INTRODUCCIN: El nitrgeno es un elemento qumico, de nmero atmico 7, smbolo N y que en condiciones normales forma un gas diatmico (nitrgeno diatmico

o molecular) que constituye del orden del 78% del aire atmosfrico. El nitrgeno (del latn nitrum -i y ste del griego , "nitro" -nombre que histricamente ha sido usado en forma vaga para referirse a diversos compuestos de sodio y de potasio que contienen nitrgeno-, y -geno, de la raz griega -, "generar") se considera que fue descubierto formalmente por Daniel Rutherford en 1772 al dar a conocer algunas de sus propiedades. Sin embargo, por la misma poca tambin se dedicaron a su estudio Scheele que lo aisl, Cavendish, y Priestley. El nitrgeno es un gas tan inerte que Lavoisier se refera a l como azote (zoe) que significa sin vida1 (o tal vez lo llam as por no ser apto para respirar2 ). Se clasific entre los gases permanentes, sobre todo desde que Faraday no consiguiera verlo lquido a 50 atm y -110 C, hasta los experimentos de Pictet y Cailletet que en 1877 consiguieron licuarlo. Los compuestos de nitrgeno ya se conocan en la Edad Media; as, los alquimistas llamaban aqua fortis al cido ntrico y aqua regia (agua regia) a la mezcla de cido ntrico y clorhdrico, conocida por su capacidad de disolver el oro. Por fijacin de nitrgeno se entiende la combinacin de nitrgeno molecular o dinitrgeno con oxgeno o hidrgeno para dar xidos o amonio que pueden incorporarse a la biosfera. El nitrgeno molecular, que es el componente mayoritario de la atmsfera, es inerte y no aprovechable directamente por la mayora de los seres vivos. La fijacin de nitrgeno puede ocurrir de manera abitica (sin intervencin de los seres vivos) o por accin de microorganismos (fijacin biolgica de nitrgeno). La fijacin en general supone la incorporacin a la biosfera de una importante cantidad de nitrgeno, que a nivel global puede alcanzar unos 250 millones de toneladas al ao, de las que 150 corresponden a la fijacin biolgica.

Ciclo del Nitrgeno: El nitrgeno es uno de los elementos ms abundantes en la superficie terrestre. En las plantas es el cuarto elemento ms abundante despus del C, H y O, siendo un macronutriente esencial que forma parte de biomolculas como protenas, cidos nucleicos, porfirinas y alcaloides.

La figura muestra los principales procesos e interacciones entre el nitrgeno de la atmosfera, el suelo y los seres vivos en lo que se conoce como ciclo biogeoqumico del nitrgeno. La litosfera dispone de la mayor reserva de N, sin embargo este nitrgeno mineral se encuentra atrapado en rocas gneas y tiene una escasa participacin en el ciclo del N. De esta forma es el N presente en la atmsfera (78%) la principal fuente de N que interviene en este ciclo. El proceso por el cual el N atmosfrico se reduce a amonio (NH3) se denomina fijacin de N y puede llevarse a cabo de forma industrial, a travs de la reaccin de Haber-Bosch, o biolgica, a travs de organismos fijadores de nitrgeno. La fijacin atmosfrica debida a descargas elctricas es poco relevante en cuanto al volumen de N fijado. La fijacin Biolgica de Nitrgeno (FBN) es el principal punto de entrada de N atmosfrico en el ciclo biogeoqumico. Una vez en la solucin del suelo, el amonio puede ser transformado en NO3- por las bacterias nitrificantes (nitrificacin) o ser tomado como tal por las plantas o microorganismos convirtindose en N orgnico. Las plantas pueden obtener el nitrgeno en forma de nitrato (NO3-) y amonio (NH4+). En algunos casos, las plantas pueden obtener el N a travs de la FBN formando asociaciones simbiticas con organismos fijadores de N.

Esta forma de adquisicin de N es especialmente importante dentro de la familia de las leguminosas. La transformacin de N orgnico en NH4+ se denomina mineralizacin. Este NH4+ puede volver de nuevo a la atmsfera mediante procesos de desnitrificacin. Organismos fijadores de Nitrgeno: Entre los seres vivos, los nicos capaces de llevar a cabo la fijacin de N son organismos procariotas. Estos organismos fijadores de N o diazotrofos llevan a cabo este proceso gracias al complejo enzimtico nitrogenasa que se encuentra exclusivamente en organismos procariotas y cataliza la siguiente reaccin: N2 + 16 ATP + 10 H+ + 8 e- 2 NH4+ + H2 + 16 Pi + 16 ADP Este complejo enzimtico es muy sensible al oxgeno. Sin embargo muchos de estos organismos presentan adaptaciones que les permiten fijar N en condiciones muy diversas. En primer lugar se debe distinguir entre organismos capaces de llevar a cabo la fijacin de N en vida libre y aquellos que establecen asociaciones simbiticas para llevar a cabo este proceso. Dentro de los organismos fijadores en vida libre podemos encontrar bacterias anaerobias estrictas, como Clostridium, y facultativas, como Klebsiela, pero tambin aerobias como Azotobacter, Beijerinckia y Azospirilum. Se encuentran tambin en este grupo, arqueobacterias como Methanosarcina y Methanococcus, bacterias fotosintticas como Rhodospirillum y Chromatium) y cianobacterias con (Oscillatoria y Gloeothece) y sin heterocistos (Nostoc y Anabaena). Entre los organismos fijadores en simbiosis debemos destacar por su importancia agronmica, los organismos que forman simbiosis con plantas leguminosas. Estos organismos pertenecen al subgrupo de las proteobacterias en el que se incluyen los gneros Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (recientemente includo en Ensifer) y se denominan genricamente rizobios. Tambin existen algunas simbiosis fijadoras de nitrgeno entre algunos gneros de plantas no leguminosas y otros organismos procariotas como el actinomiceto Frankia y las cianobacterias Nostoc y Anabaena. Dentro de los gneros que forman simbiosis con las leguminosas, el gnero Rhizobium forma ndulos con leguminosas de origen templado, presenta un crecimiento rpido en vida libre y los genes relacionados con la fijacin se encuentran en plsmidos. Por el contrario, el gnero Bradyrhizobium forma simbiosis con leguminosas de origen tropical, presenta un crecimiento lento en vida libre y los genes relacionados con la fijacin son cromosmicos. El resto de los gneros presenta caractersticas intermedias y una similitud entre el 93-96% respecto a los dos primeros gneros. En los ltimos aos se han descrito nuevos gneros capaces de establecer simbiosis y formar ndulos con leguminosas, algunos pertenecientes al grupo de las -

proteobacterias pero tambin algunos que se engloban en el grupo de las proteobacterias como Burkholderia y Ralstonia. Organismos fijadores de nitrgeno y grupos de plantas con los cuales establecen simbiosis: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Allorhizobium: leguminosas de origen templado y tropical Azorhizobium: Sesbania (Leguminosa) Frankia: Alnus, Casuarina, Myrica, Comptonia, Coriairia Nostoc: hongos, briofitos (Blasia), gimnospermas (Macrozamia) y angiospermas (Gunnera) Anabaena: pteridofitos (Azolla)

La capacidad para formar ndulos se ha observado en 3.400 especies de leguminosas que se encuentran en el 57% de los gneros de esta familia. Analizando las tres subfamilias de leguminosas por separado, podemos decir que la nodulacin en el caso de las Papilionoideas ocurre en el 99 % de las especies y en un 93 % de los gneros. En la subfamilia Mimosoideae, la nodulacin ocurre en el 97 % de las especies y en 88 % de los gneros. Por ltimo, bastante menos habitual es la formacin de ndulos en la subfamilia Cesalpinioideas, ya que ocurre slo en el 21 % de las especies y en el 5 % de los gneros (SPRENT, 2001). Es cierto que estos porcentajes de nodulacin se han obtenido cuando este aspecto no ha sido analizado en todos los gneros de cada subfamilia y por lo tanto podran variar en base a nuevas observaciones. Establecimiento de la simbiosis: El establecimiento de una simbiosis efectiva entre las leguminosas y los rizobios es un proceso complejo que implica mecanismos de sealizacin y reconocimiento por parte de ambos simbiontes. Las races de las leguminosas liberan flavonoides e isoflavonoides, compuestos fenlicos que inducen la expresin de los genes de nodulacin en el microsimbionte. Como resultado, los rizobios producen los factores de nodulacin, denominados factores nod. Estos factores nod inducen una serie de respuestas en la planta, que incluyen la deformacin de los pelos radicales, la divisin de las clulas corticales y la formacin del ndulo. La unin de los rizobios a los pelos radicales, la penetracin a travs de la epidermis y la invasin del tejido cortical a travs del cordn de infeccin son sucesos que estn acompaados del comienzo de actividad meristemtica en las clulas del crtex y el periciclo radicales y la supresin de las respuestas de defensa de la planta. La liberacin de rizobios del cordn de infeccin a clulas individuales del crtex se consigue mediante endocitosis, por lo que los rizobios se encuentran encerrados en una membrana de origen vegetal denominada membrana peribacteroidea o simbiosomal, que

les asla del citoplasma de la clula husped. Los rizobios se dividen activamente en las clulas infectadas y, quedan rodeados, individualmente o en grupos, por la membrana peribacteroidea. Antes de que se pueda llevar a cabo la FBN, es necesario un ambiente micro-aerbico en el interior de los ndulos, que permite la diferenciacin de los rizobios a bacteroides con capacidad para fijar nitrgeno. El tipo de flavonoides liberado por cada especie de leguminosa es especfico para activar los genes de nodulacin de una especie determinada de rizobio. La activacin de estos genes de nodulacin en las distintas especies de rizobios determina la sntesis especfica de factores nod (lipo-quitin-oligosacaridos). De esta forma, estos factores nod activan de forma especfica la respuesta simbitica en la leguminosa correspondiente. En la tabla siguiente se muestran algunos ejemplos de especificidad rizobio-leguminosa. Ejemplos de especificidad rizobio-leguminosa: Rhizobium leguminosarum phaseoli: juda Rhizobium leguminosarum trifolii: trebol Rhizobium leguminosarum viciae: haba, guisante, lenteja Sinorhizobium meliloti: alfalfa Sinorhizobium fredii: soja Mesorhizobium loti: lotus Mesorhizobium ciceri: garbanzo Bradyrhizobium japonicum: soja Bradyrhizobium japonicum sp. (Cowpea): cowpea, cacahuete Bradyrhizobium japonicum sp. (Lupinus): lupino

Patrones de desarrollo nodular: Adems de la especificidad rizobio-leguminosa que se establece en esta interaccin simbitica, podemos diferenciar dos variantes en el patrn de desarrollo de los ndulos en funcin de la planta husped. Por un lado, los ndulos de las leguminosas de climas tropicales y subtropicales se caracterizan por su crecimiento determinado y su forma esfrica. En este caso, no todas las clulas son infectadas por el cordn de infeccin, las infectadas, se dividen hasta conformar el ndulo mientras que las clulas no infectadas reciben el nombre de clulas parenquimticas.

Sin embargo, los ndulos de las leguminosas de climas templados son indeterminados, su forma es cilndrica y a menudo con ramificaciones. En este caso, lo que ocurre es que el cordn de infeccin llega hasta las clulas prximas al cilindro vascular y el proceso de infeccin perdura a lo largo de la existencia del ndulo (AZCN-BIETO & TALN, 2008). En la figura se muestra la morfologa de un ndulo indeterminado y un ndulo determinado.

Metabolismo nodular: El equilibrio establecido en los ndulos entre el metabolismo del carbono y nitrgeno determina el funcionamiento de esta estructura y, por lo tanto, el necesario aporte de nitrgeno para el crecimiento de la planta. En ndulos, la sacarosa procedente de la parte area de la planta es catabolizada, fundamentalmente, a travs de la actividad sacarosa sintasa, y los productos derivados de esta reaccin son metabolizados a travs de la glucolisis para suministrar esqueletos de carbono para la respiracin bacteroidal y la asimilacin de amonio. De esta forma, el nitrgeno fijado por la nitrogenada bacteroidal ser asimilado y exportado al resto de la planta para su crecimiento. La figura muestra un esquema de las principales rutas metablicas que tienen lugar en un ndulo.

La utilizacin de sacarosa implica la ruptura de su enlace glucosdico, que se lleva a cabo por las enzimas invertasa alcalina y sacarosa sintasa. La reaccin catalizada por la sacarosa sintasa es reversible, pero el enzima funciona principalmente en el sentido de degradacin de sacarosa, localizndose fundamentalmente en sumideros de carbono, como los ndulos. De esta forma, mediante el catabolismo de la sacarosa se obtiene una fraccin de hexosas fosfato interconvertibles que dirigen el flujo de carbono hacia la ruta glucoltica, as como hacia otras rutas metablicas, entre las que se encuentran la biosntesis de pared celular o almidn, y la ruta de las pentosas fosfato, ruta esencial para la biosntesis de intermediarios metablicos. Cuando la sacarosa es metabolizada a travs de la va glucoltica, se produce fosfoenolpiruvato como producto final de la misma. El fosfoenolpiruvato se metaboliza hasta oxalacetato mediante la accin del enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa. A continuacin el oxalacetato se convierte en malato, en una reaccin catalizada por el enzima malato deshidrogenasa. Los cidos dicarboxlicos constituyen la principal fuente de carbono para los bacteroides. El malato es el cido orgnico ms abundante en los ndulos y el sustrato preferente para la respiracin bacteroidal. La mayor parte del amonio fijado es transferido al citosol vegetal por difusin a travs de las membranas, aunque recientemente se ha presentado un modelo que propone que el bacteroide exporta nitrgeno en forma de aminocidos al citosol vegetal. El amonio es rpida y eficazmente asimilado en el citosol a travs del ciclo GS/GOGAT y de esta forma el gradiente de concentracin de amonio entre el citosol y el bacteroide es siempre muy alto, favoreciendo el transporte de amonio hacia el citosol vegetal. La glutamina es el aminocido que se utilizar despus como donador de nitrgeno para la sntesis del resto de compuestos nitrogenados y tambin como compuesto nitrogenado transportable al resto de la planta.

Compuestos nitrogenados exportados desde los ndulos al resto de la planta: En las leguminosas de origen templado el nitrgeno es exportado principalmente en forma de glutamina y asparagina, representando este ltimo entre un 60%-70% de total de compuestos nitrogenados exportados. Aunque la proporcin entre las distintas amidas puede variar, las leguminosas de origen templado exportan amidas independientemente de si obtienen el nitrgeno o no a travs de la FBN. Sin embargo, las leguminosas de origen tropical exportan amidas, glutamina y asparagina fundamentalmente, cuando crecen a expensas de una fuente de nitrgeno mineral y, sin embargo, al establecer una asociacin simbitica, estas especies pasan a sintetizar ureidos como compuesto para distribuir el nitrgeno al resto de la planta. Esta adaptacin metablica se interpreta como una optimizacin de la economa en el uso del carbono. Los ureidos presentan una elevada proporcin N/C, es decir, la sntesis de ureidos requiere menos carbono orgnico para sintetizar la misma cantidad de nitrgeno orgnico que las amidas y, por lo tanto, estos compuestos nitrogenados se consideran formas de transporte muy eficaces. Los ureidos proceden de las purinas sintetizadas en las clulas infectadas y la posterior oxidacin de estas purinas en las clulas no infectadas de la zona central del ndulo.