CoA i dioxid de carbon necesit trei enzime diferite i cinci coenzime organizate ntr-un complex multienzimatic. Etapele de reacii realizate sub influena acestor enzime sunt artate mai jos. CH3 - C - COOH + E1 - TPP O
piruvat dehidrogenaza

E1 - TPP - CH - CH3

OH CO2 Aceast etap este catalizat de ctre piruvat dehidrogenaz, enzim a crei grupare prostetic este coenzima tiaminpirofosfat. 11

Luciana Dobjanschi

Piruvatul sufer o decarboxilare pentru a elimina dioxidul de carbon i derivatul -hidroxietil.


aminoacizi glucoza acizi grasi

piruvat CO2 2H acetil-CoA oxalilacetat malat citrat [cis-aconitat]

fumarat

izocitrat CO2

succinat succinil-CoA 2H 2H 2H

-cetoglutarat CO2 2H

NAD

flavoproteine

ADP + P ATP

coenzima Q

citocrom b transportul de e- si fosforilarea oxidativa din lantul respirator citocrom c ADP + P citocrom a3 ATP ADP + P ATP

2H+ + 1/2O2

H2O

11

Biochimie farmaceutic

n etapa a doua, gruparea hidroxietil este dehidrogenat de piruvat dehidrogenaz iar gruparea acetil care rezult este transferat la acidul lipoic, care reprezint gruparea prostetic legat covalent la cea de a doua enzim, dihidrolipoil transacilaz.
E1 - TPP - CH - CH3 + E2 OH S S E1 - TPP + E2 S SH O = C - CH3

Transferul unei perechi de atomi de hidrogen de la gruparea hidroxil a TPP la legtura disulfuric a acidului lipoic face ca aceasta din urm s treac n forma redus a acidului dihidrolipoic. n etapa a treia, gruparea acetil este transferat pe cale enzimatic, de la gruparea lipoil a acidului dihidrolipoic la gruparea tiolic a CoA.
E2 S SH O = C - CH3 + CoA-SH E2 SH SH + CH3 - CO - SCoA

Acetil-CoA astfel format prsete complexul enzimatic sub forma sa liber. n etapa a patra, forma ditiolic a gruprii lipoil a dehidrolipoil transacetilazei este reoxidat la forma disulfuric prin transferul atomilor de hidrogen de la cea de a treia enzim a complexului, cunoscut sub numele de dihidrolipoil dehidrogenaz, la a crei grupare prostetic este strns legat FAD.
E2 SH SH + E3 - FAD E2 S S + E3 - FADH2

FADH2, care rezult, rmne legat de enzim i este reoxidat n faza a cincea de ctre NAD+. E3 - FADH2 + NAD+ E3 - FAD + NADH + H+

11

Luciana Dobjanschi

Complexul piruvat dehidrogenaz este inhibat specific de compuii arsenului trivalent (As+3). Activitatea complexului piruvat dehidrogenaz este reglat la nivelul ATP-ului i a ionilor de calciu. Acetil-CoA rezultat intr n ciclul acizilor tricarboxilici unde este transformat n dioxid de carbon i ap. Reaciile ciclului tricarboxilic. La nceput ciclul acizilor tricarboxilici reprezenta o simpl schem. Aceast schem a fost completat cu detalii privind enzimele care catalizeaz reaciile, ct i stereochimia reaciilor din ciclu. 1. Acidul citric este primul intermediar al ciclului acizilor tricarboxilici se formeaz prin condensarea acetil-CoA cu oxalilacetat.
CO - CoA CoAS - OC - CH3 + O = C - COOH
acetil-CoA citrat sintetaza

CH2 HO - C - COOH CH2 COOH


citroil-CoA

H2O

COOH CH2 HO - C - COOH CH2 COOH


acid citric

CH2
oxalilacetat

COOH

CoA-SH

Aceast reacie este catalizat de citrat sintetaz, enzim ce determin formarea intermediar a citroil-CoA, care ulterior trece n acid citric. Citrat sintetaza are rol de enzim reglatoare, deoarece este inhibat de ATP i (NADH + H+), produsul final al fosforilrii oxidative. 2. A doua reacie a ciclului acizilor tricarboxilici este reprezentat de trecerea citratului n izocitrat, printr-un intermediar denumit acid cis-aconitic.
COOH CH2 HO - C - COOH CH2 COOH
acid citric

COOH H2O CH2 C - COOH CH COOH


acid cis-aconitic

COOH H2O CH2 CH - COOH HO - CH COOH


acid izocitric

Enzima care catalizeaz aceast reacie se numete aconitaz, care este activat i stabilizat de Fe+2 i de cistein. Aceast reacie este stereospecific, adiia apei la cis-aconitat este o trans adiie.

11

Biochimie farmaceutic

3. Oxidarea izocitratului la -cetoglutarat este o reacie care are loc n prezen de izocitrat dehidrogenaz care necesit prezen de NAD+ sau NADP+. COOH CH2 CH - COOH HO - CH COOH
acid izocitric izocitrat dehidrogenaza

COOH CO2 CH2 CH2 C=O NAD


+

NADH + H+

acid -cetoglutaric

COOH

Izocitrat dehidrogenaza NAD dependent din mitocondrie necesit prezena ionilor de magneziu, este o enzim alosteric reglat de ADP, ca i activator specific i Mg+2. 4. A patra etap o constituie oxidarea -cetoglutaratului la succinil-CoA n prezena -cetoglutarat dehidrogenazei.
COOH CH2 CH2 C=O
acid -cetoglutaric

+ NAD+ + CoA

-cetoglutarat dehidrogenaza

COOH CH2 CH2 + CO2 + NADH + H+

COOH

CO - CoA
succinil-CoA

Reacia este analoag oxidrii piruvatului la acetil-CoA i dioxid de carbon i are loc prin acelai mecanism, cu participarea tiamin-pirofosfatului, a acidului lipoic, a coenzimei A, FAD-ului i NAD-ului drept coenzime. 5. n etapa a cincea succinil-CoA sufer o pierdere a gruprii CoA, nu printr-o simpl reacie de hidroliz ci printr-o reacie conservatoare de energie. Reacia are loc n prezena succinil-CoA sintetazei, ca enzim, care provoac formarea legturii macroergice a GTP-ului, gin GDP i fosfat anorganic, pe seama legturii macroergice din succinil-CoA.

11

Luciana Dobjanschi

COOH CH2 CH2 CO - CoA


succinil-CoA

+ Pa + GDP

succinil-CoA sintetaza

COOH CH2 CH2 COOH


Acid succinic

+ GTP + CoASH

GDP + Pa

GTP E-succ-fosfat + CoA fosfat + succinat E + GTP

succinil-CoA + Pa + E E-succ.-fosfat E fosfat + GDP E

6. n etapa urmtoare succinatul este oxidat la fumarat de flavoproteina succinat dehidrogenaza, care conine FAD legat covalent. COOH CH2 CH2 COOH
Acid succinic succinat dehidrogenaza

COOH CH HC COOH
Acid fumaric

+ FAD

+ FADH2

Enzima este activat de succinat, fosfat, ATP i coenzima Q redus i inhibat de concentraii mici de oxalilacetat. Reacia este stereospecific, dehidrogenaza ndeprteaz atomii de hidrogen din poziia trans de la atomii de carbon metilenici ai succinatului. 7. Succinatul rezultat este apoi hidratat la L-malat n prezena enzimei fumarat dehidrogenaz sau fumaraz. COOH CH HC COOH
Acid fumaric

COOH + H2O
fumaraza

HO - C - H CH2 COOH
Acid malic

11

Biochimie farmaceutic

Fumaraza acioneaz stereospecific, deoarece ea formeaz numai stereoizomerul L al malatului. 8. n ultima reacie a ciclului L-malatul este oxidat la oxalilacetat n prezen de L-malat dehidrogenaz NAD dependent. COOH HO - C - H CH2 COOH
Acid malic

COOH + NAD+ O=C CH2 COOH


Acid oxalilacetic

+ NADH + H+

Reacie este strict stereospecific pentru stereoizomerul L al acidului malic. Oxalilacetatul rezultat poate reintra ntr-un nou ciclu condensndu-se cu acetil-CoA. Dac facem un bilan al ciclului se constat c pentru fiecare grupare acetil intrat n ciclu doi atomi de carbon formeaz dou molecule de dioxid de carbon, iar prin reacia de dehidrogenare enzimatic, care au loc, rezult patru perechi de atomi de hidrogen: trei dintre ele au fost utilizate la reducerea NAD+ i una la reducerea FAD. Aceste patru perechi de atomi de hidrogen vor ceda electronii, n cursul lanului respirator, oxigenului. Ecuaia global se poate scrie astfel:
Ac-CoA + 3 NAD+ + FAD + 2 H2O + GDP + Pa 2 CO2 + CoA-SH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP

Localizarea intracelular a enzimelor ciclului Cercetrile efectuate de Kennedy i Lehninger au demonstrat c mitocondriile izolate prin ultracentrifugare omogenatelor de esut hepatic, asigur transformarea tuturor intermediarilor ciclului citric, deci conin toate enzimele necesare acestui ciclu. Pe de alt parte nucleele, fraciunea microzomal i fraciunea solubil a citoplasmei erau inactive. Deci, mitocondriile hepatice conin toate enzimele necesare ciclului citric i enzimele necesare transportului de electroni. Deci, se constat c la toate animalele i plantele studiate pn n prezent, sediul desfurrii ciclului Krebs ce reprezint mitocondriile. Natura amfibolic a ciclului 11

Luciana Dobjanschi

Ciclul acizilor tricarboxilici este de fapt o cale amfibolic, care funcioneaz nu numai n catabolism, ci i n anabolism, fiind precursor important ntr-o serie de biosinteze. Anumii intermediari i cu preponderen -cetoacizi i oxalilacetatul servesc n biosinteza unor aminoacizi ce pot fi uor transformai n prezena unor transaminaze.
HOOC - C - CH2 - CH2 - COOH + H3C - CH - COOH O
acid -cetoglutaric GPT

NH2
alanina

HOOC - CH - CH2 - CH2 - COOH + H3C - C - COOH


acid glutamic

NH2

O
acid piruvic
GOT

HOOC - C - CH2 - CH2 - COOH + HOOC - CH - CH2 - COOH O


acid -cetoglutaric

NH2
acid aspartic

HOOC - CH - CH2 - CH2 - COOH + HOOC - C - CH2 - COOH NH2


acid glutamic

O
acid oxalilacetic

Citratul format imediat dup intrarea acetil-CoA n ciclu poate s serveasc ca precursor n biosinteza hemului. La fel i succinilCoA va servi pentru biosinteza hemului. Prin ndeprtarea citratului din ciclul acizilor tricarboxilici, acesta servete pentru biosinteza acizilor grai Aceti intermediar pot fi, la rndul lor, pui la loc prin reacii enzimatice specifice, numite i reacii anaplerotice. De exemplu carboxilarea piruvatului duce la formarea acidului oxalilacetic.
CH3 - CO - COOH + CO 2 + ATP + H2O
piruvatcarboxilaza Mn+2

HOOC - CO - CH2 - COOH + ADP + Pa

Lanul respirator constituie o secven de procese biochimice a crui rezultat este transportul electronilor la oxigenul molecular. Sistemul este format dintr-un complex multienzimatic avnd componentele niruite ntr-o secven dictat de valoarea crescnd a potenialului redox. 11

Biochimie farmaceutic

Sistemul de enzime care deservete lanul respirator este localizat n membran mitocondrial intern.
substrat NADH + H
+

FMNH2

CoQ

cit. b

cit c1

ADP + Pa

ATP ADP + Pa

ATP

cit c

cit a

cit a3 + H+ + O2

H2O

ADP + Pa

ATP

Energia eliberat n urma proceselor de oxidare din lanul respirator este ncorporat n moleculele de ATP. ADP + Pa + Q ATP + H2O

Aceste procese ce cupleaz sinteza endergonic de ATP n urma unor procese de oxidoreducere din lanul respirator reprezint punctele de fosforilare oxidativ. Astfel, oxidarea unei molecule de NADH + H+ din lanul respirator produce trei molecule de ATP, iar oxidarea unei molecule de FADH2 produce 2 ATP. Semnificaia energetic a ciclului acizilor tricarboxilici. Procesele din ciclul Krebs i din lanul respirator au loc n mitocondrie i constituie etapa final a oxidrii celulare care furnizeaz o cantitate mare de energie stocat sub form de ATP. Bilanul energetic al ciclului este urmtorul: GTP 3(NADH + H+) FADH2 1 ATP 3 ATP 2 ATP 12 ATP/AcCoA

11

Luciana Dobjanschi

Reglarea ciclului acizilor tricarboxilici. piruvat CO2 Ac-CoA

oxalilacetat malat fumarat succinat

citrat izocitrat CO2 -cetoglutarat succinil-CoA CO2

12

Biochimie farmaceutic

IX. ENZIME TRANSPORTOARE DE ELECTRONI n transportul de electroni de la substrate organice la oxigenul reductor particip patru tipuri de enzime: 1. dehidrogenaze legate de un nucleu piridinic (piridindependente), care necesit NAD sau NADP ca i coenzime; 2. dehidrogenaze legate de nucleu flavinic (flavindependente), care conin FAD sau FMN ca i grupare prostetic; 3. proteine cu fier-sulf; 4. citocromii, care conin inelul porfirinic cu fier ca i grupare prostetic. n plus, fa de aceste proteine, pentru transportul de electroni mai particip i ubiquinona sau coenzima Q. Dehidrogenaze legate de piridin. Deoarece aceste enzime necesita NAD sau NADP drept coenzime, aceste enzime se numesc dehidrogenaze piridin dependente. Se cunosc mai bine de dousute de astfel de enzime care funcioneaz n diferite procese metabolice. Forma general a reaciilor catalizate de acest tip de enzime este: SH2 + NAD+ SH2 + NADP+ S + NADH + H
+

S + NADPH + H+

Aceste reacii implic transferul reversibil a echivalenilor reductori de la substrat, sub forma unui ion de hidrur (H-), la poziia 4 a inelului nicotinamidic (n forma oxidat) a nucleului piridinic; cellalt hidrogen este eliminat de pe substrat ca ion liber (H+) Piridinnucleotidele sunt legate necovalent i slab de dehidrogenaza proteic. Deci, NAD i NADP trebuiesc privite nu ca 12

Luciana Dobjanschi

i grupri prostetice fixe, ci ca un al doilea substrat, deoarece ele se leag reversibil de situsul activ catalitic de pe enzim. Astfel, nucleotidele piridinice servesc ca i transportori disociabili de electroni. Unele dehidrogenaze piridin dependente (ex. -hidroxibutirat dehidrogenaza) sunt localizate n mitocondrie, altele (de ex. lactat dehidrogenaza) sunt localizate n citoplasm, iar altele (ex. malat dehidrogenaza) se gsesc n ambele compartimente. n celulele animale, NAD se gsete intr-o cantitate mult mai mare dect NADP. n ficat cca 6o% din NAD-ul total se afl n mitocondrie, iar restul n citoplasm. Dehidrogenazele NAD - dependente au un rol important n respiraie unde asigur transferul de electroni de pe diferite substrate spre oxigen, pe cnd dehidrogenazele NADP-dependente servesc n principal la transferul de electroni de la intermediari catabolici la intermediari anabolici. Multe dehidrogenaze piridin dependente conin strns legai ioni metalici divaleni, de exemplu, alcool dehidrogenaza conine ioni de zinc (Zn+2). Dehidrogenazele piridin dependente reacioneaz stereospecific, de exemplu, lactat dehidrogenaza este specific numai pentru L-lactat. n secvena glicolitic aldehida 3-fosfogliceric este oxidat la piruvat n urmtoarele reacii, cu intermediarul comun NAD. CH = O H - C - OH + Pa + NAD+ CH2 - O- P CH3 NADH + H+ + C = O COOH nsumnd cele dou ecuaii: CH = O CH3 COOH CHOOP CH3 COOH COOP H - C - OH + NADH + H+ CH2 - O- P CH3 NADH+ + H - C - OH COOH

H - C - OH + Pa + C = O CH2 - OP

H - C - OH + H - C -H CH2 - OP

12

Biochimie farmaceutic

deci sistemul NADH/NAD+ poate transfera electroni de la un substrat la altul n virtutea faptului c NADH are capacitatea de a aciona ca un intermediar comun pentru dou reacii piridin dependente, fiecare catalizat de o dehidrogenaz specific. Dehidrogenaze legate de flavin. Aceste enzime conin, strns legate grupri prostetice, fie FMN, fie FAD. n reaciile catalizate de aceste enzime are loc transferul unei perechi de atomi de hidrogen de la substrat pentru a genera formele reduse FMNH2 i FADH2. SH2 + E-FMN SH2 + E-FAD O H3C H3C N N R N N H O 2H H3C H3C S + E-FMNH2 S + E-FADH2 H N N R O N N H H O

Cele mai importante dehidrogenaze flavin dependente ntlnite n transportul de electroni n procesul de respiraie mitocondrial sunt: 1. NADH dehidrogenaza, care conine FMN i catalizeaz transferul de electroni de la NADH la urmtorul membru al lanului respirator; 2. Succinat dehidrogenaza, este activ n ciclul acizilor tricarboxilici; 3. Dihidrolipoil dehidrogenaza, un component al sistemului piruvat i -cetoglutarat dehidrogenaz; 5. Acil-CoA- dehidrogenaza, catalizeaz prima etap de dehidrogenare din oxidarea acizilor grai. Dehidrogenazele flavin dependente difer semnificativ de cele piridin dependente, deoarece flavin nucleotida este strns legat de molecula enzimei, funcionnd astfel ca o grupare prostetic i nu ca i o coenzim. Flavin nucleotida nu prsete enzima n timpul sau dup efectuarea ciclului catalitic. Enzimele de oxidoreducere flavin dependente pot fi plasate n dou clase: dehidrogenaze i oxidaze, n funcie de capacitatea lor 12

Luciana Dobjanschi

de a reaciona ca acceptori de electroni. La flavin dehidrogenaze de tipul NADH dehidrogenaz i succinat dehidrogenaz exist o tendin foarte slab a reoxidrii formei reduse a flavin nucleotidei de ctre oxigenul molecular. Spre deosebire de acestea, flavin oxidazele sunt reoxidate de oxigenul molecular cu formare de peroxid de hidrogen, de exemplu, D-aminoacid oxidaza i xantin oxidaza. n celule, acceptorul direct de electroni dintre hidrogenazele flavin dependente, pare s fie ubiquinona din lanul transportor de electroni. Unele flavoproteine conin, pe lng flavin nucleotid i metale (de ex. Fe i Mn), acetia fiind eseniali n pentru exprimarea activitii catalitice. Flavoproteinele cu fier (de ex. succinat dehidrogenaza i NADH dehidrogenaza) conin atomi de sulf reactivi. Atomii de fier n flavoproteinele cu fier i sulf sufer tranziia: FeII FeIII

i par s participe la transferul de electroni ctre i de la gruparea prostetic flavinic. Alte enzime flavin dependente (de ex. xantin oxidaza i aldehid oxidaza) conin Fier i molibden. Proteine cu fier i sulf. Proteinele cu fier sulf conin fier i sulf liberabil cu acizi, n cantiti echimoleculare. Prima protein fier sulf descoperit, feredoxina, a fost identificat ntr-o bacterie anaerob, Clostridium pasteurianum, capabil s fixeze azotul atmosferic. Proteine asemntoare au fost apoi descoperite n plantele superioare, unde ele se gsesc n cloroplaste i particip la transportul de electroni al procesului de fotosintez. Proteine cu fier sulf au fost gsite i n microorganisme i n esuturi animale, n mod special n mitocondrii. Grupri Fe S se gsesc n unele flavoproteine i se numesc centri fier sulf. Aceste proteine par s funcioneze ca transportori de electroni suferind tranziii reversibile Fe(II) Fe(III). n lanul mitocondrial de la NADH la oxigen, par s existe cel puin apte centre de fier sulf diferite. Patru sunt localizate n complexul NADH-dehidrogenaza, dou centre sunt asociate citocromului b i unul citocromului c1. Citocromii 12

Biochimie farmaceutic

Citocromii sunt proteine transportoare de electroni care conin n molecula lor ca i grupri prostetice fier porfirinic. Aceste structuri sunt prezente doar n celulele aerobe. Unii citocromi sunt localizai n membrana mitocondrial intern, unde acioneaz secvenial pentru transportul de electroni provenii de la diferite sisteme de oxidoreducere pn la oxigen molecular. Ali citocromi joac un rol important n procesele specializate de hidroxilare. Toi citocromii sufer tranziii reversibile de stare de oxidare Fe(II) Fe(III) n timpul secvenelor de transport de electroni. Formele reduse de citocromi nu pot fi oxidate direct de ctre oxigenul molecular, cu excepia citocromului terminal al respiraiei mitocondriale, i anume citocromul a3 sau citocrom c oxidaza, care conine cupru ca i cofactor. n membrana mitocondriile animalelor superioare, au fost identificai cel puin cinci citocromi diferii (cit. b, c1, c, a i a3. Citocromii conin ca i grupare prostetic porfirinic protoporfirina. Dac protoporfirina complexeaz ionul de F+2 rezult hemul iar dac complexeaz ionul Fe+3 rezult hemina.
CH=CH2 H3C CH3 CH=CH2 H3C CH=CH2 CH3 CH=CH2

N H

N Fe
+2

H3C

CH3 CH2 CH2

H3C

CH3 CH2 CH2 COOH

CH2 CH2

CH2 CH2 COOH hem

COOH COOH protoporfirina IX

Se tie c ionul de fier are ase coordinaii. Datorit structurii plane a sistemului aromatic porfirinic cei patru atomi de azot formeaz un ptrat iar ionul de fier se afl n centru, consumnd n felul aceste patru coordinaii. Coordinaiile 5 i 6 se afl de o parte i de alta a planului ptratului pe o perpendicular.

12

Luciana Dobjanschi

5 1 2

N Fe N3

4N

6 n mioglobin i hemoglobin, coordinaia a cincea este legat de gruparea imidazolic a unui rest de histidin, iar poziia a asea este fie neocupat, fie ocupat cu O2. n aproape toi citocromii (cu excepia citocromului a3, att poziia a cincea ct i poziia a asea de coordinare sunt ocupate de gruprile R ale unor resturi specifice de aminoacizi. Deci citocromii pot lega liganzi ca O2, CO sau CN-. n funcionarea normal a hemoglobinei i a mioglobinei atomul de fier nu sufer schimbri ale strii de oxidare, n timp ce oxigenul este desprins sau prins. La citocromi, ns, Atomul de fier sufer trecerii reversibile ntre starea de oxidare Fe(II) i Fe(III). Deci, se constat c citocromii servesc ca transportori de electroni, pe cnd hemoglobina i mioglobina acioneaz ca transportori de liganzi. Ubiquinona (Coenzima Q) Ubiquinona este o coenzim liposolubil, care particip la transferul de electroni de la substratele organice la oxigen, n lanul respirator din mitocondrie.
O H3CO H3CO O CH3 CH3
+ 2e-, + 2 H+ - 2 e-, - 2 H+

OH H3CO H3CO OH CH3 CH3

(CH2 - CH = C - CH2)n

(CH2 - CH = C - CH2)n

Aceast coenzim este o chinon reductibil, n mod reversibil i are o caten lateral izoprenoid. Se cunosc mai multe ubiquinone, care difer numai prin lungimea catenei izoprenoide, care are ase uniti de izopren n unele microorganisme i zece n mitocondriile esuturilor animale. n esuturile vegetale, corespondentele ubiqinonei sunt plastochinonele, care ndeplinesc funcii similare n transportul de electroni ai fotosintezei. 12

Biochimie farmaceutic

Calea transportului de electroni (lanul respirator) Secvenele de reacii pe care le pargurg electronii de la NADH la oxigen molecular poart numele de lan respirator. NADH este forma sub care electronii sunt colectai de la diferite substrate, cu ajutorul dehidrogenazelor NAD-dependente. Secvena de reacii, care are loc este: NADH + H+ + FMN FMNH2 2 Fe.S(III) 2 Fe.S(II) + 2 H + Q QH2 + 2 cit.b(III) 2 cit.b(II) + 2 cit.c(III) 2 cit.c(II) + 2 cit.a(III) 2 cit.a(II) + 2 cit.a3 (III) 2 cit.a3(II) + 1/2 O2 + 2 H+
+

NAD+ + FMNH2 FMN + 2 Fe.S(II) + 2 H+ 2 Fe.S(III) + QH2 Q + 2 H+ + 2 cit.b(II) 2 cit.b(III) + 2 cit..c(II) 2 cit.c(III) + 2 cit.a(II) 2 cit.a(III) + 2 cit.a3(II) 2 cit.a3(III) + H2O

Se constat c transportorii de electroni intermediari din lan, dinspre substrat ctre oxigenul molecular, se gsesc n stare de echilibru aerob ntr-o succesiune de forme din ce n ce mai oxidate, artnd c electronii se scurg de-a lungul unui gradient de la NADH la O2. De asemenea, s-a constatat c exist inhibitori care blocheaz n mod specific transportorii din lanul transportor de electroni. Exemple de astfel de inhibitori amintim: rotenona (substan foarte toxic extras din plante), amitalul (medicament din clasa barbituricelor), antimicina (izolat din Streptomiccs griseus), monoxidul de carbon, hidrogenul sulfurat i acidul cianhidric. Schimburi de protoni n timpul transportului de electroni. O alt proprietate a lanului transportului de electroni este aceea c ionii de hidrogen sunt formai sau utilizai ntru-nele din reaciile secveniale ale transportului de electroni. Unii dintre transportorii de electroni (NADH i ubiquinona) transport electroni ca atare i nu preiau s-au cedeaz protoni. Aceste reacii unde se formeaz sau se absorb protoni au un rol important n conservarea energiei transportului de electroni. Energetica transportului de electroni. n cursul trecerii unei perechi de electroni de-a lungul lanului respirator de la NADN la oxigen se formeaz 3 ATP, n urma unui proces numit fosforilare oxidativ. ATP + H2O Pa + ADP 12

Luciana Dobjanschi

Cele trei puncte de formare a ATP n procesul de transport de electroni de la NADH la oxigen sunt: FP - Fe.S cit.b cit.a3 Q 1 ATP cit.c 1 ATP O2 1 ATP Deci, se constat c eliberarea energiei are loc n trepte i sunt absorbii i eliberai numai la unele dintre aceste etape, sugernd c schimburile de protoni sunt implicate n conservarea energiei. Transhidrogenaze piridin-nucleotide esuturile animale i microorganismele conin enzime ce catalizeaz reacia: NADP+ + NADH

NADPH + N AD+

Aceast reacie permite utilizarea echivalenilor reductori ai NADH de ctre lanul respirator, care, n mod normal, accept electroni de la NADH ca donor apropiat. Enzimele ce catalizeaz reacia invers, ce permite reducerea NADP+ se numesc transhidrogenaze. Sensul reaciei de trasnhidrogenare n mitocondria intact depinde de energia produs de transportul de electroni i prezena ATP. Viteza reaciei de la NADPH la NAD+ este, de obicei, mai mare dect viteza reaciei n sens invers. Tendina electronilor de a trece de la NADH la NADP + cu formare NADPH apare atunci cnd exist exces de ATP, iar NADPH-ul rezultat joac un rol nsemnat n procesele de biosintez. Utilizarea oxigenului de ctre oxigenaze. Dei, cea mai mare parte an oxigenului molecular consumat de celulele aerobe este redus cu formare de ap. Cantiti mici de oxigen sunt folosite n reacii enzimatice, n care unul sau ambii atomi de oxigen din molecul sunt introdui direct pe substrate organice cu formare de grupri hidroxil. Enzimele care catalizeaz astfel de reacii se numesc oxigenaze. i se mpart n dou clase.: - dioxigenaze - monoxogenaze Dioxigenazele catalizeaz introducerea ambilor atomi de oxigen ai moleculei O2 pe diferite substrate organice, n timp ce monoxigenazele introduc numai unul. Dioxigenazele numite i oxigen-transferaze, catalizeaz reacii de tipul: 12

Biochimie farmaceutic

AH2 + O 2

A(OH)2

unde AH2 este molecula de substrat A(OH)2 forma hidroxilat. Cele dou grupri hidroxil sunt introduse de obicei n poziii adiacente sau vicinale. Produsul A(OH)2 este deseori instabil i are loc ruperea legturii C C ntre gruprile hidroxilice vicinale. Un exemplu important este cazul triptofan-2,3-dihidroxilazei, enzim ce catalizeaz o etap de degradare oxidativ a triptofanului. n aceast reacii doi atomi de oxigen sunt introdui n ciclul de cinci atomi al triptofanului rezultnd un produs hidroxilat, care este apoi transformat n L-formilkinunerin.
NH2 CH2 - CH - COOH OH N H OH

CH2 - CH - COOH N H NH2

O2 dioxigenaza triptofan oxigenaza

NH2

C - CH2 - CH - COOH NH - CH = O
N-formil-L-kinuinerina

Monooxigenazele sau hidroxilazele catalizeaz introducerea unui singur atom de oxigen din molecula de oxigen pe un substrat organic, cellalt atom de oxigen fiind redus la ap. Monoxigenazele necesit un al doilea substrat care s cedeze electroni pentru reducerea pentru reducerea celui de-al doilea atom la ap. Din aceast cauz monooxigenazele mai sunt numite i oxigenaze cu funciune mixt. Ecuaia general este: AH + XH2 + O2 AOH + H2O + X

unde: AH - substratul ce va fi hidroxilat, XH2 - donorul de electroni, AOH substratul hidroxilat i X donorul de electroni oxidat. Substratul care furnizeaz electroni pentru a reduce un atom de oxigen la ap este NADH sau NADPH. 12

Luciana Dobjanschi

Cele mai multe monooxigenaze (din bacterii) sunt flavoproteine care conin FAD i catalizeaz secvena de reacii: NAD(P)H + E-FAD E-FADH2 + AH + O2 NAD(P)+ + E-FADH2 E-FADH2 + AOH + H2O

unde E + enzima i AH + substratul. De exemplu: fenilalanin hidroxilaza (enzim hepatic) sau fenilalanin-4-monooxigenaza catalizeaz reacia de hidroxilare a fenilalaninei cu formare de tirozin. Ultimul donor de electroni este NADPH, dar echivalenii reductori sunt transferai prin intermediul tetrahidrobiopterinei.
O2 CH2 - CH - COOH NH2 NADPH + H
+

HO

CH2 - CH - COOH + H2O NH2

Superoxid dismutaza i catalaza n timpul transportului de electroni spre oxigenul molecular sau n diferite reacii de hidroxilare i oxigenare, se pot forma produi toxici rezultai prin reducerea parial a oxigenului. Cei mai importani produi toxici sunt O -2 (superoxid) i H2O2, care sunt extrem de reactivi i capabili de a distruge activitatea biologic a unor macromolecule. n celulele aerobe a fost pus n eviden o superoxid dismutaz, ce catalizeaz reacia: 2 O2- + 2 H+ H2O2 + O2

Peroxidul de hidrogen format este distrus de o hemoglobulin numit catalaz. H2O2 H2O + 1/2 O2

Superoxid dismutaza se gsete sub dou forme una n citoplasma extramitocondial i alta n mitocondrie. Aciunea superoxid dismutazei i catalazei este completat de acidul sorbic, 13

Biochimie farmaceutic

glutationul redus i vitamina E, care accept uor electroni, fiind eficieni pentru ndeprtarea radicalului.

13