Master Sciences de la Vie et de la Sant

Mention Biologie Intgrative, Evolutive et Infectiologie

Spcialit Biologie de la Reproduction Anne 2011-2012

Mohammed SEHNINE

Modulation des taux plasmatiques dinsuline par un apport alimentaire de propylne glycol sur la quantit, la qualit des ovocytes et des embryons produits par OPU-FIV chez des gnisses laitires

Responsable du stage : Claire PONSART (UNCEIA) Tuteurs : Giselle GAMARRA et Brigitte LE GUIENNE (MIDATEST-UNCEIA)

Laboratoire daccueil : UNCEIA en collaboration avec MIDATEST Laboratoire de Biotechnologie et de transplantation embryonnaire Station exprimentale de DENGUIN

Remerciements & Ddicaces

Il n'est jamais facile pour un tudiant de trouver un stage, c'est pourquoi je remercie UNCEIA et MIDATEST de m'avoir accueilli durant ces 6 mois.

Je tiens tout dabord remercier Mme Claire PONSART, Directrice scientifique de lUNCEIA, ma responsable de stage, qui m'a accord sa confiance et attribu des missions valorisantes durant ce stage. Et je remercie particulirement Mr Serge LACAZE de mavoir accueilli comme stagiaire au sein de lentreprise de biotechnologie et Transplantation Embryonnaire de MIDATEST Denguin.

Je remercie normment mes tutrices, Melle Giselle GAMARRA et Mme Brigitte LE GUEINNE, qui ont supervis mon stage au jour le jour, ainsi que toute l'quipe de l'entreprise, (animaliers, agents administratifs et le personnel de la cantine), car chacun d'entre vous su trouver un peu du temps pour m'aider dans mes missions.

Je tiens remercier toutes ces personnes qui ont contribu par leur disponibilit et leur bonne humeur rendre mon stage enrichissant et motivant.

Faire mon stage de master 2 dans votre entreprise (UNCEIA-MIDATEST) a t un plaisir, j'ai pu apprendre beaucoup grce vous et surtout tre confort dans mon projet professionnel, ce qui est un aboutissement mon cursus universitaire.

Enfin, Je ddie ce rapport celui qui ma indiqu la bonne voie en me rappelant que la volont fait toujours les grands hommes A mon pre. A celle qui a attendu avec patience les fruits de sa bonne ducation A ma mre. A mes frres, Abdou, Ibrahim et Zaki et tous mes amis et tous ceux qui sont chers pour moi merci pour votre soutien.

Que Dieu vous garde

Mohammed SEHNINE

SOMMAIRE
LISTE DES TABLEAUX : LISTE DES FIGURES : LISTE DES ABREVIATIONS :

I- INTRODUCTION :.....

1. Effet du niveau dapport nergtique sur la qualit des gamtes et le dveloppement embryonnaire : ...... 2 2. Effets de linsuline et du glucose sur la croissance folliculaire et le dveloppement embryonnaire :... 3 3. Effets dune supplmentation en propylne glycol sur le mtabolisme et la reproduction des bovins :..... 4
II- OBJECTIFS :..... III- MATERIELS & METHODES : ...

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1- Prparation des Animaux et conditions de logement:...

2- Rationnement, poids vif et la note dtat corporel :.. 7 3- Protocole de synchronisation et superovulation:.. 7 4- Prlvements sanguins et dosage dinsuline :... 8 5- Echographie et ponction folliculaire OPU (Ovum Pick Up) :.. 9 6- Production dembryons in vitro :...... 7- Analyses statistiques :........ 11 12

IV- RESULTATS :.... 13 1. Poids vif et note dtat corporel (NEC) :... 13 2. La concentration plasmatique des hormones mtaboliques (insuline) :.. 13 3. Les caractristiques folliculaires :... 14 4. la collecte des ovocytes et la production des embryons :....
16

V- DISCUSSION :. 19 1. Poids vif et note dtat corporel (NEC):..

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2. La concentration plasmatique des hormones mtaboliques (insuline) :.... 19 3. Les caractristiques folliculaires :. 20 4. la collecte des ovocytes et la production des embryons :.. VI - CONCLUSION :...
VII- REFERENCES :..... VIII- ANNEXES :..... 21

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LISTE DES TABLEAUX

Tableau. 1 : Les caractristiques de gnisses lentre en station exprimentale de Denguin.

Tableau. 2 : Caractristiques folliculaires (J2 et J5), la collecte des ovocytes et la production d'embryons in vitro par OPU J5 pour groupes Tmoin et PG.

Tableau 3. Nombre moyen des ovocytes collects par OPU J5 et les embryons produits in vitro J7 et J8 de culture in vitro pour groupes Tmoin et PG.

LISTE DES FIGURES

Figure. 1 : Cycle de Kreps et mcanisme dinteraction du propylne glycol (PG) avec la ctogense dans le foie des bovins.

Figure. 2 : Protocole exprimentale de synchronisation, superovulation et OPU chez le groupe tmoin et PG

Figure .3 : Ovum Pick-Up : dispositif de ponction (daprs Nibart et Marquant-Le Guienne 1995)

Figure. 4 : Une image chographique dun ovaire superovul.

Figure. 5: image de technique de ponction folliculaire par OPU.

Figure. 6 : Moyennes de poids des gnisses pendant la priode de restriction alimentaire.

Figure. 7 : Concentration plasmatique dinsuline (UI/ml) dtermine par radio-immunologie, les prlvements jugulaires sont pris 16:00 h de laprs-midi de jours 7 de cycle stral ( -10 min, 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min) chez le groupe control compar avec le groupe PG.

Figure. 8 : Nombre moyen dembryons totaux et de qualit 1 (Q1) produits par OPU-FIV J7 de culture en SOF dans les deux groupe Tmoin et PG.

Figure. 9 : Nombre moyen et les diffrents stades de dveloppement dembryons qualit 1 (Q1) produits par OPU-FIV J7 de culture en SOF dans les deux groupe Tmoin et PG

LISTE DES ABREVIATIONS :

BEN : Balance nergtique ngative. CIV: Culture In Vitro. COC : Complexe Ovocyte-Cumulus. ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay. Embryon B : Blastocyste ou jeune blastocyste. Embryon EB: Blastocyste panoui. Embryon HB: Blastocyste Eclos. FD : Follicule dominant. FIV : Fcondation In Vitro. GMQ : Gain moyen quotidien. GnRH: Gonadotropin Releasing Hormone. I.E.T.S: International embryo transfer society. IGF-1: Insulin-like growth factor. MIDATEST : Union Rgionale des Coopratives dElevage dAmlioration Gntique et dInsmination Animale du Sud-Ouest de la France. MIV: Maturation In Vitro. NEC: Note de dtat corporel. OPU-FIV: Ovum Pick Up Fcondation in vitro. PCR: Polymerase chain reaction. PG: Propylne Glycol. PIV: Production in vitro. qFSH: Porcine Follicle Stimulating Hormone. SOF: Synthetic oviduct fluid, minitube. SPZ : Spermatozode. TALP : Tyrode Albumine Lactate et pyruvate. TE: Transfert embryonnaire. UNCEIA : Union Nationale des Coopratives dElevage et dinsmination animale.

RESUME :
Lobjectif de ce travail a vis amliorer le nombre et la qualit des ovocytes collects et des embryons produits in vitro par lutilisation combine de lOvum-Pick-Up et de la Fcondation in Vitro (OPU-FIV) chez 16 gnisses laitires de race PrimHolstein (16 1,2 mois dge et 370 41,2 kg), en modifiant linsulinmie via un apport oral de 400 ml de Propylne Glycol pur (PG). Ces effets ont t observs dans un modle exprimental discriminant, dans lequel les gnisses ont t soumises une alimentation et une croissance restreinte avec un gain moyen quotidien (GMQ) de 600 g. Deux sessions dOPU ont t programmes 3 semaines dintervalle. Chaque session a t constitue chronologiquement des traitements suivants : synchronisation de chaleurs, superovulation et session de collecte dovocytes (OPU) J5 du cycle. Les ovocytes rcuprs ont t maturs et fconds in vitro, puis les embryons ont t cultivs dans un milieu SOF pendant 7 jours. La session dite Tmoin , comportant une administration quotidienne, par voie orale, heure fixe (16 heures) de 400 ml deau comme placbo, de J1 jusqu J8 du cycle stral ; tandis que la seconde session dite PG comportant une administration de 400 ml de PG sous forme liquide (Picot, France) de J1 J8. Pour chaque gnisse, des peses doubles ont t ralises tous les 15 jours. Une srie de prlvements de sang a t effectue la veine jugulaire le septime jour du cycle stral pour suivre la cintique des concentrations plasmatiques dinsuline avant et aprs administration du PG ou du placbo (-10, 0, 15, 30, 45, 60, 90 min). De plus, des chographies ont t ralises J 2 et J5 du cycle stral pour compter et classer les follicules selon leur taille. Le GMQ observ pendant lexprimentation a t de 590 g. La concentration plasmatique avec un pic observ entre 15 et 45 minutes aprs ladministration. Dans notre tude, les sessions dOPU-FIV ayant comport une administration de PG ont t associes une augmentation significative (P < 0.05) du nombre de petits follicules (2-3 mm) J2 du cycle, du nombre de follicules de 4-8 mm jour 5 du cycle (P < 0.05) et le taux de dveloppement embryonnaire (nombre total dembryons B, EB et HB rapport au nombre dovocytes insmins) (P < 0.05) et du nombre dembryons de qualite 1 produits in vitro J7 (1,5 fois), (P < 0.05).
Mots cls : Balance nergtique, OPU-FIV, Propylne Glycol, insuline plasmatique, ovocyte, cycle stral, blastocystes

ABSTRACT:
The objective of the work was to improve number, , quality of oocytes collected and embryos produced in vitro by combined use of Ovum Pick-Up-and in vitro fertilization (OPU-IVF) in 16 Holstein heifers (16 1.2 months old and 370 41.2 kg), by modifying insulin via oral intake of 400 ml of Propylene Glycol (PG). These effects were observed in an experimental discriminating model, in which heifers were subjected to a restricted diet and growth with a daily weight gain of 600 g. 2 OPU sessions were scheduled 3-weeks apart. For each session: estrus was synchronized, followed by superovulation and oocyte collection (OPU) on D 5 of the cycle. Recovered oocytes were matured, fertilized in vitro and zygotes cultured in SOF medium for 7 days. For the "Control session ", 400 ml of water (placebo) was administrated, orally, at 16 hours from D 1 to D 8 of the cycle, while for the second "PG session " 400 ml of liquid PG (Picot, France) was administrated from D1 to D8. Double weighing was performed every 15 days. A series of blood samples was collected from the jugular vein on the D7 of the cycle to monitor kinetics of plasma insulin concentrations before and after PG or placebo administration (-10, 0, 15, 30, 45, 60, 90 min). Ultrasounds were performed on D2 and D5 for follicle counting and classifying by size. DWG observed during the experiment was 590 g. Oral intake of PG increased insulin immediately with a peak plasma concentration observed between 15 and 45 minutes after administration. Administration of PG has been associated with a significantly (P < 0.05) increased number of small follicles (2-3 mm) on D2 of the cycle, number of follicles 4-8 mm in D5 day cycle as well as in vitro embryonic development rate (total number of embryos / number of inseminated oocytes), (P < 0.05) and number of grade1 embryos on D7 (1.5 times).

Keywords : Energy balance, OPU-IVF, Propylene Glycol, plasma insulin, oocyte, estrous cycle, blastocysts

I- INTRODUCTION :

Chez lespce bovine, le transfert embryonnaire est un outil de choix pour lacclration du progrs gntique et sa diffusion, en facilitant les changes nationaux et internationaux. Il participe aussi la prservation des ressources gntiques existantes grce au stockage des embryons dans des cryobanques. La production des embryons ncessite soit la ralisation de collectes in vivo, par lavage des cornes utrines ou soit la mise en uvre de mthodes de culture in vitro, partir dovocytes collects par OPU-FIV. Ces deux techniques reposent sur ladministration dun traitement de stimulation ovarienne ou superovulation par lHormone folliculo-stimulante (FSH), qui permet de stimuler la croissance folliculaire chez des femelles dites donneuses , de collecter des nombres dovocytes plus levs par OPU-FIV et dinduire des ovulations multiples dans le cas des collectes in vivo. (Douar et al., 1998). La rponse des donneuses au traitement de superovulation est extrmement variable, et de nombreux facteurs de variation, la fois intrinsques et extrinsques ont t rapports (Kafi et McGowman. 1997). Lexistence dune forte variabilit entre les femelles donneuses, du nombre dovulations et de nombre dembryons produits aprs superovulation, constitue une limite majeure du dveloppement de cette technique. Dans le contexte de diminution de la fertilit des vaches laitires, de nombreuses tudes ont montr que lutilisation des rserves nergtiques au cours du post-partum affectait la fonction de reproduction diffrents niveaux : 1/ axe hypothalamo-hypophysaire, 2/ ovaires, 3/ environnement utrin et 4/ qualit de lovocyte et dveloppement embryonnaire prcoce. En particulier, les variations du niveau nergtique de la ration, les modifications de certains constituants des rations comme les acides gras ou lajout de supplments modifiant les mtabolismes glucidique et nergtique ont t associs des modifications de la qualit des ovocytes ou des embryons, ainsi qu des variations quantitatives des nombres dovocytes collects ou dembryons produits (Leroy, 2010 ; Sinclair, 2010). Des approches similaires ont t conduites in vitro, en modifiant la composition des milieux de culture (Leroy, 2010 ; Bossaert et al., 2010 ; Sutton-Mac Dowall, 2010). Plusieurs de ces essais mettent en vidence le rle prpondrant du glucose et de linsuline comme signaux du mtabolisme sur la fonction de reproduction. Les principaux rsultats rapports dans la littrature sont prsents ci-aprs.

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1) Effet du niveau dapport nergtique sur la qualit des gamtes et le dveloppement embryonnaire :
Chez les vaches, le dficit nergtique post-partum a t associ des effets spcifiques sur la croissance folliculaire et la qualit de l'ovocyte (Snijders et al., 2000), en relation avec des concentrations dIGF et dinsuline peu leves (pour revue, Humblot et al., 2008). De mme, chez des gnisses allaitantes, une rduction de 2,8 fois 0,8 fois les besoins dentretien a t associe une moindre survie des embryons, avec des mortalits embryonnaires observes dans les 14 jours suivant la fcondation (Dunn et al., 1999). Toutefois, chez les gnisses, les effets dun apport nergtique restreint court terme sont parfois peu marqus sur la fertilit et la production dembryons in vivo et in vitro. Une suralimentation a galement t lie une diminution de la qualit des embryons. Chez des gnisses suralimentes ou trop grasses, une altration de la qualit des gamtes et du dveloppement embryonnaire a t rapport in vivo (McEvoy et al., 1995a ; Negrao et al., 1997) et in vitro (Popadopoulos et al., 2001), dans le cas de cycles superovuls. Dans le cas de gnisses suralimentes, Freret et al. (2006) ont observ une stimulation de la croissance folliculaire concomitante une altration du dveloppement embryonnaire. Avec lobjectif damliorer les rsultats de production dembryons obtenus par OPU-FIV, ces auteurs ont alors appliqu une restriction alimentaire de plusieurs semaines, Dans cette approche, une priode de 6 semaines a t ncessaire pour amliorer le dveloppement embryonnaire. Ceci montre que les conditions nutritionnelles optimales pour stimuler la croissance folliculaire ne sont sans doute pas tout fait les mmes que celles recherches pour favoriser le dveloppement prcoce de lembryon. Les essais de rgimes squentiels en dbut de lactation tendent confirmer ces observations : Garnsworthy et al. (2009) ont rcemment observ une amlioration de la fertilit en proposant une squence de rations alimentaires aprs vlage visant : 1) augmenter le taux plasmatique dinsuline jusqu la reprise de cyclicit des vaches (avec lobjectif de stimuler la croissance folliculaire) puis 2) diminuer la concentration dinsuline pendant la priode de mise la reproduction chez des vaches laitire en dbut de lactation (avec lobjectif de favoriser le dveloppement embryonnaire). Ces rsultats mettent en vidence le rle prpondrant de certains mdiateurs mtaboliques comme linsuline, qui agissent sur la fonction ovarienne (Webb et al., 2004 ; Humblot et al., 2008).

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2) Effets de linsuline et du glucose sur la croissance folliculaire et le dveloppement embryonnaire :

Chez la vache laitire, la concentration sanguine du glucose reflte la gluconogense qui correspond la synthse de glucose partir des prcurseurs non glucidiques (lactate, acides amins et glycrol), alors que la glycolyse correspond la formation de glucose partir du glycogne stock dans le foie et dans les muscles. Les diffrents types des glucides proviennent de lapport alimentaire (Rizos et al., 2008). Le glucose est le principal substrat fournisseur dnergie pour lovaire chez les bovins (Rabiee et al., 1997), est mtabolis pour la synthse de substrats ncessaires la maturation de lovocyte (Sutton-Mc Dowall, 2010) et aussi constitue un prcurseur nergtique majeur chez les embryons bovins post-blastulation (Bonland et al., 2001). Les variations dinsuline sont galement des signaux mtaboliques qui rgulent la fonction de reproduction. La baisse de la fertilit chez la vache qui est lie un retard dovulation pendant la premire vague folliculaire a t associe une baisse de concentration plasmatique dinsuline (Beam et Butler 1997 ; Butler, 2000). Gnralement, la baisse de concentration plasmatique en insuline est associe une BEN au dbut de la priode postpartum (McCann et al., 1986). En outre, Miyoshi et al. (2001) ont mis en vidence que la baisse des concentrations plasmatiques dinsuline, concomitante une BEN affecte le dveloppement folliculaire depuis le stade de follicule primordial jusquau stade antral. Il en rsulte un fonctionnement anormal de follicule tertiaire et de corps jaune. Linsuline stimule localement la croissance folliculaire, la strodognse. In vitro, linsuline stimule le fonctionnement des cellules folliculaires chez plusieurs espces y compris la vache (Spicer et al., 1993). Gong (2002) ont montr que ces effets bnfiques de linsuline taient indpendants de laxe hypothalamo-hypophysaire. Dailleurs, les transporteurs du glucose prsents au niveau ovarien comme GLUT1 et GLUT3 sont indpendants des modifications des niveaux dinsuline. Au niveau central, des faibles concentrations dinsuline et de glucose au cours du post- partum inhibent la scrtion hypothalamique de GnRH et par consquent la scrtion pulsatile de LH par lhypophyse. Au niveau ovarien, la croissance folliculaire est altre directement en cas de faibles niveaux dinsuline, IGF1, leptine et des concentrations leves dAGNE (Leroy et al., 2008).

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3) Effets dune supplmentation en propylne glycol sur le mtabolisme et la reproduction des bovins :
Le Propylne glycol (PG) chimiquement nomm par 1,2-propanediol; C3H8O2 est un

prcurseur gluconogniques largement utilis, depuis les annes 1950 (Johnson 1954; Maplesden 1954) et encore utilis nos jours, pour traiter le problme de dsquilibre alimentaire et lutter contre la ctose rsultant dune balance nergtique ngative (BEN) chez les vaches laitires aprs vlage. Plus rcemment, le PG a t utilis comme additif alimentaire pour amliorer la production laitire (Nielsen et Ingvartsen 2004). Beaucoup dtudes ont montr que le PG a un effet bnfique sur la fermentation au niveau du rumen, entranant une diminution du ratio molaire de lactate/propionate des acides gras volatils du rumen. Linfluence dun apport de PG sur le pH ruminal a t rapporte par laugmentation de la proportion de propionate dans le rumen induisant une baisse de pH ruminal (Shingfield et al. 2002a). Cette proportion de propionate est probablement induite par la grande digestibilit des fibres dans lalimentation qui stimule la croissance de certains microbes. Cette flore bactrienne a la capacit de transformer rapidement le PG en Propionate (Czerkwaski breckenridge 1973). Aprs ladministration orale de PG, une portion de PG est mtabolise en propionate, mais la majorit de PG schappe du rumen et est mtabolis sous forme de glucose au niveau de foie, principalement par la voie lactaldhyde, aprs loxydation pour donner du lactate. Le PG est transport vers le foie par le systme porte o il va se transformer en pyruvate et ventuellement en glucose via loxaloactate. En rponse ladministration de PG, la concentration plasmatique de glucose et dinsuline augmente comme prvu (Formigoni et al., 1996).

Figure.1 : Cycle de Kreps et mcanisme dinteraction du propylne glycol (PG) avec la ctogense dans le foie des bovins. Les voies gluconogniques sont indiques par les lignes continues daprs Nielsen et Ingvartsen (2004).

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En outre, (Christensen et al., 1997) ont montr que la mthode dadministration du PG et sa forme liquide ou solide sont importants pour optimiser laugmentation de la concentration dinsuline dans le plasma. Miyoshi et al. (2001) ont dmontr que ladministration orale de PG liquide entraine un effet plus marqu sur la concentration plasmatique dinsuline que ladministration de PG en poudre incorpor dans la ration ou distribu sous forme de concentr. La raison pour laquelle leffet sur linsuline reste peu marqu avec le PG mix avec lalimentation est li au temps de consommation, beaucoup plus long que la forme liquide, administre directement dans le rumen. (Nielsen et Ingvartsen 2004). Plusieurs tudes ont donc observ une augmentation de taux plasmatique dinsuline lie a laugmentation rapide du glucose sanguin aprs un apport de PG chez les vaches (Studer

1993 ;Butler et al., 2006 ; Christensen et al., 1997 ; Miyoshi et al., 2001) et les gnisses (Grummer

et al., 1994, Hildago et al., 2004). Studer et al (1993) ont suggr que le propionate ou un autre mtabolite rsultant du catabolisme du PG stimulent la scrtion dinsuline par le pancras (Webb et al., 1999). Les mcanismes exacts qui expliquent cette augmentation ne sont pas encore dmontrs. En outre, ladministration journalire dun apport de PG chez des vaches au dbut de lactation amliore la fertilit de ces vaches aprs le postpartum (Miyoshi et al., 2001). La supplmentation nergtique via ladministration de PG augmente les concentrations dinsuline, qui stimulent le fonctionnement ovarien, au niveau des cellules de granulosa et la prolifration des cellules thcales (Alvarez et al., 2000). En revanche, la stimulation continuelle de linsulinmie induit une rduction de rponse sur la production dembryon in vivo chez les donneuses (Nielsen et Ingvartsen 2004). Les effets toxiques de ladministration de PG chez la vache nont pas t dcrits dans la littrature. Une enqute prliminaire danoise sur les effets dune supplmentation en PG sur la performance de 300 vaches laitires a montr chez certaines vaches un phnomne dhyperventilation et de somnolence aprs ladministration de 40g / j de PG. Ces symptmes ont nanmoins disparu aprs 3 4 jours (Hindhede 1976). De plus, il a t observ que le traitement de la ctose par une dose relativement leve de PG (800 1800 g par jour) provoque des symptmes de salivation et dataxie (Johnson 1954).

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II- OBJECTIFS : Lobjectif du travail est damliorer la rponse ovarienne au traitement de superovulation ainsi que la quantit et la qualit des ovocytes collects par OPU et des embryons produit in vitro par fcondation in vitro, en modulant linsulinmie dans un modle exprimental discriminant chez des gnisses laitires : sous alimentation restreinte et recevant un apport nergtique oral de propylne glycol (PG).

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MATERIELS & METHODES: 1- Prparation des Animaux et conditions de logement:

Le travail a t ralis dans la station exprimentale de MIDATEST Denguin dans le Sud Ouest de la France en collaboration avec lUNCEIA et lunit BDR de lINRA sur 16 gnisses de race PrimHolstein prsentant les caractristiques suivantes lentre en station (Tableau.1) :

Tableau 1. Caractristiques de gnisses lentre dans la station exprimentale de Denguin.

Paramtre (n=16) Age (mois) Poids (Kg) Note dtat corporel

(chelle de 0 5)

Mean S.E.M 16 1,2 370 41,2 2,3 0,3

Les gnisses ont t soumises une consultation de service vtrinaire lors de lachat pour vrifier leur tat de sant gnral. Des prises de sang effectues sur chaque gnisse ont t envoyes ensuite vers le laboratoire danalyse biologique des Pyrnes, le laboratoire dpartementale et Aveyron Labo pour confirmer leur statut vis--vis de la tuberculose, brucellose, leucose, IBR, BVD, nosporose, paratuberculose, et fivre catarrhale ovine (FCO) par des tests ELISA ou PCR. Aprs leur arrive, les animaux ont t rpartis en 2 lots de 8 gnisses, apparis selon leurs poids et aprs vrification par voie rectale et sous chographie de leur activit ovarienne. Une injection dIvermectine (Ivomec 1 ml /50 kg) a t ralise par voie sous cutane, pour la prvention contre les infestations parasitaires.

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2- Rationnement, poids vif et note dtat corporel :

La gestion alimentaire des gnisses a t spare en deux priodes : La priode dadaptation de 4 semaines qui a dbut ds lentre des animaux en station, au cours de laquelle un rgime ad-libitum base de foin volont et de 3 kg de concentr commercial a t distribu 8 heures chaque matin, avec un gain moyen quotidien (GMQ) de 950 g/j sur lensemble de la priode (Annexe. 1). La priode dalimentation restreinte, dmarre 4 semaines avant le premier traitement de synchronisation, au cours de laquelle les animaux ont reu 1.5 kg /j de concentr et 6,94 kg/j de foin pour restreindre le GMQ 600 g/j. La note dtat corporel, a t enregistre mensuellement pour chaque gnisse, pendant la priode dexprimentation, en fonction de la grille dcrite par Lowman et al. (1976), avec un score de 0 indiquant une maciation grave et un score de 5 en cas dobsit. La croissance corporelle des gnisses a t suivie tout au long du lexprimentation par des peses doubles ralises tous les 15 jours, le matin.

3- Protocole de synchronisation et superovulation:

Le protocole a comport deux sessions dOPU-FIV pour les 16 gnisses durant la priode de lexprimentation. La synchronisation des chaleurs de chaque groupe de gnisses a t ralise avec un implant cutan de 3 mg de Norgestomet (Crestar intervet, Angers, France) insr sous la surface convexe de loreille pendant 9 jours. Une injection intramusculaire de 2.5 ml de GnRH

(Receptal intervet, Angers, France) a t ralise au moment de la pose de limplant. Deux jours avant le retrait de limplant, une injection de 500 ug de Cloprostenol i.m. (Estrumate ScheringPlough Veterinaire, Levallois-Perret, France) a t effectue. Aprs le retrait dimplant, les chaleurs seront dtectes visuellement. Le jour des chaleurs induites a t dfini comme jour de rfrence (J0). Le traitement de superovulation a t initi 2 jours et demi aprs la dtection des

chaleurs induites, avec 5 injections intramusculaires de FSHp, Follitropine porcine (Stimufol Ulg FMV), de doses dcroissantes (2 ml, 1.5 ml, 1 ml, 0.6 ml et 0.4 ml), 2 fois par jour 12 heures dintervalle, pendant 3 jours (figure 2). Le protocole a permis de tester lapport oral de PG, sous forme dun carr latin, au cours duquel chaque gnisse a t son propre tmoin : une administration de 400 ml deau a t effectue par

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voie orale partir de J1 de cycle stral, et ce pendant 8 jours, heure fixe (16 heures) pour la , premire session dite Tmoin (n=16), tandis que la deuxime session dnomme PG moin (n=16) a comport ladministration de 400 ml de propylne glycol (Monopropylene Glycol USP : administration (Monopropylene lot 9309) pur (Figure. 2) Pour des raisons dorganisation pratique et de faisabilit, les 16 gnisses de chaque groupe ont , t synchronises en 2 lots (lot de 8 gnisses) conduits une semaine dintervalle.

Figure.2 : Protocole exprimental de synchronisation, superovulation et OPU chez le groupe tmoin trait par 400 ml deau (n=16) et le groupe PG trait par 400 ml de Propylne Glycol (n=16) avec les prlvements sang 400 sanguin J7 de cycle stral.

4- Prlvements sanguins et dosage dinsuline :

Le sang a t prlev la veine jugulaire, J7 du cycle stral, afin de doser l linsuline

plasmatique pour les groupes tmoin et PG et de suivre la cintique plasmatique aprs s administration orale de PG. Aprs la dsinfection lalcool de la rgion du prlvement le sang a prs prlvement, t prlev dans des tubes Vacutainer sous vide (9 ml), contenant du Citrate de Sodium 3.8 %. , Ces prlvements ont t raliss chez les 16 gnisses, en commenant 10 min avant ladministration de leau ou du PG, et aux temps successifs suivants par rapport eau ladministration : 0, 15, 30, 45, 60, 90 min. Le sang a t centrifug immdiatement aprs prlvement 2500 rpm pendant 10 min 4C, et stock 80 C jusqu lanalyse biochimique de linsuline par le laboratoire dhormonologie de lUNCEIA Maisons-Alfort. Le dosage de linsuline a t effectu par une technique radio-immunologique (RIA) qui repose sur la immunologique (RIA), -8-

comptition entre linsuline marque lIode 125 (porcine) et linsuline d chantillons des mesurer, vis--vis dun nombre limit de sites anticorps anti vis anti-insuline fixs sur les tubes (Insulin-CT
; MP Biomedicals, New York 10962, USA) USA).

5- Echographie et ponction folliculaire OPU (Ovum Pick Up) :

Les examens chographiques ont t raliss le jour 2 de cycle stral, avec un chographe Tringa 50S VET (Esaote Pie Medical, Hospimedi, Valdmpierre, France) quip dune sonde transrectale de 5 et 7.5 MHz pour compterle nombres de follicules et les classer selon leur taille e taille. Un autre examen chographique a t ralis J5, au moment de lOPU. A chaque examen, les nombres de follicules ont t comptabiliss selon 3 classes de taille : petit (2-3mm), moyen (4-8 it mm) et grand ( 8 mm). LOPU est une technique permet de collecter de faon rpte, par voie transvaginale sur un animal debout, les ovocytes intra ovariens par ponction des follicules visualiss sur lcran dun intra-ovariens chographe. La ponction des folliculaires ovariens a t effectue les jours 5 de cycle stral aprs superovulation, dans la salle de collecte de la station, quipe des cages de contention et dune table roulante qui porte un chographe, une pompe daspiration et un kit daspiration comportant daspiration une tuyauterie qui se lie au support de laiguille dune part et au tube de collecte reli la pompe part, vide dautre part (Figure. 3).

Figure .3 : Ovum Pick-Up : dispositif de ponction ( daprs Nibart et Marquant-Le Guienne 1995) Le

Aprs la vidange de rectum, le nettoyage de la rgion vulvaire et du prine avec leau savonne, la rgion est dsinfect avec une solution de polyvidone iode (Vetedine Solution de dsinfecte
Vetoquinol). Une anesthsie loco loco-rgionale par voie pidurale basse (dans lespace intervertbral

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entre le sacrum et le premier os coccygien) base de Lidocane (Laocane de Schering-Plough

vtrinaire, 4 ml) a t ralise pour le bien bien-tre des gnisses.

La visualisation des ovaires et la quantification des follicules ovariens sur lcran de lchographe (Pie Mdical PARUS 240) ont t possibles grce une chographie transvaginale, utilisant un guide lubrifi portant la sonde dchographe (frquence 75 MHZ). (Figure. 4). MHZ).

Figure. 4 : Une image chographique dun ovaire superovul. Figure 5: image de technique de ponction folliculaire par OPU OPU.

Les follicules ont t ponctionn par des aiguilles de 18 G1 BC montes sur des supports ponctionns striles lis la pompe vide (Cook Veterin Veterinary rgl -0.38 mmgh) relie un systme de tuyauterie en silicone (Tygon)(Figure. 5),. Ensuite, le contenu folliculaire a t recueilli dans des . tubes striles de 50 ml (un tube par animal) contenant du milieu de collecte (EuroFlush de imvTechnologies) avec 1 ml dhparine sodique (Hparine Choay de Sanofi avertis Les tubes ) avertis). contenant les milieux sont placs dans un rchauffeur (COOK V-FTH-2000) calibr 38,5C 2000) pour viter tout choc thermique aux ovocytes ovocytes. Les collectes des ovocytes ont utilis un kit daspiration et un support daiguilles striles pour chaque gnisse. Le changement de laiguille de ponction a t effectu trs rgulirement, chaque e fois que 5 follicules ont t ponctionns ponctionns. Les ovocytes collects au cours d deux sessions dOPU J5 pour la production dembryon des ont t jugs et nots selon les critres morphologiques classiques (cytoplasme et cellules de cumulus) dcrits par Marquant Leguienne dans MarquantlUNCEIA en quatre catgories ( es (Annexe. 2). lAtlas de lovocyte Bovin (1998) de

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6- Production dembryons in vitro :

Le contenu folliculaire rcupr lors de lOPU J5 a ensuite t transport vers le laboratoire pour la recherche des ovocytes. Le milieu a t filtr grce un tamis puis rinc par le milieu de collecte EuroFlush hparin, afin de rcuprer les ovocytes immatures. Lopration a t mise en place dans une hotte flux laminaire avec de matriels striles. Le mode opratoire de la production dembryons in vitro selon les instructions techniques de lUNCEIA a t suivi.

A- La maturation in vitro (MIV):

Les ovocytes ont t ensuite isols dans des boites de ptri de 30ml et subissent deux lavages successifs dans un milieu de collecte EuroFlush non hparin, un troisime lavage dans le milieu de maturation compos de Medium 199 (Sigma) additionn de srum de veau ftal (SVF), antibiotique base de gentamicine , hormones hypophysaires LH / FSH, Hormone strodien stradiol 17, et facteur de croissance EGF. Seuls les ovocytes valus de bonne qualit (Q1, Q2 et Q3) de chaque gnisse ont t mise dans une plaque 4 puits strile contenant 500 l de milieu de maturation, incubs pendant 22 heures dans une tuve 38,5 C, sous 5 % de CO2 dans lair.

B- La Fcondation in vitro (FIV) :

Les ovocytes matures de chaque gnisse, sont insmins avec des spermatozodes (spz) dun taureau agre la monte publique ENZO (78773-3654) de race Inra 95. Les paillettes de sperme, stockes dans lazote liquide -192 C ont t dcongeles dans un bain marin de 37,5 C en 30 secondes au minimum, la slection de spermatozodes vivant par centrifugation sur un gradient de densit (BoviPure). Une couche de BoviPure Top de faible densit est dpose sur une couche de BoviPure Bottom de forte densit pour composer un gradient discontinu. Le culot est rcupr aprs centrifugation. La concentration spermatique utilise pour la FIV est mise en place par la quantification des spermatozodes dans la cellule de Thoma sous un microscope invers (dilution dans 100 l pour une concentration finale de 1 10 spz/mL dans chaque puits). La fcondation des ovocytes aura lieu dans une plaque 4 puits contenant de milieu de fcondation base de Tyrode Albumine Lactate et pyruvate (TALP) avec de bovine serum albumin (BSA), Hparine et de penicillamine hyptaurine epinephrine (PHE : stimulant la motilit des spermatozodes). La co-incubation avec les ovocytes est ralise pendant 18 heures dans une tuve 38,5 C, sous 5 % de CO2 dans lair. - 11 -

C- Culture des embryons in vitro (CIV) :

Les possibles zygotes ont t soumis une dcolonisation pour liminer lexcs de spermatozodes et de cellules du cumulus demeurant aprs FIV et incubs pendant 6 jours dans une plaque puits contenant 420l de milieu de culture de base SOF (synthetic oviduct fluid, minitube) avec de BSA, pyruvate de Na, des acides amins et gentamycine sous 400l dhuile minral (Sigma-M4810) 38,5 C, dans une tuve sous 5 % de CO2 dans lair et 100% dhumidit. Les embryons produits in vitro sont valus aprs 7 et 8 jours de la culture in vitro par leur stade de dveloppement et leur qualit selon la Socit Internationale de Transfert Embryonnaire lIETS (Annexe. 3).

7- Analyses statistiques :
Le model statistique PROMIX (SAS) a permis de comparer les caractristiques de croissance folliculaire (nombre et taille des follicules), production dembryons (nombres et qualit des ovocytes et des embryons), et les niveaux dinsuline entre les groupes tmoin et supplments au PG.

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IV- RESULTATS : 1- Poids vif et note dtat corporel (NEC) :

La croissance corporelle a suivi une augmentation linaire depuis le dbut de la priode de restriction alimentaire de (371.06 22.73 kg) (424.75 22.75 kg). (Figure. 6). Et comme convenu en ntres objectif le gain moyen quotidien calcul dans la priode de restriction alimentaire tait 590 g. De plus, la note dtat corporel la fin de la priode exprimentale tait 2.55 0.14.

430 420 410 400 390 380 370 360 350 340 20-fvr 09-mars 5-avr. 04-mai

Poids (Kg)

Moyenne du poids (Kg)

Priode de restriction alimentaire Figure. 6 : Moyens de poids des gnisses pendant la priode de restriction alimentaire.

2- La concentration plasmatique des hormones mtaboliques (insuline) :

Les concentrations plasmatiques dinsuline J7 de cycle stral 10 min avant ladministration orale de 400 ml deau (groupe control) et 400 ml de Propylne Glycol (groupe PG) et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min aprs ladministration deau ou PG sont prsentes dans la (Figure. 7). La valeur de concentration plasmatique dinsuline nest pas diffrente significativement entre les deux groupes dans les 10 minutes avant ladministration orale de 400 ml deau (groupe Tmoin) ou 400 ml de Propylne glycol (groupe PG), (176.95 pg/L vs 215.09 pg/L), (P > 0.05). Au moment de ladministration du PG par per os (16:00h) de J0 du cycle stral, on a observ une diffrence significative (P < 0.05) de concentration plasmatique dinsuline entre le Tmoin et le PG. Le niveau de concentration dinsuline a t augment aprs 15 minutes dadministration de PG pour atteindre le niveau significatif entre le Tmoin et le PG (P <0.01). (Figure. 7).

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500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -10

Concentration d'insuline (pg/L)

a a a a

a c b c c c c c Tmoin PG

15

30

45

60

90

120

Temps (Minutes)

Figure. 7 : Concentration plasmatique dinsuline (pg/L) dtermine par radio-immunologie, les prlvements jugulaires sont pris 16:00 h de laprs midi de jours 7 de cycle stral ( -10 min, 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min) chez le groupe control () (n=16) administr en per os 400 ml deau compar avec le groupe PG () (n=16) issus 400 ml de Propylne Glycol par voie buccale. (a versus b) (P < 0.05) et a versus c, (P < 0.01), la diffrence est significative).

Le pic de concentration plasmatique dinsuline t enregistr entre 15 et 45 minutes aprs ladministration de PG (414.74 vs 244.93 pg/L) et (414.74 vs 244.93 pg/L), respectivement, avec une lvation significative (P < 0.01) pour le PG. (Figure. 7). A partir de 45 jusqu 120 minutes, le niveau de concentration systmique dinsuline de groupe PG commence rduire mais en gardant toujours des diffrences significatives (P < 0.01) au bout de chaque prlvement (60, 90 et 120 min) compar avec celui du Tmoin.

3- Les caractristiques folliculaires :

Le nombre moyen et lcart type (LsMeans S.E.M) des follicules (2-3 mm, 4-8 mm, > 8 mm et < 8 mm) visualiss par chographie jours 2 de cycle (2 jours avant le traitement de superovulation) et au moment de lOPU jour 5 de cycle stral pour le groupe Tmoin compar a celle de PG, sont prsents dans le (Tableau. 2).

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Tableau 2. Caractristiques folliculaires visualiss par chographie en J2 et J5 de cycle, le comptage de nombre

folliculaire selon la taille de follicule (petit : 2-3 mm, moyen : 4-8 mm, et grand : > 8 mm) pour groupes Tmoin et PG (LsMeans S.E.M.).

Groupe Tmoin (n=16) LsMeans S.E.M Caractristiques Folliculaires : Jours 2 : (2 jours avant FSH) Follicules (2 3) mm Follicules (4 8) mm Follicules > 8 mm Follicules < 8 mm Jours 5 : (Au moment de lOPU) Follicules (2 3) mm Follicules (4 8) mm Follicules > 8 mm Follicules < 8 mm

Groupe PG (n=16) LsMeans S.E.M

7.31 1.88 x x 0.88 9.19 x

a-x

2.60 1.59 0.89 2.56

9.69 1.56 x 0.13 11.25 x

b x

2.98 1.50 0.34 11.38

0.06 y 13.63 a - y 5.5 y 13.69 a - y

0.25 7.97 6.36 7.93

0.19 y 19.50 b - y 2.81 19.69 b - y

0.54 9.55 2.97 9.42

a et b lettres diffrences dans la mme ligne (a vs b), (P < 0.05). x et y lettres diffrences dans la mme colonne (x vs y), (P < 0.05) la diffrence est statiquement significative

Au jour 2 de cycle oestral, le nombre moyen de follicule (2-3 mm) tait amlior avec une diffrence statistiquement significative (9.69 vs 7.31), (P < 0.05) dans le groupe PG par rapport au groupe Tmoin. Ce nombre moyen de follicule (2-3 mm) de chaque groupe J2 de cycle tait trs lev (P < 0.05) en comparant avec celui qui est compt au moment de lOPU (J5 de cycle stral) por le superovulation. De plus, une difference significative entre les deux groupes a t observe dans la population folliculaire de 4-8 mm (13.63 vs 19.50), (P < 0.05) aprs la superovulation (J5 de cycle oestral) pour le groupe PG par rapport au Tmoin. Tandis que le nombre moyen des follicules (4-8 mm) tait plus lev en de J5 par rapport J2 de cycle stral. Le nombre moyen de folliclule de 2-8 mm (< 8 mm) a t amlior significativement J5 de cycle par le traitement de PG (13.69 vs 19.69), (P < 0.05). En outre, le traitement de FSH (J5) avait multipli le nombre moyen de la population folliculaire entre 2 et 8 mm (< 8 mm), par 1.5 par rapport celui de J2 pour les deux groupes (13.69 vs 9.19), (P < 0.05) (Tableau. 2). De plus, on a observ aussi que le nombre moyen de follicule (> 8 mm) entre J2 et J5 chez le groupe Tmoin a t amlior significativement (1.88 vs 5.5), (P < 0.05) mais aucune diffrence a t mise en vidence entre le groupe Tmoin et PG que se soit J2 ou J5 de cycle.

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4- La collecte des ovocytes et la production des embryons :

Le nombre moyen et lcart type (LsMeans S.E.M) des ovocytes collects par ponction folliculaire et la production dembryon in vitro J7 et J8 de culture in vitro pour le groupe PG compar a celle de Tmoin, sont prsents dans le (Tableau. 3).
Tableau 3. Nombre moyen des ovocytes collects et les embryons produits in vitro par OPU J5 pour groupes
Tmoin et PG (LsMeans S.E.M.). Les pourcentages sont calculs sur les ovocytes recueillis (totaux) et embryons segments respectivement pour les ovocytes de collecte et des donnes de production d'embryons J7 et J8 de culture en SOF.

Groupe Tmoin (n=16) LsMeans S.E.M Ovocytes Collects : Ovocyte Total (Q1,2,3 et 4) Ovocyte Qualit 1-3 (Q1, Q2 et Q3) % Ovocyte 1-3 Ovocyte Qualit 1 (Q1) % Ovocyte Q1 Production dembryons in vitro : Ovocytes insmins Embryons segments % de segmentation Embryon total J7 (B, EB et HB) % dembryon total J7 / insmins % dembryon total J7 / segments Embryon (B, EB et HB) J7 de Q1 % dembryon J7 (Q1) / insmins % dembryon J7 (Q1) / segments Blastocyste (B) de J7 (Q1) Blastocyste Expans (EB) de J7 (Q1) Blastocyste Eclos (HB) de J7 (Q1) Embryon total J7 +8 (B, EB et HB) % dembryon total j7 +8 / insmins % dembryon total j7 +8 / segments Embryon (B, EB et HB) J7 + 8 de Q1 % dembryon J7 +8 (Q1) / insmins % dembryon J7 +8 (Q1) / segments 18.00 14.81 82.3 5.38 29.9 8.88 8.95 3.74 -

Groupe PG (n=16) LsMeans S.E.M 20.19 17.44 86.4 5.75 28.5 12.45 11.61 3.24 -

14.75 14.19 96.2 6.1 41.1 a 42.7 a 4.5 a 30.5 a 31.7 1.06 2.81 0.63
a

8.96 8.83 3.68 3.01 1.53 2.46 1.09 4.18 3.37 -

17.31 15.75 91 8.4 48.4 b 53.2 b 7.1 b 40.8 b 44.8 1.38 4.94 0.75
b

11.48 10.75 6.22 5.47 1.78 3.75 1.81 6.23 5.47 -

7.0 47.4 49.3 5.0 33.9 35.2

a

8.4 48.7 53.5 7.1 40.8 44.8

b

a versus b, (P < 0.05).

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Dans notre tude, 960 follicules ont t ponctionns par OPU J5 (Tmoin+PG), un total de 611 ovocytes a t collect, seuls 517 ovocytes de qualit Q1, Q2 et Q3 ont t mis en maturation in vitro. Aprs lOPU, le taux de rcupration (nombre dovocytes recueillis par rapport au nombre de follicules aspirs) ne diffraient pas entre le groupes Tmoin et PG (63,72 % vs 63,58 %). (Donnes non prsentes). Cela peut montrer une stabilit technique envisag pendant la comptabilisation de follicule par chographe, la suivie de mme rythme mthodologique lors de ponction folliculaire, ainsi pendant la recherche des ovocytes. Selon nos rsultats, le nombre moyen dovocytes totaux collects ainsi le nombre moyen dovocytes de qualit (Q1, Q2, Q3) ne prsentent aucune diffrence statiquement significative (P > 0.05) chez groupe PG par rapport au groupe Tmoin. De plus, aucun effet de PG sur la qualit morphologique des ovocytes ont t observ. Un total de 516 ovocytes a t matur est insmin in vitro, alors 247 embryons entre blastocystes, blastocyste panoui et clos (B, EB et HB) ont t dvelopps aprs 7 ou 8 jours de culture in vitro dans le milieu SOF. Le taux de segmentation a t de 96.2 % pour le groupe Tmoin et 91 % pour le groupe PG avec une diffrence non significative (P > 0.05). (Tableau. 3). Ce taux de segmentation qui nest pas significatif peut monter une stabilit technique lie la manipulation des ovocytes pendant la maturation in vitro ainsi le bon choix de la semence lors de la fcondation in vitro. Nous avons observ, aprs 7 jours de culture, une amlioration significative (P < 0.05) de taux de dveloppement dembryons par rapport au nombre dembryon segment et ovocytes

insmines a t mise en vidence chez le groupe PG en comparaison avec le groupe Tmoin (53.2 % vs 42.7 % et 48.4 vs 41.1 respectivement). Cette diffrence entre le groupe PG et Tmoin a t galement apparue dans le taux de dveloppement des blastocystes Q1 Jour 7 par rapport au nombre dembryon segment (44.8% vs 31.71%) ou insmin (40.8% vs 30.5%) et pour le nombre moyenne des blastocystes (B, EB et HB) de Q1 J7 qui a t multipli par 1.5 J7 chez le groupe trait par le PG compar avec celle du Tmoin. (Figure. 8). (P < 0.05) (Figure. 8).

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Tmoin Nombre moyen d'embryon 7.1 a 10 8 6 4 2 0 4.5 b

PG 8.4 6.1

Total B, EB, HB (Q1)

Total B, EB, HB (Q1,Q2,Q3)

Embryons de J7 (culture en SOF) Figure. 8: Nombre moyen dembryons totaux et de qualit 1 (Q1) produits par OPU OPU-FIV J7 de culture en SOF dans les deux groupe Tmoin et PG. (a vs b), (P < 0.05).

Le nombre dembryon total (B, EB et HB) de qualit (1, 2 et 3) J7 ne montre aucune e dffirence significative entre le Tmoin et le PG. (Figure. 8). Dautre, Il est intressant de montrer que jour 7 de culture, la plus part des embryons sont dvelopps au stade de B, EB, HB pour le groupe PG compar au groupe Tmoin dont une partie suprieure des embryons va achever son dveloppement jour 8 d culture. de En relation avec le stade des embryons dans la prsente tude, le nombre moyen de blastocyste expans t multipli par 1.75 pour le groupe PG par rapport au Tmoin. ( (Figure. 9). a
5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 B BE Q1 J 7 de culture en SOF Figure. 9 : Nombre moyen et les diffrents stades de dveloppement dembryons qualit 1 (Q produits par (Q1) OPU-FIV J7 de culture en SOF dans les deux groupe Tmoin et PG. (a vs b), (P < 0.05). BH Tmoin PG b

Nombre moyen d'embryons

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V- DISCUSSION : 1- Poids vif et note dtat corporel (NEC) :

Grce aux doubles peses rgulires, il a t possible de vrifier que le GMQ observ est concordant avec lobjectif souhait. Il est important de signaler que les gnisses nont pas t sous alimentes de faon drastique, mais seulement soumises une restriction diminuant leur croissance 590 g/j : le GMQ a t diminu mais les besoins dentretien et de croissance ont t couverts 100 % en fonction de ce GMQ impos. La dure dapplication de la restriction alimentaire devait tre compatible avec les conditions de terrain. Dans notre tude, la supplmentation orale de PG liquide na pas affect lapptence des gnisses et lingestion alimentaire a t normale. En revanche Hildago et al. (2004) ont montr que ladministration orale de PG liquide long terme pouvait causer la rduction de lingestion alimentaire.

2- La concentration plasmatique des hormones mtaboliques (insuline) :

Le Propylne Glycol est un prcurseur glycognique qui est absorb rapidement dans le rumen. Il est transform majoritairement partir de PG en glucose dans le foie, alors quune moindre partie du PG est mtabolise en propionate au niveau du rumen (Nielsen et Ingvartsen 2004). Grummer et al. (1994) ont mis en vidence quune dose de 296 ml de PG tait presque aussi efficace quune dose de 887 ml de PG dans un rgime alimentaire restreint. Dans notre tude, lapport nergtique oral de 400 ml de Propylne Glycol sous forme liquide, a induit une augmentation immdiate de la concentration systmique dinsuline aprs 15 minutes de ladministration de PG, chez des gnisses soumises une alimentation restreinte pendant 2 mois. Ceci conforte le modle exprimental, qui se voulait discriminant, en soumettant les gnisses un rgime hypo-insulinmique. La rponse ladministration de PG a gnr un pic dinsuline entre 15 et 45 minutes aprs son administration. Dans le mme cadre, Studer et al. (1993) et Grummer et al. (1994) avaient rapport que laugmentation postprandiale des concentrations plasmatiques dinsuline atteignait un pic de 30 minutes de lapport oral de PG sous forme liquide. Dans une autre tude mene par Christensen et al.(1997), il a t indiqu que le pic des concentrations plasmatiques dinsuline est enregistr dans les 90 min suivant lapport oral de 307 ml/ jour de PG liquide chez les gnisses. Ce pic dinsuline indique que la plupart du PG administr a t absorb rapidement par le rumen et mtabolis de sa forme PG en glucose dans le foie pour la glyconogense. Diffrentes tudes ont compar lefficacit des diffrentes mthodes - 19 -

dadministration de PG : ladministration orale de PG sous forme liquide ou incorpor dans le concentr est plus efficace pour augmenter la concentration plasmatique dinsuline par rapport au PG mix avec la ration (Christensen et al.,1996). De plus, le respect du temps de prlvements sanguins par rapport au temps de ladministration de PG a une grande importance pour mesurer la rponse dinsuline et glucose. Par consquence, un long intervalle entre la prise de sang et ladministration de PG peuvent expliquer leffet mineur de PG sur linsuline observ dans ltude de Grummer et al. (1994). Dans notre exprimentation, la chronologie des prlvements sanguins qui a t mise en place pour le dosage dinsuline avant, au moment et aprs ladministration deau ou du PG tait efficace pour enregistrer le pic plasmatique dinsuline pour le groupe PG. La moindre conversion de PG en propionate dans le rumen peut aussi expliquer lapparition du pic de concentration plasmatique dinsuline aprs un apport oral de PG, puisque le propionate stimule la scrtion pancratique dinsuline. De plus, le PG lui-mme ou les intermdiaires du mtabolisme de Propylne Glycol tels que le lactate et pyruvate, peuvent aussi stimuler la scrtion dinsuline qui a un effet direct sur la fonction ovarienne (Brockman, 1986).

3- Les caractristiques folliculaires :

De nombreux efforts ont t mis en uvre pour amliorer la rponse de superovulation et augmenter le nombre de la population folliculaire sensibles la gonadotrophine dans les ovaires au dbut de la stimulation chez les bovins (Armstrong ; 1993). Par consquent, toutes les approches qui peuvent augmenter la population folliculaire dans lovaire sont susceptibles davoir une implication positive pour lamlioration de la rponse de la superovulation. Miyishi et al. (2001) ont montr que laugmentation de concentration plasmatique dinsuline chez les vaches traites oralement par le PG liquide peut avoir un effet direct sur le dveloppement folliculaire partir de stade follicule primordial au stade antral dans la priode postpartum. Dans notre tude, 2,5 jours avant lOPU (J2 de cycle), ladministration orale de 400 ml PG avait amlior le nombre moyen de petits follicules (2-3 mm), qui pourront tre stimuls lors de la superovulation. De plus, aprs la superovulation, on a observ une augmentation des follicules de 4-8 mm dans le groupe PG compar avec le Tmoin. Cela suggre que le Propylne glycol a permis de stimuler la croissance folliculaire basale des petits follicules de taille (2-3 mm) J2 qui se dveloppent en follicules (4-8 mm) J5 de cycle de la mme faon, Gutierrez et al (1997) a dmontr que laugmentation du niveau alimentaire de court terme, pouvait stimuler laugmentation de linsuline chez les gnisses : cela est associe avec - 20 -

une augmentation de nombre des petits follicules au cours des 3 premiers jours de cycle stral. De plus, laugmentation dinsuline peut stimuler la sensibilit folliculaire FSH comme il a dmontr Mazerbourg et al (2003). Cette croissance a t effectue via laugmentation de linsuline plasmatique au cours de la premire vague folliculaire au dbut de cycle stral. Par ailleurs, dans notre tude, le nombre moyen des follicules entre 2 et 8 mm (< 8 mm) J5 aprs superovulation a t multipli par 1. 4 pour le groupe PG par rapport au Tmoin. Ces rsultats ont montr que lapport nergitique de PG, induisant une hyperinsulinmie, intervient dans le renforcement de la rponse ovarienne la superovulation en stimulant le recrutement des petits follicules chez les gnisses soumises un rgime alimentaire restreinte. Une tude mene par Freret et al. (2006) qui avait montr que le nombre moyen des follicules entre 2 et 8 mm (< 8 mm) a t amlior significativement chez des gnisses suralimentes (1300 g/j) exprimant un niveau significatif dinsuline systmique par rapport a celles qui soumises en restriction alimentaire (750 g/j).

4- la collecte des ovocytes et la production des embryons :

Aprs lOPU (J5 de cycle stral), le nombre moyen dovocytes totaux collects et dovocytes de qualit 1,2 et 3 selon la classification morphologique na pas t affect par le traitement de PG. Ces rsultats sont concordants avec ceux rapports par Rizos et al. (2008), qui ont conclu que le traitement oral de 500 ml de PG na pas deffet significatif sur le nombre et la qualit dovocytes collects chez les vaches laitires en postpartum. Et de faon similaire, ltude ralise par Nolan et al. (1998) na rapport aucun effet dun apport nergtique sur la qualit ovocytaire. En outre, leffet de PG sur la qualit ovocytaire reste prouver par des marqueurs molculaires associs la comptence au dveloppement. Adamiak et al. (2005) montrent que leffet du niveau de l'alimentation sur la qualit des ovocytes est dpendant de l'tat corporel de l'animal au moment de la suralimentation, ils ont montre qui avec un tat corporel faible la suralimentation amlior la qualit des ovocytes par contre avec un tat corporel gras la sur alimentation diminue la qualit des ovocytes. Et rcemment, les investigations ont montr que le glucose aussi joue un rle bnfiques pendant la maturation in vitro sur le complexe cumulus-ovocyte (Leroy et al. 2006). Sutton-Mac Dowall, (2010) ont montr que le glucose est significatif dans tous les aspects de la maturation folliculaire finale, comme l'a dmontr par ses effets sur les miotique, cytoplasmique et la maturation des cellules de cumulus. Par consquent, des altrations dans le - 21 -

mtabolisme du glucose sont susceptibles d'tre une cause de la diminution de la comptence ovocytaire et une rduction de la fcondit. La supplmentation nergtique via ladministration de PG augmente le niveau de la concentration de linsuline qui est associe avec le fonctionnement ovarien et le dveloppement initial de lembryon par la stimulation des cellules de granulosa et la prolifration des cellules thcales (Alvarez et al. 2000). Aprs la fcondation in vitro, on a mis en vidence que le PG a amliore significativement le taux de dveloppement des blastocystes (B, EB et HB) aprs 7 jours de culture in vitro. De plus, le traitement de PG a ainsi amlior le nombre moyen des blastocystes (B, EB et HB) de qualit 1 (Q1) J7 ainsi que le taux de dveloppement des balstocystes de Q1 J8. Ces rsultats montrent que les ovocytes collects ont une meilleure capacit se dvelopper in vitro avec le PG bien quaucune diffrence morphologique nait t mise en vidence. Lamlioration de la production de blastocyste a t dj dmontre par ltude dAdamiak et al. (2006) : dans cette tude, un apport plus lev en alimentation associ une insulinmie a induit un effet positif sur la production des blastocystes in vitro chez les gnisses prsentant un faible tat corporel. De plus, une tude mene par Souza et al. (2008) sur des chvres

superovules recevant une administration continuelle de PG ou dinsuline inject en sous cutane trois jours pendant 24 heures dintervalle, induit une augmentation de la production des blastocystes in vivo considrs comme excellents (Q1). Par contre, La relation inverse entre la suralimentation et la production dembryon chez des gnisses superovules avec plus de 3.25 de condition corporelles, a t aussi observ pendant la production dembryon in vivo (Kadokawa et al. 2008). Boland et al, (2001) ont montrs quil y a une amlioration de la rponse du traitement de superovulation via la manipulation de amliore significativement le nombre et la qualit

linsulinmie avant linsmination et dembryons produits in vivo.

Il intressant signaler, la plus part des embryons Blastocyste, blastocyste panoui et blastocyste clos de toutes les qualits (B, EB et HB) de groupe PG ont t dvelopps J7. En revanche un pourcentage plus lev des embryons de groupe Tmoin achvent leur dveloppement J8. Cela suggrant que lapport hyper-insulinmique via le PG a tendance davoir un effet prcoce sur le dveloppement embryonnaire. Cet effet prcoce de dveloppement embryonnaire via ladministration de PG chez les gnisses superovules pendant une priode dalimentation restreinte a t bien apparu aussi chez les embryons dembryons (B, EB et HB) de - 22 -

qualit 1 (Q1). Pareillement, Des tudes ont dj montres que laugmentation artificielle de linsuline par un rgime alimentaire manipul est associe un avancement de linitiation de cycle strale dans la priode postpartum (Gong et al. 2002) et stimul le dveloppement embryonnaire prcoce chez les gnisses de viande (Mann et al. 2003). Dans cette prsente tude, on pu montrer leffet positive dun apport nergtique hyperinsulinmique base de Propylne Glycol sur le nombre moyen de blastocystes expanss de qualit 1 (Q1) produit J7 chez des gnisses superovules et soumises en alimentation restreinte.

VI- CONCLUSION :

Les rsultats de ce travail montrent quun apport oral de 400 ml de PG par 7 jours chez des gnisses Holstein superovules soumises une alimentation restreinte (GMQ = 590 g/j) augmente le niveau dinsuline et contribue amliorer les rsultats dOPU-FIV : les effets ont concern (P <
0.05)

le nombre de petits follicules (2-3 mm) J2 de cycle oestral, le nombre de follicules de 4-8 aprs un traitement de superovulation, le nombre et le taux de dveloppement des

mm

blastocystes (B, EB et HB) de qualit 1 aprs 7 jours de culture in vitro et le nombre moyen dembryons de qualit 1 par gnisse, qui a t multiplie par 1,5 par rapport au groupe Tmoin. Il est intressant de signaler que le nombre dembryons panouis a t amlior significativement (P
< 0.05)

sous leffet de PG, ce qui est intressant dans un cadre de slection gntique, puisque ces

embryons peuvent tre utiliss pour la conglation destine au programme de transplantation embryonnaire. Les rsultats obtenus avaient recommand dadministrer 400 ml PG liquide deux jours avant le traitement de superovulation pour avoir une meilleure quantit et qualit des embryons produits in vitro par la technique OPU-FIV chez le gnisse laitire.

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VII- REFERENCES :
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25

VIII- ANNEXES: Annexe (1): La composition du concentr utilis dans notre exprimentation :

Annexe (2) : Classification de qualit ovocytaire selon lAtlas de lovocyte Bovin-UNCEIA-(1998):

Complexe ovocyte cumulus de qualit 1

Qualit 1 : (COC-1) correspond un ovocyte intact et immature avec trois ou plusieurs couches de cellules de cumulus et un cytoplasme denses et homognes

Complexe ovocyte cumulus de qualit 2

Qualit 2 : (COC-2) : les couches de cumulus (maximum 3) sont moins compactes ou partiellement dnud avec un cytoplasme homogne.

Complexe ovocyte cumulus de qualit 3

Qualit 3 : (COC-3) : une partie de lovocyte immature perdu ces cellules de cumulus o la zone pellucide partiellement dnud, mais avec un cytoplasme homogne ou avec quelques irrgularits mineures dans le cytoplasme

Complexe ovocyte cumulus de qualit 4 (a)

Qualit 4a : (COC-4a) : Le cumulus peut tre en grande partie ou totalement perdu avec un cytoplasme qui peut prsenter des zones de pigmentation fortement diffrente.

Complexe ovocyte cumulus de qualit 4 (b)

Qualit 4b : (COC-4b) : Le cumulus est expans et prsente des couches cellulaires regroupes en gros amas sembres, avec un cytoplasme htrogne.

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Annexe (3) :

Stade de dveloppement embryonnaire :

stade de dveloppement embryonnaire chez les bovins selon lIETS 1998

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Qualit morphologique des embryons :

Critre AM Qualit Critres IETS 1990 08/09/86 TE (France) Excellent : Embryon idal pour son jour de collecte,
symtrique, avec des cellules de couleur et de texture comparable, aspect compact EXCELLEN EXCELLENT

Critre de qualit de lembryon

Bon : Embryon un peu en retard de dveloppement

par rapport son jour de collecte ou embryon semble lembryon excellent mais asymtrique, ou exclusion quelques blastomres dans lespace privitellin. Embryon en retard de dveloppement de 1 2 jours (blastomres sphriques au stade morula) ou des dfauts bien prcis comme :

ou Bon

MOYEN

MOYEN

- Nombreuses cellules chappes dans lespace privitillin, des vsicules, des cellules dgnres, blastomres de taille variable - Aspect plus claire ou plus sombre que normal. - Nombreux dfauts, comme nombreuses cellules chappes, cellules dgnres, cellules de taille

MEDIOCRE

MEDIOCRE

diffrente, vsicules grosses et nombreuses. - Mais, prsence dune masse cellulaire homogne qui apparat viable.

MORT ou DEGENERE

MORT ou DEGENERE

Arrt de dveloppement un stade prcoce, cellules dgnres

Tableau de Classification des embryons collects in vivo

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