Sunteți pe pagina 1din 77

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA L.1. Protecia muncii. Prezentare lucrri.

L.2. Tehnici de eantionare, recoltare i pregtire a probelor pentru analiza microbiologic Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de microorganisme de alterare din alimente L.3. Determinarea numrului total mezofile L.4. L.5. L.6. L.7. de bacterii aerobe

Determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri Determinarea bacteriilor sporulate aerobe i anaerobe Determinarea microorganismelor osmofile Determinarea bacteriilor de putrefacie

Metode rapide, clasice i moderne de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor L.8. L.9. Proba reductazei Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor

Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari L.10. Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli Analiza bacteriilor care induc risc biologic n alimente L.11. Determinarea numrului de bacterii Staphylococcus aureus (coagulazo pozitivi) L.12. Genul Listeria L.13. Genul Bacillus. Genul Clostridium L.14. Colocviu de laborator

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGIC

1.

Eantionarea probelor

Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie s reflecte condiiile microbiologice existente n momentul recoltrii i s reprezinte fidel lotul din care provine. De modul n .care se face recoltarea i transportuI probelor la laborator depinde de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etap foarte important const n stabilirea eantioanelor, a condiiilor de recoltare a probelor i de transport n condiii corespunztoare la laboratorul de analize. n activitatea de prelevare a probelor exist o terminologie general, i anume: ! lotul - reprezint cantitatea de produse cu aceleai caracteristici, realizate n condiii tehnologice uniforme, ntr-o arj, schimb de producie sau ntr-o perioada limitat de timp; ! elementul - este partea indivizibil a lotului; ! eantionul global - reprezint prob format prin mai multe prelevri din acelai lot; ! eantionul redus - este fraciunea reprezentativ dintr-un eantion global; ! eantionul de laborator - este fraciunea din eantionul global sau redus destinat analizelor de laborator; ! prelevarea (recoltarea) - reprezint tehnica de recoltare a unui eantion elementar dintr-un lot sau a unui element indivizibil. Sunt posibile dou tipuri de recoltare a eantioanelor: prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenia cauza producerii acestora; prelevarea la ntmplare a unor elemente care aparin unor condiii normale de producie, pentru controlul calitii microbiologice. n acest caz sunt aplicate metode statistice, astfel nct eantionul s fie statistic semnificativ. Eantioanele se aleg prin tragere la sori, dup scheme prestabilite, pe baza tabelelor de recoltare ce conin numere echivalente numrului de probe din lot, dar dispuse la ntmplare (tabelul 1). Dup numerotarea elementelor lotului, se coreleaz aceste numere cu cele din tabel, i, apoi, se preleveaz probele corespunztoare numerelor din tabel n succesiunea stabilit de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct i ntr-o ordine arbitrar aleas se compune eantionul cu elementele corespunztoare. De exemplu, dac se dorete ca dintr-un lot de 80 buci s se preleveze la ntmplare 5 probe, se vor

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

preleva elementele corespunztoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46 (valoarea 97 este exclus pentru c nu exist). Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot n vederea eantionrii
07 45 32 62 84 96 74 54 80 96 53 52 45 98 89 59 01 36 44 88 44 50 41 95 47 62 50 53 26 39 66 64 52 03 65 92 33 90 01 23 97 28 94 99 07 97 32 26 61 64 77 45 46 67 51 78 59 02 26 26 63 48 54 09 14 26 66 51 22 45 95 26 22 14 11 46 85 28 37 01 52 25 73 84 37 08 29 22 91 26 18 43 95 48 20 29 42 98 05 83 84 62 08 52 45 42 84 13 42 79 34 27 35 97 09 61 89 91 01 52 62 10 08 28 16 45 25 84 09 17 71 83 36 85 63 56 24 32 49 11 04 09 59 46 71 59 10 76 24 65 68 32 92 58 22 45 39 78 62 96 49 13 59 45 79 93 26 24 54 54 37 18 96 73 79 20 25 69 52 03 43 62 87 36 46 23 08 05 17 58 83 32 05 95 12 12 65 91 07 39 66 90 59 63 92 56 72 89 27 93 48 90 13 15 79 02 72 89 46 78 61 83 14 25 28 68 57 18 68 14 05 75 61 45 70 85 58 98 94 37 87 06 72 12 89 92 26 38 83 80 88 75 14 63 45

Alegerea elementelor pentru analiz (x) se poate stabili pe baza formulelor:

x=

N sau x = N n

n care: N = numrul elementelor unui lot; n = numrul eantioanelor de prelevat.

Dup stabilirea valorii x se numeroteaz i se asociaz n grupe diferite elemente ale lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grup elementul notat cu x. Aceste tehnici sunt aplicabile att loturilor de produse finite din depozite, ct i pe fluxul de fabricaie sau n momentul livrrii. Pe fluxul de fabricaie prelevarea se efectueaz, de obicei, dup terminarea unei etape de procesare. Pentru a fi semnificativ, eantionarea trebuie s fie realizat n timp, deoarece un eantion constituit exclusiv din elemente succesive este puin reprezentativ pentru ansamblul unei producii sau al unui lot. Frecvena prelevrilor i a controlului depinde n general de nivelul produciei, riscurile de contaminare, sau de apariia defectelor de fabricaie. n cazul unei producii mari, frecvena prelevrilor va fi mai mare. Este de asemenea important s se efectueze analize ori de cte ori au loc variaii la nivelul fabricaiei, generate de: - schimbarea lotului de materie prim; - fluctuaiile generate de modificarea schimbului; - modificri sau reparaii ale utilajelor, .a.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pachete mici, cutii, .a.), din produse ambalate n vrac, sau pri dintr-un element de dimensiuni mari. Pentru acest domeniu se recomand analize n cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare prelevare trebuie s fie compus din 5 probe (n=5).

2.

Tehnici de prelevare

De cele mai multe ori prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (cutii de conserve, sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici .a.). n alte cazuri, probele se recolteaz din produse n vrac sau pari dintr-un element de dimensiuni mari. Prelevrile ce corespund primului caz sunt simple i nu necesit masuri de precauie suplimentare. Condiii generale de prelevare (recoltare) Cantitatea de prob recoltat depinde de natura analizei i de planul de eantionare. Omogenizarea Repartizarea microorganismelor n produsul analizat nu este ntotdeauna omogen, mai ales n cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. n asemenea cazuri se recomand ca prelevrile s se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte important s se cunoasc zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune omogenizarea produselor vrac nainte de prelevarea probelor. Msuri aseptice Este absolut necesar s se evite contaminarea suplimentar a probelor n timpul recoltrii sau dup aceast etap. Pentru aceasta recipientele utilizate i instrumentele de recoltare trebuie s fie sterile i protejate n ambalaje sterile. Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare. Recoltarea produselor lichide Se realizeaz apelnd la diferite tehnici, n funcie de natura produsului, de forma i volumul recipientului. nainte de recoltare se recomand omogenizarea probei, care se poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril, precum i prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanic cu care sunt prevzute recipientele. n funcie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). n cazul n care recoltarea se face de la reea, se flambeaz gura robinetului, se las s curg o parte din produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conduct i apoi se face recoltarea propriu-zis. Recoltarea produselor solide n funcie de natura produsului, pentru recoltare se folosete scalpelul, sonda (de exemplu, pentru brnz), pipeta tip harpon, etc. Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Instrumentele trebuie s fie sterilizate. n general, microorganismele de la suprafaa produsului,.expus contactului cu aerul, se analizeaz prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizeaz prin recoltare de probe dup ce s-a ndeprtat o poriune de produs de la suprafa sau s-a cauterizat suprafaa cu ajutorul unei spatule nclzite la rou. n cazul n care structura produselor este neomogena semisolida sau semilichid este absolut necesar omogenizarea probelor.

3.

Pregtirea probelor pentru analiz

Prepararea eantionului presupune deschiderea aseptic a recipientelor nchise (produse ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea i pregtirea extractelor lichide (n cazul produselor solide). Etichetarea O mare atenie trebuie s se acorde etichetrii eantioanelor. Eticheta trebuie s cuprind toate elementele necesare, i anume: numrul lotului, numrul de ordine, data, ora, locul exact de unde s-a realizat recoltarea, modalitatea de recoltare (metoda eantioanelor, tehnica de recoltare .a.). Stabilitatea eantioanelor Calitatea microbiologic a eantionului nu trebuie s se modifice n intervalul de timp de la recoltare pn n momentul analizei. Principalii factori care influeneaz stabilitatea sunt: temperatura i durata de pstrare, protecia fata de contaminrile externe. Omogenizarea i mcinarea n cazul produselor lichide proba ca atare reprezint suspensia iniial . Pentru produsele solide este necesar obinerea i standardizarea suspensiei iniiale, prin stabilirea raportului de diluie (n general 1:10 sau 1:5) ntre proba de analizat i lichidul de extracie (diluare). Astfel, n cazul produselor dense se procedeaz n dou moduri: - se cntrete n condiii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g), direct n sistemul de mrunire, apoi se adaug un volum cunoscut de lichid de diluie (40 ml pentru diluia 1/5; 90 ml pentru diluia 1/10); - se introduc n recipientul de mrunire o cantitate aproximativ de prob i se cntrete tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscut), apoi se adaug lichidul de diluie, n funcie de cantitatea de prob. n ambele cazuri concentraia suspensiei iniiale este perfect definit n raport cu produsul de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Rezultatele analizei se raporteaz la 1 ml suspensie sau 1 g produs. Dup cntrire n condiii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene sunt omogenizate, n paralel cu extracia microorganismelor n lichidul de diluie, aplicnd

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

diverse tratamente precum: mojarare manual cu nisip steril sau bile de sticl sau mrunire mecanic . Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticl se utilizeaz un mojar care conine 5-20 g nisip special, steril, sau bile din sticl (=0,5 mm). Mojararea se realizeaz manual n apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mrunirii se adaug 2-5 volume de ap steril. Proba se las n repaus timp de 5 minute, apoi se colecteaz supernatantul ntr-un vas steril. Aceast metod nu este ntotdeauna practic, dar este simpl i nu necesit aparatur special. Tehnicile moderne de omogenizare prevd utilizarea sistemelor performante, care permit meninerea condiiilor aseptice i o bun eliberare a microorganismelor n lichidul de extracie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system, Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc. n cazul utilizrii omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionat, g) i un volum corespunztor de lichid de extracie (diluie) sunt introduse ntr-o pung de plastic steril (de unic folosin), care se nchide ermetic i se monteaz n aparat pentru omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic trebuie s aib o capacitate suficient pentru a permite amestecarea corect a probei cu o cantitate echivalent de lichid de diluare. n general, volumul recipientului trebuie s fie egal cu aproape de dou ori volumul probei plus volumul soluiei de diluare. Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcioneaz dup un principiu similar cu aparatul tip Stomacher, la care ns s-a mbuntit tehnica de omogenizare prin vibraii (fig.1). Acest tratament (vitez vibratorie mare) ofer o eliberare a microorganismelor (n general a bacteriilor) n lichidul de diluare similar cu cazul prelucrrii probei n stomacher (grad de similaritate a rezultatelor de 96%), ns asigur obinerea unui extract clar cerin impus de analizele moderne precum: evaluarea cantitativ a microbiotei prin ATP bioluminiscen, teste imunologice i analize PCR (din limba englez Polymerase Chain Reaction) (Fung 1999).

Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier Pentru unt i margarin protocolul de pregtire a probelor prevede o serie de etape preliminare, particulare, n concordan prevederile impuse de unele normative (adaptare dup Tofan i colab, 2002):

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

1) Proba este topit pe baie de ap la 45oC i omogenizat. Se prepar diluia 1:10 prin prelevarea a 10 ml produs topit i transferare ntr-un flacon de 200 ml, care conine 90 ml soluie Ringer cu 0,1% geloz, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul i pipetele trebuie s aib temperatura de 45oC. Alte diluii i analizele microbiologice trebuie realizate n urmtoarele 10 minute. 2) Se preleveaz n condiii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate ntr-o eprubet de analiz coninnd 2,1 ml de soluie Ringer , i se termostateaz la 45oC pn la topire. Dup omogenizare, amestecul este meninut pe baie de ap (la 45oC) pn la separarea celor dou faze. Faza apoas este utilizat pentru analiza microbiologic . 3) O cantitate de 50 g de prob se suspend n 42 ml de soluie 0,1 M tampon fosfat (pH=7,58,0), apoi se termostateaz la 4045oC pn la topire (timp de maximum 1 h, cu agitare intermitent ). Separarea fazelor este realizat n final prin centrifugare n condiii aseptice, timp de 110 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoas este utilizat pentru examen microbiologic. O alt mbuntire a vizat tehnica de realizare a diluiilor. Prin realizarea unui instrument de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat i aseptic a unui volum cunoscut de lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniiale sau a diluiilor decimale. Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid de diluie, cuprinse ntre 0,1 ml i 100 ml, direct n pungi sau vase sterile, n care s-a introdus n prealabil aseptic proba de analiz . Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de diluie, realiznd transferul automat a unui volum corespunztor de lichid, n funcie de greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate n analiz (fig. 2).

Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniiale n general, condiiile particulare de eantionare i pregtire a probelor de analiz sunt precizate n standardele specifice pentru evaluarea calitii microbiologie a fiecrui produs. n absena unor standarde specifice disponibile, sau n cazuri speciale, metodologia se adapteaz la condiiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de analiz.

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

DEFINIII Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor, a mediilor solide. Bacteriile mezofile reprezint grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20C, temperaturi optime n intervalul 30 - 40C i maximum la temperaturi peste 45C Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE Numrul de bacterii aerobe mezofile se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup termostatare la 37C, timp de 48 de ore. Numrul de bacterii aerobe mezofile reprezint un indicator valoros pentru aprecierea calitii generale i a stabilitii la pstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU Se iau dou placi Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc, n fiecare plac, cte 1 cm2 prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal. Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) (Anexa 2) cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor. Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea. Plcile ce conin mediul solidificat se plaseaz cu capacul n jos, pentru 48 de ore, n termostat cu temperatura de 37C.

PARTICULARITI PRIVIND NUMRAREA COLONIILOR Dup termostatare, se aleg pentru numrare plcile care conin un numr colonii cuprins ntre 25 i 250, acestea trebuie s fie repartizate pe o suprafa mai mare de 25% din suprafaa total a mediului de cultur. Pentru numrare se poate adopta:

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

numrarea manual, cu ajutorul unui numrtor electronic (care la atingerea fiecrei colonii o contabilizeaz n memoria sa), pentru a evita erorile de numrare; numrare automatizat, utiliznd instrumente speciale de numrare, cnd se consum numai 10% din timp, comparativ cu numrarea manual. Exist totui i unele limitri ale acestui procedeu i anume: pot s apar erori de numrare n cazul prezenei n mediu a unor impuriti solide sau bule de gaz; nu se obin rezultate bune cnd coloniile au diametru mare i sunt rspndite pe o suprafa mare etc. La numrare pot fi ntlnite urmtoarele tipuri de colonii: lanuri de colonii, care aparin unei singure surse (celule asociate, n perechi, lanuri, pachete etc.). n acest caz se va numra ntregul lan ca o singur colonie; colonii dezvoltate n filmul de ap dintre baza mediului de cultur i suprafaa capacului inferior; colonii dezvoltate n filmul de ap de la suprafaa mediului cu agar. Rezultatele se exprim, dup caz, n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs, astfel: 1) Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:

ufc / g (ml ) =
n care:

C
(n1 + 0,1 n 2 ) d

C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;


n1 = numrul de plci reinute din prima diluie; n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv; d = factor de diluie corespunztor primei diluii

Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atribuit numrului 10. Exemplu: Dac la numrare au fost alese cte 2 plci corespunztoare diluiilor a doua i a treia, iar numrul de colonii din cele 4 plci reinute este: la prima diluie reinut, 10-2: 232 i 244 colonii; la a doua diluie reinut, 10-3: 33 i 28 colonii.

ufc / g (ml ) =

C
( n1 + 0,1 n2 ) d

232 + 244 + 33 + 28 537 = = 24409 2,4 10 4 2 0,022 [2 + (0,1 2)] 10

(prin rotunjire la dou cifre semnificative*)

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

* Exemplu: ufc calculat 12700 12400 15500 14500 ufc estimat 13000 12000 16000 14000

Prin analiz statistic s-a stabilit c n 95% din cazuri limitele de ncredere ale acestei metode variaz de 12% la 37% (pentru numrul total de microorganisme aerobe) i ntre 16% la 52%. n practic ns se pot obine variaii mai mari ce deriv din condiiile de analiz aplicate i experiena analistului. 2) Plcile inoculate din dou diluii succesive conin mai puin 25 colonii. Se aplic modul de calcul prezentat mai sus. Plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniial (d =10-1, produse solide), conin mai puin de 25 colonii:
ufc / g (ml ) =

C
2d

Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie ptratic r2=0,95, intervalele de variaie a numrului posibil de ufc, pentru plcile n care se dezvolt mai puin de 15 colonii, sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Limite de ncredere pentru estimri n cazul unui numr de colonii sub baremul minim Numr de colonii/plac 1 2 3 4 5 6 7 8 Interval posibil de variaie a ufc <12 <14 <15 16 29 210 212 313 Numr de colonii/plac 9 10 11 12 13 14 15 Interval posibil de variaie a ufc 414 416 518 619 720 721 823

3) n plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniial (d =10-1, produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie: ufc/ml < 1 (produse lichide) ufc/g < 1 10-1 (produse solide)

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

4) Cnd plcile conin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numrarea se poate realiza: pe anumite sectoare delimitate ale suprafeei plcii n = n delimitate (4, 8 sau 16) pe o suprafa delimitat (ptrat) de 1 cm2, astfel: cnd numrul de colonii pe un ptrat este mai mare de 10 se numr la ntmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri; cnd numrul de colonii distribuite pe un ptrat este mai mic dect se numr coloniile de pe 12 ptrele reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri. 5) Cnd numrul de colonii pe plac este foarte mare rezoluia este imposibil numrarea, concentraie de celule mult mai mare dect diluia estimat. 6) Cnd se produce contaminarea accidental sau se obin rezultate neconcludente rezoluia este analiz efectuat necorespunztor. sec tor nr. sectoare

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

Grupe de produse Pine i produse de panificaie Lapte i produse lactate Carne i produse din carne Pete i produse din pete Uleiuri, grsimi i semine oleaginoase Ou i produse pe baz de ou Zahr i produse zaharoase Fructe. Legume i produse prelucrate Buturi alcoolice Buturi nealcoolice Produse de cofetrie i patiserie Cereale i produse din cereale Condimente, supe, sosuri, salate ngheate Ap Ceai, cafea, cacao Alimente cu destinaie special Alte alimente

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2

CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Condiiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele romneti adaptate la condiiile ISO (SR ISO) sunt prezentate n tabelul 1.
Tabelul 1. Condiii de cultivare pentru numrarea microorganismelor impuse de normativele ISO

Grup de microorganisme Numr total de microorganisme aerobe, care se dezvolt la 30C

Medii de cultur PCA

Condiii de termostatare Temperatur/timp 30C/72h 3h

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea numrului de uniti formatoare de colonii

Indicator microbiologic Numr total de microorganisme aerobe mezofile

Compoziie medii de cultur, g/L (engl. Plate count agar); SMA- Standard methods agar) Tripton ..................... 5,0g Extract de drojdie ....... 2,5g Glucoz anhidr .......... 1,0 Agar-agar ........ 12,0-18,0g Ap pn la ......... 1000ml pH=7,2 Mediul este disponibil comercial.
PCA

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE nr. __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n plcile selectate pentru numrare)
Proba Diluia 1 2 3 4 Nr. colonii/plac

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ Proba 3 _______________ Proba 4 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI


DEFINIII Drojdii microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat prin nmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat (meioz). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite i multe dintre ele au activitate fermentativ. Mucegaiuri microorganisme eucariote, care prezint organe de reproducere difereniate. Sunt agenii mucegirii. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI Prin aceast metod, numrul de drojdii i mucegaiuri se apreciaz indirect, pe baza coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv gelozat, dup termostatare la 25C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE Omogenizator; Balan analitic; Termostat reglat la 25C; Baie de ap pentru fluidificarea mediului de cultur reglat la 45C.

MATERIALE I STICLRIE 25g produs alimentar; 225 ml 0.1% apa peptonat; Plci Petri =10 cm sterile; Pipete de 1 cm3 i 10 cm3 sterile; Eprubete cu ser fiziologic steril, cte 9 cm3 per eprubet; Baloane cu ser fiziologic steril; Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide; Numrtor de colonii. Reactivi pentru determinare Mediu de diluare: Soluie ser fiziologic; Mediu de cultur: Anexa 2.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se cntresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaug 225 ml apa peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min. Pentru diluarea probei se aplic schema de diluie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor


*Toate probele se realizeaz in duplicat.

Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 cm2 prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal (Fig.1). Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 cm2 mediu MEA (Malt Extract Agar) cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor.
* Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, pentru 3-5 zile la temperatura de 25-28C.

REZULTATE Se rein plcile care conin 25-250 de colonii. Numrul de ufc de drojdii i mucegaiuri per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:
ufc / g (ml ) =

C
(n1 + 0,1 n 2 ) d

unde C suma coloniilor numrate n toate plcile reinute; n1 numrul de placi reinute dintr-o diluie n2 numrul de placi reinute din diluia succesiv d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea plcilor. Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Se exprima gradul de contaminare printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuit lui 10. Dac cele dou placi Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii, se face media aritmetic, m, a coloniilor numrate n cele dou placi. Rezultatul se exprima sub forma: - numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per ml: NE=m (produse lichide) - numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per gram NE=md-1 (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei iniiale (alte produse). Dac cele dou plci Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte produse) nu conin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma: mai puin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide); mai puin de 1d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

Grupe de produse Pine i produse de panificaie Produse lactate acide si brnzeturi Carne i produse din carne Uleiuri, grsimi i semine oleaginoase Fructe. Legume i produse prelucrate Buturi alcoolice Buturi nealcoolice Finuri proteice, furaje , roturi Zahr i produse zaharoase Cereale i produse din cereale Produse de cofetrie i patiserie Condimente, supe, sosuri, salate

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2
CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Condiiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele romneti adaptate la condiiile ISO (SR ISO) sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Condiii de cultivare pentru numrarea microorganismelor impuse de normativele ISO Grup de microorganisme Drojdii i mucegaiuri Medii de cultur - YGC - OGA (OGYE) Condiii de termostatare Temperatur/timp 25C/5 zile

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea numrului de uniti formatoare de colonii Indicator microbiologic Drojdii i mucegaiuri Compoziie medii de cultur, gl-1 YGC (Extract de drojdie, glucoz, cloramfenicol agar ) Extract de drojdie ......... 5g Glucoz ...................... 20g Cloramfenicol ............ 0,1g Agar-agar ................... 15g Ap pn la .......... 1000 ml pH=6,6 OGA (OGYE) (Oxitetraciclina glucoz agar) Extract de drojdie ......... 5g Glucoz ...................... 20g Agar-agar ................... 16g Ap pn la ........... 1000ml pH=7,2 n momentul utilizrii, n mediul fluidificat se Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

adaug 100 ml soluie 1mg/ml oxitetraciclin. Geloz nutritiv (geloz alba) Agar-agar ........................... 12-18g Ap pn la ...................... 1000 ml MEA (Malt Extract Agar) Extract de malt ........................ 30g Pepton .................................... 5g Agar-agar ................................ 15g Ap pn la ....................... 1000ml pH=7,6

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII I MUCEGAIURI

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n plcile selectate pentru numrare)
Proba Diluia 1 2 3 Nr. colonii/plac

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ Proba 3 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I ANAEROBE


DEFINIII

Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparin genului Bacillus. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de form cilindric, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate n unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanuri. Sporii nu se coloreaz prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal dect al celulei, fiind poziionai central sau terminal. Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparin genului Clostridium. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari dect cele din genul Bacillus, singure sau n lanuri, care formeaz endospori dispui central sau terminal, care dau celulelor forma de suveic sau paleta. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI

Determinarea microorganismelor sporulate aerobe i anaerobe estimeaz numrul microorganisme n stare sporulata prezente per g sau ml de produs. Proba de analizat sau diluii succesive se supun pasteurizrii la 80C timp de 10 minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se rcete i se inoculeaz n medii specifice, cultivarea realizndu-se n condiii particulare n condiii aerobe sau anaerobe.

MATERIALE I ECHIPAMENTE SPECIALE

1. Baie de ap reglabil la 45C i la 80C; 2. Stomacher 3. pH-metru; 4. Plci Petri; 5. Termostat reglabil la 37C; 6. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare n anaerobioza; 7. Numrtor de colonii; 8. Reactivi i medii de cultura: mediu de diluare (ap peptonat), medii de cultur: (Anexa 2).

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Testul se efectueaz n conformitate cu instruciunile de mai jos: Manipularea eantioanelor n laborator, nainte de analiz, cu excepia produselor alimentare care nu necesit condiii speciale de depozitare, probele se pstreaz fie la frigider la temperatura de 0-5C, fie congelate, n funcie de natura produsului. Prepararea mediilor de cultur Se pregtete mediul Trypticase Soy Agar n cantiti corespunztoare i se sterilizeaz. Se tempereaz mediul de cultur ntr-o baie de ap la temperatura de 45C, asigurndu-se c nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete. Se cur zona de lucru cu un dezinfectant adecvat. Se marcheaz n mod clar plcile Petri cu numrul probei, diluia i data termostatrii. Pregtirea diluiilor Se prepar un raport de diluie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a de 10g (ml) produs n 90 ml ap peptonat. Probele se omogenizeaz: timpul de amestecare nu trebuie s depeasc 2.5 min, n scopul prevenirii supranclzirii. n cazul produsele alimentare care au tendina de a spuma, este indicat agitarea moderata. diluiile se omogenizeaz prin meninere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc de 30 cm, n aproximativ 7 sec).

Pentru fiecare prob de analizat, se pipeteaz 20-25 ml din diluia 10-1 ntr-o eprubet steril. Se plaseaz eprubetele n baia de ap la 80C i se menin timp de 20 de minute. Dup rcire se prepar diluii (diluii recomandate sunt de 10-1,10-2, i 10-3). Inocularea i termostatarea probelor Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de analizat. Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pentru bacteriile aerobe sporulate, plcile se termostateaz la 35oC 0.5oC timp de 48 2 ore. Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plcile se termostateaz 35oC 0.5oC timp de 48 2 ore. ntr-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack (Anexa 3). Numrarea coloniilor Coloniile se numr imediat dup perioada de termostatare. Dac este posibil, se selecteaz plcile cu 20-200 colonii.

REZULTATE

Numrul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculeaz cu urmtoarea formula:
ufc / g (ml ) =

C
( n1 + 0,1 n 2 ) d

n care:

C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;


n1 = numrul de plci reinute din prima diluie; n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv; d = factor de diluie corespunztor primei diluii

Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac. Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atribuit numrului 10.

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRUPE DE PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahr Din proba de analizat se executa n condiii aseptice diluia 1/5 prin cntrire a 20g zahr i dizolvarea n 80 ml ap steril. Pentru inactivarea termic a formelor vegetative se face pasteurizarea prin meninerea diluiei 1/5 pe baie de ap la 80C, timp de 20 minute i rcire n jet de ap rece. Din proba pasteurizat i rcit, cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de analizat. Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de 455C. Plcile se termostateaz la 32oC 1oC timp de 48 3 ore. Numrul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raporteaz la 10 g zahr.

Bacterii anaerobe sporulate din lapte Se execut prin metoda Weinyirl n probe de lapte destinat fabricrii brnzeturilor. n 5 eprubete sterile ce conin parafin (cca. 1ml n stare fluida) se introduc cte 5 ml proba de analizat (lapte destinat fabricrii brnzeturilor). Dup pasteurizare (meninere 10 minute la 80C) i termostatare 48 ore la 24-48C se apreciaz eprubetele pozitive, n care s-a produs deplasarea dopului de parafin. Interpretarea rezultatelor Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative Lapte calitate satisfctoare 1 eprubeta pozitiva din 5 Lapte de calitate nesatisfctoare 2 pn la 5 eprubete pozitive.

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1
GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Grupe de produse

Finuri Lapte Produse lactate acide i brnzeturi Carne i produse din carne Conserve alimentare Zahr i produse zaharoase Produse deshidratate Condimente i plante aromate

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2
CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea numrului de uniti formatoare de colonii Indicator microbiologic Bacterii sporulate aerobe Compoziie medii de cultur, g/l BD Trypticase Soy Agar Extract pancreatic de cazein.15,0 g Clorur de sodiu 5,0 Extract papaic de soia ..5,0 Agar .15,0 pH 7,3 0,2*Ajustat i/sau completat n funcie de necesiti pentru a corespunde criteriilor de performan. MYP Mediu de baz ................. 90 ml Soluie polimixin B ......... 1,0ml Emulsie de glbenu de ou10,0ml Se lichefiaz mediul de baz, se tempereaz la 50C, apoi se adaug aseptic celelalte componente. Mediul de baz Soluie de polimixin B Extract de carne ..................1,0g Sulfat de polimixin B ...... 106 UI Pepton ............................10,0g Ap pn la .....................100 ml D-manitol ..........................10,0g Clorur de sodiu ..............10,0g Rou de fenol ................. 0,025g Agar-agar .................. 12g-18g 3) Ap pn la ................... 900 ml pH=7,2, la 25C Agar glucozat Tripton ............................10,0g Purpur de bromcrezol .... 0,015g Extract de drojdie ...............1,5g Agar-agar ................... 12g-18g 3) Glucoz .............................10,0g Ap pn la .................. 1000 ml Clorur de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare) Mediul Voges-Proskauer (VP) Pepton ..............................7,0g K2HPO4................................ 5,0g Glucoz ...............................5,0g Ap pn la .................. 1000 ml Clorur de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare) Mediul cu nitrat Pepton ..............................5,0g Ap pn la .................. 1000 ml Extract de carne ..................3,0g pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare) Azotat de potasiu................1,0g

Bacillus cereus

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 3
SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA

1. Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei controlate (anaerobioza, microaerofilie, mbogita n CO2).

Figura a. Sisteme anaerobioza (GASPACK) Containerele sunt rezistente la ocuri i sistemul perfect de etaneizare transforma sistemele GasPak EZ n condiii ideale de stocare i transport. Noua tehnologie, bazata pe un sistem rectangular de termostatare, etaneizare uoar i rezisten la ocuri, minimizeaz riscul apariiei condensului, asigurnd astfel o vizibilitate perfecta a coloniilor bacteriene. Structura sistemului anaerob i indicatorii CO2 asigura metoda optima de obinere a condiiilor anaerobe.

2. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost ndeprtat sau nlocuit cu un amestec controlat de alte gaze.

Pag 7

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I ANAEROBE

1. nregistrai in tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n plcile selectate pentru numrare)
Proba Diluia 1 Nr. colonii/plac

Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

2. nregistrai in tabelul de mai jos eprubete pozitive i negative, stabilind in funcie de rezultatele obinute calitatea probei analizate
Proba 1 1 2 Eprubetele testate 3 4 5

Proba 1 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE


PRINCIPIUL METODEI Drojdiile, mucegaiurile i bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile s creasc ntr-un mediu cu concentraii ridicate de zahr sau sare producnd alterri care conduc la modificarea calitii senzoriale i a valorii nutritive a alimentelor. Prin aceast metod, numrul de microorganisme osmofile se apreciaz prin examen cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente n proba de analizat, sau o diluie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate, suplimentate cu 10% zahar sau sare, dup termostatare optim. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

MATERIALE I ECHIPAMENTE
1. Mediu de baza (Anexa 2):

Pentru bacterii: dextroz, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, ap distilat, 1.000 ml; Pentru drojdii i mucegaiuri: mediu hiperglucidic.

2. Mediul de diluare:zaharoz sau NaCl 400 g; ap distilat 1000 ml.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Pentru obinerea diluiilor decimale pot fi folosite dou tehnici pentru orice tip de prob luat n analiz. Numrul de diluii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in analiza, i anume: Din proba de analizat se executa in condiii aseptice diluia 1/5, prin transferul a 20g prob n 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezint diluia iniial 1:5 (proba martor). Se transfer aseptic 20 ml din proba martor n 80 ml mediu de diluare, proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25. Se cntresc in condiii aseptice 10 g prob de analiza i se transfera n 90 ml mediu de diluare, obinnd diluia nti, din care se obin alte diluii decimale prin diluare succesiva.

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Cu o pipet steril se transfer n 2 plci Petri in paralel, cte 1ml prob de analizat. Se repartizeaz n fiecare plac Petri cte cca. 15ml mediu de cultur fluidificat i temperat la temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor1. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos in urmtoarele condiii:

A. Bacterii osmofile Plcile Petri se termostateaz la 35-37C timp de 48 3 ore (2 zile). Se rein plcile care conin 25-250 de colonii. Se numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar i se stabilete numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs. B. Drojdii i mucegaiuri osmofile Plcile Petri se termostateaz la 25-30C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar i se stabilete numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs. Se nregistreaz numrul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs.

REZULTATE Numrul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:
ufc / g (ml ) =

C
(n1 + 0.1 n2 ) d

unde C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute; n1 numrul de cutii reinute dintr-o diluie n2 numrul de cutii reinute din diluia succesiv

Pe capacul plcilor Petri se noteaz: denumirea i numrul probei, mediul de cultura, diluia din care se realizeaz inocularea, temperatura la care se realizeaz termostatarea.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea plcilor. Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Se aplica aceeai formula de calcul ca i la bacterii aerobe mezofile sau drojdii i mucegaiuri

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5.

Grupe de produse Zahr i produse derivate Produse conservate prin adaos de zahar Lapte condensat Amestecuri de srare Saramuri i produse conservate prin srare

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2

COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR

Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate

Mediu de cultura/Denumire PCA (engl. Plate Count agar)

Compoziie medii de cultur, gl-1 Tripton ......................... 5,0g Extract de drojdie .......... 2,5g Glucoz anhidr ............... 1,0 Agar-agar ............. 12,0-18,0g Ap pn la .............. 1000ml pH=7,2 Mediul este disponibil comercial.

Mediu hiperglucidic

Extract de drojdie ........... 10g Glucoz ......................200,0 g Uree ..............................1,0 g Agar-agar ............. 12,0-18,0g Ap pn la .............. 1000ml

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n plcile selectate pentru numrare)
Proba Diluia 1 2 Nr. colonii/plac

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs: Proba 1 _______________ Proba 2 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE

PRINCIPIUL METODEI Bacteriile de putrefacie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine animal pn la produi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compui indolici. Primele semne ale alterrii prin putrefacie sunt formarea de mucus, apariia mirosului neplcut i modificarea gustului. Bacteriile de putrefacie aparin urmtoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc. Determinarea lor are la baz dou principii: I. Evidenierea hidrolizei substratului de natur proteic, astfel se determin bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei). II. Evidenierea produilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste biochimice reunite in testul HIL (H - evidenierea producerii de hidrogen sulfurat; I evidenierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia gelatina) Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1. MATERIALE I ECHIPAMENTE1
1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazein sau 10% lapte; 2. Mediul de diluare: ap peptonat; 3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se pregtete suspensia iniial prin cntrirea a 10 g prob, peste care se adaug 90 ml ap peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min. a. determinarea bacteriilor cazeinolitice

Anexa 1

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Se realizeaz diluii decimale. Prin tehnica cultural Koch se fac inoculri in mediu PCA suplimentat cu 1% cazein sau 10% lapte. Mediile se uniformizeaz rapid n plci Petri sterile, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor2. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, timp de 48h, la temperatura de 37C. Bacteriile care prezint capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar incolor comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece, bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzeaz n exteriorul coloniilor i hidrolizeaz cazeina.

b. determinarea produilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL


Testul H evideniaz prezena hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor

Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Se plaseaz deasupra lichidului o hrtie steril mbibat n acetat de plumb. Proba se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h. Proba este pozitiv dac hrtia se nnegrete, ca urmare a formarii de sulfura de plumb, prin reacia dintre acetatul de plumb si H2S care se degaja.
Testul I evideniaz prezena indolului

Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Proba se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h, apoi se adug 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich. Proba se consider pozitiv prin apariia unui inel de culoare roie la interfaa mediu-reactiv, care indic prezena indolului.
Testul L evideniaz bacteriile care lichefiaz gelatina

Se recolteaz cu ansa celule din suspensia iniial i se neap un tub de gelatin ntr-o eprubet sterila. Se termostateaz la temperatura de 20C, timp de 7 zile3. Proba este pozitiv dac se produce lichefierea parial sau total a tubului de gelatin.

REZULTATE Stabilirea numrului de bacterii cu activitate cazeinolitic se aplica aceeai formula de calcul utilizata pentru stabilirea numrului de unitatea formatoare de colonii (metoda indirecta de numrare)
2

Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea. 3nainte de analiza, probele se menin timp de 30 min la frigider

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1
GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3.

Grupe de produse

Carne Preparate din carne sau pete Brnzeturi

ANEXA 2
COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR SI A REACTIVILOR UTILIZATI

Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate Mediu de cultura/Denumire PCA (engl. Plate count agar) Compoziie medii de cultur, gl-1 Tripton ......................... 5,0g Extract de drojdie .......... 2,5g Glucoz anhidr ............... 1,0 Agar-agar ............. 12,0-18,0g Ap pn la .............. 1000ml pH=7,2 Mediul este disponibil comercial.

Tabelul 2. Compoziia soluiilor si a reactivilor utilizai Reactiv - Soluie/Denumire Ap peptonat Soluie de acetat de plumb Reactiv Kovacs Compoziie medii de cultur, gl-1 Pepton ....................... 10,0g Ap pn la .............. 1000ml Acetat de plumb .......... 10,0g Ap pn la ................ 100ml p dimetilnanobenzaldehida..10,0g HCl.25,0ml Alcool amilic pn la .100ml

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n plcile selectate pentru numrare)
Proba Diluia 1 2 Nr. colonii/plac

Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________ Proba 2 _______________ 2. nregistrai in tabelul de mai jos probele pozitive i negative, prin aplicarea testului HIL
Proba Testul H 1 2 Testul HIL Testul I Testul L

Proba 1 _______________ Proba 2 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

PROBA REDUCTAZEI
PRINCIPIUL METODEI Proba reductazei este o metod indirect de apreciere a numrului de microorganisme vii dintr-un produs, in funcie de corelaia dintre gradul de contaminare si durata n care se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen i resazurina), sub aciunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente n produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta reductazelor) se transforma in leucoderivai incolori. Analiza se preteaz cel mai bine pentru evaluarea calitii microbiologice a laptelui materie prima. In funcie de tipul indicatorului si concentraia acestuia variaz durata analizei si culoarea probei, parametrii in funcie de care se poate aprecia gradul de contaminare si calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizrii albastrului de metilen, iniial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina i schimb culoarea de la albastru la violet spre roz i apoi incolor.

MATERIALE I ECHIPAMENTE
1. Soluie de albastru de metilen 1% 2. Soluie de resazurin 0,05%

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU a. Proba reductazei cu albastru de metilen Pentru analiza laptelui, se transfer 20 ml lapte ntr-o eprubeta steril peste care se adaug 1 ml soluie de albastru de metilen. Eprubeta se menine n baie de apa termostatat la temperatura de 38-40C, astfel nct nivelul apei s fie superior probei. Se fac notaii asupra modificrii culorii la intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute. Exist i varianta rapida a acestei metode cnd se utilizeaz aceeai tehnic de lucru utiliznd urmtoarele cantiti: 10 ml lapte i 1 ml soluie albastru de metilen, diluie 1/10. b. Proba reductazei cu resazurina n eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaug 1 ml soluie de resazurina 0,05%, apoi proba se termostateaz la temperatura de 38-40C, urmrindu-se modificarea culorii in intervalul 20 i 60 minute.
Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

REZULTATE a. Proba reductazei cu albastru de metilen Aprecierea calitii laptelui se face in conformitate cu specificaiile din tabelul 1. Tabelul 1. Aprecierea calitii laptelui n proba reductazic cu albastru de metilen
Durata decolorrii probei, minute Metoda clasica Metoda rapida 330 120-330 20-120 20 180 60-180 8-60 8 Numr bacterii per ml 510 5 6 510 - 410 6 6 410 2010 6 2010
5

Calitatea laptelui Buna Satisfctoare Slaba Foarte slaba

Categoria I II III IV

b. Proba cu resazurina In proba cu resazurina aprecierea calitii laptelui si a gradului de contaminare se face realizeaz in conformitate cu datele nscrise n tabelul 2. Se apreciaz c la temperaturi de 38-40C, o capacitatea reductazic superioar o au lactobacilii, streptococii i bacteriile coliforme. Dac probele se menin la temperatura de 22C la reducere particip i bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus, Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numrului de bacterii din proba de lapte


Timp de modificare a culorii Dup 1h Dup 1h Dup 1h Dup 20 min. Culoare proba Albastru Albastru violet Rou-alb Alb Numr de bacterii per ml 5 510 5 6 510 - 410 6 6 410 2010 6 2010 Calitatea laptelui Buna Satisfctoare Slaba Foarte slaba Categoria I II III IV

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

PROBA REDUCTAZEI

1. nregistrai n tabelele de mai jos variaia culorii probelor analizate, stabilind n funcie de rezultatele obinute calitatea acestora
1.1.
PROBA 1. 2.

Proba reductazei cu albastru de metilen


Durata decolorrii probei, minute Metoda rapida Numr bacterii per ml Calitatea laptelui

1.2.
PROBA 1. 2.

Proba reductazei cu resazurin


Timp de modificare a culorii Culoare proba Numr bacterii per ml Calitatea laptelui

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR


Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale, denumite Petrifilme (n limba englez, Petrifilms), n care mediul de cultur specific (n general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru i grosime variabil) pe un suport din carton plastifiat i acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul i prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor. Petrifilmele au fost concepute n vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza hazardului, punctele critice de control), care prevd aplicarea unor msuri corective, pe tot parcursul procesului de producie, fr ca acesta s stagneze, ceea ce impune analiza unui numr mare de probe, cu obinerea unor rezultate prompte i n scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic (Bahrim, 2003). Practica a demonstrat c Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiz microbiologic, aplicabile mai ales pentru evaluarea calitii materiilor prime i controlul n punctele critice pe parcursul procesrii acestora, oferind numeroase avantaje, care se regsesc n reducerea timpului de analiz, reducerea costului analizei per prob, creterea numrului de probe analizate, asigurarea inocuitii alimentelor i mbuntirea substanial a productivitii (Jordano i Medina, 1999).

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este extrem de simpl i presupune parcurgerea urmtoarelor etape: Se pregtete proba, conform metodologiei clasice, i se dilueaz prin tehnica diluiilor decimale, pn la o concentraie de celule de aproximativ 104 celule per ml. Se ridic filmul superior.

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului aezat pe un suport special.

Se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber. Cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz uor deasupra zonei inoculate pentru distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a mediului de cultur.

Se ndeprteaz dispozitivul de rspndire i se ateapt un minut pentru solidificarea mediului. Se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din instruciunile de utilizare a Petrifilmului.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Se realizeaz numrarea coloniilor (pragul optim de detecie 25-250 colonii/petrifilm); faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care mparte suprafaa mediului n ptrate cu suprafaa de 1cm2, uureaz mult numrarea.

Se calculeaz ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficiena oferit de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizrii acestora pentru evaluarea calitii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv n industria de panificaie pentru analiza finii, a pastelor finoase, a cerealelor i a cerealelor pentru micul dejun. n tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe pia i principalele lor caracteristici.

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim, 2003b)1


Tip Petrifilm Grup de microorganisme analizate Drojdii i mucegaiuri Bacterii mezofile aerobe Condiii de termostatare 72-120 25C ore, Particulariti

PYM (Petrifilm yeast/mould) PAC (Petrifilm aerobic count) PCC (Petrifilm coliforms count)

determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri; nu necesit adugarea de antibiotice sau acid tartric.

48 2 ore, 30 1C 24 2 ore, 35 1C sau 37 1C

Bacterii coliforme

PHSCC (Petrifilm sensivity count)

Bacterii coliforme high coliforms

24 2 32...35C

ore,

P 2000 CC (Petrifilm rapid coliforms count)

Bacterii coliforme

24 2 ore, 35 1C

PEC (Petrifilm E. coli)

Escherichia coli

48 2 ore, 35 1C sau 24 2 ore, 42 1C 48 2 ore, 35 1C sau 24 2 ore, 42 1C 24 2 ore, 30 1C sau 37 1C

Petrifilm Kit HEC

Escherichia coli tip enterohemoragic

Petrifilm Enterobacteriaceae

Enterobacterii

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk)

Staphylococcus aureus

24 2 ore, 37 15C

determinarea numrului total de bacterii aerobe; analiza este eficient prin prezena unui indicator care coloreaz coloniile n rou. evidenierea coliformilor totali; analiza este nlesnit de prezena unui indicator ce coloreaz coloniile n rou; filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia substratului lactoz, cu apariia specific a bulelor de gaz n jurul coloniilor. evidenierea bacteriilor coliforme la diluii mari n probele de analizat (1-2 celule g-1); permite inocularea a 5 ml prob, sau diluii ale acesteia; evaluare similar ca i n cazul utilizrii Petrifilmelor tip PCC. dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme; indicator de pH foarte sensibil, cu evidenierea producerii de acid, chiar de la nceputul formrii coloniilor; reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei creteri accelerate; rezultate test prezumtiv n 6-14 h, cu confirmare n 18 -24 h. dou teste n unul singur: evaluarea cantitativ a coliformilor fecali i a lui E. coli; conine indicator -glucuronidaz pentru evidenierea selectiv a tulpinilor de E. coli; rezultate pozitive n 24 - 48 ore; nalt selectivitate. evidenierea serotipurilor E. coli enteropatogene (O157: H7), care produc glucuronaze; se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA, care se menine 2 minute n contact cu Petrifilmul, iar dup 18 ore de termostatare testul pozitiv se evideniaz prin apariia unor pete gri pe membran. evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae; producerea de acid este pus n eviden cu ajutorul unui indicator de pH, ce vireaz n galben n mediu acid; evidenierea formrii de gaz prin fermentaia heterolactic a lactozei. evidenierea selectiv a tulpinilor de Staphylococcus aureus prin formarea de colonii de culoare rou-violet; confirmarea prezenei lui Staphylococcus aureus, cu ajutorul discului, care conine albastru-toluidin-O, ce faciliteaz developarea unei zone de culoare roz (reacie DN-az pozitiv), n jurul coloniilor specifice.

|Anexa 1

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Garania utilizrii Petrifilmelor este validat oficial de numeroase asociaii de renume din ntreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de baz: reproductibilitate, repetabilitate i precizie.
Tabelul 2. Validarea oficial a utilizrii Petrifilmelor pentru evaluarea calitii microbiologice a alimentelor
Organizaia internaional* AOAC Produse pentru care s-a realizat validarea Majoritatea alimentelor Indicator microbiologic Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapid a bacteriilor coliforme Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapid a bacteriilor coliforme Enterobacterii Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Test Kit HEC

ANFOR

Majoritatea alimentelor

NMKL VDIA HPB

Majoritatea alimentelor Lapte i produse lactate Lapte i produse lactate Alte alimente Evaluarea calitii mediului

* AOAC Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR French Standardization Association (Frana); NMKL Nordic Committee of Food Analysis; VDIA Victorian Dairy Industry Authority (Australia); HPB Health Protection Branch, Compendium of Analytical

Analiza comparativ a fidelitii evalurilor cantitative, pentru patru indicatori microbiologici: drojdii i mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme i Escherichia coli, realizat pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea Petrifilmelor, n paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizeaz medii selective (OGYE, PCA, VRBL, EMB), a evideniat c evalurile privind numrul total de drojdii i mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, n variantele analizelor realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale. Explicaia const probabil n existena unei suprafee insuficiente pentru creterea extins a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce n multe cazuri la suprapunerea coloniilor, genernd erori n evaluarea corect a unitilor formatoare de colonii (ufc). De remarcat este faptul c la Petrifilmele destinate evalurii drojdiilor i mucegaiurilor, suprafaa mediului de cultur este de 30 cm2, comparativ cu 20 cm2, n cazul majoritii Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano i colab., 1995).

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Evalurile statistice, realizate pe baza coeficienilor de corelaie i a pantei ecuaiilor de regresie liniar, ofer certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici i recomand utilizarea Petrifilmelor ca o alternativ la metodele microbiologice convenionale pentru controlul microbiologic, realizat att pe faze de fabricaie, ct i n cazul materiilor prime i al produselor finite (tabelul 3).

Tabelul 3. Evaluri statistice privind acurateea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale (Jordano 1995, 1999)
Parametrul statistic Coeficient de corelaie Indicatorul microbiologic Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Petrifilme/ Metode culturale clasice* 0,897 0,861 0,981 0,599 1,051 0,998

Panta ecuaiei de regresie

* Valori medii pentru 5 probe n paralel (n = 5)

Datele obinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru cinci probe n paralel (n = 5), certific fidelitatea i acurateea analizelor realizate cu Petrifilme, amplificarea preciziei realizndu-se prin asigurarea condiiilor selective de cultivare i interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corect i distinctiv a speciilor analizate (fig. 5).

Fig. 5. Dezvoltarea selectiv a microorganismelor n funcie de natura Petrifilmelor


1 drojdii i mucegaiuri; 2 bacterii aerobe mezofile; 3 enterobacterii; 4 bacterii coliforme/ Escherichia coli

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

n concluzie, implementarea utilizrii Petrifilmelor n controlul calitii microbiologice a alimentelor ofer numeroase faciliti care se reflect n: uurina n exploatare; analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare, termostatare i evaluare cantitativ i calitativ; simplitate n utilizare i n interpretarea cu acuratee a rezultatelor, prin crearea unor condiii selective de cretere i de evaluare a microorganismelor testate. Evalurile cantitative sunt facilitate, chiar n cazul dezvoltrii unui numr mare de colonii, prin caroiajul tiprit pe filmul inferior, care delimiteaz suprafee de 1 ml; reducerea semnificativ a costului manoperei per analiz; reducerea la jumtate a timpului necesar pentru realizarea analizelor microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice, optimizrii strategiilor de control, creterii numrului de analize efectuate, eficientizrii procesrii, mbuntirii calitii i asigurrii inocuitii produselor finite; impact pozitiv asupra organizrii laboratorului de microbiologie, prin eliminarea operaiilor de pregtire i sterilizare a mediilor de cultur i a ustensilelor de laborator, impuse de metodele convenionale de analiz microbiologic; riscuri reduse pentru mediul nconjurtor dup utilizare; volum redus de produse reziduale la finalul analizei care pot fi uor anihilate pin incinerare; economie de spaiu la transport, pstrare i termostatare (un pachet de 50 de Petrifilme ocup un spaiu similar cu cel ocupat de 2 plci Petri clasice); valabilitate prelungit (mai mult de un an, prin meninere la 4C). Practica a demonstrat c exist i unele limitri n utilizarea Petrifilmelor generate de (Williams i Busta, 1999b): capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de solidificare, ceea ce conduce la rspndirea i suprapunerea coloniilor; unii compui din alimente (acizi, sruri etc.) pot exercita efect inhibitor asupra dezvoltrii coloniilor n cazul utilizrii Petrifilmelor, comparativ cu tehnicile clasice. Studii efectuate n 85 de companii productoare de alimente, privind eficiena economic a tehnicilor de evaluare a calitii microbiologice, au demonstrat c manopera se reflect n proporie de 70,7 % n costul tot al analizelor, iar prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calitii i creterea numrului de analize (Jordano, 1999).

Pag 7

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

ANEXA 1
Tipuri de Petrifilme comerciale
Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate Exemple Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate Petrifilm high sensivity coliforms count) Bacterii coliforme Exemple

Petrifilm yeast/mould Drojdii i mucegaiuri

Petrifilm aerobic count Bacterii aerobe mezofile

Petrifilm rapid coliforms count Bacterii coliforme

Petrifilm coliforms count Bacterii coliforme

Petrifilm E. coli Escherichia coli

Petrifilm E. coli / Coliform count plate Bacterii coliforme i E. coli

Petrifilm Enterobacteriaceae Enterobacterii

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk) Staphylococcus aureus

Petrifilm Environmental Listeria plate Listeria

Pag 8

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

BACTERII COLIFORME. COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI


Bacteriile coliforme conform definiiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate, oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s se nmuleasc n prezena srurilor biliare (care inhib dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor ageni cu proprieti echivalente), capabile de a produce fermentaia heterolactic a lactozei cu producere de acid lactic i gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37C. Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1. PRINCIPIU METODEI Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare i testul complet, bazate pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, n timp de 48 ore la 35C. Testul prezumtiv const in inocularea probei n mediu nutritiv cu lactoz. Aprecierea probelor pozitive se face fie n funcie de prezena gazelor acumulate n tubul Durham, fie ca urmare a scderii pH-ului prin acumularea de acid lactic. Testul de confirmare const in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv in medii selective care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor coliforme de origine fecala. Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme i se bazeaz pe testarea unor proprieti biochimice caracteristice. Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o contaminare fecal recent. MODUL DE LUCRU DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI Analiza se efectueaz n dou etape, dup cum urmeaz: 1. Etapa de mbogire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezena bacteriilor coliforme i multiplicarea acestora, dac sunt n concentraii reduse, n vederea evidenierii lor facile n etapa urmtoare.

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

2. Etapa de confirmare certific prezena bacteriilor coliforme prin cultivare n condiii selective specifice. Pornind direct de la eantionul de analiz (n cazul unui produs lichid) sau de la suspensia iniial (10-1) (n cazul unui produs solid), n funcie de gradul de contaminare presupus se pot adopta dou modaliti de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru inoculare cte 10 ml de prob (pentru probele cu grad de contaminare mai redus) utiliznd mediu selectiv de mbogire dublu concentrat, sau cte 1 ml de prob prin inoculare n mediu selectiv de mbogire simplu concentrat. Pentru acest din urm caz, se inoculeaz serii de cte trei eprubete n paralel pentru i pentru urmtoarele diluii succesive: 10-1, 10-2,...a. Probele inoculate se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 24-48 h. Se nregistreaz eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz n plutitor), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 h i se nregistreaz din nou eprubetele pozitive. Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se inoculeaz eprubete cu bulion lactoz bil verde briliant; dup termostatare la temperatura de 37C, timp de 48 h, n condiiile n care se produc gaze n plutitor, tulburare, si virajul culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirma ca n produsul analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. 1). EVIDENTIEREA FECALA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIGINE

Testul const n transferul cu o ans a probelor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv, n eprubete cu mediu E.C. i termostatare la temperatura de 45.5C, timp de 24 de ore. CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli Din eprubetele pozitive ce conin mediu E.C., dup termostatare la temperatura de 45.5C, timp de 24 de ore, se fac trasri aplicnd metode scarificate pe suprafaa mediului Levine cu agar, repartizat n plci pentru a obine colonii distincte. Se termostateaz apoi la temperatura de 35C, timp de 18-24 de ore. Din coloniile caracteristice se fac inoculri pentru testele biochimice denumite generic IMViC*, care permit diferenierea a lui E. coli de Enterobacter aerogenes.
*I producere de indol din triptofan M reacia fa de rou de metil V reacia Vages Proskauer de producere a acetoinei C utilizarea citratului.

Difereniere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmeaz : Specii Escherichia coli Enterobacter aerogenes I + M + V + C + Mobilitate + -

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

Figura 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativ a bacteriilor coliforme prin tehnica numrului probabil
Legend: 1) Mediu selectiv de mbogire dublu concentrat (Mdc) + tub Durham 2) Mediu selectiv de mbogire simplu concentrat (Msc) + tub Durham 3) Mediu selectiv de confirmare + tub Durham 4) Temperatura de termostatare poate fi 30C, 35C sau 37C i este stabilit n funcie de scopul analizei i anume: scop tehnologic sau evaluarea riscului privind sigurana alimentar; n anumite cazuri testul pozitiv poate fi evideniat i dup o perioad de termostatare de 24 h 2h * Prob pozitiv: modificarea turbiditii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz n tubul Durham ** Prob pozitiv: modificarea turbiditii; virajul culorii mediului din verde n galben; acumularea de gaz n tubul Durham

CALCULUL I INTERPRETAREA REZULTATELOR Folosind, metoda titrului, in funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete cifra caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunztor cifrei caracteristice Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

si numrul de eprubete inoculate in paralel, se determina numrul probabil de coliformi (MPN) Pentru a calcula numrul probabil de coliformi/cm3 prob, valoarea din tabel se nmulete cu factorul de diluie corespunztor primei cifre din cifra caracteristic. Tabel Mac Cready
Cifra caracteristica 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 Numr probabil de microorganisme 0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1 1.5 1.6 0.9 Cifra caracteristic 201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301 Numr probabil de microorganisme 1.4 2.0 1.5 2.0 3.0 2.0 3.0 3.5 4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0 Cifra caracteristica 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 Numr probabil de microorganisme 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0 9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110 140

Interpretarea rezultatelor Pentru fiecare eantion examinat se rein trei diluii consecutive, care, dup caz, corespund uneia dintre situaiile urmtoare: 1) Cel puin o diluie prezint trei eprubete pozitive. Se alege diluia cea mai mare (adic cea care corespunde celei mai mici concentraii de eantion inoculat) care prezint trei eprubete pozitive, i nc dou diluii succesive. Dac schema de diluie adoptat este necorespunztoare, adic nu exist diluii la care s se fi nregistrat i probe negative, se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au cea mai sczut concentraie de prob inoculat). 2) Nu exist cazuri e s prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat. Se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au cea mai sczut concentraie de prob inoculat), care conin cel puin un rspuns pozitiv. 3) Cazuri particulare. n toate cazurile n care mai mult de una dintre cele trei diluii de la pct. 1) i 2) nu prezint eprubete pozitive (adic cea n care s-a inoculat cea mai mare cantitate de prob) i cele dou diluii consecutive mai mici (adic cele n care concentraiile de prob inoculat sunt de 10 i respectiv 100 de ori mai mici dect n prima diluie aleas), excluznd cazul n care se nregistreaz probe pozitive, doar la prima diluie preparat, pornind de la eantion. n acest ultim caz, se vor reine primele trei diluii, chiar dac seria include dou diluii care nu prezint nici o prob pozitiv.

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

ANEXA 1
GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Grupe de produse

Lapte i produse lactate Carne i produse din carne Pete i produse din pete Buturi alcoolice Buturi nealcoolice Produse de cofetrie i patiserie

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

ANEXA 2
COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR
Etapa Etapa de mbogire Denumirea mediului Buliontripton i lauril sulfat (mediul selectiv de mbogire) Compoziie Mediu dublu concentrat: Tripton ............................... 40,0g Lactoz ................................ 10,0g K2HPO4 ................................ 5,5 g KH2HPO4 .............................. 5,5 g NaCl ..................................... 10,0g Lauril sulfat de sodiu ............. 0,2g Ap .................... pn la 1000 ml pH=6,8; la temperatura de 25C (dup sterilizare) Mediu simplu concentrat Tripton ............................... 20,0g Lactoz .................................. 5,0g K2HPO4 ............................... 2,75g KH2HPO4 ............................. 2,75g NaCl ....................................... 5,0g Lauril sulfat de sodiu ............. 0,1g Ap .................... pn la 1000 ml pH=6,8; la temperatura de 25C (dup sterilizare) Pepton ............................... 10,0g Lactoz ................................ 10,0g Bil ....................................... 20,0g Verde briliant ................... 0,0133g Ap ...................... pn la 1000ml pH=7,2; la temperatura de 25C (dup sterilizare) Instruciuni de pregtire Se dizolv componentele sau mediul comercial n ap, nclzind dac este nevoie. Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu dublu concentrat n eprubete mari (20mm x 200mm), fr tub Durham. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu simplu concentrat n eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizeaz n autoclav la 121C, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie s conin bule de aer dup sterilizare.

Etapa de confirmare

Bulion lactozat cu bil i verde briliant (BLBV) (mediul de confirmare)

Mediu Levine

Mediu EC (mediul selectiv confirmare)

Pepton ............................... 10,0g Lactoz ................................ 10,0g K2HPO4 .................................. 2,0g Eozin ................................... 0,4g Albastru de metilen ........... 65,0mg Geloz ................................ 15,0g Ap ...................... pn la 1000ml pH=7.1; Triptoz ............................... 20,0g Lactoz .................................. 5,0g Sruri biliare .......................... 1,5g Fosfat dipotasic ..................... 4,0g Fosfat monopotasic ............... 1,5g Clorur de sodiu .................... 5,0g Ap ...................... pn la 1000ml pH=6.9;

Se dizolv componentele sau mediul comercial n ap, nclzind dac este nevoie. Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu n eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizeaz n autoclav la 121C, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie s conin bule de aer dup sterilizare. Se sterilizeaz n autoclav la 121C, timp de 15 minute.

Se sterilizeaz n autoclav 121C, timp de 15 minute. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu n eprubete mici, cu tub Durham.

la

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

REZULTATE LUCRARE __________ Nume______________________________ Grupa______________________________ Data_______________________________

BACTERII COLIFORME. COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli

1. nregistrai in tabelul de mai jos probele pozitive:


a. Etapa de mbogire (testul prezumtiv) Proba Diluia 1 2 b. Etapa de confirmare Proba Diluia 1 2 Stabilii gradul de contaminare exprimat in numrul probabil de bacterii coliforme/cm3 prob: Proba 1 _______________________ Proba 2 _______________________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMRULUI DE BACTERII Staphylococcus aureus (COAGULAZO POZITIVI)

Staphylococcus aureus (stafilococi coagulazo-pozitivi) - bacterii care formeaz colonii caracteristice i/sau necaracteristice la suprafaa unui mediu de cultur selectiv i care dau o reacie puternic coagulaz pozitiv. Prezenta procedur de lucru stabilete modul de evideniere i numrare a stafilococilor coagulazo-pozitivi din produsele alimentare. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI Prin aceast metod, numrul de bacterii aparinnd speciei Staphylococcus aureus se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii generate de celulele acestei bacterii prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv gelozat (inoculat n dou probe n paralel), dup termostatare la temperatura de 35C sau 37C, timp de 24-48 de ore.

MATERIALE I STICLRIA PENTRU DETERMINARE Plci Petri 10 cm sterile; Pipete de 1 cm3 sterile; Eprubete sterile; Eprubete cu cte 10 ml mediu Baird-Parker cu geloz; Eprubete cu cte 10 ml bulion inim-creier steril; Baloane cu ser fiziologic steril; Ans cu bucl cu diametrul de 3 mm; Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide; Numrtor de colonii. MEDII DE CULTUR I REACTIVI PENTRU DETERMINARE Mediile de cultur utilizate pentru determinare sunt (Anexa 2): Mediu cu geloz Baird-Parker Bulion de inim-creier Plasm de iepure

Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Cerine: Apa folosit trebuie s fie distilat sau demineralizat, lipsit de substane care s inhibe dezvoltarea celulelor de Staphylococcus aureus n condiiile analizei; Reactivii chimici utilizai trebuie s fie de calitate recunoscut; Pentru prepararea soluiilor de diluare i a mediilor de cultur se vor utiliza componente de baz deshidratate sau medii comerciale deshidratate; Pentru emulsia de glbenu de ou se recomand utilizarea unui preparat comercial, respectnd cu strictee instruciunile fabricantului.

MODUL DE LUCRU Pentru evidenierea bacteriilor Staphylococcus aureus se fac inoculri n mediul BairdParker cu geloz, prin metoda ncorporrii n mediul nutritiv. Din probele lichide se pot realiza diluii decimale direct n eprubete, n timp ce pentru probele solide sau semisolide se realizeaz o omogenizare i suspendare n ser fiziologic steril. Se cntresc n condiii aseptice 10 g din produsul de analizat, folosind drept suport o pung steril. Se adaug 90 cm3 ser fiziologic steril, se nchide punga i se introduce n omogenizator. Se omogenizeaz timp de 1 min n treapta a doua, dup care se continu diluarea n eprubetele cu ser fiziologic steril. Inoculrile se fac din 3 diluii succesive ale probei, alese convenabil, n funcie de gradul presupus de contaminare a probei. Pentru fiecare din diluiile alese, se inoculeaz cte 1 cm3 n cte dou plci Petri. Pentru a obine colonii uniform repartizate, dup turnarea n plci a mediului fluidificat i rcit la 471C, se omogenizeaz coninutul cutiei Petri prin micri de rotaie executate n plan orizontal, dup care se las n repaus pn la solidificare total. Dup inoculare, probele sunt termostatate timp de 24-48 de ore la temperaturi de 35 1C sau la 371C, apoi se marcheaz pe reversul mediului coloniile caracteristice. Se continu termostatarea la temperatura de 35 1C sau la 371C, timp de nc 22-24 de ore i se marcheaz toate coloniile caracteristice; se marcheaz i coloniile necaracteristice eventual prezente. Se rein pentru numrare plcile Petri care conin ntre 15-150 colonii caracteristice i/sau necaracteristice. Prin numrare se stabilete numrul de ufc (uniti formatoare de colonii) care reprezint numrul prezumtiv de bacterii ale speciei Staphylococcus aureus, prezente n proba de analizat.

Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Din fiecare plac Petri se aleg pentru confirmare cinci colonii caracteristice i/sau necaracteristice (dup caz). Pentru confirmarea prin proba coagulazei se procedeaz astfel: din fiecare colonie reinut se preleveaz biomas cu ajutorul unei anse sterile i se inoculeaz n cte o eprubet ce conine 10 ml bulion inim-creier. Probele inoculate se termostateaz la 370,5C, timp de 18-24 de ore. Se amestec n eprubete sterile 0,1 ml cultur recoltat n condiii sterile 0,3 ml plasm de iepure i se termostateaz la temperaturi de 35-37C, timp de 1-6 ore. Se consider c reacia este pozitiv cnd coagulul ocup mai mult de trei ptrimi din volumul ocupat iniial de lichid. Pentru control, se adaug 0,1 ml bulion inim-creier steril n 0,3 ml plasm de iepure i termostateaz n condiii similare cu probele de analizat. Plasma din eprubeta martor nu trebuie s prezinte semne de coagulare.

INTERPRETAREA REZULTATELOR n interpretarea rezultatelor se vor ine cont de urmtoarele recomandri: - coloniile caracteristice sunt negre, strlucitoare i convexe, diametrul de 1..1,5 mm, dup 24 de ore de termostatare, i de 1,5-2,5 mm, dup 48 de ore de termostatare, i sunt nconjurate de o zon clar sau parial opac; - coloniile necaracteristice au caractere culturale asemntoare, dar sunt lipsite de zon clar; coloniile necaracteristice sunt constituite adesea de tulpini de Staphylococcus aureus care contamineaz produsele lactate; - dac la o diluie predomin un tip de colonii, iar la o diluie diferit predomin alt tip de colonii, se rein plcile corespunztoare ambelor diluii. Pot fi ntlnite urmtoarele situaii: 1) Dac cel puin 80% dintre coloniile selecionate sunt coagulazo-pozitiv se ia ca numr prezumtiv de Staphylococcus aureus, numrul de ufc obinut prin numrarea coloniilor selectate pentru numrare. 2) n toate celelalte cazuri, numrul se calculeaz pornind de la procentul de Staphylococcus aureus prezumtiv, care sunt coagulazo-pozitiv. Calculul pentru determinarea bacteriilor Staphylococcus aureus prin numrare Pentru plcile care conin ntre 15 i 150 de colonii caracteristice i/sau necaracteristice pentru dou diluii consecutive, numrul de ufc de Staphylococcus aureus se calculeaz media aritmetic a valorilor obinute, exceptnd cazul cnd raportul dintre valoarea cea

Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

mai mare i valoarea cea mai mic este mai mare dect 2; n acest caz se reine ca rezultat valoarea cea mai mic. Dac n plcile Petri alese pentru numrare sunt prezente colonii caracteristice i/sau necaracteristice, aceste colonii se numr separate. Se adun mediile obinute din coloniile caracteristice i/sau necaracteristice, lund n considerare, pentru fiecare, factorul de diluie. Nu se rein dect dou cifre semnificative, procednd dup cum urmeaz: - dac numrul este mai mic de 100, se rotunjete la cel mai apropiat multiplu de 5; - dac numrul este mai mare de 100 i se termin cu 5, se rotunjete la cel mai apropiat multiplu de 20; - dac numrul este mai mare de 100 i nu se termin cu 5, se rotunjete la cel mai apropiat multiplu de 10 Pentru a obine ufc/ml produs lichid sau ufc/g produs solid, dup caz, se multiplic valoarea obinuta anterior cu inversul volumului inoculului i apoi cu inversul diluiei eantionului analizat. Rezultatul se exprim printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 multiplicat cu 10n, unde n este puterea corespunztoare. Pentru o estimare a numerelor mici, se face o medie din numrul coloniilor confirmate, caracteristice i necaracteristice i se rotunjete la numrul ntreg urmtor cel mai apropiat. Dac numrul mediu al coloniilor confirmate este mai mic de 15, rezultatul se exprim sub forma: a) pentru produse lichide: - mai puin de 15x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde ne = 1/volum de inocul b) pentru alte tipuri de produse: - mai puin de 15x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde Ne = 1/volum de inocul x 1/diluia eantionului analizat c) estimarea numerelor mici n produsele lichide: - m x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde m = numrul de colonii confirmate d) estimarea numerelor mici n alte tipuri de produse: - m x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde m = numrul de colonii confirmate Limitele de ncredere ale estimrilor de numere mici sunt prezentate n tabelul de mai jos. Limitele de ncredere cu o probabilitate de 95% din estimrile de numere mici
Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

(variantele c) i d)), atunci cnd numrul mediu de colonii confirmate n dou plci Petri inoculate cu eantionul de analiz sau o diluie a acestuia este mai mic de 15 ufc sunt prezentate n tabelul de mai jos: Limite de ncredere pentru estimri de numere mici
Staphylococcus aureus ufc/ml sau ufc/g 1 2 3 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Limita de ncredere la nivelul de 95% inferioar superioar <1 2 <1 4 <1 5 1 6 2 9 2 12 3 13 4 14 4 16 5 18 6 19 7 20 7 21 8 23

Dac nu exist nici o colonie confirmat rezultatul se exprim sub forma: a) pentru produse lichide: - - mai puin de 1 x ne Staphylococcus aureus per mililitru b) pentru alte tipuri de produse: - - mai puin de 1 x Ne Staphylococcus aureus per gram

Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

ANEXA 1
GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Grupe de produse

Pine i produse de panificaie Lapte i produse lactate Carne i produse din carne Pete i produse din pete Uleiuri i grsimi Ou i produse pe baz de ou Zahr i produse zaharoase Fructe. Legume i produse prelucrate Buturi alcoolice Buturi nealcoolice Produse de cofetrie i patiserie Produse de catering Semipreparate Cereale i produse din cereale Condimente, supe, sosuri, salate ngheate

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

ANEXA 2
PREPARAREA MEDIILOR DE CULTUR I A REACTIVILOR PENTRU DETERMINARE 1. Mediul cu geloz Baird-Parker

Compoziie: Mediu de baz ................................................. 90 ml Soluie telurit de potasiu ..................................... 1ml Soluie piruvat de sodiu .................................. 5,0 ml Emulsie de glbenu de ou ............................ 5,0 ml Preparare: Se solubilizeaz mediul de baz, apoi se rcete la circa 50C pe baia de ap. Se adaug celelalte componente, omogeniznd cu grij dup fiecare adaos. 1.1. Mediu de baz Compoziie: Tripton ........................................................... 10,0g Extract de drojdie .............................................. 1,0g Extract de carne ................................................ 5,0g Glicin ............................................................. 12,0g Clorur de litiu ................................................... 5,0g Agar-agar ..................................................... 12-20g Ap .............................................................. 1000 ml i dac este necesar: Soluie de sulfamezatin .............................. 27,5 ml Preparare: Se dizolv componentele sau mediul gelozat comercial n ap distilat prin nclzire pn la fierbere. Dac este necesar, se adaug 27,5 ml soluie de sulfamezatin (sulfadimidin, INN). Se ajusteaz pH-ul astfel nct, dup sterilizare, acesta s fie 7,2 la temperatura de 25C. Se repartizeaz mediul cte 10 de ml n eprubete. Se sterilizeaz mediul la 121C, timp de 15 minute. Mediul poate fi conservat timp de 1 lun, la temperaturi de 0C-.5C. Soluie de sulfamezatin (sulfadimidin, INN) se folosete numai n cazul n care se suspect prezena bacteriilor din genul Proteus). Compoziie: Sulfamezatin ..............................................................0,2g Soluie hidroxid de sodiu 0,1M .................................... 10ml Ap ............................................................................ 100ml Preparare: Se dizolv sulfmezatina n soluie de hidroxid de sodiu. Se completeaz volumul pn la 100 ml cu ap. 1.2. Soluie de telurit Compoziie: Telurit de potasiu (trioxotelurat dipotasic) ....................1,0g Ap ........................................................................... 100ml Preparare: Se dizolv teluritul de potasiu n ap, nclzind ct mai puin posibil. Se sterilizeaz prin filtrare. Soluia poate fi conservat mai multe luni la temperaturi de 0C-.5C. 1.3. Soluie de piruvat de sodiu Compoziie: Piruvat de sodiu .........................................................20,0g Ap ............................................................................ 100ml

Pag 7

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Preparare: Se dizolv piruvatul de sodiu ntr-un volum de ap. Se completeaz cu ap pn la volum final. Se sterilizeaz prin filtrare. Soluia poate fi conservat maxim o lun la temperaturi de 0C-5C. 1.4. Emulsie de glbenu de ou (cu o concentraie de circa 20%) Este recomandat utilizarea preparatului comercial. n lipsa preparatului comercial emulsia se va prepara respectnd cu strictee urmtoarea reet: Se folosesc dou ou proaspete de gin i se separ glbenuurile de albuuri. Se amestec glbenuurile cu un volum de ap egal cu de patru ori volumul lor. Se nclzete amestecul pe baia de ap reglat la temperatura de 455C apoi se menine la temperatura de 0C-5C, timp de 18-24 de ore. Se las s se decanteze, apoi lichidul supernatant se sterilizeaz prin filtrare. Emulsia poate fi conservat maxim 72 de ore, la temperaturi de 0C-.5C.

2.

Bulion de inim-creier

Compoziie: Pepton ............................................................................................ 10g Extract deshidratat din creier de viel ............................................ 12,5g Extract deshidratat de inim de bou ............................................... 5,0g Glucoz ........................................................................................... 2,0g Clorur de sodiu .............................................................................. 5,0g Ortofosfat disodic (Na2HPO4) .......................................................... 2,5g Ap ............................................................................................ 1000 ml Preparare: Se dizolv componentele sau mediul complet n ap, aducnd la fierbere. Se ajusteaz pH-ul astfel nct, dup sterilizare, acesta s fie 7,4 la temperatura de 25C. Se repartizeaz mediul de cultur, cte 10 ml, n eprubete. Se sterilizeaz mediul la temperatura de 121C, timp de 20 de minute. Mediul poate fi conservat timp de mai multe luni la temperatura de 0C-.5C.

3.

Plasm de iepure

Se folosete plasm de iepure deshidratat din comer, care se rehidrateaz conform instruciunilor fabricantului. Se adaug o soluie de EDTA (acid etilen-diamino-tetra acetic) (plasma oxalat sau heparinizat nu necesita EDTA), astfel nct s se obin o concentraie de 0,1% EDTA n plasma rehidratat. Se poate utiliza plasm de iepure proaspt steril i ap steril, n raport de 1:3. nainte de a fi utilizat, fiecare lot de plasm trebuie controlat cu tulpini de Staphylococcus aureus slab i intens pozitive, precum i cu tulpini de stafilococi coagulazo-negativi.

Pag 8

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL LISTERIA

Genul Listeria monocytogenes.

cuprinde

specii,

dintre

care

cea

mai

important

este

L.

TEHNICI DE MBOGIRE mbogirea se poate realiza cu o metod la rece (metoda Gray), metod bazat pe caracterul psihrofil. Produsul de analizat este meninut la temperatura de 4C (eventual n tampon PBS) sau prembogit ntr-un bulion cu triptoz la temperatura de 4C. Se utilizeaz apoi (fcndu-se eventual prelevri la timpi diferii) un bulion de mbogire care conine ramnoz, albastru de metilen, acid nalidixic, polimixin B i acriflavin. Acest mediu se termostateaz timp de 2 zile la temperatura de 25C, apoi se realizeaz o repicare pe mediul de izolare. Se poate utiliza i un bulion cu acridin sau mediul de mbogire Feindt, care conine acridin (tripaflavin) i tiocianat de potasiu. Alte medii permit s se efectueze o mbogire la temperatur clasic de 30-37C. Bulionul de mbogire pentru Listeria (LEB) permite evidenierea bacteriei Listeria monocytogenes: Cicloheximida, acidul nalidixic i acriflavina sunt agenii selectivi ai mediului. Mediul este termostatat timp de 24-48 h la temperatura de 30C. Bulioanele de mbogire pentru Listeria, UVM I, II se bazeaz pe aceiai ageni selectivi: acriflavina (12 mg/l pentru UVM I i 25 mg/l pentru UVM II) i acid nalidixic. Esculina (hidrolizat de Listeria) este n acest mediu un agent de difereniere. mbogirea se realizeaz de obicei n dou etape: se termostateaz mai nti, timp de 4 h, pe UVM I, se izoleaz i se retermostateaz timp de 24 h la temperatura de 30C, se reizoleaz i se face repicarea pe UVM II. Dup o perioada de 24 h la temperatura de 30C se face o ultim izolare (pe geloza Oxford sau PALCAM). Bulionul Fraser este un mediu asemntor mediului UVM, dar conine clorura de litiu i citrat de fier. nnegrirea mediului indic posibila prezen a bacteriilor din genul Listeria.

TEHNICI DE IZOLARE Izolarea bacteriei Listeria monocytogenes se realizeaz adesea pe geloza Oxford sau PALCAM. Geloza Oxford conine amidon, esculin i citrat de fier. Selecia se datoreaz clorurii de litiu
Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

i amestecului de inhibitori CCCFA (cicloheximid, colistin, cefotetan, fosfomicin, acriflavin). Dup o perioad de termostatare de 24-48 h la temperatura de 37C, Listeria monocytogenes formeaz colonii verde-oliv cu halou negru. Adaosul de CCCFA poate fi nlocuit de un amestec de colistin i moxalactam. Geloza PALCAM conine glucoz, amidon, manitol, esculin i citrat de fier. Selecia este datorat prezenei clorurii de litiu i inhibitorilor: ceftazidin, polimixin i acriflavin. Dup o perioad de termostatare de 24 h la temperatura de 37C, Listeria monocytogenes formeaz colonii verde-oliv cu halou negru. Aceste medii sunt foarte selective, dar pe ele pot crete stafilococi i enterococi (colonii galbene datorate fermentaiei manitolului din mediul PALCAM). Se pot utiliza i alte medii: geloz Mac Bride cu feniletanol i cicloheximid; geloz cu snge suplimentat cu acid nalidixic, polimixin i ramnoz; geloz Despierre, geloz cu snge sau geloz Columbia sau tripticaz soia coninnd acid nalidixic, polimixina i ramnoz; geloz nutritiv cu acridin i acid nalidixic, care conine n plus tiamin; geloz LCA (geloz inima-creier coninnd clorura de litiu, glicin i ceftazidin).

TEHNICI DE IDENTIFICARE Identificarea este realizat dup repicare timp de 24 h la temperatura de 35-37C pe o geloz TSYEA. Pe acest mediu coloniile sunt mici (1-2 mm), translucide i cu margini neregulate. Folosind un fascicul luminos oblic (lumin alb; unghi 45) coloniile apar albstrui i granuloase (testul de iluminare Henry). Bacteriile din genul Listeria sunt bacili mobili, aero-anaerobi, catalazo +, oxidazo -. Principalele caractere biochimice studiate pentru identificarea genului sunt: VP (+), RM(+), indol (-), ureaz (-), H2S (-) etc. Geloza cu esculin este inoculat prin nepare i termostatat timp de 48 h la temperatura de 37C. Speciile genului Listeria i, n particular, L. monocytogenes, dau un rspuns pozitiv (culoare neagr). Caracterul hemolitic este studiat cu testul Camp. Tulpinile de studiat se inoculeaz prin metoda striilor pe o geloz cu snge de oaie i, perpendicular pe acetia, se inoculeaz o tulpin de S. aureus i de Rhodococcus equi. L. monocytogenes i L. seeligeri produc hemoliza cu S. aureus, n timp ce L. ivanovii produce hemoliza cu R. equi. Pentru identificare rapid se pot utiliza urmtoarele teste: API Listeria (Biomerieux), ID32 (Biomerieux), Micro ID (AES), sistemul VITEK Biomerieux (VITEK GPI), etc.
Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Pentru detectarea i identificarea speciilor genului Listeria se folosesc i metode imunologice: imuno-analiza ELFA (Vidas Biomerieux): identificarea genului Listeria i L. monocytogenes kit-ul TECRA (3M) de detectare imunologica prin microplci pentru Listeria; imunofluorescen cu anticorpi fluoresceni (Difco) poli Listeria; Liste Test (AES): mbogire prin captur imunomagnetic i confirmare imunoenzimatic dup izolarea n plac Petri i replicare pe membran (numrare n 24h); Listeria Micro ID Listeria (Organon-Technika); Kit Transia utiliznd microplci (ELISA sistem "sandwich"); Listeria Tek Elisa (Sistem Organon Technika/AES); Clearview Listeria test (Unipath); Assurance IA pentru Listeria (Biocontrol). n tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile bacteriilor din genul Listeria. Tabelul 1 Caracteristicile bacteriilor incluse n genul Listeria
L. monocytogenes

-hemoliz Testul Camp (S. aureus) Testul Camp (R. equi) Nitrat reductaz Amidon Ramnoz Xiloz Manitol Hipurat

+ + -

L. grayi

Caracteristica

V -

+ + + +

+ + + +

+ + V +

+ + V N + V

V N V + V

V - Variabil N - Nedeterminat
Pag 3

L. welshimeri

L. seeligeri

L. innocua

L. ivanovii

L. murrayi

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL BACILLUS Bacillus cereus

Bacteriile aparinnd genului Bacillus sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de form cilindric, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate n unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanuri. Sporii nu se coloreaz prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal dect al celulei, fiind poziionai central sau terminal. Aptitudinea de a sporula poate fi pus n evidena prin testul termorezistenei (10 min la temperatura de 80C). Bacteriile genului Bacillus sunt catalazo+, aerobe sau anaerobe. Se clasific n funcie de morfologia sporului studiat prin examen microscopic sau n funcie de mai multe criterii, care includ caracterul respirator sau fermentativ, termofilia, etc. Dac se ine cont de forma i dispunerea sporului, se disting urmtoarele grupe: grupa 1: spori ovali nedeformani, cu perete subire (ex. Bacillus subtilis); grupa 2: spori ovali deformani cu perete subire (B. stearothermophilus i B. polymyxa); grupul 3: spori sferici deformani (B. pasteurii, B. sphaericus), grup subdivizat n 6 subgrupe. Dac se consider ansamblul caracterelor, dup Priest, se definesc urmtoarele grupe: grupa I sau grupa B. polymyxa: specii cu spori de tip 2, metabolism facultative anaerob cu fermentaie acid (include B. alvei, B. circulans, B. macerans etc.); grupa II sau grupa B. subtilis: specii cu spori de tip 1, metabolism aerob cu fermentaie acid; grupa III sau grupa B. brevis: specii cu spori de tip 2, metabolism strict aerob; grupa IV sau grupa B. sphaericus: specii cu spori de tip 3; grupa V sau grupa Bacillus thermophilus: specii cu spori de tip 2 (include B. coagulans, B. stearothermophilus).

TEHNICI DE IZOLARE
Izolarea i numrarea bacteriilor sporulate aerobe se pot aplica fie formelor sporulate singure, fie ansamblului de forme vegetative i sporulate, astfel nct, de multe ori se realizeaz doar izolarea sau numrarea. Principiul de selecie al formelor sporulate este bazat pe proprietile de termo-rezisten ale sporilor i pe caracterul aerob sau aero-anaerob al celulelor vegetative. Proba plasat ntr-o eprubeta este supus unei nclziri de 10 min pe baie de ap, la o
Pag 1

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

temperatur de 70-80C. Aceasta servete apoi la efectuarea unei serii de diluii destinate numrrii bacteriilor pe mediu cu geloz, n plci Petri. n unele cazuri particulare tratamentul termic se poate face prin meninere timp de 10 min la temperatura de 100C. n acest caz, sporii supravieuitori corespund speciilor termorezistente. Mediul de izolare i de numrare al bacteriilor sporulate aerobe selectate prin tratament termic nu trebuie s fie specific, deoarece, practic, sporii de bacterii din genul Bacillus, care au rezistat tratamentului termic i pot apoi s se dezvolte n condiii aerobe, nu mai au concureni. n continuare, este necesar s se utilizeze un mediu bogat, care s favorizeze germinarea sporilor. Uneori, sporii manifest fenomenul de repaus, ceea ce genereaz o ntrziere a dezvoltrii lor. Fenomenul este limitat prin adugarea n mediu a amidonului, compus care poseda proprieti de stimulare a germinrii i de detoxificare. Pentru numrare sau izolare pe mediu solid, cel mai frecvent folosite sunt geloza glucozat coninnd BCP sau laptele gelozat, aceste dou medii fiind mbogite cu 0.2% amidon solubil. Geloza nutritiv obinuit cu glbenu de ou permite diferenierea speciilor lecitinazo + i -. Termostatarea difereniat a mediilor permite selecionarea urmtoarelor grupe de bacili: bacili mezofili (termostatare la temperatura de 30C) i bacili termofili (termostatare la temperatura de 55C). Numrarea n mediu lichid pe bulion glucozat cu BCP sau bulion TSB (bulion tripton soia) este mai puin specific, fiind urmarea unui anumit grad de anaerobioz care poate s existe la baza eprubetelor. Pentru numrarea formelor vegetative (numrare realizat pentru anumite specii) trebuie s fac apel la medii mai selective sau de difereniere. Mossel a descris un mediu de izolare pentru Bacillus cereus, care este bazat pe prezena manitolului, clorurii de sodiu, roului de fenol, glbenuului de ou i polimixinei. Coloniile de Bacillus cereus sunt rugoase, uscate, roz (manitol -) i nconjurate de un halou albicios (produi de hidroliz insolubili formai pornind de la lecitin). Alte medii se bazeaz pe un principiu asemntor (geloz manitol - glbenu de ou - polimixina MYP). Mediul PEMBA (polimixina - glbenu de ou - manitol - albastru de bromtimol - agar), mediu selectiv pentru B. cereus, poate fi i el utilizat: B. cereus formeaz colonii albastre, dantelate, nconjurate de un precipitat de glbenu de ou. Mediul Reuter conine piruvat, tiocianat, actidion i glbenu de ou.

TEHNICI DE IDENTIFICARE
Capacitatea de sporulare Bacilii sunt caracterizai prin capacitatea de sporulare i prin producere de catalaz. Prezena sporilor poate fi pus n eviden direct prin examinare microscopic a unui frotiu colorat prin metoda Gram. Acetia se prezint sub forma de particule endocelulare, sferice sau ovale, necolorate i alunecoase. n toate cazurile poate fi realizat o colorare
Pag 2

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

specific. Capacitatea de sporulare poate fi pus n eviden i prin testul de termorezisten: o cultura n vrst de 3-10 zile, inoculat pe un bulion nutritiv obinuit coninnd 0.004% sulfat de mangan (agent ce favorizeaz sporularea), este supus timp de 10 min la nclzire pe baie de ap la temperatura de 80C. Cultura este apoi inoculat prin nepare pe un bulion nutritiv i termostatat la temperatura de 30C, timp de 2-3 zile sau mai mult. Dac exist dezvoltare microbian, se presupune c a existat sporulare, doar cteva specii rare nesporulate sunt capabile s reziste acestor condiii; aceasta presupunere trebuie confirmat ntotdeauna printr-un examen microscopic, eventual cu o colorare specific. Diverse alte medii favorizeaz sporularea: mediul Duncan i Strong, mediul Ellner, mediul Schaeffer, mediul glucozat obinut cu carne fiart, mediul SEC, etc. Pentru caracterizarea sporilor sunt utilizate mai multe colorri specifice, dintre care citam doar dou: metoda Moeller modificat - preparatul uscat este fixat n alcool. Frotiul se acoper cu cteva picturi de acid cromic 5%. Dup 10 min de contact i dup o splare abundenta cu ap, lama este acoperit cu fucsina i este nclzit uor la flacra unui bec Bunsen, pn la evaporare. Operaia de colorare se repet de doua ori. Frotiul este apoi decolorat cu alcool absolut, apoi cu acid clorhidric 1/3, dup care este splat cu ap. Frotiul este apoi recolorat cu cteva picturi de albastru de metilen diluat timp de 30 s. Dup splare, lama este uscat i conservat. Sporii sunt colorai n rou i corpul bacterian n albastru; metoda Bartholomew i Mittwer - frotiul fixat termic (20 de treceri ale lamei prin flacr) este colorat timp de 10 min cu ajutorul unei soluii apoase, saturate, de verde malahit, apoi splat rapid, timp de 10 min, cu ap rece. Frotiul este recolorat cu safranin 25% timp de 15 min, apoi este splat rapid cu ap, uscat i examinat. Sporii sunt colorai n verde, iar corpul bacterian n rou. Aceast metod este mai practic, dar este mai puin sigur dect precedenta. Caractere fiziologice n afara de prezena i morfologia sporului, identificarea se bazeaz pe urmtoarele caractere (termostatarea are loc la temperatura de 30C timp de 24 h sau mai mult): termorezistenta sporilor - dup cultivare pe un mediu de sporulare, se compar numrul sporilor care rezist la un tratament de 10 min la temperatura de 80C i la un tratament de 5 min la temperatura de 95C. Se spune c sporii sunt termorezisteni dac se observ o diferena mai mic de dou reducii decimale ( Iog10N < 2); cnd sunt sensibile, diferena depete 5 ( log10N > 5); tipul respirator - este studiat prin inocularea unei geloze profunde VF sau pe mediu glucozat n anaerobioz. Acest test const n inocularea unui bulion cu extract de drojdie i glucoza (YG) dintr-o eprubet, dup regenerare. Suprafaa mediului se acoper cu un strat de parafin lichid. Dup termostatare se observa dezvoltarea.
Pag 3

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

fermentarea glucidelor - studiul fermentrii glucidelor este bine s se realizeze pe un mediu gelozat pentru studiul fermentaiilor, specific bacteriilor. Acest mediu nu conine pepton (mediu semisintetic). Dup introducerea glucidului (0.5%) n mediile fluidificate, eprubetele sunt aezate n poziie semi-nclinat. Dup solidificarea mediilor, acestea sunt inoculate prin striere i prin nepare n zona centrala. Utilizarea glucidelor se manifesta prin virajul culorii indicatorului. Glucidele testate sunt glucoza, arabinoza, xiloza i eventual lactoza, manitolul, ramnoza, celobioza i zaharoza. De asemenea, este posibil s se utilizeze bulion nutritiv adiionat cu 0.004% rou de fenol n care se introduce un tub Durham. Acest ultim test permite studierea acidifierii i producerii de gaz. acidificare pe mediul glucoza amoniu - un mediu coninnd glucoza, amoniu ca singur sursa de azot i un indicator de pH (mediu Knigh i Proom) este inoculat, termostatat i examinat; ntrzierea creterii ca urmare a prezentei glucozei - pe mediul peptonat, prezena glucozei inhib parial creterea anumitor specii. Dou medii cu geloz nutritiv obinuit, unul cu glucoz (1%), altul fr glucoz, se repartizeaz n plci Petri, dup care se inoculeaz prin nepare i se incubeaz. Se observ diferenele dintre culturi; hidroliza cazeinei - este pus n evidena n mod clasic pe geloz cu lapte; hidroliza gelatinei - se studiaz printr-o metod clasic (Frazier); hidroliza lecitinei - este studiat n mod clasic, prin inocularea unei geloze nutritive obinuite cu glbenu de ou (10%) sau pe mediu McLung. Acest mediu termostatat n anaerobioz permite diferenierea bacteriilor Bacillus i Clostridium prin reacia LV legat de haloul caracteristic obinut: tulpinile LV+ formeaz precipitat i o zon luminoas (reacia Nagler la lecito-vitelina); hidroliza amidonului - este pus n eviden, n mod clasic, pe geloz nutritiv obinuit coninnd 10 g/l amidon solubil, n plci Petri; producerea de acetoin (test Voges Paskauer: VP) - este evideniat prin reacia O'Meara dup o perioad de 2-10 zile de cultivare pe mediul Smith; comportamentul faa de temperatur, pH i clorura de sodiu acest studiu este realizat pe bulion nutritiv sau geloz nutritiv obinuit. Culturile sunt testate la temperatura de 60C, pH 6 i la temperatura de 65C, pH 7, n prezena a 10% clorur de sodiu; alte testri: cultivare pe lapte turnesolat; producere de indol; reducere de nitrai; utilizarea citratului; evidenierea ureazei. Aceste ultime teste sunt realizate cu medii i metode clasice.

Pag 4

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL CLOSTRIDIUM Clostridium perfringes

Bacteriile aparinnd genului Clostridium sunt bacterii Gram +, mobile, cu celule de form cilindric cu dimensiuni mai mari dect cele din genul Bacillus, singure sau n lanuri, care formeaz endospori dispui central sau terminal, care dau celulelor form de suveic sau palet. Reprezentanii genului Clostridium sunt catalazo - i sunt strict anaerobi. Totui, cteva specii rare sunt aero-tolerante.

TEHNICI DE IZOLARE
Tehnici generale Bacteriile sporulate anaerobe sunt cultivate pe medii foarte reductoare, cum ar fi mediul VL sau VF (lichid sau semi-solid) sau chiar pe medii lichide protejate de oxigenul din aer printr-un strat de parafin: mediu Rosenow simplu sau cisteinat, eventual adiionat cu amidon, sau mediu RCM (Reinforced Clostridium Medium sau mediul Hirch i Grinsted). Acest ultim mediu este folosit ca diluant pentru operaia de numrare. Principiul de izolare i numrare al bacteriilor din genul Clostridium este foarte apropiat de cel indicat pentru bacteriile genului Bacillus. n afara de termorezistena sporilor, selecia este bazat pe cultivarea n anaerobioza strict (sau n mediu foarte reductor). Sunt utilizate tehnicile clasice de cultivare n anaerobioz: condiiile de anaerobioz trebuie respectate att pentru cultivri, ct i pentru diluri. Temperatura de termostatare variaz ntre 30 i 37C, n cazuri particulare fiind mai mare. Pentru numrare se utilizeaz fie tehnica pe mediu lichid sau solid n eprubet, folosind un mediu reductor sau protejat de parafin, fie tehnica de numrare pe mediu solid n plci Petri, termostatate n anaerobioz. Aceasta ultima metod este preferabil, deoarece faciliteaz prelevarea coloniilor izolate pentru studiile ulterioare. Selecia formelor sporulate este realizata prin nclzire timp de 10 min la temperatura de 80C. Cnd termorezistena sporilor este sczut sau cnd se dorete s se tin cont de celulele vegetative, nu este posibil utilizarea acestei tehnici. n acest caz, va trebui s se foloseasc medii coninnd compui inhibitori specifici, permind astfel dezvoltarea speciilor de Clostridium (de ex. antibioticele). Sporii tuturor speciilor de Clostridium pot fi izolai i numrai dup nclzirea necesar realizrii seleciei, prin inoculare n mediul
Pag 5

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

RCM gelozat (geloz Hirch i Grinsted) adiionat cu amidon i repartizat n eprubete sau plci Petri (n acest caz, termostatarea trebuie s aib loc obligatoriu n mediu anaerob). Pentru numrri n medii lichide se poate utiliza mediul Rosenow sau alte medii lichide enunate mai sus. Izolri specifice Exist medii de izolare relativ specifice pentru grupele de Clostridium, adaptate sporilor i, uneori, celulelor vegetative. Sporii de Clostridium sulfito-reductori pot fi izolai i numrai utiliznd medii coninnd sulfit. Cea mai bun concentrate de sulfit pe care trebuie s o conin mediul este de 0.05%, nsa ea elimin unele specii sulfito-sensibile. Mediul Wilson Blair pentru Clostridium permite punerea n eviden a sulfito-reductorilor, care formeaz colonii negre. Metoda este aplicat dup realizarea pasteurizrii. Dup inocularea mediului fluidificat i omogenizare prin rsturnare, eprubeta este rcita imediat, prin imersie n ap rece, i termostatat la o temperatura de 37C, timp de 24-48 h. Pentru aceasta numrare este posibil s se utilizeze geloz VF sulfit. Exist medii bazate pe acelai principiu, care sunt specifice pentru Clostridium perfringens i care, prin compoziia lor chimic, permit evitarea pasteurizrii i selecionarea deodat a formelor vegetative i a sporilor. Este vorba de mediul TSN Marshall cu neomicina i polimixin, care este termostatat la temperatura de 46C, mediul SPS Angelotti cu polimixin i sulfadiazin, care este termostatat la temperatura de 37C, sau de mediul TSC triptoz - sulfit - cicloserin, care este termostatat la temperatura de 46C. Termostatarea se efectueaz n anaerobioz (eventual, cu mbogire de CO2): coloniile colorate n negru sunt colonii prezumtive de Clostridium perfringens. Se poate confirma apartenena la specie prin teste simple: nitrat reductazo +, lactozo+, gelatino+. Confirmarea se poate face repicnd coloniile pe geloza Willis i Hobbs cu ou, plasat ntr-o plac Petri, pe a crei jumtate din suprafa se depun cteva picturi de ser anti Clostridium perfringens (6000 uniti/ml). Coloniile care nu se vor dezvolta pe mediul adiionat cu toxine sunt desigur Clostridium perfringens.

TEHNICI DE IDENTIFICARE
Identificarea lui Clostridium este bazat pe studiul morfologiei sporilor i caracterelor biochimice. Termostatarea are loc obligatoriu n mediu reductor sau n anaerobioz, n general la o temperatura de 30-37C timp de 24-48 h. Unele specii trebuie termostatate la temperaturi superioare. Nu mai precizam c aceasta cultur trebuie s aib loc n anaerobioz, deoarece acest fapt nu mai este necesar, ca urmare a puterii reductoare a mediului utilizat. Mediile studiate sunt inoculate pornind de la o cultur pe mediu lichid reductor, de exemplu bulion VL sau VF , coninnd cistin (sau pe mediu Rosenow).

Pag 6

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Aciunea pe mediu Rosenow Acesta este un mediu lichid reductor recomandat pentru cultivarea bacteriilor anaerobe. Conine, printre altele, pepton, glucoz, un indicator colorat, un fragment redus de creier i o bucic de marmura alb. Dup o regenerare de 15 min realizat pe baie de ap la fierbere i rcire, mediul este inoculat i acoperit cu un strat de parafin steril, care asigur anaerobioza. Dup o termostatare de 24 h sau mai mult, examinarea acestui mediu permite studierea urmtoarelor caracteristici: fermentaia glucozei se indic prin virajul indicatorului de la roz la rou: acest viraj trebuie s fie observat la nceputul cultivrii. Virajul indicatorului la verde indic prezena bacteriilor reductoare; producerea de gaz se indic prin deplasarea dopului de parafin; puterea reductoare se manifest prin decolorarea mediului. Mobilitatea Mobilitatea este observat ntre lam i lamel, pornind de la o prelevare efectuat din mediul Rosenow. Prelevarea trebuie efectuat la formarea biomasei de celule, iar examinarea trebuie realizat rapid, deoarece contactul cu aerul inhib rapid mobilitatea. Morfologia sporului Morfologia sporului este studiat prin examen microscopic pe un frotiu colorat Gram sau prin colorarea specific a sporilor. Examenul poate fi realizat pornind de la o cultur mai veche obinut n mediul Rosenow. Sporularea nu intervine n toate mediile. Sporii nu se formeaz uneori dect pe medii uor alcaline. Unele bacterii sporuleaz greu n mediu artificial: este cazul lui Clostridium perfringens care trebuie cultivat pe ser din carne de cal cu 0.5% extract de came i 0.1% sulfat de magneziu. Hidroliza gelatinei Hidroliza gelatinei este studiat utiliznd un disc de gelatin Kohn cu crbune, care se plaseaz pe mediul Rosenow. Dup termostatare, degradarea gelatinei este indicat de eliberarea particulelor de crbune. Anaerobioza se obine cu ajutorul unui strat de parafin. Se poate efectua experimentul i ntr-o placa Petri, n anaerobioz, folosind geloza Columbia mbogit cu albumin seric bovin. Aciunea asupra laptelui cu cistein Cultivarea este realizat n eprubete cu lapte cisteinizat dup regenerare. Nu este absolut necesar s se parafineze eprubetele. Dup termostatare, se examineaz aspectul laptelui i se remarc urmtoarele: coagulare (+/-); retracia coagulului (+/-); coagul alveolar (+/-); peptonizarea eventual a coagulului; peptonizarea fr coagulare.
Pag 7

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Studiul fermentaiei glucidelor Acest studiu este realizat cu ajutorul medii lor VL, VF sau TY semisolide. Mediul este regenerat nainte de folosire i se completeaz cu unul din urmtoarele glucide, adugate n proporie de 1%: maltoz, lactoz, zaharoz, manitol, xiloz, glicerol, amidon i eventual ali compui. Nu este necesar parafinarea acestui mediu reductor, cu condiia ca el s aib o suprafa de contact cu aerul extrem de redus (eprubet mic). Dup 24 h sau mai mult de termostatare la temperatura de 37C, se introduc n mediul de cultur 10 picturi dint-un indicator de pH, pentru a sesiza dac exista aciditate sau nu. Cu indicatorul universal Prolabo, acidifierea este indicat de virajul n rou al mediului, cnd cantitatea de acid este mare, sau n galben, cnd cantitatea produs este mic. Este recomandat s se inoculeze i o eprubet fr glucid, ca martor. Producerea indolului Este pus n eviden prin cultivarea pe mediu VL sau VF semisolid n eprubete, apoi prin caracterizare cu reactivul Kovacs sau Ehrlich. Inocularea mediului este realizat n mas, dup regenerare, dar fr amestecare, astfel nct inoculul s rmn pe fundul eprubetei, sau prin nepare central profund. Producerea hidrogenului sulfurat i evidenierea caracterului sulfito-reductor Producerea de H2S este pus n eviden pe mediul VL (sau VF) semisolid sau solid, mbogit cu 0.2 g/l sulfat feros i cu 0.3 g/l hiposulfit de sodiu. Producerea hidrogenului sulfurat provoac nnegrirea mediului. Se pot utiliza geloze "sulfit" sau "sulfit-fier". Caracterul hemolitic Caracterul hemolitic este determinat prin inocularea pe suprafaa unui mediu solid mbogit cu 10% snge de oaie sau de cal defibrinat sau cu citrat, care este apoi termostatat, n anaerobioz, la temperatura de 37C. Producerea acetoinei Acetoina este evideniat dup cultivare pe mediu lichid VL (sau VF) prin reacia Voges Proskauer. Pe mediul gelatina-lactoz, dup 24 h de termostatare la temperatura de 37C, prezena gazului, acidifierea (nglbenirea) i lichefierea gelatinei sunt puse n eviden pentru C. perfringens.

TEHNICI DE EVIDENIERE A TOXINELOR


Enterotoxina de Clostridium perfringens Enterotoxina produs de Clostridium perfringens (CPE) poate fi pus n evidena prin aglutinare pasiv pe reversul particulelor de latex: PET-RPLA (Oxoid).

Pag 8

MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Exist o metod indirect de detectare a enterotoxinei de Clostridium perfringens (tip A) prin titrarea -hemolizinei (toxina sau fosfolipaz C). Aceasta toxin este stabil la frig i rezistent n condiiile n care celulele mor (congelare). Concentraia se poate considera direct proporional cu numrul de bacterii productoare. Se mojareaz, timp de 2 min, 5 g de aliment n 100 ml de tampon HEPES. Dup centrifugare timp de 10 min la 20 000 rpm la temperatura de 5C, supernatantul este filtrat (pori de 0.45 rn) apoi dializat fa de polietilenglicol 20 000. Dializatul este diluat binar n proporie de 1/256 n clorura de sodiu 0.85%. Se realizeaz un martor prin amestecarea a 0.25 ml de dializat, 0.25 ml de clorur de sodiu 0.85% i 0.1 ml antitoxina . Hemoliza este pus n eviden pe o geloz cu snge, n care se fac decupaje de 3 mm diametru. Din fiecare eantion se introduce o cantitate mic n decupaje i dup 24 h de termostatare la temperatura de 35C, se examineaz apoi hemoliza: martorul mbogit cu antitoxina a trebuie s fie negativ. Se poate evidenia activitatea lecitinazei pe eantioanele rmase, adugnd un volum de glbenu de ou (n clorura de sodiu 0.85%). Dup 20 min de centrifugare la 14 000 rpm la temperatura de 5C i filtrarea supernatantului, activitatea lecitinazei se manifest prin limpezirea mediului (martorul mbogit cu antitoxina d o reacie negativ).

Pag 9