Evaluation de lefficacit de lavages appliqus aux des embryons aprs infection exprimentale par le srotype 8 (BTV-8) du virus de la fivre

catarrhale 8) ovine (FCO). 2011

Mohammed SEHNINE

RAPPORT DE STAGE : Master 1 Biologie de la reproduction

Du 04 Mars 20 Mai 2011 Dpartement R&D fertilit femelle -UNCEIAService de Fcondation in vitro

Matre de stage : Claire PONSART Tuteur : Brigitte LE GUIENNE

Anne universitaire 2010/2011

UNCEIA / LNCR / ASCEDIATE 13, rue de Jout -BP65- 94703 Maisons-Alfort, Cedex France Alfort,

Remerciements

Je tiens remercier normment mon matre de stage, Claire PONSART, et mon tuteur Brigitte LE GUIENNE, de lUNCEIA pour mavoir encadr et conseill tout au long de mon stage et de la rdaction de ce rapport de fin danne. Je voudrais aussi remercier lensemble du groupe de fertilit femelle de lUNCEIA et particulirement Laetitia CLEMENT, qui mont aid dans sa ralisation. Ses conseils et remarques restent toujours importants. Je remercier gravement mon collgue du bureau Agathe DECHERF de maccompagner durant tout la priode de stage. Je remercie Isabelle SPORTIELLO, documentariste de lUNCEIA pour mavoir aid lors de mes recherches bibliographiques. Je remercie lensemble des personnels de LNCR / ASCEDIATE / UNCEIA maisons- Alfort et chteauvillain qui ont tout fait pour faciliter mon intgration et avec qui jai pass de bons moments pendant toute la dure de mon stage.

Mohammed SEHNINE

Sommaire

REMERCIMENT

LISTE DABREVIATION

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RESUME 1 INTRODUCTION .2 MATERIEL ET METHODES 5 RESULTATS 12 DISCUSSION 15 CONCLUSION .17

REFERENCES

LISTES DABREVIATIONS

FIV : Fcondation in vitro FCO : Fivre catarrhale ovine BTV-8 : srotype 8 de la Fivre catarrhale ovine LF : Liquide folliculaire Ov : Ovocyte Mc : milieu de contamination Coll : milieu de collecte dovocyte Matu : milieu de maturation avant la maturation (rinage) Miv : milieu de maturation aprs 22 heures TALP : milieu de Fcondation CC : cellules de cumulus Zy : zygote aprs la Fiv Fiv : milieu de fcondation aprs 18 heures L 1, 2, 3 : Lavage1, 2 , 3 EMB : embryon lav sans traitement de Trypsine L8T : lavage aprs trypsine EMBT : embryons lav aprs traitement de trypsine

ABSTRACT 2011.

Bluetongue (BT) virus serotype 8 (BTV-8) which caused an epidemic in ruminants in central Europe and North in August 2006 and especially in France in the summer of 2007 seems to differ from other serotypes of BT by its ability to spread transplacentally, and has been associated with an increased incidence of abortions, related usually to early embryonic death, and other reproductive problems. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of washing protocol recommended by the IETS, applied to embryos produced in vitro and in vivo, to control the risk of contamination by BTV-8 during embryo transfer with fresh or frozen, widely used in chain from cattle breeding. In this context, we used, first, by an approach in vitro- In vitro experimental contamination of immature oocytes retrieved from slaughterhouse ovaries by BTV-8, for 1 hour (10 TCID50/ml) before maturation, fertilization and culture in vitro for 7 days until blastocyst stage, and secondly by an approach in vivo - in vitro contamined with the same viral concentration for 1 hour, embryos collected 7 days post insemination, from two donor cows (FCO negative) undergoing hormonal treatment Superovulation based FSH followed by artificial insemination with semen from a bull approved for the mating (FCO negative). Blastocysts 7 days, infected experimentally (products In vitro and in vivo) were subjected to washing health recommended by the IETS: 10 washes performed in groups of 10 embryos up in 10 successive baths of phosphate buffer (PBS) according to a dilution 1: 100 for each bath. A proportion of embryos produced in vitro undergoes treatment with trypsin for 60 to 90 seconds after the 5th bath followed by 5 rinses containing baths of PBS and 2% fetal calf serum (FCS). The search for viral RNA was performed by RT-qPCR specific. In this study, decreased rate of embryonic development after contamination of immature oocytes could be related to the presence of virus in all culture media and cumulus cells. The virus has not been detected in the last sanitary rinsing bath prove of the effectiveness of serial dilutions. However it was systematically detected on embryos after 10 sanitary washes even after treatment with trypsin. This suggests that the particles Viral remain adsorbed on the zona pellucida of embryos and cannot be eliminated by including trypsin treatment.

By: Mohammed SEHNINE.

March, 2011.

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RESUME : Le srotype 8 (BTV-8) du virus de la fivre catarrhale ovine (FCO) a caus une pidmie dans

les levages de ruminants dans lEurope centrale et du Nord en aot 2006 et surtout en France partir de lt 2007 semble diffrent des autres srotypes de la FCO par sa possibilit de se propager par voie transplacentaire, associe une incidence accrue des avortements, lis gnralement une mortalit embryonnaire prcoce, et dautres problmes de reproduction. Lobjectif de la prsente tude tait dvaluer de lefficacit du protocole de lavage prconis par lIETS, appliqu aux embryons produits in vitro et in vivo, pour matriser le risque de contamination par le BTV-8 lors du transfert embryonnaire ltat frais ou congels, largement utilis dans la filire de la slection bovine. Dans ce cadre, nous avons utilis, dune part, par une approche in vitro in vitro en contaminant exprimentalement des ovocytes immatures rcuprs partir dovaires dabattoir par le BTV-8, pendant 1 heure (10 TCID50/mL), avant maturation, fcondation puis culture in vitro pendant 7 jours jusquau stade blastocyste, et dautre part par une approche in vivo in vitro en contaminant avec la mme concentration virale pendant 1 heure, des embryons collects 7 jours aprs insmination, chez deux vaches donneuses (FCO ngatif), ayant subi un traitement hormonal de Superovulation base de FSH, suivi dune insmination artificielle par la semence dun taureau agr pour la monte publique (FCO ngatif). Les blastocystes de 7 jours, contamins exprimentalement, (produits in vitro et collects in vivo) ont t soumis aux lavages sanitaires recommands par lIETS : 10 lavages raliss par groupe de 10 embryons maximum dans 10 bains successifs de tampon phosphate (PBS) en respectant une dilution 1 :100 pour chaque bain. Une proportion des embryons produits in vitro subit dun traitement la Trypsine pendant 60 a 90 secondes aprs le 5ime bain, suivi de 5 bains de rinages contenant de PBS et 2 % de srum de veau ftal (SVF). La recherche dARN viral a t ralise par RT-qPCR spcifique. Dans cette tude, une diminution de taux de dveloppement embryonnaire aprs contamination des ovocytes immatures qui pourrait tre lie la prsence de virus dans tous les milieux de culture et les cellules du cumulus. Le virus na pas t mis en vidence dans les derniers bains des rinages sanitaires tmoins de lefficacit des dilutions en srie. Par contre il a t systmatiquement dtect sur les embryons aprs les 10 lavages sanitaires de mme quaprs traitement par la Trypsine. Ceci suggre que les particules virales restent adsorbes sur la zone pellucide des embryons et ne peuvent tre limines y compris par traitement la Trypsine.
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8-

INTRODUCTION : La mise au point, la fin des annes 70, des techniques non chirurgicales de collecte et de

transfert des embryons ainsi que leur conglation a grandement favoris le commerce dembryons bovins travers le monde. Par la suite, certaines spculations quant la transmission possible des maladies infectieuses par des embryons ont t souleves par les instances vtrinaires, beaucoup des travaux ont t mis en place pour valuer les risques de transmission de maladies via les embryons et pour aider laborer des procdures de scurit sanitaire et pratiques visant les rduire. Par ailleurs, la technique de fcondation in vitro (FIV) utilise chez les diffrentes espces danimaux dlevage a aussi rapidement volu depuis la naissance du premier veau produit par FIV en 1982 [1]. Comparativement aux mthodes tablies de production par superovulation, la FIV permet la production dun grand nombre dembryons des fins commerciales, avec moindres cots partir dovaires de vaches abattues. En 1992, des recommandations sanitaires portant sur la certification des embryons produits par FIV et destins au commerce international ont t proposes par la Socit internationale de transfert embryonnaire (IETS). Ces dernires ont ensuite t adoptes par lOffice international des pizooties (OIE) et ont t ajoutes au Code international sur la sant des animaux [2]. Il est reconnu que les embryons rsultant dovocytes fconds in vitro diffrent au point de vue morphologique et physiologique des embryons fconds in vivo. Par exemple, les embryons produits par FIV sont moins compacts et peuvent prsenter un nombre de cellules moindres. Il y a des diffrences au niveau de la structure de la zone pellucide [3], soulevant lexistence de problmes sanitaires spcifiques aux embryons produits in vitro comparativement aux embryons produits in vivo. Les ovocytes peuvent tre infects avant lovulation, par contact avec un agent infectieux sil est prsent dans les cellules ovariennes, dans le liquide folliculaire pendant la phase aigu de la maladie (virmie) ou si lagent pathogne est prsent dans la semence. Dans une approche in vitro, il est possible de reproduire des contaminants externes peuvent tre introduites dans le systme de FIV via les milieux de culture. La Fivre catarrhale ovine (FCO ou bluetongue en anglais) est une maladie virale vectorielle non contagieuse, qui peut affecter un large spectre de ruminants domestiques et sauvages [4]. Elle est
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transmise entres les htes exclusivement par des piqres dun vecteur tropical Culicodes imicola, diptres hmatophages. Lagent de FCO est un virus nu genre Orbivirus appartenant de la famille Reoviridae (BTV), constitu de deux capsides symtrie icosadrique qui entourent dix segments dARN bicatnaires (ARNdb) codant pour au moins dix protines, sept de ces protines sont structurales (VP1 VP7) formant les capsides externes et internes, et trois protines qui sont non structurales (NS1 NS3).

Il existe dans le monde 24 srotypes diffrents connus, en y incluant le nouveau virus Toggenburg isol rcemment en suisse (BTV-25) [5,6]. La protine VP2 est le constituant majeur de la capside externe qui dtermine une spcificit antignique de chaque srotype tandis que la protine VP7 de la capside interne est conserve chez tout les srotypes de virus FCO (pitopes antigniques communs aux 25 srotypes). La variabilit gntique de ce virus risque de conduire lmergence de nouvelles souches avec une virulence modifie ou de nouveau srotype. La pathognie de BTV se fait en 5 tapes : 12La piqre par des culicodes qui favorise la mobilisation des lymphocytes T. Rplication primaire dans les ganglions lymphatiques et le virus a un tropisme pour les mononuclaires et les lymphocytes. 345vaisseaux sanguins et les monocytes, cela explique la virmie trs leve et lorigine de la forte fivre. Cest une maladie, est inscrite la liste A de loffice international des pizooties (OIE), dclaration obligatoire en raison du fait quelle induit de lourdes pertes socio-conomiques lies La dissmination par les vaisseaux lymphatiques. Premire virmie transitoire dans les vaisseaux sanguins. Rplication secondaire dans les ganglions, la rate, les cellules endothliums des

gnralement un taux lev de mortalit et de morbidit avec un chec de reproduction y compris les avortements qui perturbent considrablement le commerce international danimaux et des produits dorigine animal [7]. En plus de sang, dautre matriaux biologiques, tels que la semence et les embryons peuvent tre considrs risque en ce qui concerne la dispersion du virus de FCO. Lapparition brutale et inattendue de la souche BTV-8 de la fivre catarrhale (FCO) dans le Nord de lEurope en Aot 2006 comme une maladie mergente [8] et en France partir de Juillet 2007 a prsent une virulence particulire chez les bovins, avec des rpercussions majeures sur les performances de la reproduction tant chez le mle que chez la femelle. Ces rpercussions ont t marqus par une dgradation de taux de russite des insminations (taux de conception) ou allongement de lintervalle vlage vlage [9], une diminution pour cause davortement suite des mortalit embryonnaires prcoces, et une infertilit souvent transitoire chez les taureaux associes la phase aigu de linfection lis la virmie (hyperthermie qui peut attendre 42 C) [10]. Lhydrocphalie, labsence complte de parenchyme crbral, est le signe clinique le plus marqu chez les veaux ns ou avorts dune vache infecte par la FCO, qui peut tre associ une infection intra- utrine par le BTV-8 dans les premiers 50 60 jours de gestation [11]. Cette transmission transplacentaire de virus BTV-8 a t mise en vidence suite la virmie qui prcde linoculation de virus. En outre, lisolement du virus par la technique de RT-qPCR chez 60 % des avortons srongative et PCR-positive issus des mres PCR- ngative, qui pourrait suggrer quil y a une possibilit dimmunotolrance au BTV-8, soulignant la ncessit de restreindre le

commerce des rgions infect mme si elles sont BTV-8 RT-qPCR ngative. [12]. Du fait des particularits du BTV-8, il est essentiel de vrifier lventuelle spcificit de srotype par rapport au risque de transmission via les embryons. La manipulation des embryons entre la collecte et le transfert doit prvenir la transmission dagents pathognes des donneuses aux receveuses, par des procdures de dcontamination de la zone pellucide qui tiennent une place importante dans les protocoles de manipulations sanitaires recommandes par l'IETS (International Embryo Transfer society). Lobjectif de ce travail, a t dvaluer lefficacit des procdures de lavage recommandes par lIETS sur le srotype du virus de la bluetongue.

MATERIEL ET METHODES : Production des blastocystes in vitro (UNCEIA, Maisons-Alfort, Paris) : Maturation des ovocytes in vitro : Les ovaires ont t collects labattoir Sicavyl de

Migennes (Auxerre) sous contrle vtrinaire, et rapports au laboratoire dans un milieu saline (Euro-Flush) contenant des antibiotiques (kanamycine sulfate 50mg/l) une temprature de 28 C. Le contenu des follicules est ensuite aspir dans un tube de 50 ml laide dune aiguille relie un systme sous dpression. Les contenu de chaque tube est filtr sur un tamis, les ovocytes sont ensuite isols dans des boites de ptri et subissent deux lavages successifs dans un milieu de collecte Medium 199 tamponn en hepes (Gibco) avec Nystatine, gentamycine et SVF (serum de veau fetal). La mise en culture des ovocytes se fait dans une plaque 4 puis strile contenant 500l de milieu de maturation Medium 199 additionn de srum de veau ftal (SVF), antibiotique base de gentamicyne , hormones hypophysaires LH / FSH, Hormone strodien stradiol 17, et facteur de croissance EGF, incubs pendant 22 heures dans une tuve 38,5 C, sous 5 % de CO2 dans lair. Fcondation in vitro : les ovocytes matures sont mis en contacte avec des spermatozodes

(spz) dun taureau agre la monte publique FARMAN (92-363) de race Charolais, avec une dilution dans 500 l pour une concentration finale de 1 10 spz/mL. La paillette de sperme est stocke dans lazote liquide -192 C. Aprs de sa dconglation dans un bain marin de 37,5 C en 30

secondes au minimum, la slection de spermatozodes vivant par centrifugation sur un gradient de densit (BoviPure). Une couche de BoviPure Top de faible densit est dpose sur une couche de BoviPure Bottom de forte densit pour composer un gradient discontinu. Ensemble, ils constituent deux phases de densits diffrentes ; au cours de la centrifugation, les spermatozodes morts seront arrts linterface entre les deux milieux. Le culot rcupr aprs centrifugation ne contient que des spermatozodes normaux purifis et prsentant la meilleure motilit afin doptimiser la fcondation. La fcondation des ovocytes se fait dans une plaque 4 puits contenant de milieu de fcondation base de Tyrode Albumine Lactate et pyruvate (TALP) avec de bovine serum albumin (BSA), Hparine et de penicillamine hyptaurine epinephrine (PHE : stimulant la motilit des spermatozodes). La co-incubation avec les ovocytes est ralise pendant 18 heures dans une tuve 38,5 C, sous 5 % de CO2 dans lair. Culture des embryons in vitro : les zygotes sont soumis une dcoronisation par des

mouvements va et vient dans la pipette ou par vortex pour liminer lexcs de spermatozodes et de cellules du cumulus demeurant aprs FIV, puis incubs pendant 6 jours dans une plaque puits contenant 50l de milieu de culture SOF (synthetic oviduct fluid) avec de BSA, Nystatine et

gentamycine sous 450l dhuile minral (Sigma-M4810) 38,5 C, dans une tuve sous 5 % de CO2 dans lair.

Contamination exprimentale avec le srotype BTV-8 : Le virus de FCO srotype BTV-8 a t isol en 2008 partir de matriel biologique (sangs positifs en RT-PCR) de bovin prsentant des signes cliniques. Aprs incubation de 2 7 jours des ufs inoculs avec une prparation dhmaties obtenues partir de sangs prlevs sur EDTA, les ufs sont ouverts et les embryons daspect hmorragiques sont broys dans un milieu avec antibiotiques. Le broyat obtenu est ensuite inocul sur un tapis des cellules rnales de bb dhamster (BHK-21) ensemences depuis 24 heures. Au bout de 7 jours, si aucun effet cytopatique (ECP) nest observ, les boites de cellules sont conserves en -80 C dans le cas ou le tapis cellulaire recouvre 20 % ou plus de la surface ensemence ou en -20 C si le tapis cellulaire est dtruit plus de 80 %. Lisolation de virus est ralise par rcupration de surnageant et dbris de cellules qui ont t aliquot, avec une concentration de 10 TCID50/mL, congel -80 C et titr par la mthode de Reed et Muench. Le virus est dtenu par lagence nationale de la scurit sanitaire de lalimentation, lenvironnement, et du travail ANSES (cr en 1er juillet 2010 par la fusion de deux agences sanitaires franaises : l'Afssa (Agence franaise de scurit sanitaire des aliments) et l'Afsset (Agence franaise de scurit sanitaire de l'environnement et du travail) sige Maisons-Alfort, Paris.

Approche in vitro in vitro: Dans chaque exprience, trois lots dovocytes immatures ont t

constitus et soumis aux tapes de production dembryons in vitro : Le premier lot de 50 ovocytes (Tmoin manip) a subi le traitement classique de maturation Medium 199 incub pendant 22 heures. La fcondation in vitro pendant 18 heures dincubation, et la mise en culture dans une goutte de 50 l de milieu SOF sous huile pendant 6 jours, dans une tuve 38.5 C sous 5% de CO2 dans lair. Le deuxime lot de 50 ovocytes (Tmoin MEM) a t mis dans 450 l de milieu de maturation Medium 199 auquel sont ajouts 50 l de milieu MEM (milieu dans lequel a t cultiv le virus) et le troisime lot comprenant le reste des ovocytes collects (virus + MEM) rpartis par 50 dans des puits contenant 450 l de milieu de maturation, plus 50 l de suspension virale (BTV-8 +MEM) avec une concentration finale de 10 TCID50/mL. Les lots tmoin MEM et virus ont t incubs pendant 1 heure 38,5 C dans une tuve sous 5 % de CO2 dans lair. Aprs 1 heure, les ovocytes ont t rincs successivement dans 2 bains de collecte, un bain de milieu de maturation strile, puis mis en culture pendant 22 heures 38,5 C dans une tuve 5 % CO2 dans lair.

Les ovocytes matures de chacun des 3 lots ont subi sparment trois lavages dans du milieu de fcondation TALP avant la mise en contact avec les spermatozodes dun taureau agr (ngatif en FCO) puis incubation pendant 18 heures. Avant la culture, les zygotes sont dcoroniss par pipetages rpts, puis, trois lavages sont raliss dans le milieu SOF et les embryons sont cultivs pendant 6 jours 38.5 C dans une tuve sous 5 % de CO2 dans lair. Aprs la culture des trois lots, les embryons sont soumis la procdure de lavage sanitaire recommande par lIETS International Embryo Transfer society, (10 lavages raliss par groupe de 10 embryons, sans trypsine) [13]. Approche in vivo in vitro : la rcolte dembryons in vivo a t ralise dans la station

exprimentale de lUNCEIA Chteauvillain, par aspiration transvaginale suite un lavage utrin laide dun cathter souple, strilis par une gaine de protection, permet daccder la partie suprieure des cornes utrines des deux donneuses de race Montbliarde. En amont, les vaches ont subi un traitement de superovulation (entre 9 13 jours aprs les chaleurs de rfrence 0J), constitu de 8 injections de FSHp (extraits hypophysaires porcines ; STIMUFOL Merial) 12 heures dintervalle, avec des doses dcroissantes (dose totale = 500 g de FSHp pour les vaches, 350 g pour les gnisses). Une injection de Prostaglandine F2 alpha est ralise 48 heures aprs le dbut de la stimulation par la FSH (5e injection de FSH) afin dentraner la lyse de corps jaune [14]. Une insmination artificielle (IA) avec une semence dun taureau agr pour la monte publique (ngatif pour la FCO) t ralise 12 heures aprs la dtection des chaleurs. Aprs 7 jours aprs lIA, 44 embryons sont rcuprs par filtration directe des liquide de lavages, dans un milieu de collecte Euro-Flush, puis transports le mme jour de Chteauvillain Maisons-Alfort, une temprature de 4 C avec une concentration de 10 TCID50/mL pendant 1 heure 38.5 C dans une tuve sous 5 % de CO2 dans lair. Aprs 1 heure de contact avec le virus, les trois lots dembryons sont soumis la procdure de lavage sanitaire recommande par lIETS International Embryo Transfer society, (10 lavages raliss par groupe de 10 embryons, sans trypsine).

Procdure de lavage sanitaire recommande par lIETS [13] : Les lavages sanitaires, selon IETS, des embryons produits in vivo ou in vitro dont la zone pellucide est intacte, suffit liminer la plupart des pathognes bovins. Toutefois, un traitement supplmentaire tel que le traitement de la Trypsine est parfois ncessaire pour certains agents pathognes qui semblent sattacher ou adhrer la zone pellucide aprs des expositions exprimentales in vitro. Les exigences relatives au lavage des embryons selon IETS sont :

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- Ne pas laver plus de dix embryons la fois (compter avant le lavage). - Ne laver que les embryons dont la zone pellucide est intacte (confirmer avant et aprs le lavage). - Ne laver que les embryons libres de matriel adhrent (nettoyage si ncessaire avant lavage). - Faire au moins dix lavages (allouer suffisamment de temps entre chaque lavage pour que le tout se mlange compltement). - Utiliser une nouvelle micropipette strile (cne de pipette) chaque fois que les embryons sont transfrs dun bain lautre. - Surveiller les volumes pour que chaque bain corresponde 100 fois la dilution de bain prcdent.

Le protocole recommand pour le traitement la Trypsine tait mis en place par le transfert de 10 embryons dans cinq bains successifs de tampon phosphate (PBS) et 0.4 % dalbumine srique bovine (BSA). Les embryons taient ensuite plongs dans deux bains de Trypsine pour une exposition totale de 60 90 secondes. Une solution Trypsine strile (trypsine porcine [1 :250] dont lactivit est telle que 1 g hydrolyse 250 g de casine 25 C, PH 7.6 en 10 minutes) dans une solution quilibre de HANK tait utilise une concentration de 0.25 %. Aprs le traitement la trypsine, les embryons taient transfrs dans cinq autres bains conscutifs de tampon phosphate contenant de 2 % de srum de veau ftal (SVF).

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Collecte et stockage dchantillons sanitaires :

En thorie, la prsence de pathognes dans nimporte quel composant du systme de production in vitro (ex., liquide folliculaire, complexe cumulus ovocytes, cellules de granulosa, milieu de maturation ou de culture) pourrait se traduire par la production dembryons contamins [15]. Une telle approche assure un produit de premire qualit et constitue une vrification rgulire des pratiques et des normes sanitaires des embryons avant leur transfert. Un chantillon dovocytes et liquide folliculaire obtenu par aspiration folliculaire provenant des lots dovaires rcuprs labattoir a t utilis pour attester labsence de pathognes dans la population dovocytes de dpart. Les chantillons suivants devraient tre utiliss des fins de contrle de qualit pour chacun des lots de production contamin et tmoin MEM : - Echantillon de milieu de contamination. - Echantillon de milieu de collecte (2 rinages). - Echantillon de milieu de maturation (Midium199) avant (1 rinage) et aprs 22 heures dincubation. - Echantillon de milieu FIV (TALP) avant (2 rinages) et aprs 18 heures de fcondation. - Echantillon de cellules cumulus et 10 embryons aprs la fcondation. - Echantillon de milieu de culture (SOF) avant (2 rinages) et aprs 7 jours de culture. - Echantillon des trois premiers et des trois derniers bains de lavages sanitaires en PBS+BSA (sans traitement pas Trypsine) de la srie de 10 lavages effectue sur une srie de 10 embryons dvelopps. - Echantillon des 5 embryons lavs. - Echantillon des trois derniers lavages sanitaires PBS+SVF 2% (aprs traitement par 0.25% de Trypsine) de la srie de 10 lavages effectue sur une srie de 10 embryons dvelopps. - Echantillon des 5 embryons lavs par PBS+SVF aprs traitement par Trypsine. Ces chantillons sont recueillis le plus tt possible aprs les manipulations dans des tubes de 1.5 ml et congels dans -20 C avant dtre analyss par RT-PCR visant dtecter la prsence de gnome viral, et afin dvaluer lefficacit des lavages sanitaires mis en place. Dtection de gnome viral : Lextraction de gnome de FCO (ARN puis ADN) se fait par la technique de Transcription inverse suivie dune raction en chaine de polymrase temps rel (RT-qPCR: RT-PCR quantitative). Elle consiste a mesur, pendant chaque cycle damplification, la quantit dADN total ou damplicon grce un marqueur fluorescent. Lobtention de la cintique complte de la raction
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de polymrisation permet dobtenir une quantification absolue de la quantit initiale dADN cible. Cest une technique danalyse rapide et extrmement sensible, utilise avec succs pour dtecter la prsence de srotype BTV-8 sur ou dans lembryons produits in vivo ou in vitro, et dans les liquides de lavage et de rinage. Dans ce cadre, le service de biologie molculaire de LNCR utilise un Kit qui dtecte tout les gnotypes de la FCO, le Kit TaqVet fourni et conseill par le laboratoire service international (LSI) permet la dtection des 24 srotypes de la blue Tongue recens travers le monde et

rpertoris par lInstitute for Animal health Pirbright. Les chantillons trouvs positifs laide du Kit TaqVet BTV8 gnotyps pour le srotype 8, dans ce cas, il est possible de travailler directement partir des ARN positifs en recherche le BTV-8 sils ont t conservs -20 C ds leur extraction. Le kit contient les lments suivants : 2 tubes de Mix prt lemploi Blue Tongue -Mix BTV8- contenant : 1 Set de Nuclotides BTV8 : 1 Forward primer. 1 Reverse primer. 1 Sonde BTV8 - Sonde TaqMan marque FAM-MGB (fluorescente).

1 Set de Nuclotides IPC : 1 Forward primer. 1 Reverse primer. 1 Sonde IPC - Sonde TaqMan marque Vic TAMRA (fluorescente).

Le Mix ractionnel de RT-PCR. Lenzyme spcifique RT-PCR. 1 EPC (External Positive Control) BTV-8 dj extrait. Lavantage pratique de ce Kit quil est prt lemploi, il ne ncessite donc aucune reconstitution de Mix de ractif avec lajout de lextrait dARN tester. Lextraction et la purification de lARN viral : sont ralises en colonne en utilisant le Kit QIAGEN QIAamp viral RNA mini Kit (rf : 52904 ou 52906) pour :

lextraction de NCS Contrle Ngatif Sample (extraire 100 l deau Rnase Free). Prparation du Tampon RNA-AVE (310l de Tampon AVE, fourni par le kit dextraction, dans un tube dARN carrier du kit, Vortexer et centrifuger brivement).

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Prparation le Tampon de lyse (TL) par 1,5 ml de Tampon AVL (Viral lysis) et 100 l de lchantillon prlev puis centrifugation rapide. On ajoute dans le tube une quantit de 560 l dthanol 100% et on centrifuge pour obtenir le lysat de lchantillon. Un lavage mis en place laide de 500l de Buffer AW1 et AW2 (reconstitu) successivement afin dliminer lalcool suivi dun schage de la membrane de silice par centrifugation 3 min 10000g. La rcupration de lARN extraire sera aprs distribution de 40 l de Buffer AVE du Kit QIAamp Viral dans des microtubes de 1.5 l. Une centrifugation de 2 min 6000g et stockage des microtubes dans la glace 4 C si lamplification est ralise tout de suite ou conserver lARN -20 C.

La dnaturation et lamplification des ARN viraux : la dnaturation et lamplification de lARN double brin de virus de FCO se fait dans un appareil de PCR en temps rel. Il sagit dun thermocycleur (Abi-Prism 7500 fast Time PCRSystem), dune haute technologie fourni par Applied Boisystems et valid par LSI, coupl un spectrofluorimtre (systme optique de dtection des sondes qui ne fluorescent qu'aprs leur fixation l'ADN gnre lors des ractions de PCR en temps rel). Une fois que la quantit d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dpasser un seuil alors on obtient un numro de cycle PCR appel "Ct" pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil. C'est cette valeur qui est la base des calculs pour quantifier l'ADN de faon absolue ou relative. La dnaturation de lARN est ralise en mettant 20 l dchantillon (ARN viral) dans chaque puits dune plaque 96 puits, la plaque ensuite est recouvrit par un film daluminium et sous mise une centrifugation rapide (pour enlever certains bulles dair qui perturbent lanalyse lors de leur explosion) puis un chauffage forte et rapide dans le thermocycleur pendant 3 minutes 95 C afin de sparer les double brins dARN. A la fin de cette tape, La plaque est centrifuge en quelques minutes avec 2500g 4 C puis dpose dans la glace pile pour conserver lARN ltat de simple brin. Lamplification, hybridation et longation, ont ralises en mme temps aprs programmer le thermocycleur aprs la mise de 5 l de ARN dnatur dans chaque puis de plaque 96 puits contient 20 l de Mix BTV-8 (prt lemploi). La plaque est couvrit par un film collant transparent adapt et lancer lamplification selon le programme suivant : Etape 1 : 45 C pendant 10 minutes correspond ltape de RT-PCR (produire ADN complmentaire partir de lARN viral dnatur) avec une seule rptition.

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Etape 2 : 95 C pendant 10 minutes correspond une dnaturation des doubles hlices de lADN complmentaire et activation de la Taq Polymrase, avec une seule rptition. Etape 3 : 95 C pendant 15 secondes (dnaturation) et 60 C pendant 45 secondes correspond ltape dhybridation, fixation des primers et llongation avec une rptition de 40 cycles. (la lecture de la fluorescence est ralise pendant ltape dlongation : 60 C - 45 secondes).

Linterprtation des rsultats de RT-qPCR : Pour les contrles avant mouvements dexportations / importations, tous les animaux ayant un Ct inferieur 40 sont considrs comme positifs. Pour le diagnostic de suspicion clinique, les animaux ayan un Ct inferieur ou gal 34 sont considrs comme positifs, pour les animaux ayant un Ct suprieur 34 et infrieur 40, faibles positifs, le statut de lanimal ne peut tre dfini . Linfection peut tre tres rcente (dbut de virmie) ou ancienne (dtection du gnome BTV jusqu 200 jours aprs infection) dans ce dernier cas, le virus nest alors plus infectieux.

Analyse statistique :

Le taux de fcondation, segmentation et dveloppement embryonnaire produits in vitro, a t calcul par rapport aux ovocytes insmins.

Les rsultats en pourcentage (%) et en cartypes () on t calcul pour la moyenne de chaque lot et chaque stade de dveloppement.

les effets de lot de traitement et de manips ont t tests par le Proc GLM sous logiciel SAS qui analyse les variance (ANOVA) si P > 5% il na pas une diffrence significative si P< 5 % il y a une diffrence significative

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10-

RESULTATS : a) Linfluence de BTV-8 sur le dveloppement embryonnaire : Plus de 1000 ovocytes collects partir des ovaires dabattoir sont rpartis de faon ingale sur

les trois lots, tout en basant sur le lot virus qui nous intresse le plus pour effectuer les lavages sanitaires. Les ovocytes de chaque lot, Tmoin labo, Tmoin MEM et Virus MEM, sont soumis aux tapes de production des embryons in vitro (Tableau 1).

Nom culture

lot Nombre initiale Nombr e 158 88,9 % 145 49 40 Fcondation Segmentation Morula Blastocyste

27,2 % 25,0 % 81,4 % 7,5 3,1 4,3

tmoin labo

177

% et 3,7 Nombr e 135

114 67,0 %

40

28

23,3 % 21,5 % 8,0 6,7

tmoin MEM

168

% et 78,3 % 14 13,5 Nombr e 574 85,5 % 507

124

86

18,7 % 16,5 % 75,5 % 2,5 8,5 NS NS 8,9 NS

Virus MEM

671

% et 1,7 NS

Tableau 1 : Taux de fcondation, segmentation et dveloppement des embryons produits in vitro

Pour le lot dovocytes traits dans les conditions de routine (Tmoin labo) les taux de fcondation (88.9%), segmentation (81.4%), dveloppement jusquaux stades morula (27%) et blastocystes (25%) sont conformes aux rsultats moyens observs sur lanne avec ce taureau. Lajout de milieu MEM dans le milieu de maturation et lincubation pendant 1 heure supplmentaire avant rinage (Tmoin MEM) induit une rduction non significative des pourcentages de fcondation, segmentation et dveloppement embryonnaire observs.

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De mme, lincubation des ovocytes pendant 1 heure en prsence de virus rsulte dans une diminution non significative du dveloppement embryonnaire par rapport au tmoin MEM (18.7 % de morula et 16.5 % de blastos vs 23% et 21.5 % respectivement).

Les stades de dveloppement des embryons observs 48 heures aprs la FIV sont reprsent dans la (Figure.1).
60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 2cell 4-6 cell 6-8 cell Tmoin labo Temoin MEM Virus

Figure 1 : Stade de dveloppement embryonnaire J2 de la mise en culture. Les pourcentages dembryons au stade 2 cellules, 4-6 cellules et 6-8 cellules 48 heures aprs la fcondation ne sont pas significativement diffrents de ceux du Tmoin. b) Evaluation de la procdure des lavages sanitaires des embryons : A. Approche In vivo : Les 44 embryons collects par lavage utrin in vivo dune donneuse (FCO ngatif), et la mise en culture des embryons pendant une heure aprs une contamination exprimentale par le BTV-8. Cependant, 10 lavages sanitaires sont mises en place pour rincer les embryons par groupe de 10. Les prlvements de milieu de contamination, les chantillons des bains de rinage (3 premiers et 3 derniers) et les embryons lavs sous misent une analyse dRT-qPCR (Figure 2).

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40 35 30 25 20 15 10 5 0

Seuil : Ct <34

Ct

MC

L1

L2

L3

L8

L9

L10

EMB

Figure 2 : Rsultats danalyse RT-qPCR dchantillons prlevs aprs les procdures des lavages sanitaires des embryons produits in vivo.

Le milieu de contamination est utilis comme tmoin avec une dtection trs lev de BTV-8. Lanalyse par RT-qPCR a mis en vidence la prsence dune quantit leve de gnome virale dans les premiers lavages sanitaires. La quantit de gnome virale dcroit partir du troisime lavage et pour les 3 derniers bains est deca du seuil de dtection (Ct > 34). Le gnome viral a t dtect dans lensemble des embryons lavs avec une contamination plus ou moins leve (Ct moyen = 26.51 0.75). B. Approche in vitro : Seuls les chantillons du lot contamins par le virus BTV-8 ont t analyss par la RT-qPCR, les rsultats de (Figure.3). Le seuil de dtection de gnome viral par technique RT-qPCR est de 34 Ct. Au-del, les rsultats obtenus sont considrs comme ngatifs.
40 35 30 25 20 15 10 5 0

Seuil =

Srie1

Ct

Figure 3 : Rsultats danalyse RT-qPCR dchantillons prlevs lors des tapes de production dembryons in vitro et aprs les procdures des lavages sanitaires.

LF OV MC coll1 coll2 matu MIV TALP1 TALP2 CC FIV ZY SOF1 SOF2 CJ7 L1 L2 L3 L8 L9 L10 EMB L8T L9T L10T EMBT

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Le Ct moyen observ pour le milieu de contamination (10 TCID50/mL) des ovocytes est de tous les milieux diffrents de rinage : Avant maturation (coll1, coll2, matu). Aprs maturation (Miv) et avant FIV (TALP1 et TALP2). Aprs FIV (FIV) et avant culture (SOF1, SOF2)

Ainsi que le milieu ayant contenu des embryons pendant les 6 jours de culture prsentent de Ct moyen compris entre 21 et 27 qui tmoignent donc de la prsence de virus dans tous ces chantillons. Les cellules de cumulus prleves aprs la fcondation ainsi que les zygotes sont galement porteur de gnome viral. Les 3 premiers lavages sanitaires des embryons (L1, L2, L3) ainsi les 3 derniers (L8, L9, L10) sont ngatifs tmoignant de lefficacit de la dilution en srie du virus. Par contre le Ct moyen de 26 observ pour les embryons lavs est la preuve de prsence de gnome viral sur ces embryons. Le traitement des embryons par une solution 0.25 % de Trypsine ne permet pas dliminer le virus puisque le Ct moyen des embryons trypsins lavs est de 27. Ceci bien que les derniers lavages aprs trypsine soient ngatifs. 11DISCUSSION : Les embryons sont entours de la zone pellucide qui empche la pntration de la plupart des agents pathognes dans lembryons ds la fcondation et donc sa contamination. Toutefois, il peut y avoir contamination de la receveuse par des pathologies ayant adhr la zone pellucide de lembryon transfr. Plus tard, aprs son closion de la zone pellucide, lembryon peut lui aussi tre contamin. Peu importe les mcanismes prcis de ladhrence des pathologies la zone pellucide, il est gnralement assez facile dinactiver ou de retirer les pathognes collants sur la zone pellucide, particulirement chez les embryons bovins. De plus, il a t dmontr que les lavages accompagn dun court traitement la Trypsine, procdures recommandes par lIETS pour le lavage des embryons produits in vivo, permettent dliminer la quasi-totalit des germes adhrant la zone pellucide et dobtenir des veaux indemnes partir des embryons issus de donneuses et/ou taureaux infects aprs un transfert embryonnaire [16].

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Dans notre tude, nous avons montr que la prsence de gnome viral na pas deffet significatif sur les diffrents paramtres tudies, fcondation, segmentation et dveloppement embryonnaire. Le virus naffecte pas les premiers stades du dveloppement embryonnaire in vitro puisque les cintiques observes 48 h aprs la FIV ne sont pas diffrentes entre les tous lots. Le fait dajout du milieu MEM (milieu dans lequel est prpar le virus BTV-8) seul na aucune impact sur la production dembryons in vitro. Pour ltude in vitro in vitro, nos rsultats montent une absence de contamination des lots dovocytes de dpart justifiant que les femelles abattues labattoir de SICAVYL sont indemnes de BTV-8. Lexposition des ovocytes immatures au virus rsulte dans une contamination des ovocytes, zygotes et milieux des rinages entre les diffrentes tapes de la production dembryons in vitro (coll1, coll2 matu, Talp1, Talp 2, Sof1, Sof 2). Les cellules du cumulus prleves aprs la Fiv ainsi que les zygotes prsentent du gnome viral. Ceci montre que le virus sest fix sur les cellules du cumulus, quil a galement pendant la priode de maturation de 22 heures pu se rpliquer dans ces cellules. Les zygotes dbarrasss des cellules du cumulus environnantes montrent galement la prsence de gnome viral. Aucune tude in vitro na notre connaissance tudi leffet dune telle contamination. Le gnome viral a t mis en vidence dans les embryons aprs les 10 lavages sanitaires. Le non prsence de virus dans les derniers milieux de lavage montre lefficacit des dilutions 1 : 100. Cependant le gnome viral est dtect dans les embryons montre que ces lavages sont insuffisants pour liminer le virus. Ltude rcente mene par Leen Vandaele et al. (2011) sur les blastocystes cols in vitro de J8 J9 aprs insmination, a galement montr une inefficacit des lavages sanitaires pour liminer le virus BTV-8. Outre, dans le cas dembryons sortis de leur zone pellucides, le virus peut pntrer et se rpliquer dans les cellules embryonnaires provoquant un arrt de croissance et baisse de nombre de cellules total, suite la mort cellulaire par apoptose [17]. Les virus ne passent pas la barrire de la zone pellucide glycoproteique, dans les cas des embryons J7 de notre tudes, il sagit probablement de virus adsorb sur cette couche protectrice. Le traitement par la trypsine reconnue pour liminer la majorit des agents pathognes fixs sur la zone pellucide des embryons na montr aucune efficacit.

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Lincubation dembryons collects in vivo 7 jours en prsence de virus a montr une fixation du virus sur la zone pellucide, qui na pu tre limin malgr les lavages sanitaires. Il semble bien que le virus BTV-8 a un comportement diffrent de BVDV par exemple qui peut tre limin par les lavages des embryons produits in vivo alors quil reste fix sur la zone pellucide des embryons produits in vitro[18-19]. Cependant la dtection du gnome viral sur des embryons ne signifie pas finalement quils pourraient enduire une infection des femelles receveuses sils taient transfrs. Ltude de linfectivit des embryons contamins serait la seule preuve dun risque sanitaire aprs un transfert embryonnaire.

12-

CONCLUSION :

De nombreuses mesures de prcaution seront sans doute disponibles comme cest le cas pour les embryons produits in vivo. De plus, les perces technologiques qui seront ralises dans le domaine de la FIV pourraient contribuer rduire les risques de transmission de la fivre catarrhale. Dans cette tude, et suivant nos rsultats exprimentaux, on a pu constater que le srotype 8 de FCO na pas une influence significative sur le dveloppement embryonnaire. Ainsi que les lavages sanitaires des embryons recommands par lIETS nont pas t efficace pour liminer le srotype 8 qui demeure fix sur la zone pellucide. Des nouvelles recherches doivent tre ralises en perspective pour valuer leffet contaminant de virus adhr la zone pellucide des embryons lavs, augmenter le temps dexposition des embryons contamin la Trypsine et la mise en place des nouveaux protocoles sanitaires afin dapporter un meilleur contrle des risques pidmiologiques de BTV-8 lis la production dembryons in vitro, et de pouvoir dterminer les mthodes les plus efficaces pour la production par FIV dembryons exempts de FCO particulirement.

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REFERENCES :

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