DETERMINACION DE LACTOSA EN QUESOS

I. INTRODUCCIN La lactosa es el nico glcido libre que existe en cantidades importantes en todas las leches, es tambin el componente ms abundante, el ms simple y la ms constante en proporcin. El contenido de lactosa en la leche vara entre 3.6 y 5.5% . El contenido de lactosa en el queso fresco vara entre 3.6 y 5.5% . El contenido de lactosa en el queso maduro estar en funcin al tipo de queso. En la elaboracin del queso, parte de la lactosa queda en el queso y parte pasa al suero. Algunos grupos tnicos en el mundo no toleran este disacrido debido fundamentalmente a la ausencia de la enzima D galactosidasa llamada lactasa del jugo intestinal, es por esta razn que resulta importante su determinacin. En la presente prctica determinamos cuantitativamente el contenido de lactosa en queso fresco y queso madurado, por el mtodo espectrofotomtrico.

II. OBJETIVO

Determinar el contenido de lactosa en queso con un mtodo espectrofotomtrico

Alberto,Manuel,Leonel

III. BASE TEORICA 3.1 LACTOSA La Lactosa es un azcar que se encuentra en la leche y pertenece al grupo de los compuestos qumicos orgnicos llamados hidratos de carbono. Este disacrido se encuentra exclusivamente en la leche de los mamferos y est constituido por una molcula de galactosa y una de glucosa unidas por un enlace glucosdico -(1-4). El carbono anomrico de la glucosa est libre, lo cual hace a la lactosa un azcar reductor. Existe en forma y , y por lo tanto presenta el fenmeno de mutarrotacin. De los disacridos de importancia en alimentos, la lactosa es el azcar menos soluble y dulce. La estructura qumica se puede apreciar en la Figura 1.

Figura 1: Estructura molecular de la lactosa

La lactosa se utiliza en la industria de los alimentos por su poder adsorbente como agente base para retener sabores artificiales, aromas y colores y al igual que la maltosa se emplea en la panificacin ya que puede fcilmente interaccionar con protenas y producir pigmentos a travs de las reacciones de Maillard ( Alais, 1991)

El contenido de lactosa vara entre 3.6 y 5.5%. La lactosa es soluble en agua y se presenta como solucin molecular en la leche. (Manual de Industrias Lcteas 1996).

Alberto,Manuel,Leonel

Efecto de la temperatura: La lactosa es sensible al calor. Entre 110 y 130 C la forma hidratada pierde su agua de cristalizacin. Ms all de los 150C se torna amarilla y despus de los 170C tiene lugar un oscurecimiento pronunciado debido a la formacin de un caramelo. Sin embargo en la leche se observa que oscurecimiento sobreviene a temperaturas muy inferiores. En efecto, este fenmeno no se debe a una caramelizacin de la lactosa, sino a una reaccin del azcar con las materias nitrogenadas, que lleva consigo la aparicin de compuestos oscuros reductores llamados melanoidinas. Est reaccin de pardeamiento, muy compleja y an no bien conocida, catalizada por el hierro, cobre y los fosfatos se denomina reaccin de Maillard.

Efecto de los cidos (Hidrlisis) La lactosa puede ser hidrolizada por los cidos. La reaccin solo tiene lugar a altas temperaturas y cuando se trata de un cido fuerte, como el sulfrico o clorhdrico a concentraciones elevadas. Mientras que una disolucin al 5% de sacarosa se hidroliza a 75C en 20 minutos en presencia de un mililitro de cido clorhdrico concentrado, la misma disolucin de sacarosa requiere de 10 ml de cido a 90 C para ser hidrolizada en 1 hr con 30 minutos.

Figura 2: Cambios de la lactosa

Alberto,Manuel,Leonel

El poder edulcorante de la lactosa es aproximadamente del de la sacarosa o 1/5 de la fructosa y del de la glucosa. A diferencia de muchos otros azcares de los alimentos la adicin de lactosa no reduce la solubilidad de la sacarosa. Adems al incrementar la concentracin de lactosa, cambian los hbitos cristalinos tanto de la sacarosa como de la lactosa.

3.2 LACTOSA EN LECHE La leche desnatada o desgrasada contiene 4.5 - 5% de lactosa (y solo 4% de protena) no tiene marcado sabor dulce, ya que la lactosa es uno de los azcares con poco poder edulcorante. Segn Madrid, 1994 Tabla 1: Physical chemical status of cows milk Average Relative sizes Osmotic composition % (mm) pressure atm Lactose 3.6 - 5.5 4.8 10-6 10-7 3.3 Source: Dairy Processing Handbook. Published by Tetra Pak Processing Systems AB, S221 86 Lund, Sweden. pg. 35. Tsenkova, 1999. Reporta lo una cantidad mnima en la leche de 3.94% , una cantidad mxima de 4.74 % y como un promedio de 4.4% .

Degradacin de la lactosa

Durante el tratamiento trmico de la leche se produce la descomposicin de la lactosa.

Un compuesto que aparece en la leche tratada por el calor es la lactulosa, que puede utilizarse como ndice de calentamiento de la leche. As el contenido en lactulosa puede diferenciar entre leches pasterizada y esterilizada.

La lactulosa es algo ms que dulce y ms soluble que la lactosa; se considera que estimula el crecimiento de lactobacillus bifidus, y por lo tanto, es beneficiosa para dietas infantiles.
Alberto,Manuel,Leonel

Su sabor se modifica pues la lactoalbmina y la lactoglobulina coagulan. Tambin precipitan algunos compuestos con fsforo, Fermentacin

Son muchos los microorganismos que metabolizan la lactosa como sustrato y la utilizan dando lugar a compuestos de menor masa molecular.

Las fermentaciones que producen cido lctico son las ms importantes para la industria lctea, pero hay otras fermentaciones que tiene tambin importancia considerable.

La fermentacin propinica se lleva a cabo por accin de las bacterias del gnero Propionibacterium, que fermentan el cido lctico a cido propinico, cido actico, CO2 y agua. Esta fermentacin es tpica de algunos tipos de quesos, siendo el proceso responsable de la aparicin de los caractersticos ojos.

Tradicionalmente, se ha considerado que la lactosa favorece la retencin de Ca, por lo que estimula la dosificacin y previene la osteoporosis. Acta interaccionando con las vellosidades intestinales, sobre todo a nivel del fleo, incrementando su permeabilidad al calcio. Sin embargo, en los adultos el inters nutritivo de la lactosa tiene an reservas a causa de los problemas de intolerancia. El origen de esta intolerancia se encuentra en el dficit de galactosidasa.

3.3. LACTOSA EN QUESO FRESCO y MADURADO Durante el proceso de elaboracin de queso la lactosa se transforma en cido lctico, producto de la fermentacin generada por la microflora , esto ocurre durante el proceso de coagulacin, moldeado , prensado y maduracin. Posteriormente a las dos semanas despus tambin se generan otros componentes como: cido actico, alcohol
Alberto,Manuel,Leonel

etlico,

acetona,

anhdrido

carbnico,

diacetilo,

cido

succnico

frmico.

(Veisseyre,1980)

BOUZAS, 1993. Estudi la influencia del tiempo y temperatura en los indicadores de envejecimiento de qumico para queso cheddar comercial, y reporta la variacin de la concentracin de lactosa y produccin de cido lctico durante la maduracin es en los primeros 10 das a 12 y 24C respectivamente , Esto se atribuye a las concentraciones de sal y al desarrollo de bacterias no starter , como el lactobacilli y pediococci afectan la proporcin de metabolismo de lactosa.

BOUZAS,

1993. Desarrollo expresiones

predictivas para los indicadores

qumicos( protelisis, lactosa, cido ctrico, cido lctico, acidez total, cido actico, cido propinico, cido butrico y cido isovalrico) maduracin tal como se puede observar en la Tabla 2. del queso cheddar durante la

Tabla 2: Expresiones matemticas para los cambios qumicos durante la maduracin de queso cheddar Componente Coeficientes Temperatura (C) 6 Y= YO+KO t exp(b/T) Protelisis Ko = 1.79 x 10 14 b = -5315 Y= YO exp(kt) Lactosa Ko = -0.3194 15 Y= YO exp(ko t exp (b/T) cido ctrico Ko = -1.09 x 1016 12 b = -12108 Y= YO+A(1- exp(kt)) cido lctico A = 2.87 12 - 25 K= -0.2848 Y= YO+A(1- exp k0 t (exp Acidez total A = 7651 25
Alberto,Manuel,Leonel

(b/T))) Y= YO exp(a t exp (c/T) cido actico cido propinico cido butrico Acido isovalrico

K0= -4.39 109 a = 5.21 1010 c = -8222 a = 1.8 1011 c = -8502 a = 1.64 1012 c = -9407 a = 4.5 108 c = -6831 25 25 15 25

Yo = concentracin inicial (dry basis) de lactosa y cido en nmoles/100g; proteolysis en nmoles glycina/100g; acidez total en g cido lctico/100g. T = Temperatura absoluta. t = tiempo (das) K0 = concentracin/ da, para orden cero Ko = da / para orden cinco b = constant , K k = constante de reaccin , 1/da A = constante, unidades de concentracin c = constante, k a = constante 1/ da DAIGLE (1998). Report que los quesos producidos con bifidobacterium no ha

producido cambios en la actividad metablica de las protenas y lactosa durante su maduracin, manteniendo sus propiedades organolpticas conforme de manera que la produccin de cido lctico ha sido creciente y el consumo de lactosa decreciente.

IV. FUNDAMENTO

El fundamento se basa en los efectos frente a la temperatura y cidos de la glucosa que en la siguiente Figura 3 podemos observar lo que sucede la lactosa, que primero se hidroliza y pasa al D- glucosa y esta glucosa en medio cido concentrado y calor ( el cido ataca en el carbono que tiene ms hidrgenos y se forma el 5- hidroximetilfurfural,
Alberto,Manuel,Leonel

este hidroximetilfurfural reacciona con el fenol en un medio cido concentrado (H2SO4) y temperaturas de 140C dndole la coloracin respectiva al 5- hidroximetilfurfural que es incoloro originalmente. El Zinc acta como disolvente del calcio y catalizador. En los monosacridos glucosa y fructuosa (que son una hexosa y una cetohexosa respectivamente) el carbono aldehdico y cetnico, acta como grupo reductor permitiendo diversas reacciones: un ejemplo de dichas reacciones es la de Mayllard, en la que estos azcares son uno de los substratos necesarios para desarrollarse pardeamiento no enzimtico. Toribio y Lozano,1984. Citado por Pelegrina, 1999.

Figura 3: Cambios de la lactosa hasta formar la coloracin

Alberto,Manuel,Leonel

V. MATERIALES Y METODOS Muestra quesos (fresco, madurado y otros) 5.1 MATERIALES Tubos de prueba. Gradilla Dispensador o pipeta de 5 ml. 1 ml. Fiolas de 100 ml. 1 fiola de 250 ml. Papel filtro.

Alberto,Manuel,Leonel

Embudo. Kitazato.

EQUIPOS - Licuadora - Bao Mara - Espectrofotmetro a 490 nm. - Bomba de vaco REACTIVOS Hidrxido de Sodio 0.5 M. Solucin de sulfato de zinc al 10%. Solucin acuosa de fenol al 5%. Acido sulfrico concentrado. Solucin de lactosa (1g/l lactosa monohidratada).

VI.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar entre 4.8 y 5.3 g de queso y llevarlo al vaso de la licuadora, aadir 20 ml. De hidrxido de sodio 0.5 M y aproximadamente 100 ml. de agua destilada. Licuar hasta que la muestra este dispersa. Transferir a una fiola de 250 ml, aadir 20 ml. de solucin de sulfato de zinc al 10% y agitar. Enrasar con agua destilada y filtrar, eliminar los primeros mililitros del filtrado.

2. Preparar soluciones estndar conteniendo 0, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, y 8,0 mg/100 ml. de lactosa por dilucin de la solucin stock estndar de lactosa conteniendo 1g/l, en fiolas de 100 ml.

3. Pipetear 1 ml. de cada una de las soluciones estndar en tubos de prueba y pipetear 1 ml. de la muestra filtrada. A cada uno de estos tubos aadir 1 ml. de la

Alberto,Manuel,Leonel

10

solucin de fenol y 5 ml. de cido sulfrico concentrado cuidando de que no caiga en las paredes del tubo.

4. Colocar los tubos en Bao Mara hirviendo por 5 min. Medir la absorbancia de cada uno a 490 nm.

VII. RESULTADOS Y DISCUSIONES 6.1 ANALISIS DE QUESO Los resultados del anlisis de las muestras podemos observar en la Tabla 3, resultados estos resultados proviene de los clculos previos (ANEXO). Tabla 3: Resultados de los anlisis de contenido de lactosa en muestras de queso por mtodo espectrofotomtrico a 490 nm. Muestra Peso (g) Absorvancia % de lactosa experimental Queso fresco 4.1081 1.135 0.72 Queso Edam 4.1214 0.514 0.214 Queso Edam 4.000 0.361 0.24 En cuanto a los resultados del contenido de lactosa en queso madurado Edam , presenta un resultado de 0.214 0.24 % , este valor es caracterstico del tipo de queso, por el tipo de proceso y tipo madurado que presentan cada una de ellas. Los resultados obtenidos muestran resultados bajos, estos resultados concuerdan con los trabajos realizados por Bouzas 1993, Daigle 1998. que muestran una tendencia de disminucin del contenido de lactosa durante el proceso de maduracin que ha sufrido cambios en cantidades referente a la cantidad existente en el queso fresco.

Para el resultados de queso fresco se cometi el error de realizar las diluciones ya que la lectura est fuera del rango y no se hizo la dilucin respectiva por que la muestra ya se haba desechado, se trabaj extrapolando los datos y obtenemos un resultado de 0.72% de contenido de lactosa en el queso fresco, este resultado depende de varios factores, como
Alberto,Manuel,Leonel

11

del tipo de coagulacin realizada al queso si es cida o enzimtica, obviamente si es cida la mayora de los minerales y otros se pierden en el suero caso contrario la prdida es menor. La modificacin en cantidades de lactosa tambin est influenciada por los tratamientos que pasa el producto desde la leche, pasteurizado, calentado, coagulacin, prensado, moldeado y madurado. Estos resultados si consideramos lo que inicialmente considera el contenido en la leche por Tsenkova,1999 4.4% y lo que reporta Bouzas,1999 en quesos madurados (Cheddar) 2 mm moles/100g , podemos decir que la lactosa sufre modificaciones desde la leche hasta el producto final procesado.

6.2 ABSORVANCIA DE LAS SOLUCIONES STANDART En la Tabla 4 se pueden apreciar los resultados de las absorvancias obtenidas para la construccin de la curva standart, como vemos los resultados presenta una distribucin casi homogneos con una pequea dispersin tal como podemos apreciar en la Figura 4.

Tabla 4: Resultados de Absorvancia de mg de lactosa por 7 ml para la CURVA ESTNDAR a 490 nm de longitud de onda
Solucin estndar (mg/100ml) mg lactosa/ 7 ml Absorvancia A Absorvancia B 0.05 0.005 0.112 0.037 1 0.01 0.07 0.041 4 0.04 0.398 0.299 6 0.06 0.54 0.63 8 0.08 0.693 0.726 Absorvancia C 0.05 0.078 0.369 0.621 0.725

Construccin de grfica standart para los resultados de la Tabla 4.

Alberto,Manuel,Leonel

12

CURVA PATRON A 490 nm

0.8

0.7

0.6
y= 9.4712x R2 = 0.9888

0.5 Absorvancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 m g de lactosa/m l solucin

Figura 4: Curva de absorvancia para cada concentracin de lactosa (curva patr)

De grfico anterior se obtiene la funcin del grfico Y = 9.4712X lactosa/7 ml) se construye la nueva grfica para la funcin.

X = (mg

Alberto,Manuel,Leonel

13

CURVA PATRON DE ABSORNACIA EN FUNCION DE CONCENTRACION DE LACTOSA A 490 nm

1.000

0.900

0.800

0.700

0.600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
mg Lactosa/7 ml

Figura 5: Curva de solucin standart de absorvancia en funcin de concentracin de lactosa.

Alberto,Manuel,Leonel

14

VIII. BIBLIOGRAFA

1. Alais Ch. "Ciencia de la leche; Principio de tcnicas lecheras" Compaa editorial continental, Barcelona, 1971 2. BOUZAS, J.et al . 1993. Time and temperature influence on chemical aging indicators for a commercial cheddar cheese. Journal Food Science .Volume 58, N 6 pag. 1307 1311 3. DAIGLE A. et all. 1999. production of probiotic cheese (cheddar like) using Enriched cream fermented by Bifidobacterium infantis. Jornal of dairy Sciencie Vol 82, N 6. pag. 1081 1091. 4. Madrid, A. 1994. Nuevo Manual de Lactologa Quesera. Editorial Mundiprensa Libros S.A. Espaa. 5. PELEGRINA A., Lozano J.1999, Desarrollo de color e Hidroximetilfulfural en zumos de fruta. Talleres de herramienta de calculo Universidad Politcnica de Valencia. 6. SOURCE: Dairy Processing Handbook. Published by Tetra Pak Processing Systems AB, S-221 86 Lund, Sweden. pg. 35. 7. TESENKOVA et al. 1999. Near Infrared Spectroscopy for Dairy Management: Measurement of Unhomogenized Milk Composition. Journal of Dairy Science vol 82, N 11. pag- 2344 2351.

Alberto,Manuel,Leonel

15

ANEXO

CALCULOS a. Para muestra de queso Edam 1 (4.1214g) Con la absorvancia leda ( 0.514) ubicamos en el grfico la coordenada de mg de lactosa que es de 0.0535 mg Cantidad de lactosa en los 250 ml de solucin (fiola) 1 ml -----------0.0535 mg lactosa 250 ml ----------X1 X1 = 8.825 mg lactosa 4.1214 g (4121.4mg) -------------100% 8.825 mg lactosa ---------------x2

X2 = 8.825*100 / 4121.4 = 0.214 % de lactosa en queso Edam

b. Para muestra de queso Edam 2 (4.0g) Con la absorvancia leda ( 0.361) ubicamos en el grfico la coordenada de mg de lactosa que es de 0.038 mg Cantidad de lactosa en los 250 ml de solucin (fiola) 1 ml -----------0.038 mg lactosa 250 ml ----------X1 X1 = 9.5 mg lactosa 4.0 g (4000mg) -------------100% 9.5 mg lactosa ---------------x2

X2 = 9.5*100 / 4000 = 0.24 % de lactosa en queso Edam (muestra2)

Alberto,Manuel,Leonel

16

Para la muestra de queso fresco Absorvancia = 1.135 , este valor est fuera del rango , pero por extrapolacin la concentracin de lactosa es de 0.118 mg/ ml 1 ml -----------0.118 mg lactosa 250 ml ----------X1 X1 = 29.5 mg lactosa 4.1081 g (4108.1mg) -------------100% 29.5 mg lactosa ---------------x2

X2 = 29.5*100 / 4108.1 = 0.72 % de lactosa en queso fresco

Alberto,Manuel,Leonel

17