OMS.93 Parasitologie Med Tech Base Labo 9242544108

Parasitologie
mdicale:
techniques
de base
pour le
laboratoire
Organisation mondiale de. la Sant
Genve
1993
Rimprim 1997
Catalogage la source : Bibliothque de l'OMS
Parasitologie mdicale : techniques de base pour le laboratoire.
1. Parasitologie- manuels de laboratoire
ISBN 92 4 254410 8 (Classification NLM: WC 25)
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apports au texte, les nouvelles ditions prvues et les rimpressions et traductions dj disponibles.
Organisation mondiale de la Sant, 1993
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IMPRIME EN FRANCE
90/8687 JOUVE- 2000
97/11445 JOUVE -1000
Table des matires
Prface vii
Liste des collaborateurs viii
Introduction 1
Scurit au laboratoire 2
Premire partie : Techniques de prlvement,
de prparation et d'examen 5
Entretien du microscope 7
Etalonnage du microscope 8
Prlvements de selles 9
Techniques de prlvement 9
Examen 10
Examen macroscopique des selles 1 0
Examen microscopique
de prparations l'tat frais 10
Identification des parasites 13
Techniques complmentaires 16
Technique de concentration 16
Techniques de coloration permanente 17
Identification des parasites
dans les talements colors 25
Ecouvillonnage anal la recherche
des ufs d'oxyures 25
Etalement pais de matires fcales sous
cellophane pour le diagnostic des bilharzioses
intestinales (technique de Kata-Katz) 26
Expdition des prlvements un laboratoire
de rfrence 30
Elimination des prlvements 30
Contrle de la qualit des examens coprologiques 31
Prparation des ractifs 32
Techniques de prparation et d'examen des lames 32
iii
PARASITOLOGIE MDICALE: TECHNIQUES DE BASE POUR LE LABORATOIRE
Urines 34
Prlvement des urines pour le diagnostic
des infestations Schistosoma 34
Examen des urines 34
Mthode de sdimentation des urines
de 24 heures recueillies en fin de miction 34
Mthode de filtration la seringue 35
Identification 37
Prlvements vaginaux et urtraux 38
Examen direct de frottis vaginaux et urtraux 38
Prlvements de sang et autres prlvements 40
Frottis sanguins colors 41
Prlvements 41
Coloration des frottis sanguins au Giemsa 44
Coloration de Field 45
Coloration l'hmatoxyline de Delafield
pour la mise en vidence des microfilaires 46
Examen 46
Contrle de la qualit des examens de sang 47
Techniques spciales pour les Plasmodium 48
Identification 48
Surveillance de la chloroquinorsistance
dans le paludisme fa/ciparum 49
Techniques spciales pour les trypanosomes 50
Recherche des trypanosomes dans le sang 50
Recherche des trypanosomes
dans le suc ganglionnaire 55
dans le liquide cphalorachidien (LCR) 57
Techniques spciales pour les microfilaires 59
Prlvements de sang
pour la recherche de microfilaires 59
Recherche des microfilaires
dans le sang priphrique 59
Techniques spciales pour les leishmanies 60
iv
TABLE DES MATIRES
Prlvements cutans 64
Examen des prlvements 65
Deuxime partie : Identification
des espces parasitaires 68
Parasites intestinaux 69
Helminthes 69
Cl de dtermination des ufs 69
Larves 72
Protozoaires 73
Formes vgtatives d'amibes 7 4
Kystes d'amibes 75
Flagells 79
Balantidium coli 80
lsospora belli et Cryptosporidium 80
T oxoplasma gond ii 81
Problmes d'identification 81
Parasites sanguins 83
Paludisme 83
Identification des Plasmodium
dans les frottis minces 83
Identification des Plasmodium
dans les gouttes paisses 83
Structures pouvant tre confondues
avec des Plasmodium 85
Trypanosomes 85
Microfilaires 92
Bibliographie 95
Annexe 1. Matriel de parasitologie diagnostique
ncessaire dans les centres de sant
et les laboratoires des hpitaux de district 96
Annexe 2. Prparation des ractifs et solutions 99
Annexe 3. Prparation des milieux de culture 111
Annexe 4. Nettoyage et conservation des lames porte-objets 113
Index 115
v
Prface
Ce manuel est un guide pratique destin aux techniciens de laboratoire
des centres de sant et des hpitaux de premier recours. Seules les
mthodes diagnostiques faisant appel la microscopie sont dcrites ici.
Ce manuel a t prpar partir d'lments tirs de matriels de forma-
tion et de divers ouvrages publis par le Hospital for Tropical Diseases,
Londres, Angleterre, la Parasitology Training Section, Division of Labo-
ra tory Training and Consultation, Laboratory Program Office, Centers
for Disease Control, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amrique, l'Organisation
mondiale de la Sant, Genve, Suisse, et l'Organisation panamricaine
de la Sant, Washington, OC, Etats-Unis d'Amrique. En particulier, un
certain nombre d'illustrations ont t tires des publications suivantes:
Brooke, M.M. & Melvin, D.M., Morphology of diagnostic stages of intestinal
parasites of humans, 2nd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and
Human Services, 1984 (HHS Publication N (CDC) 84-8116); Melvin,
D.M. & Brooke, M.M., Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal
parasites, 3rd ed., Atlanta, GA, US Department of Health and Human Ser-
vices, 1982 (HHS Publication N ( CDC) 82-8282). Les noms d'espces de
parasites utiliss sont ceux de: International Nomenclature of Diseases,
Volume II, Infectious Diseases, Part 4: Parasitic Diseases, CIOMS, OMS,
Genve, 1987. Les rgles de la nomenclature zoologique voudraient que
quand le nom de genre est employ seul, il soit suivi de sp. ou sp.p. selon
le cas. Dans le but de faciliter la lecture pratique de cet ouvrage, ces der-
nires lettres ont t supprimes. Par exemple, nous avons employ Plas-
modium au lieu de Plasmodium sp.p ..
vii
Liste des collaborateurs
Les personnes suivantes ont contribu la prparation de cette publica-
tion:
Dr P. L. Chiodini, Consultant Parasitologist, Hospital for Tropical Disea-
ses, Londres, Angleterre;
Dr K. Engbaek, Dpartement de Microbiologie clinique, Hpital gnral
de Copenhague, Herlev, Danemark;
Dr C. C. Heuck, Technologie de Laboratoire de Sant et Scurit du Sang,
OMS, Genve, Suisse;
Dr L. Houang, Annemasse, France;
Dr R. C. Mahajan, Department of Parasitology, Postgraduate Institute of
Medical Education and Research, Chandigarh, Inde;
Dr M. A. Melvin, Atlanta, GA, Etats-Unis d'Amrique;
Dr L. Monjour, Parasitologie et Mycologie, Maladies tropicales et para-
sitaires, Groupe hospitalier Piti-Salptrire, Pavillon Laveran,
Paris, France;
Dr J. C. Petithory, Contrle national de Qualit en Parasitologie, service
de Biologie mdicale, Centre Hospitalier, Gonesse, France;
Dr J. Vandepitte, Dpartement de Microbiologie clinique, Hpital uni-
versitaire St-Raphal, Louvain, Belgique.
viii
Introduction
Les maladies parasitaires sont responsables d'une morbidit et d'une
mortalit considrables dans le monde entier et se prsentent souvent
comme des affections symptmes non spcifiques. La plupart d'entre
elles ne peuvent tre diagnostiques l'aide du seul examen clinique, et
des examens de laboratoire sont ncessaires pour savoir si un malade est
infest ou non par un parasite et, si tel est le cas, par quelle espce. Le
laboratoire joue donc un rle important dans l'tablissement du dia-
gnostic des maladies parasitaires et il constitue l'lment cl du choix
thrapeutique. Les examens de laboratoire doivent tre exacts et fiables
si l'on veut aider le mdecin et par l mme le malade.
Ce manuel est un guide rdig l'intention des techniciens de labora-
toire. On trouvera dans sa premire partie des techniques permettant de
rechercher les parasites dans les selles, le sang, les urines et autres scr-
tions ou tissus. On y a signal les piges et erreurs possibles, ainsi que
les mthodes permettant de les viter. Les moyens de contrle de la qua-
lit sont galement voqus. Le technicien de laboratoire doit compren-
dre que seule l'application rigoureuse des techniques de mise en
vidence des parasites permettra l'observation prcise de ces derniers au
microscope.
La deuxime partie de ce manuel s'attache aux critres morphologiques
utiliss pour identifier les parasites. Artefacts et problmes d'identifica-
tion y sont galement voqus.
On trouvera le dtail du matriel et des ractifs ncessaires dans les qua-
tre annexes qui suivent. L'annexe 1 fournit une liste du matriel et des
ractifs ncessaires dans les centres de sant et les laboratoires des
hpitaux de premier recours; l'annexe 2 fournit les formules et modes
opratoires pour prparer les ractifs, et l'annexe 3 pour prparer les
milieux de culture; enfin, l'annexe 4 dcrit les mthodes de nettoyage et
de conservation des lames employes pour les frottis sanguins.
Scurit au laboratoire
Principes gnraux
1. Chaque laboratoire doit disposer d'un manuel des consignes de scurit au
laboratoire, applicables en tout temps.
2. Le laboratoire doit galement disposer d'une trousse de secours, et son per-
sonnel doit compter une personne capable d'apporter les premiers soins.
3. Tout personnel tranger au service doit se voir interdire l'accs aux salles de
travail du laboratoire.
4. Il est interdit de manger, de boire, de fumer et de se maquiller dans
l'enceinte du laboratoire.
5. Le personnel de laboratoire portera des vtements protecteurs, qui devront
tre enlevs avant de quitter le laboratoire.
6. Le personnel de laboratoire doit nettoyer les paillasses au dtergent (savon)
et dsinfecter les surfaces de travail en fin de journe, ou lorsque du matriel
infectieux a t renvers. Les dsinfectants les plus couramment utiliss sont
les suivants:
l'thanol 96% ou l'isopropanol (irritants pour la peau),
la solution de phnol 1% (corrosive, caustique),
la solution d'hypochlorite 0,5-1% (caustique, corrosive) (la solution
alcaline est plus agressive que la solution neutre),
les solutions de formaldhyde 1% ou de glutaraldhyde 2% (toxiques
et irritantes pour la peau).
Les solutions d'aldhyde et de phnol agissent plus longtemps. Il est
conseill d'essuyer les surfaces de travail avec un chiffon imbib de dsin-
fectant plutt que d'employer un vaporisateur.
7. Le personnel doit toujours se laver les mains avant de quitter le laboratoire.
Manipulation des prlvements
La manipulation de tous les prlvements de laboratoire exige des prcautions
particulires et le port de gants en caoutchouc doit tre obligatoire.
Prl'lements de sang. Tous les prlvements de sang doivent tre considrs
comme potentiellement infectieux. Comme des germes trs dangereux peu-
vent tre transmis par le sang (par exemple, virus de l'immunodficience
humaine (VIH), virus de l'hpatite B), il faut faire extrmement attention lors-
que l'on recueille et que l'on traite les chantillons. Les risques particuliers
sont les suivants:
a) Piqres ou coupures accidentelles- se dbarrasser des aiguilles ou des hmo-
styles dans un rcipient pouvant tre incinr par la suite, ou les enterrer dans
un sac dchets aprs les avoir fait tremper dans une solution dsinfectante.
Ne pas rutiliser les hmostyles. Ne pas laisser traner des hmostyles usa-
gs dans le laboratoire. Ne pas utiliser de verrerie brche ni fle.
b) Contamination au niveau de lsions de la peau ou des muqueuses- recou-
vrir toute coupure d'un pansement occlusif. Eviter tout contact du sang avec
la peau ou les muqueuses. Le pipetage la bouche doit tre absolument
proscrit! Si du sang est renvers sur la peau, laver immdiatement la zone
touche au savon et l'eau; en cas de projection dans les yeux, les rincer
2
SCURIT AU LABORATOIRE
abondamment l'eau. Toute claboussure de sang dans le laboratoire doit
tre noye avec une solution d'hypochlorite, puis essuye avec un chiffon
imprgn de cette mme solution.
Prlvements de selles. Eviter tout contact avec la peau. Aprs utilisation, les pr-
lvements doivent tre soit a) incinrs, soit b) plongs dans une solution
dsinfectante puis enterrs dans des sacs dchets.
Pre1vements d'urine. Tout contact avec la peau doit tre vit. Les prlve-
ments non contamins peuvent tre jets dans les canalisations destines aux
eaux uses.
Elimination des lames porte-objets
Les lames doivent tre dposes dans un rcipient contenant une solution
d'hypochlorite 1% et enterres dans des sacs dchets, si elles ne sont pas
nettoyes et rutilises.
3
Premire partie
Techniques de prlvement,
de prparation et d'examen
Entretien du microscope
'
Ce que vous devez faire
1. Recouvrir le microscope d'une housse propre en tissu ou en plastique
lorsqu'il n'est pas utilis.
2. Prendre un surcrot de prcautions pour protger le microscope de la
poussire pendant les priodes chaudes et sches.
3. Prendre un surcrot de prcautions pour protger les lentilles et les pris-
mes du microscope des moisissures pendant les priodes chaudes et humi-
des. Pour cela:
- garder le microscope dans une pice climatise.
ou
- le ranger dans une pice spciale, dshumidifie -le prix d'un dshu-
midificateur lectrique reprsente environ la moiti de celui d'un clima-
tiseur.
ou
- brancher plusieurs ampoules de 15 ou 25 watts dans une armoire dont
les portes ferment bien,
ou
- mettre une ampoule de 15 watts dans la bote du microscope, qui agit
alors comme une armoire chauffante,
ou
- dans les rgions sans lectricit, installer une tagre sur laquelle on
mettra la bote du microscope environ 30 cm au-dessus du tuyau du
rfrigrateur gaz ou krosne ou du conglateur ; un sac tanche
l'air et du gel de silice l'tat sec (de couleur bleue) permettront de
conserver un microscope suffisamment au sec pour que les lentilles
soient l'abri des moisissures.
4. Nettoyer chaque jour l'huile des objectifs immersion avec un chiffon
doux inbib d'thanol/ ther (3 ml/7 ml) ou de benzne/ thanol/ ther
(2 ml/2 ml/1 ml), puis essuyer avec un chiffon propre non pelucheux.
5. Nettoyer les oculaires avec un chiffon doux non pelucheux; on peut aussi
utiliser du papier optique ou des serviettes dmaquiller.
6. Utiliser la vis de blocage du microscope fixe la base de la bote pour vi-
ter que l'instrument ne soit abm pendant le transport.
7. Donner le numro du modle et si possible le numro de l'instrument et
de la pice lors des commandes de pices dtaches.
Ce que vous ne devez pas faire
1. Ne pas utiliser le papier ou le chiffon qui a servi nettoyer l'objectif
immersion pour nettoyer les oculaires.
2. Ne pas nettoyer les surfaces peintes du microscope l'alcool.
3. Ne pas dmonter, ni essayer de nettoyer les parties du microscope diffici-
les atteindre, sauf si l'on a t form le faire.
4. Ne pas laisser les orifices de la tte et de la couronne vides; les reboucher
avec les obturateurs appropris ou avec du sparadrap.
5. Ne pas changer les objectifs ou les oculaires de microscopes de marques
diffrentes - mme les divers modles d'un mme fabricant peuvent
avoir des caractristiques diffrentes.
7
Etalonnage du microscope
La taille est un critre important de dtermination de nombreux parasites, en
particulier lorsqu'il s'agit de kystes et d'ufs. On peut la dterminer au moyen
d'une cellule hmatirntrique (de Neubauer) ou d'un micromtre oculaire.
Avec ce dernier, on procde de la manire suivante:
1. L'chelle oculaire est divise en 100 petites divisions.
2. L'chelle du micromtre objectif reprsente 1 mm divis en fractions de
0,1 mm, elles-mmes divises en fractions de 0,01 mm.
3. Insrer le micromtre oculaire (un disque de verre rond) dans l'oculaire,
en enlevant les lentilles suprieures et en posant le disque sur le dia-
phragme de champ.
4. Remettre l'oculaire dans le microscope.
5. Mettre le micromtre objectif sur la platine du microscope.
6. Mettre au point sur le micromtre objectif avec l'objectif le plus faible.
7. Ajuster les deux chelles (oculaire+ objectif) jusqu' ce qu'elles soient
parallles.
8. Noter le nombre de divisions de l'oculaire et leur dimension sur le micro-
mtre objectif, par exemple, 50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm; 10 divi-
sions de l'oculaire = 0,15 mm.
9. A partir de ce rsultat, calculer la valeur d'une division de l'oculaire
comme suit:
50 divisions de l'oculaire= 0,75 mm
1 division de l'oculaire = 0,75/50 = 0,015 mm
ou
10 divisions de l'oculaire= 0,15 mm
1 division de l'oculaire = 0,15/10 = 0,015 mm.
10. Passer des mm aux f.im (1 mm = 1000 f.im), par exemple, 0,015 mm =
15 f.im.
11. Rpter l'opration pour tous les objectifs et noter le rsultat obtenu pour
chacun d'eux.
12. L'talonnage n'a besoin d'tre fait qu'une fois pour chaque microscope.
8
Prlvements de selles
On examine les prlvements de selles la recherche de protozoaires et de lar-
ves ou d'ufs d'helminthes.
Les diffrentes formes de protozoaires retrouves dans les selles sont les
formes vgtatives et les kystes. Pour les helminthes, les stades que l'on
retrouve en gnral sont les ufs et les larves, bien qu'on puisse galement
observer des vers adultes ou des segments de vers. Les vers adultes et les seg-
ments de tnias sont en gnral visibles l'il nu, mais les ufs, les larves, les
formes vgtatives et les kystes ne sont visibles qu'au microscope. Pour pou-
voir voir ces structures, les matires fcales doivent tre correctement prpa-
res et examines.
Techniques de prlvement
En raison de la fragilit de nombreux parasites intestinaux et de la ncessit de
ne pas modifier leur morphologie pour pouvoir les dterminer avec certitude,
on ne pourra poser un diagnostic microscopique fiable que si les selles sont
correctement recueillies.
1. Donner au malade le matriel suivant:
- une bote en carton paraffin avec couvercle embot ou une bote en
plastique avec couvercle bien ajust, et
2 btonnets applicateurs.
Si l'on ne dispose pas de bote paraffine ni de bote en plastique, on peut
utiliser des botes de conserve ou des pots en verre. Ne pas utiliser de feuil-
les de bananier ni de botes d'allumettes pour la collecte et la conservation
des selles.
Dans les programmes de lutte, il suffit souvent d'examiner un seul prl-
vement, mais pour des malades, il en faut en gnral trois, recueillis
3 jours d'intervalle, afin de dceler toutes les infestations parasitaires. Diver-
ses substances peuvent gner la recherche des parasites (par exemple, les
laxatifs, les antiacides, les milieux de contraste ingrs et certains antibioti-
ques).
2. Demander au malade de dfquer directement dans le rcipient, ou sur un
morceau de papier et de mettre ensuite la selle dans le rcipient au moyen
des btonnets applicateurs. S'il ne dispose pas de papier, le malade peut
dfquer sur une grande feuille propre, comme une feuille de bananier.
Toutefois, la selle doit tre immdiatement transvase dans le rcipient prvu
cet effet. Elle ne doit pas rester sur la feuille, ni tre apporte au laboratoire
ainsi.
3. Certains lments parasitaires, en particulier les formes vgtatives d'amibes,
vont se dcomposer ou se modifier assez rapidement aprs l'mission de
la selle et ne seront plus reconnaissables. Les tempratures leves accl-
rent cette dgradation. Par consquent, le prlvement doit atteindre le
laboratoire trs rapidement, c'est--dire dans la demi-heure qui suit son
mission. Sic' est impossible, on ajoutera des conservateurs (voir page 30).
4. Le rcipient contenant la selle doit tre tiquet lisiblement et porter les
mentions suivantes:
9
les nom et prnom ou le numro du malade;
la date d'mission de la selle;
- l'heure laquelle elle a t mise (la demander au malade).
moule
molle
trs molle
liquide
TECHNIQUES DE PRLVEMENT, DE PRPARATION ET D'EXAMEN
5. Le prlvement doit tre suffisamment important pour permettre une ana-
lyse satisfaisante. Il doit tre au minimum de la taille d'un uf de pigeon.
Il ne doit tre ni souill, ni mlang de l'urine, car celle-ci dtruit les
formes vgtatives d'amibes; les salets gneront l'examen. Si le prlve-
ment est trop petit ou s'il est mlang de l'urine ou des salets, il faut
le refuser et demander au malade d'en apporter un autre.
6. Garder le carton contenant l'chantillon dans un rfrigrateur ou, si c'est
impossible, dans l'endroit le plus frais et le plus ombrag du laboratoire.
Ne pas le garder au chaud ni le laisser au soleil.
Examen
Examen macroscopique des selles
1. Ds que le prlvement arrive au laboratoire, vrifier sa consistance (degr
d'humidit) et inscrire l'une des mentions suivantes sur le rcipient: mou-
le, molle, trs molle, liquide.
S'il y a du mucus, inscrire la lettre Met s'il y a du sang, inscrire la lettre S.
Par exemple, une selle trs molle avec du sang et du mucus portera la men-
tion trs molle, S, M. La consistance, ou le degr d'humidit, constituera
une indication quant la prsence possible de formes vgtatives ou de
kystes de protozoaires. Les diverses catgories de selles et les techniques
utiliser figurent dans le tableau 1.
2. Si l'on reoit plusieurs prlvements la fois, on examinera d'abord ceux
qui contiennent du sang et du mucus, puis ceux qui sont liquides. Ces pr-
lvements contiennent en effet trs probablement des formes vgtatives
d'amibes (qui meurent rapidement) et doivent tre examins dans l'heure
qui suit l'mission de la selle. Les selles moules peuvent tre examines
dans la journe suivant leur mission, mais ne doivent pas attendre, le len-
demain (les kystes peuvent se dcomposer).
Examen microscopique de prparations l'tat frais
La prparation l'tat frais est la technique la plus simple et la plus facile
mettre en uvre pour examiner les selles et il convient de l'employer dans
tous les laboratoires priphriques. Une telle prparation se fait directement
partir de la selle ou aprs concentration (voir page 16). Les principaux types
de prparations non fixes que l'on utilise pour les analyses de selles sont les
prparations en solut physiologique, l'iode et au bleu de mthylne tam-
ponn:
Consistance
Moule
Molle
Trs molle
Liquide
Tableau 1. Catgories de selles
et techniques appropries
Stades
Technique utiliser
des protozoaires
Bleu de mthylne
les plus
Solut
tamponn
susceptibles
physiologique
Iode (si des formes
d'tre retrouvsa
vgtatives sont
visibles)
Kystes
+ +
Kystes (parfois
+ + +
formes vgtatives)
Formes vgtatives
+ +
Formes vgtatives
+ +
On peut trouver des ufs et des larves de vers dans tous les types de selles.
10
2Z.lt
10/4/84
WHO 886r3
PRLVEMENTS DE SELLES
La prparation en solut physiologique sert un premier examen microscopi-
que des selles. On l'emploie surtout pour mettre en vidence les ufs et les
larves de vers, ainsi que les formes vgtatives et les kystes de protozoaires.
Ce type de prparation peut galement rvler la prsence d'hmaties et de
leucocytes.
- La prparation l'iode est surtout utilise pour colorer le glycogne et les
noyaux des kystes, s'il y en a. On peut en gnral identifier prcisment les
kystes dans ce type de prparation.
Il faut faire un montage au bleu de mthylne tamponn chaque fois que l'on
observe des formes vgtatives d'amibes ou que l'on souponne leur pr-
sence dans une prparation en solut physiologique. Il colore les formes
vgtatives d'amibes mais pas les kystes amibiens, pas plus que les formes
vgtatives ni les kystes de flagells. Cette coloration ne convient qu'aux
prparations l'tat frais. Elle n'est pas employe sur les prlvements
conservs dans lesquels les parasites sont morts.
Matriel et ractifs
1 Lamelles couvre-objets
2. Flacons compte-gouttes contenant: du solut physiologique (ractif No 24)
1
du lugol (solution 1 %) (ractif No 18)
du bleu de mthylne tamponn
(ractif No 2)
3. Lames porte-objets
4. Crayons ou feutres pour l'tiquetage
5. Anse de platine (ou btonnets applicateurs, allumettes, cure-dents)
Prparations en solut physiologique et l'iode
(examen direct)
1. Inscrire les nom et prnom ou le numro du malade et la date sur le ct
gauche de la lame avec un crayon gras.
2. Dposer une goutte de solut physiologique au centre de la moiti gauche
de la lame et une goutte de solution iode au centre de la moiti droite de
la lame.
NOTE:
Si l'on souponne la prsence de formes vgtatives d'amibes, on
emploiera du solut physiologique chaud (37C)
0
Tout au long de ce manuel, les " numros de ractif " renvoient aux numros attribus aux ractifs dans
l'annexe 2.
11
3. A l'aide d'un btonnet applicateur (allumette ou cure-dents), prlever une
petite portion d'chantillon (de la taille d'une tte d'allumette) et mlanger
avec la goutte de solut physiologique.
NE:
Selle moule: prlever un petit morceau de faon avoir la fois une por-
tion externe et une portion interne de la selle.
Selle accompagne de mucus: s'il y a du mucus, tiqueter une seconde lame
au nom ou au numro du malade. Dposer une goutte de solut physiolo-
gique sur la lame. Prlever un peu de mucus et le mlanger au solut. Les
formes vgtatives, s'il y en a, sont parfois plus faciles retrouver dans le
mucus que dans les parties solides de la selle.
Selle liquide: s'il n'y a pas de mucus, prlever un peu de liquide et mlanger
avec le solut physiologique.
4. De la mme faon, prlever un peu de selle et mlanger avec la goutte
d'iode pour faire une prparation l'iode. Si l'on utilise une anse de pla-
tine, la passer la flamme aprs usage. Si l'on emploie des btonnets appli-
cateurs, les jeter.
5. Recouvrir la goutte de solut physiologique et la goutte d'iode d'une
lamelle. Pour cela, tenir la lamelle incline au contact de la lame. Toucher
le bord de la goutte et abaisser doucement la lamelle. Cela permet d'viter
les bulles d'air dans la prparation.
12
Prparation au bleu de mthylne tamponn
(A ralisersi l'on observe des formes vgtatives
d'amibes dans la prparation en solut physiologique)
Procder comme dcrit de 1 5 pour les prparations en solut physiologique
et l'iode, mais dposer une grosse goutte de bleu de mthylne tamponn au
lieu du solut physiologique ou de l'iode. Attendre 5 10 minutes avant d' exa-
miner la prparation pour permettre au colorant de pntrer dans les formes
vgtatives. Le bleu de mthylne tamponn va surcolorer celles-ci au bout
d'environ 30 minutes. ll faut donc examiner la lame dans les 30 minutes qui
suivent sa prparation.
Examen
1. Poser la lame monte sur la platine du microscope et mettre au point avec
l'objectif x 10 (faible grossissement).
2. Rgler la lumire dans le champ l'aide du diaphragme. On doit pouvoir
distinguer nettement les objets situs dans le champ. Il ne faut ni trop, ni
trop peu de lumire.
3. Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec l'objectif x 10; mettre
au point sur le coin suprieur gauche, puis dplacer la lame rgulirement
d'avant en arrire ou de haut en bas.
4. Si l'on observe des parasites ou des lments suspects, passer l'objectif
suprieur et augmenter la lumire en ouvrant le diaphragme afin d' obser-
ver leur morphologie en dtaiL
Il s'agit d'un examen systmatique. Si les lames sont examines de cette faon,
tout parasite prsent sera en gnral trouv. En revanche, si la lame n'est pas
examine attentivement, des parasites peuvent chapper l'observation. Exa-
miner chaque champ microscopique soigneusement, en faisant varier la mise au
point en hauteur, avant de passer au champ suivant.
NE PAS OUBLIER D'EXAMINER
LES PRPARATIONS DE MANIRE SYSTMATIQUE
La Fig. 1 indique quels sont les examens effectuer au laboratoire, aux diff-
rents niveaux.
Identification des parasites
ufs et larves de vers dans les prparations
en solut physiologique
Les ufs sont faciles dceler et identifier dans le solut physiologique.
ll ne faut pas les colorer (le colorant peut gner la dtermination). La plupart
des ufs sont suffisamment grands pour tre reconnus au faible grossisse-
ment (x 10), mais quelques ufs plus petits ncessiteront un grossissement
plus fort.
Dans les prparations en solut physiologique, les larves de Strongyloides ster-
coralis peuvent tre visibles. Si le prlvement est frais, il n'y a en gnral pas
13
de larves d'ankylostomes, mais s'il est plus ancien, on peut avoir les distin-
guer des premires.
Fig. 1. Techniques d'examen des selles
selon l'importance du laboratoire
Laboratoire du centre de sant
Prlvement de selles- talement
direct de matriel frais
solut physiologique - et
{
(si l'on a observ des formes vgtatives d'amibes)
- bleu de mthylne tamponn
- talement pais sous cellophane
- solution iode
- solut physiologique
Tous prlvements- concentration au -L . . .
formol/ther - solution 1odee
Hpital de district
Prlvements de selles sans conservateur
solut physiologique- et
Etalement direct l'tat frais (si les selle{ (si l'on a observ des formes vgtatives d'amibes)
ne sont pas moules ou si l'on observe - bleu de mthylne tamponn
la prsence de sang et de mucus)
- solution iode
-f
solut physiologique
Tous prlvements- concentration
au formol/ther - solution iode
Prlvements de selles avec conservateur
Fixs au formol - concentration
au formol/ther
-[ solut physiologique
solution iode
On trouvera dans la deuxime partie, pp. 69-73, les caractristiques permettant
d'identifier les diffrentes sortes d'ufs et de larves avec des diagrammes et
des cls d'identification.
Certains vers ont une rpartition gographique restreinte et on ne trouve donc
pas tous les vers partout dans le monde. Il faut tablir une liste des espces
prsentes dans la rgion o ont lieu les examens.
Protozoaires dans les prparations de matriel frais
Prparations en solut physiologique
Dans le solut physiologique, on peut observer les formes vgtatives et kystes
d'amibes et de flagells. Les kystes vont apparatre comme des structures ron-
des ou ovales, rfringentes; les formes vgtatives d'amibes peuvent tre
rondes ou irrgulires, celle des flagells sont en gnral piriformes (allongs,
en forme de poire). Dans les selles fraches (maximum, 1 heure), on peut obser-
ver des formes vgtatives mobiles. Cette mobilit peut tre trs utile pour
identifier l'espce, en particulier dans le cas des flagells. La mobilit caract-
ristique de chaque espce est dcrite dans la deuxime partie (pp. 74-82).
14
On peut dceler les lments parasitaires au faible grossissement (x 10), mais
il faut un grossissement plus fort pour identifier de faon fiable des structures
comme les kystes ou les formes vgtatives. On peut alors observer la mobilit
des lments, des inclusions comme les rythrocytes et les levures dans les
formes vgtatives d'amibes, les cristallodes dans les kystes d'amibes, ainsi
que la forme et les dtails structuraux (par exemple, cytostomes, sillon de tor-
sion ou filaments) des formes vgtatives et kystes de flagells. Aucun dtail
du noyau n'est visible dans les prparations en solut physiologique. Toute-
fois, il faut rgler soigneusement la lumire du microscope de faon que les
objets apparaissent nettement. Trop ou trop peu de lumire gneront l' obser-
vation. Il faut galement mettre au point diffrentes profondeurs de la pr-
paration, afin de voir toutes les couches de la prparation. Se souvenir qu'il
faut examiner l'ensemble de la zone recouverte par la lamelle de faon syst-
matique, afin de diminuer le risque que des parasites chappent l'observa-
tion.
Prparations au bleu de mthylne tamponn
Si l'on observe des formes vgtatives d'amibes ou des structures qui leur res-
semblent, il faut faire une prparation au bleu de mthylne et l'examiner. Au
bout de 5 10 minutes de coloration, les formes vgtatives restent parfois
mobiles, mais souvent elles se mettent en boule dans ces prparations. (Ne pas
confondre des formes vgtatives en boule avec des kystes; les kystes ne se
colorent pas au bleu de mthylne). Dans les formes vgtatives, le noyau et
les inclusions (rythrocytes, levures) se colorent en bleu fonc, le cytoplasme
en bleu clair. Il peut arriver que certaines formes vgtatives ne se colorent
pas; il faut donc rechercher les lments bien colors. Chercher les granules
prinuclaires (granules situs le long de la membrane entourant le noyau));
s'ils sont prsents, le parasite appartient une espce d'Entamoeba qu'il faut
identifier. (Les caractristiques permettant d'identifier les formes vgtatives
d'amibes figurent dans la deuxime partie, pp. 74-76).
Prparations l'iode
Les prparations l'iode servent reprer les kystes d'amibes et les kystes de
flagells. On peut les dceler l'objectif x 10, mais ils ne sont pas aussi rfrin-
gents que dans le solut physiologique. Pour observer les caractristiques des
kystes, il faut un grossissement plus fort; on mesurera les diverses structures
pour tre sr d'identifier correctement ces kystes.
Dans la solution iode, le cytoplasme des kystes se colore en jaune ou en brun
clair et le noyau en brun fonc. Dans les kystes d'Entamoeba colors l'iode, la
disposition de la chromatine priphrique et la position du caryosome sont
visibles. Les granulations chromatiques priphriques se colorent en jaune
clair et ne sont pas toujours faciles voir. Parfois, les jeunes kystes contiennent
du glycogne qui se colore en brun fonc avec l'iode.
Dans les kystes de flagells colors l'iode, on peut observer les filaments.
Dans les prparations l'iode, on peut en gnral identifier prcisment les
kystes d'amibes et de flagells. Toutefois, il est parfois impossible de faire une
dtermination prcise et il peut s'avrer ncessaire de faire une coloration per-
manente.
Les caractristiques permettant d'identifier les kystes figurent dans la
deuxime partie, pp. 76-82.
15
----------- ' TECHNIQUES DE PRLVEMENT, DE PRPARATION ET D'EXAMEN
Techniques complmentaires
En plus des prparations frais directes, on dispose de mthodes complmen-
taires pour le diagnostic des parasitoses intestinales. Les plus couramment
employes sont les techniques de concentration pour la recherche des ufs,
larves et kystes, et celles de coloration permanente pour la mise en vidence
des formes vgtatives et des kystes.
Technique de concentration
Si les lments parasitaires ne sont pas prsents en grand nombre dans
l'chantillon des selles examines, la prparation l'tat frais peut ne pas suf-
fire pour dceler une infestation. Ainsi, dans la mesure du possible, on concen-
trera les selles. Cette concentration permettra de mettre en vidence les ufs
de vers, les larves et les kystes de protozoaires, mais PAS les formes vgta-
tives de protozoaires, car ils sont en gnral dtruits au cours du processus de
concentration. L'examen direct d'une prparation l'tat frais est donc la pre-
mire tape obligatoire de tout examen microscopique.
La technique de concentration s'impose lorsque l'examen de la prparation
frais est ngatif en dpit de symptmes cliniques d'une infestation parasitaire
prsents par le malade; elle est galement indique pour dceler les genres
Schistosoma et Taenia.
La technique de concentration recommande est la mthode formol-ther (ou
formol-actate d'thyle)
1
. Cette mthode permet de retrouver tous les types
d'ufs de vers (ascaris, tnia, schistosomes et autres ufs de douves), les lar-
ves, et les kystes de protozoaires.
Matriel et ractifs
1. Btonnets applicateurs, en bois
2. Pissettes en verre ou en plastique, de 250 ml ou 500 ml. Ces flacons sont
pratiques pour rajouter du formol dans les tubes centrifuger. Toutefois,
on peut utiliser n'importe quel petit flacon ou fiole.
3. Centrifugeuse, avec couronne et adaptateurs pour tubes coniques de
15 ml. Il faut utiliser des gaines tanches.
4. Tubes centrifuger, 15 ml, coniques (inscrire une graduation 7 ml et une
10 ml au crayon gras).
5. Ecouvillons de coton
6. Lamelles couvre-objets
7. Entonnoir
8. Gaze chirurgicale
9. Lames porte-objets
10. Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc
11. Supports pour tubes
12. Formol, 10% (ractif No 10). Pour l'usage quotidien, verser une partie de
la solution dans une pissette en plastique, et l'tiqueter.
13. Ether ou actate d' thyle
1
14. Lugol, solution 1% - dans une pissette en verre ou un flacon compte-
gouttes (ractif N 18)
15. Solut physiologique (ractif No 24)
1
Si l'on ne dispose pas d'ther ni d'actate d'thyle, prendre exactement la mme quantit d'essence ordinaire.
L'actate d'thyle n'est pas aussi inflammable ni aussi explosif que l'ther, il est donc moins dangereux
manipuler au laboratoire.
16
Ether
Dbris
Formol
Culot
~
Quatre couches aprs ~
centrifugation finale
ATTENTION
L'ther est une substance extrmement inflammable qui s'enflamme et explose
rapidement au contact d'une flamme ou d'une tincelle. Conserver les bidons
ou les flacons entams sur une tagre dans la partie la plus frache du labo-
ratoire. S'assurer qu'ils sont bien bouchs. Ne PAS mettre un flacon d'ther
entam au rfrigrateur: les vapeurs s'accumulent dans celui-ci, mme si le
flacon est ferm, et peuvent exploser lorsqu'on ouvre la porte. Ne pas ranger
des flacons dj entams dans une armoire. Il vaut mieux les laisser sur une
tagre de faon que les vapeurs puissent se disperser facilement.
Technique
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Verser 10 ml de formol 10% sur environ 1 g de selles et mlanger l'aide
d'un btonnet applicateur jusqu' obtention d'une suspension lgrement
trouble.
Mettre une couche de gaze dans un entonnoir et tenir l'entonnoir au-des-
sus du tube centrifuger.
Faire passer la suspension de matire fcale travers la gaze dans le tube
centrifuger jusqu' obtenir 7 ml.
Retirer la gaze et la jeter.
Ajouter 3 ml d'ther ou d'actate d'thyle et mlanger pendant une
minute.
Centrifuger pendant une minute. Le tube doit avoir le mme aspect que
sur le diagramme ci-contre.
Dcoller le bouchon gras (dbris) avec un btonnet applicateur et jeter le
surnageant en renversant le tube d'un mouvement rapide.
Remettre le tube dans son support et laisser le liquide des parois descendre
vers le culot. Mlanger soigneusement et prlever une goutte de liquide
avec une pipette Pasteur pour la dposer sur une lame; couvrir avec une
lamelle et examiner. Faire galement une prparation colore l'iode.
Examiner toute la zone recouverte par la lamelle avec les objectifs x 10 et
x 40 la recherche d'ufs, de kystes et de larves.
Examen du culot
Les lames de matriel concentr doivent tre examines de la mme faon que
les prparations frais (voir p. 13). Les prparations en solut physiologique
(non colores) seront examines de faon systmatique, la recherche d'ufs,
de larves et de kystes. Si l'on observe des kystes ou des lments qui leur res-
semblent, on examinera une prparation l'iode pour avoir plus de dtails.
Les parasites ont le mme aspect que dans les prparations frais. Dans les
prparations en solut physiologique de sdiment obtenu par la mthode au
formol-ther (ou l'actate d'thyle), les noyaux des kystes sont fixs et peu-
vent tre visibles. Toutefois, il faut quand mme examiner des prparations
l'iode pour que l'identification soit plus fiable.
Techniques de coloration permanente
Dans la pratique courante, on ne fait pas de coloration permanente pour le dia-
gnostic, ni pour l'identification des ufs ou des larves de vers. Toutefois, elles
sont parfois ncessaires dans les cas suivants:
17
identification des oocystes de Cryptosporidium;
identification des formes vgtatives de protozoaires, en cas de doute;'
confirmation de l'identit des kystes de protozoaires, en cas de doute;
conservation d'un matriel de rfrence;
envoi un laboratoire de rfrence pour avoir l'avis d'un expert.
Coloration des oocystes de Cryptosporidium
Les oocystes de Cryptosporidium qui se trouvent dans les selles sont sphriques, et
mesurent 4 6 J.lm de diamtre. On peut les concentrer par une technique au
formol-ther modifie, mais leur identification fait appel des techniques de
coloration. La technique de Ziehl-Neelsen modifie est celle que l'on recom-
mande. On peut aussi employer la technique la safranine-bleu de mthylne ..
Matriel
Btonnets applicateurs en bois
Lamelles couvre-objets
Pinces
Lames porte-objets
Crayon ou feutre pour l'tiquetage
Agitateur en verre
Support pour lames, pour les lames montes
Botes coloration
Papier absorbant ou ponge.
Technique de Ziehi-Neelsen modifie
Ractifs
Fuchsine phnique (ractif No 4)
Formol (formaldhyde) (ractif No 10)
Solution d'acide chlorhydrique-thanol (ractif No 13)
Solution de glycrol-vert malachite (ou bleu de mthylne) (ractif N 12)
Solution d'acide chlorhydrique-mthanol (ractif No 14)
Eau.
Prparation
1. Faire un talement mince de matires fcales, le laisser scher l'air et le
fixer dans le mthanol pendant 2 3 minutes. Dans la mesure du possible,
on le fixera ensuite dans des vapeurs de formol pour diminuer son infectio-
sit. (Le culot d'extraction obtenu avec le formol-ther n'est pas utilisable.)
2. Colorer l'talement la fuchsine phnique froide pendant 5 10 minutes.
3. Procder une diffrenciation par la solution d'acide chlorhydrique-tha-
nol 1% jusqu' ce que le colorant ne diffuse plus.
4. Rincer l'eau du robinet.
5. Effectuer une contre-coloration au vert malachite (ou au bleu de mthy-
lne) 0,25% pendant 30 secondes.
6. Rincer l'eau du robinet.
7. Scher au buvard ou goutter.
8. Examiner un fort grossissement et confirmer la morphologie l'aide de
l'objectif immersion. Mesurer les oocystes. Ceux de Cryptosporidium
mesurent 4 6 J.lm.
Lorsqu'ils sont colors par cette technique, les oocystes de Cryptosporidium
apparaissent comme des sphrules rose vif sur fond vert ple. On peut obser-
ver diffrents degrs de coloration interne, en fonction de l'ge et de l'tat de
l'oocyste.
Technique la safranine-bleu de mthylne
Ractifs
Solution d'acide chlorhydrique-mthanol (ractif No 14)
Solution de bleu de mthylne-phosphate (ractif No 19)
18
Solution de safranine (ractif No 23)
Eau.
Prparation
1. Prparer un talement mince de matires fcales.
2. Le scher l'air. Le passer dans la flamme d'une lampe alcool.
3. Fixer l'talement dans une solution d'acide chlorhydrique-mthanol pen-
dant 4 minutes.
4. Le rincer l'eau du robinet.
5. Le colorer ensuite avec une solution aqueuse de safranine 1% pendant
1 minute. Chauffer le colorant en tenant un couvillon imbib d'alcool
enflamm sous la lame. Ne pas laisser le colorant scher sur l'talement.
6. Rincer le colorant l'eau du robinet.
7. Effectuer une contre-coloration avec une solution de bleu de mthylne
1% (p /v) pendant 30 secondes.
8. Rincer l'eau du robinet et scher la lame.
9. Balayer l'talement avec l'objectif x 40 la recherche d' oocystes, qui seront
ensuite identifis l'objectif x 100. Les oocystes de Cryptosporidium sont
des corpuscules ronds ovales, de couleur rose-orang (4 6j..lm de diam-
tre). Les sporozotes situs l'intrieur des oocystes sont un peu plus foncs.
Technique de coloration au trichrome
pour les protozoaires
Cette technique est intressante pour colorer les prlvements de selles fra-
ches, ainsi que le matriel fix l'alcool polyvinylique (APV). Cependant, il
importe de s'assurer que la dure de conservation des ractifs n'est pas dpas-
se et que la mthode est suivie scrupuleusement si l'on veut obtenir des rsultats
fiables.
Ractifs
Solution dcolorante d'acide actique dans l'alcool (ractif N 1)
Ethanol 70% (ractif N 7)
Ethanol 95%
1
Solution de xylne phniqu (ractif No 5) ou thanol absolu
Solution d'iode dans l'alcool (ractif No 16)
Fixateur de Schaudinn (ractif No 25)
Solution de trichrome (ractif No 27)
Xylne
1
Prparation des botes coloration, et renouvellement des colorants
i) Etiqueter les botes coloration ncessaires pour l'opration et les dispo-
ser en ligne dans l'ordre suivant:
1. Fixateur de Schaudinn
2. Solution d'iode dans l'alcool
3. Ethanol 70% (1)
4. Ethanol 70% (2)
5. Solution de trichrome
6. Solution dcolorante d'acide actique dans l'alcool
7. Ethanol 95% (1)
8. Ethanol 95% (2)
9. Xylne phniqu ou thanol absolu
10. Xylne
1
Ce ractif ne demande aucune prparation. Il est directement utilis partir des rcipients dans lesquels il a
t achet.
19
Disposer plusieurs couches de papier absorbant devant les botes. Si on n'en a
pas, prendre des ponges ou du papier journal.
ii) Remplir chaque bote avec la solution approprie. S'assurer que le fixa-
teur de Schaudinn comprenne bien de l'acide actique.
iii) Verser un peu de milieu de montage dans un petit flacon muni d'un cou-
vercle ou d'un bouchon. (Conserver le grand flacon de solution-mre her-
mtiquement ferm pour viter toute vaporation.)
La srie de botes coloration est dispose dans un endroit pratique o on la
laisse, p r ~ t e l'emploi. Si les rebords des botes sont en verre dpoli, enduire
la surface dpolie d'une fine couche de vaseline afin qu'ils adhrent bien aux
couvercles.
On renouvellera les solutions intervalles rguliers comme suit:
1. Fixateur de Schaudinn- renouveler une fois par mois. Verser le reste de
fixateur dans un flacon dchets pour solutions organiques et le rempla-
cer par une solution frache.
2. Solution d'iode dans l'alcool- renouveler toutes les trois semaines. Si la
couleur s'altre ou devient trop ple, la remplacer immdiatement.
3. Ethanol 70% (1). Cette solution va jaunir avec l'iode de la solution d'iode
dans l'alcool. La renouveler toutes les 3 semaines ou aprs avoir color
30 talements, selon le cas.
4. Ethanol 70% (2) - renouveler toutes les trois semaines.
5. Solution de trichrome - ne renouveler que lorsqu'elle devient verdtre.
Remuer doucement la bote d'avant en arrire. Si ses parois ont l'air plus
vertes que pourpres, jeter le colorant et le remplacer par du colorant frais.
6. Solution dcolorante l'alcool- acide actique- renouveler aprs avoir
dcolor 20 talements, ou une fois par semaine, selon le cas.
7. Ethanol 95% (1) - renouveler une fois par semaine.
8. Ethanol 95% (2) - renouveler toutes les deux semaines.
9. Ethanol absolu- renouveler une fois par semaine; xylne phniqu-
renouveler une fois par mois.
10. Xylne- renouveler une fois par mois.
Tenir un registre de chaque solution, avec mention de la date laquelle elle a
t verse dans la bote, par exemple:
Solution
Schaudinn
Iode dans l'\lcool
Premire utilisation le
13 janvier 1990
7 janvier 1990
A renouveler le
12 fvrier 1990
28 janvier 1990
Vrifier ce registre chaque semaine. Ainsi, les solutions coloreront toujours de
manire satisfaisante les talements de matires fcales.
NOTE:
Laisser les botes coloration couvertes en permanence, sauf pour introduire
ou retirer des lames. Ne pas enlever les couvercles en cours de coloration. Si
elles ne sont pas couvertes, les solutions vont absorber l'humidit de l'air et ne
permettront plus une bonne coloration.
La solution de xylne phniqu et le xylne sont des solutions dshydratantes
et claircissantes; elles liminent l'eau et rendent le matriel translucide ce qui
permet de l'examiner. Si ces solutions captent l'humidit, elles seront moins
efficaces. On observe parfois dans les botes des gouttelettes d'humidit dues
la condensation. Si cela se produit, il faut jeter la solution et la remplacer par
une solution frache.
20
Technique
1. Inscrire les nom et prnom ou le numro du malade et la date sur une
lame.
2. Prlever un peu de matire fcale au moyen d'un btonnet applicateur et
l'taler en une couche mince en frottant ce dernier de gauche droite au
milieu de la lame. La couche de matire fcale doit tre aussi uniforme et
lisse que possible et doit avoir la bonne densit.
Il faut agir rapidement pour viter que l'talement ne sche et plonger
immdiatement la lame dans le fixateur de Schaudinn.
NOTE:
Si la selle est dure, on en mlangera une petite quantit avec du solut
physiologique pour la ramollir et pouvoir faire l'talement.
ENTRE LE MOMENT O IL EST PRPAR
ET LE MOMENT O IL EST MONT,
L'TALEMENT NE DOIT PAS SCHER
3. Fixer dans le fixateur de Schaudinn pendant 1 heure temprature am-
biante. (S'ille faut, on peut le laisser dans le fixateur pendant 2 jours).
Disposer la lame dans la bote coloration de faon que l'extrmit por-
tant le nom du malade soit dirige vers le haut.
4. Saisir la lame avec une pince. L'goutter en mettant le bord de la lame sur
du papier absorbant ou une ponge. La plonger ensuite dans la bote
coloration suivante.
5. La laisser dans la solution d'iode dans l'alcool pendant 1 minute (ni plus,
ni moins). L'en sortir et l'goutter comme en 4. La plonger dans la bote
suivante.
6. La laisser dans l'thanol 70% (1) pendant 1 minute. La retirer et l'gout-
ter.
7. La laisser dans l'thanol 70% (2)
1
pendant 1 minute. La retirer et l'gout-
ter.
8. La colorer avec la solution de trichrome pendant 8 minutes. La retirer et
l'goutter.
1
Si la coloration doit tre interrompue, on peut laisser la lame dans de l'thanol 70% (2). C'est la seule tape
au cours de laquelle on peut interrompre le processus. Si la coloration a dpass cette tape (point 7), il faut la
terminer: elle ne doit pas tre interrompue au-del de ce point.
21
9. Dcolorer avec la solution d'alcool-acide actique- prendre la lame avec
des pinces et la plonger deux fois dans la solution (5 secondes au total).
La solution d'alcool-acide continuera dcolorer l'chantillon aussi long-
temps qu'elle restera en contact avec l'talement et 5 secondes suffisent
donc. (NE PAS plonger la lame dans la bote et compter jusqu' 5.)
Egoutter la lame sur du papier absorbant ou une ponge. Rincer imm-
diatement l'talement l'thanol 95% (1) pour liminer l'acide.
10. Plonger la lame une seule fois dans l'thanol 95% (1) pendant 1
2 secondes. L'goutter avant de la mettre dans la bote suivante.
11. Plonger la lame deux fois dans l'thanol 95% (2) pendant 2 3 secondes.
L'goutter avant de la mettre dans la bote suivante.
12. Plonger la lame dans le xylne phniqu ou l'thanol absolu pendant
1 minute. L'goutter avant de la mettre dans la bote suivante.
13. La laisser dans le xylne pendant 2 3 minutes.
14. La retirer et l'goutter. NE PAS LAISSER LA LAME SCHER A V ANT DE
LA RECOUVRIR AVEC LA LAMELLE. Si elle commence scher, la
retremper dans le xylne- mais goutter le xylne en excs avant de met-
tre le milieu de montage sur l'talement.
15. Poser la lame plat sur du papier absorbant, ou sur un morceau de papier
journal, et l'aide d'un agitateur en verre verser 3 ou 4 gouttes de milieu
de montage sur l'talement. Tenir la lamelle incline, le bord touchant le
bord de l'talement. L'abaisser doucement sur ce dernier, de faon que le
milieu s'tale sous la lamelle sans former de bulles d'air.
NOTE:
Si l'on colore plusieurs talements la fois, les dcolorer chacun spar-
ment. Prendre un talement dans la bote coloration, l'goutter, le dco-
lorer, le rincer l'thanol 95%, l'goutter et le mettre dans le xylne
phniqu ou l'thanol absolu (points 9 12). Retirer ensuite une autre
lame du colorant et lui faire subir le mme traitement. Continuer jusqu'
ce que tous les talements aient t dcolors.
Si l'on colore plusieurs lames, en retirer une seule la fois du xylne, l'goutter
et la monter. Si certains talements restent dans le xylne 4 5 minutes, ils ne
seront pas abms. Laisser la prparation monte bien plat sur du papier
absorbant ou sur un morceau de papier journal, sur une table ou une surface
plane; elle doit rester ainsi jusqu' ce qu'elle soit sche, ce qui peut prendre la
nuit ou davantage. Toutefois, on peut examiner les prparations au bout de
30 minutes, mmes si elles ne sont pas tout fait sches. Aprs examen, ne pas
essayer d'enlever l'huile d'immersion jusqu' ce que le montage soit tout fait
sec (environ 24 heures), car en essuyant l'huile on risque d'enlever la lamelle.
Si cela se produit, rincer immdiatement l'talement au xylne pendant
5 secondes et refaire le montage.
Technique pour les prlvements de selles fixs dans l' APV
1. Remuer le prlvement de selle fix dans l' APV doucement mais compl-
tement (voir p. 30), de faon bien mlanger la selle et le fixateur.
2. Etiqueter une lame comme indiqu au point 1 de la technique utilise pour
les selles fraches.
3. Plonger un btonnet applicateur dans le prlvement fix dans l' APV afin
d'en retirer un peu de suspension de selle. Etaler cette dernire en faisant
rouler le btonnet sur la lame. On peut galement taler la selle en tapotant
le btonnet sur la lame et en le frottant de bas en haut au fur et mesure
qu'on l'tale.
22
La couche de matire fcale doit tre aussi uniforme et lisse que possible.
On doit pouvoir tout juste distinguer des caractres d'imprimerie fins au
travers, mais sans pouvoir les lire. Les prparations trop paisses ne se
colorent pas bien et sont difficiles examiner. Si la prparation est trop
mince, il n'y a pas suffisamment de matriel pour que l'examen soit fiable.
matire fcale tale en
tapotant le btonnet
~
4. Les talements DOIVENT SCHER avant de pouvoir tre colors. Les lais-
ser scher sur une surface plane ou dans un support pour lames. On peut
les laisser temprature ambiante ou dans une tuve 37C. Il faut en
gnraiS 10 heures de schage, gnralement pendant la nuit. Il est pr-
frable de prparer les talements dans la journe, de les laisser scher la
nuit et de les colorer le lendemain. En cas de besoin, on peut conserver les
talements secs 3 4 semaines avant de les colorer.
5. Plonger l'talement sch fix l' APV dans une solution d'iode dans
l'alcool.
i) Solution d'iode dans l'alcool- 15 minutes. Egoutter comme indiqu
prcdemment pour les talements prpars partir de selles fraches.
ii) Ethanol 70% (1)- 5 minutes. Egoutter.
iii) Ethanol 70% (2)- 5 minutes. Egoutter.
iv) Solution de trichrome- 8 minutes. Si l'on colore plusieurs lames la
fois, n'en retirer qu'une du colorant et l'goutter (laisser les autres
dans le colorant). Ne dcolorer qu'une lame la fois.
v) Solution dcolorante l'alcool-acide actique- tenir la lame avec des
pinces et la plonger rapidement dans la solution dcolorante 2 ou
3 reprises (5 secondes au total). L'goutter 1 2 secondes. (Voir point
9 page 22).
vi) Ethanol 95% (1) -Plonger la lame deux reprises dans la solution
pour liminer l'acide. L'goutter 2 secondes.
vii) Ethanol 95% (2)- 5 minutes. Egoutter.
viii) Solution de xylne phniqu ou alcool absolu - 7 minutes. Egoutter.
ix) Xylne- 10 minutes.
x) Retirer une lame du xylne, l'goutter pendant 2 secondes, puis la
poser plat sur du papier absorbant ou un morceau de papier.
Pour le montage, procder comme indiqu pour les chantillons de
selles fraches (page 22).
Aspect de l'talement color au microscope
L'aspect des talements prpars partir de selles fixes dans l' APV est le
mme que celui des selles fraches, mais on peut observer des variations d'un
talement l'autre en raison:
- de l'paisseur des talements qui ne sera jamais exactement la mme,
- de la dure de la dcoloration qui peut tre lgrement diffrente, et
- du fait que les selles varient d'une personne l'autre.
En gnrat le substrat est color en vert ou en bleu-vert. Il peut arriver qu'un
chantillon se colore en rouge, mais cela n'empche pas de reprer ni d'iden-
tifier les lments parasitaires. Les diffrentes inclusions prsentes dans les
selles se colorent de la manire suivante:
23
VERT (ou bleu-vert)
- cytoplasme des formes vgtatives et des kystes (bien fixs et bien colo-
rs),
- cytoplasme des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire,
- levures et moisissures (gnralement),
- protozoaires dgnrs,
- parasites ayant t trop ou trop peu dcolors,
- Blastocystis hominis (un protozoaire souvent retrouv dans les selles),
qui contient des granules rouges situs tout autour de la bordure
externe de la cellule.
VIOLET (ou bleu-violet ou rouge-violet)
- cytoplasme des formes vgtatives et des kystes (parfois),
- kystes d'Entamoeba coli (parfois),
hmaties ingres et bactries situes l'intrieur des formes vgta-
tives.
ROUGE (ou rouge-violet)
- hmaties ingres et bactries situes l'intrieur des formes vgta-
tives,
- levures et moisissures (parfois),
- kystes n'ayant pas t correctement fixs,
- noyaux des cellules de pus et des cellules d'origine tissulaire,
- chromatine nuclaire des formes vgtatives et des kystes,
cristallodes des kystes d'amibes.
Examen des talements colors
1. Poser l'talement mont et tout fait sec sur la platine du microscope et
mettre au point avec l'objectif le plus faible (x 10). Choisir un endroit qui
ne soit ni trop mince ni trop pais. Si l'talement est uniforme (tous les
endroits ont peu prs la mme paisseur), mettre au point au hasard avec
l'objectif x 10. Certaines zones de l'talement peuvent tre trop paisses
pour qu'on puisse voir facilement au travers; d'autres peuvent tre trop
minces.
Si l'ensemble de l'talement est trop pais, rechercher l'endroit le plus
mince. Les lments parasitaires les mieux colors seront en gnral
retrouvs dans les zones les plus minces.
Si l'ensemble de l'talement semble trop mince, rechercher l'endroit le
plus pais. Les lments parasitaires seront probablement mieux colors
dans ces zones paisses.
2. Dposer une goutte d'huile immersion sur l'endroit choisi et passer
l'objectif immersion. Les talements colors de matire fcale doivent
tre examins l'immersion. Ne pas employer le fort grossissement sec.
3. Mettre soigneusement au point avec l'objectif immersion. Rgler l' clai-
rage du microscope l'aide du diaphragme pour avoir suffisamment de
lumire et pour pouvoir voir distinctement les cellules, bactries et autres
lments prsents dans le champ. Dplacer la lame sur la platine, en met-
tant au point soigneusement sur chaque nouveau champ, afin d'observer
les lments prsents dans les divers plans de l'talement. Il faut examiner
environ la moiti de l'talement; il n'est pas ncessaire d'examiner toute
la partie recouverte par la lamelle comme cela s'impose avec les prpara-
tions en solut physiologique.
24
4. Il s'agit de rechercher principalement les formes vgtatives et les kystes
d'Entamoeba histolytica et de Giardia. S'il y a beaucoup de parasites dans
l'chantillon, ils seront identifis en quelques minutes. Si ce n'est pas le
cas, continuer examiner l'talement.
Identification des parasites dans les talements colors
Dans les talements colors, on observera la fois les formes vgtatives et les
kystes d'amibes et de flagells. Leur cytoplasme sera color en bleu-vert ou en
vert; les noyaux, inclusions de type hmaties et bactries, les cristallodes des
kystes d'amibes et les filaments des flagells se coloreront gnralement en
rouge ou en violet. Le glycogne est dissous au cours de la coloration et n'est
pas visible dans les prparations colores. L o il a t limin, on observera
des zones transparentes ou blanches.
Les caractristiques employes pour identifier les protozoaires dans les tale-
ments colors sont prsentes dans la deuxime partie, pp. 73-82.
Ecouvillonnage anal la recherche des ufs d'oxyures
On utilise l' couvillonnage anal pour dceler la prsence des oxyures (Entera-
bi us vermicularis). Ceux-ci sont plus courants chez l'enfant que chez l'adulte.
Toutefois, si dans une famille un enfant a des oxyures il arrive souvent que
d'autres membres de la famille soient infests. Par consquent, si l'on en
trouve chez un enfant, il est souhaitable d'examiner des prlvements effec-
tus chez tous les membres de la famille, en particulier chez les autres enfants.
On retrouve en gnral les ufs d'oxyures dans les plis cutans de la marge
anale. Ils apparaissent rarement dans les selles.
Prlvement
Matriel ncessaire pour la mthode A
Centrifugeuse
Ecouvillons (coton)
Lames porte-objets
Pipettes Pasteur avec poires en caoutchouc
Solut physiologique pour humidifier les couvillons
Tubes essais, 100 x 13 mm
Technique - Mthode A
Ecarter les fesses du malade, et frotter le pourtour de l'anus avec l'couvillon,
mais sans l'introduire dans l'anus. Mettre l'couvillon dans un tube.
Matriel ncessaire pour la mthode 8
Cellophane adhsive transparente
Abaisse-langue ou cuillre en plastique ayant un manche de 10 cm de long
Lame porte-objet
Technique- Mthode 8
1. Plier une bande de cellophane adhsive transparente autour de l'extrmit
d'un manche de cuillre ou d'un abaisse-langue, le ct adhsif vers l' ext-
rieur.
25
2. De l'autre main, carter les fesses du malade. Appuyer l'extrmit de la
cuillre portant la cellophane adhsive en diffrents endroits de la marge
anale.
3. Coller ensuite le morceau de cellophane adhsive sur une lame. Avant de
l'examiner, le soulever et dposer une goutte d'huile immersion en son
milieu et le recoller. Cela permettra d'amliorer la transparence de la cel-
lophane.
Se laver les mains; autrement, les ufs qui ont pu les contaminer peuvent pro-
voquer une infestation s'ils arrivent jusqu' la bouche de l'oprateur.
Pour augmenter les chances de recueillir des ufs,le prlvement doit tre fait
entre 22 heures et minuit, ou tt le matin, avant que le malade n'ait urin, df-
qu ou fait sa toilette. Il est parfois ncessaire de procder plusieurs examens
avant d'obtenir un rsultat positif.
Mthode d'examen
Le prlvement sur cellophane adhsive permet un examen direct. Pour les
couvillons, procder comme suit :
1. Verser dans le tube contenant l'couvillon suffisamment de solut physio-
logique pour recouvrir le coton- soit environ 5 ml.
2. Laisser reposer pendant 4 5 minutes.
3. Retirer l'couvillon du solut. Le rouler contre les parois du tube pour li-
miner le liquide.
4. Jeter l'couvillon.
5. Concentrer l'chantillon en le centrifugeant pendant 1 minute.
6. A l'aide d'une pipette, liminer soigneusement le surnageant sans troubler
le peu de culot prsent.
7. Toujours l'aide d'une pipette, transfrer le culot sur une lame pour exa-
men. Diminuer l'clairage du microscope et mettre au point de la surface
vers le fond de la prparation pour observer les ufs d'Enterobius (pour
leur description, voir deuxime partie, pp. 69-71).
Etalement pais de matire fcale sous cellophane
pour le diagnostic des bilharzioses intestinales
(technique de Kata-Katz)
Cette technique d' exarpen des talements pais s'est avre un moyen efficace
pour diagnostiquer les bilharzioses et les helminthiases intestinales. Ces tale-
ments peuvent tre prpars sur le terrain, conservs dans des botes de lames
et expdis au loin pour examen dans un laboratoire central, le cas chant. En
revanche, elle ne convient pas pour rechercher les larves, kystes ou ufs de
certains parasites intestinaux.
Matriel et ractifs
Btonnets applicateurs, en bois
Tamis, en acier inoxydable, nylon ou plastique, avec mailles de 60-105
Plaque perfore en acier inoxydable, plastique ou carton
Lames porte-objets
Cellophane, de 40 50 11rn d'paisseur, en rectangles de 25 x 30 ou 25 x 35 mm
Bocal fond plat
Pinces
Papier hyginique ou papier absorbant
Papier journal
Solution de glycrol-vert malachite (ou bleu de mthylne) (ractif N12)
26
Technique
Il faut tre prudent lorsque l'on recueille des selles et toujours porter des gants
pour viter toute contamination des doigts.
1. Tremper les rectangles de cellophane dans la solution de glycrol-vert
malachite ou de bleu de mthylne 50% pendant au moins 24 heures
avant usage.
2. Dposer une petite quantit de matire fcale sur un morceau de papier
(le papier journal convient parfaitement).
3. Appuyer le tamis sur l'chantillon.
4. Au moyen d'un btonnet applicateur bord plat, racler la surface sup-
rieure du tamis pour recueillir la matire fcale qui sort des mailles.
5. Disposer une plaque perfore sur une lame propre.
6. Dposer un peu de matire fcale tamise dans la partie vide et la rem-
plir soigneusement. Lisser avec le btonnet applicateur.
7. Enlever soigneusement la plaque de faon que toute la matire fcale reste
sur la lame et que rien ne reste accroch la plaque.
8. Recouvrir avec un rectangle de cellophane ayant tremp dans le glycrol.
9. S'il y a trop de glycrol sur la face suprieure de la cellophane, l'essuyer
avec un morceau de papier hyginique ou de papier absorbant.
10. Retourner la lame et appuyer l'chantillon contre la cellophane sur une
surface lisse (un morceau de tuile ou de pierre plate fait parfaitement
l'affaire) pour l'taler de manire uniforme.
11. Ne pas retourner la lame d'un coup. La cellophane pourrait se dtacher.
La soulever doucement sur le ct en maintenant la cellophane.
La prparation de la lame est maintenant termine. Il peut tre ncessaire
d'essuyer l'excs de glycrol avec un morceau de papier hyginique pour que
la cellophane reste bien fixe. Avec de la pratique, on peut obtenir des prpa-
rations parfaites. La figure 2 montre les diffrentes tapes de la prparation de
Y talement pais.
Selles dures
Le principal problme rencontr avec cette technique d'talement pais est
l'impossibilit d'observer des ufs d'helminthes dans certains chantillons de
selles trop dures (constipation). En pareil cas:
aprs prparation par la mthode classique, attendre 24 48 heures
avant de compter les ufs sur ces lames. Il se peut qu'elles s'claircis-
sent lentement;
prparer deux autres chantillons sur une grande lame (5 x 7,6 cm) et
utiliser un morceau c ~ e cellophane lgrement plus grand (35 x 35 mm),
puis appuyer trs fort pour aplatir l'chantillon au maximum;
- lorsque l'on emploie une grande lame, on peut ramollir les selles avec
du solut physiologique ou du glycrol avant de tamiser.
Observation correcte des lames
A temprature ambiante, on conservera la lame pendant au moins 24 heures
avant de l'examiner (voir plus bas pour ce qui concerne les ufs d'ankylosto-
mes). Si l'on met la lame dans un incubateur (40C) ou sous une lampe fluo-
rescence ou incandescence au laboratoire, ou encore au soleil sur le terrain,
on peut l'examiner au bout de quelques minutes.
Pour faciliter Y examen microscopique, on peut dposer une ou deux gouttes
d'osine dans le solut physiologique (1: lOO) sur la face suprieure de la cel-
lophane, que Y on laisse agir 3 5 minutes, puis que l'on essuie avec du papier
hyginique ou du papier absorbant. Cela facilite l'observation des ufs de
Schistosoma.
27
Fig. 2. Technique d'examen des talements pais de matire fcale sous cellophane (Kato)
pour le diagnostic de la bilharziose intestinale et des helminthiases digestives
1. On peut utiliser diffrents types de matriels. On
voit ici la spatule et la plaque perfore en plastique,
ainsi que le tamis en nylon d'un ncessaire de Kata-
Katz que l'on trouve dans le commerce. Les deux
premiers ustensiles et les lames porte-objets sont
rutilisables. Le tamis en nylon est jetable. Il existe
quelques ncessaires contenant des plaques perfo-
res normalises rutilisables, que l'on peut obtenir
sur commande.
3. La mthode utilise pour cette technique est la
mme quel que soit le matriel employ. Le prlve-
ment de matire fcale est pass travers le tamis au
moyen d'une spatule afin de sparer la matire
fcale des gros dbris.
28
2. Le tamis en nylon et la cellophane ncessaires
pour la technique de l'talement pais peuvent tre
achets en vrac. La cellophane en rouleau est coupe
en morceaux de 25-30 mm et dpose dans un flacon
fond plat et large ouverture contenant une solu-
tion de glycrol 50% (ou davantage) et de vert
malachite ou de bleu de mthylne (lOO ml d'eau,
100 ml de glycrol, 1 ml de vert malachite ou de bleu
de mthylne en solution aqueuse 3%).
4. Cette matire fcale tamise est ensuite mise dans
la plaque perfore qui est pose plat au milieu
d'une lame. La partie vide est entirement remplie
de matire jusqu' hauteur de la surface de la plaque.
La plaque de Kato-Katz que l'on voit ici donne
41,7 mg de matire fcale. Pour obtenir le nombre
d'ufs par gramme de matire fcale, on multiplie le
nombre d'ufs observs par 24.
Fig. 2. (Suite)
S. Le rectangle de cellophane ayant tremp dans le
glycrol pendant au moins 24 heures est pos sur le
prlvement.
7. Les ufs d'Ascaris (gauche) et de Trichuris (droite)
sont visibles tout moment. Les ufs d'ankylosto-
mes (absents ici) ne sont visibles que dans les
30 minutes qui suivent le montage.
29
6. La lame est retourne sur un morceau de verre ou
sur une autre lame et la matire fcale est tale sous
la cellophane par pression uniforme, comme il est
montr ici. Une fois qu'elle est prte, on dpose une
autre goutte de glycrol sur la cellophane et on lisse
les bords de la cellophane pour que la lame se
conserve bien. Si des bulles d'air se forment sous la
cellophane en cours de conservation, une ou deux
gouttes de glycrol dposes sur la cellophane et que
l'on laisse reposer une nuit permettront de les limi-
ner. Ces tnlements pais sous cellophane peuvent
tre prpar, ::;:rr le terrain, conservs dans des botes
de lames et expdis au loin, ce qui permet de les
examiner dans un laboratoire central le cas chant,
quelques jours ou quelques semaines plus tard .

,
8. Le moment idal pour observer les ufs de
S. mansoni, S. intercalatum ou S. japonicum se situe
24 heures aprs le montage. Au soleil, les lames
s'claircissent rapidement et il n'est pas forcment
ncessaire d'attendre 24 heures.
Expdition des prlvements un laboratoire
de rfrence
S'il faut envoyer les prlvements un autre laboratoire pour examen, il faut
les conserver de manire ce que les parasites ne se modifient pas. On emploie
pour cela deux conservateurs:
- le formol 10%- pour la conservation des ufs, larves et kystes dans
les prparations l'tat frais;
- l' APV, un fixateur- pour la conservation des formes vgtatives et des kys-
tes, de manire pouvoir faire une coloration permanente des talements.
Matriel et ractifs
Ruban adhsif
Flacons, 1 000 ml
Etiquettes
Flacons, 20 ml, avec bouchons visss bien ajusts
Formol (formaldhyde) 10% (ractif N 10)
APV
1
(fixateur) (ractif No 22).
Conservation des prlvements
1. Inscrire les nom et prnom ou le numro du malade sur deux flacons de
20 ml. Inscrire la lettre F sur le coin suprieur droit de l'tiquette de l'un d'eux,
et l'abrviation APV dans le coin suprieur droit de l'tiquette de l'autre.
2. Remplir peu prs moiti le flacon F avec du formol 10%. Remplir
peu prs moiti le flacon APV avec de l' APV.
3. A l'aide d'un btonnet applicateur, prlever un peu de matire fcale, de
manire avoir la fois un peu de l'intrieur et du bord de l'chantillon
et mlanger avec le formol 10%. S'assurer que le tout est trs soigneuse-
ment mlang; craser les morceaux. Prendre suffisamment de selle, mais
pas trop, de faon que le mlange occupe environ les 2/3 ou les 3/4 du
flacon.
4. A l'aide d'un btonnet applicateur, prlever un peu de la partie la plus
molle de la selle et la mlanger avec l' APV comme dcrit pour le formol.
L'ensemble du mlange selle-APV ne doit pas occuper pl us des 314 du fla-
con. S'assurer que le mlange est trs soigneusement fait. Ecraser les mor-
ceaux contre les parois du flacon.
5. Bien visser les bouchons des flacons. Entourer de ruban adhsif le haut de
chaque flacon pour viter toute fuite.
6. Emballer soigneusement les flacons dans une bote ou un rcipient d' exp-
dition et les envoyer au laboratoire de rfrence. S'assurer que les flacons
sont entours d'un matriau absorbant (par exemple, coton, papier jour-
nal) et qu'ils sont bien protgs des chocs.
7. S'assurer que les informations ncessaires les accompagnent: nom et pr-
nom ou numro du malade, date d'expdition, parasites trouvs.
Elimination des prlvements
1. Si les selles sont recueillies dans des botes en carton, la meilleure faon de
s'en dbarrasser est de brler le tout. Sic' est impossible, ou si les selles ont
1
La prparation de I'APV est complexe, et fait appel des solutions toxiques et corrosives. La technique figure
dans l'annexe 2 (ractif W 22), mais il est peut-tre prfrable de prparer ce fixateur dans un laboratoire de
niveau suprieur. Autrement, on en trouve dans le commerce, prt l'emploi.
30
t recueillies dans un rcipient mtallique ou en verre, recouvrir de for-
mol 10% ce qui reste dans le rcipient. Cela tuera tous les parasites pr-
sents. Laisser reposer pendant au moins 1 heure avant de jeter le tout ou
de laver le rcipient (s'il est en verre).
2. Les lames employes pour les prparations l'tat frais doivent tremper
dans un bac de dsinfectant (par exemple, de l'hypochlorite de sodium)
pendant au moins 1 heure avant lavage. Utiliser un btonnet applicateur
pour pousser la lamelle dans un bcher ou un petit bac de dsinfectant,
puis mettre la lame dans un autre bac.
Les lamelles se cassent facilement; si on les met avec les lames, elles peu-
vent se briser et la personne qui les lave risque de se couper.
3. Entonnoirs, bouchons et tubes centrifuger doivent galement tremper
dans du dsinfectant pendant 1 heure avant lavage.
4. Les btonnets applicateurs et les compresses de gaze doivent tre brls.
Si c'est impossible, on peut les jeter aprs les avoir fait tremper dans du
dsinfectant.
Contrle de la qualit des examens
coprologiques
Pour obtenir des rsultats exacts et fiables, il faut appliquer un systme de
contrle de la qualit des mthodes de laboratoire employes pour le diagnos-
tic des infestations parasitaires. Ce contrle doit tre appliqu la technique
de prlvement, la prparation des ractifs, et aux techniques de prparation
et d'examen des prparations finales.
Si les prlvements de matires fcales ne sont pas correctement raliss et
traits avant examen, ils prsenteront peu ou pas d'intrt pour un diagnostic
prcis. Cela vaut particulirement pour les protozoaires. Les formes vgta-
tives d'amibes vont commencer dgnrer 1 2 heures aprs mission de la
selle et les modifications de leur aspect peuvent donner lieu des erreurs
d'identifications. Les formes vgtatives de flagells peuvent galement subir
des modifications rendant leur dtermination difficile. Si les selles attendent
plusieurs heures ou toute la nuit, les kystes se dtrioreront, surtout si la tem-
prature est leve.
La fracheur de la selle est moins importante pour les ufs et les larves d'hel-
minthes que pour les protozoaires. Nanmoins, il peut se produire des modifica-
tions qui gneront leur identification. Par exemple, les ufs d'ankylostomes
peuvent tre embryonns et donner naissance des larves. Mme les ufs
d'Ascaris peuvent se dvelopper jusqu'aux stades multicellulaires. En outre,
les larves peuvent dgnrer dans des selles trop anciennes empchant toute
identification de l'espce.
Pour faire en sorte que les prlvements fournis pour l'examen soient bons, il
faut tre attentif aux points suivants:
1. Employer des rcipients propres et secs pour recueillir les selles. (Les sale-
ts gneront l'examen et peuvent introduire des micro-organismes vivant
l'tat libre dans le sol, qui poseront des problmes d'identification
d'espce. Les urines et l'eau dtruiront les formes vgtatives s'il y en a.)
2. Porter l'chantillon au laboratoire ds qu'il est recueilli pour viter toute
dtrioration des protozoaires et toute altration de la morphologie de ces
derniers et de celle des helminthes. Inscrire le nom du malade et la date et
l'heure laquelle la selle a t mise.
31
3. N'accepter pour l'examen que les selles fraches. Ne pas essayer d'exami-
ner des selles qui ont attendue ou qui sont contamines par des salets, de
l'eau ou de l'urine. Demander plutt au malade d'en apporter d'autres.
4. Si les selles ne peuvent tre examines ds leur arrive, les mettre au rfri-
grateur (4-5C) ou dans l'endroit le plus frais et le plus ombrag du labo-
ratoire. Ne pas les laisser au soleil.
5. Examiner les selles diarrhiques et celles contenant du sang et du mucus
ds leur arrive au laboratoire.
Prparation des ractifs
Pour prparer les ractifs, suivre scrupuleusement les formules et directives
donnes. Ne pas modifier les ingrdients, ni leur quantit, ni la mthode de
prparation, de quelque manire que ce soit. Conserver les ractifs comme
indiqu dans la mthode de prparation.
Certains ractifs se conservent indfiniment s'ils sont correctement bouchs et
l'abri de la lumire solaire directe. C'est le cas par exemple des solutions de
formol, du solut physiologique, des fixateurs et des solutions dans l'alcool
(sauf s'il y a vaporation). Les autres ractifs ne se conservent que peu de
temps et sont inefficaces s'ils sont trop vieux. La dure d'utilisation de chaque
solution est indique dans les instructions relatives sa prparation.
1. Inscrire sur tous les ractifs la date laquelle ils ont t prpars. Tenir un
registre des solutions. Le passer en revue une fois par semaine et jeter les
solutions primes.
2. Bon nombre des solutions employes dans la coloration au trichrome doi-
vent tre renouveles intervalles rguliers. Ceux-ci figurent dans les ins-
tructions accompagnant cette technique et doivent tre observs. Si ce
n'est pas le cas, on obtiendra de mauvaises prparations, sans intrt sur
le plan diagnostique.
Techniques de prparation et d'examen des lames
Aucune mthode d'examen co pro logique n'est efficace 100% - ce qui signi-
fie que ces mthodes ne permettront pas toujours de retrouver toutes les esp-
ces prsentes et, si les individus d'une espce donne ne sont prsents qu'en
trs petit nombre, qu'ils peuvent chapper l'observation si l'on n'examine
qu'un seul chantillon. Parce que ces techniques ne sont pas parfaites, il faut
les appliquer aussi soigneusement que possible pour obtenir les meilleurs
rsultats. De plus, il faut s'assurer qu'on utilise bien les techniques appro-
pries au matriel examin.
Examen direct l'tat frais
1. S'assurer que la prparation a une bonne densit. On doit pouvoir lire de
petits caractres d'imprimerie au travers (mais pas trop nettement). S'il est
trop pais ou trop mince, l'observation des lments parasitaires peut tre
difficile.
2. Renouveler les solutions d'iode tous les 10 14 jours. Une solution trop
ancienne ne colorera pas correctement les kystes. Elle ne doit pas non plus
tre trop forte, sinon la matire fcale peut s'agglutiner en une masse
compacte, pigeant des parasites qui seront ds lors invisibles. Si elle est
trop faible, les kystes ne seront pas correctement colors.
32
Mthode de concentration
1. Choisir un chantillon bien reprsentatif de la selle pour la concentration.
2. Prparer des suspensions soigneusement mlanges de matires fcales
dans Y eau ou le solut physiologique.
3. Prendre les quantits de matriel appropries.
4. Centrifuger la bonne vitesse pendant le temps recommand.
5. Prparer et examiner soigneusement les lames montes comme dcrit pour
les prparations l'tat frais.
6. Ne pas jeter le tube contenant le matriel concentr jusqu' ce que l'exa-
men soit termin. On peut avoir besoin de faire une autre prparation.
Mthodes de coloration
1. Choisir des portions de selles molles et contenant du mucus, s'il y en a,
pour faire les talements colorer.
2. S'assurer que les solutions sont encore bonnes. Les renouveler conform-
ment aux instructions figurant dans les mthodes de coloration. Conserver
les flacons des solutions-mres hermtiquement ferms l'abri de la
lumire solaire directe.
3. S'assurer que les botes coloration sont bien fermes. Laisser les couver-
cles ferms, sauf pour introduire ou retirer des lames. Si on laisse les botes
coloration ouvertes, les solutions peuvent s'vaporer ou des dbris peu-
vent tomber dedans et adhrer la prparation.
4. Employer la quantit requise de milieu de montage. S'il y en a trop, on
aura une couche paisse travers laquelle il sera difficile de mettre au
point et l'talement ne sera pas bien visible. S'il y en a trop peu, il y aura
des vides sous la lamelle. Si l'talement a t prpar partir de selles fra-
ches, les zones de vide peuvent gner le diagnostic. Elles rendent gale-
ment la prparation difficile examiner.
5. Toujours examiner les talements colors avec l'objectif immersion.
33
Employer l'objectif x 10 pour mettre au point sur l'talement. S'il n'est pas
uniforme, choisir une zone o l'talement n'est ni trop mince ni trop pais
et qui est bien colore. Passer alors l'objectif immersion et rechercher
les formes vgtatives et/ ou les kystes de protozoaires.
NE PAS OUBLIER
QU'UNE IDENTIFICATION FIABLE
ET PRCISE DES PARASITES REPOSE SUR:
DES PRLVEMENTS SATISFAISANTS
UNE BONNE PRPARATION ET UNE BONNE
CONSERVATION DES RACTIFS
LA MISE EN UVRE SOIGNEUSE DES TECHNIQUES
APPROPRIES ET L'EXAMEN MINUTIEUX DES
PRPARATIONS FINIES
Urines
On examine en gnral les urines la recherche d'ufs de Schistosoma haema-
tobium. On peut galement y voir des formes vgtatives de Trichomonas vaginalis.
Dans les pays o la filariose est endmique, on peut trouver dans le culot de cen-
trifugation des urines parfois laiteuses de certains malades des microfilaires
appartenant aux espces Wuchereria bancrofti et Onchocerca volvulus.
Dans les rgions d'endmie bilharzienne, le premier signe de l'infestation est
une hmaturie et/ ou une protinurie dcelable l'aide de bandelettes racti-
ves. Une hmaturie importante indique une forte infestation.
Prlvement des urines pour le diagnostic
des infestations Schistosoma
Dans les urines, le nombre d'ufs varie au cours de la journe, et montre un
pic entre 10 heures et 14 heures. On recueillera donc un chantillon de 10 ml
au moins ce moment-l, en fin de miction. On peut galement recueillir de
la mme manire les urines de 24 heures. On examinera l'ensemble du prl-
vement car les ufs peuvent tre trs rares. Demander au malade d'uriner
dans une bouteille ou un flacon propre et examiner immdiatement les urines.
Si elles doivent attendre plus d'une heure, ajouter 1 ml de formol (solution de
formaldhyde 37%) non dilu pour 100 ml d'urine. Cela permettra de
conserver tous les ufs prsents.
NOTE:
Si l'on ne dispose pas de formol, on peut ajouter 2 ml d'eau de Javel ordinaire
pour 100 ml d'urine.
AlTENTION
Le formol et l'eau de Javel sont corrosifs et sont dangereux en cas d'ingestion.
Examen des urines
La sdimentation et la filtration sont les deux mthodes employes pour dce-
ler les ufs de Schistosoma haematobium. La premire est moins sensible mais
meilleur march et plus simple mettre en uvre que la seconde. La techni-
que de filtration est surtout utilise en sant publique lorsqu'on a besoin de
donnes quantitatives.
Mthode de sdimentation des urines de 24 heures
recueillies en fin de miction
Matriel
Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 15 ml
Tubes centrifuger, coniques, 15 ml
Verre pied conique pour urines
Lame porte-objets
Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc.
34
URINES
Techniques
1. Agiter soigneusement l'chantillon et le verser dans un verre pied conique.
2. Laisser reposer pendant une heure. Retirer le surnageant, transvaser le dpt
form dans un tube centrifuger et centrifuger 2000 g pendant 2 minutes.
3. Examiner le culot de centrifugation la recherche d'ufs avec l'objectif
x 10, afin de balayer l'ensemble de la prparation.
Ne pas centrifuger plus longtemps ni plus vite, car cela peut provoquer la rup-
ture des ufs et la libration des miracidiums.
TRAITER L'CHANTILLON AUSSITT QUE POSSIBLE
AGITER LE FLACON AVANT DE VERSER L'URINE
TIQUETER SOIGNEUSEMENT LAMES/TUBES/PAPIERS
FILTRES
Mthode de filtration la seringue
Matriel et ractifs
Porte-filtres, 13 mm ou 16 mm de diamtre
Pinces
Seringue plastique, 10 ml
Filtre membrane
1
, 12 ~ o u 20 ~ r n (polycarbonate), filtre en nylon ou papier filtre
Lames porte-objets
Lugol (solution-mre 5%) (ractif no 17).
Technique
1. Disposer un filtre de polycarbonate ou de nylon (porosit, 12 20 J..Lm)
dans le porte-filtre. On peut galement utiliser du papier filtre (Whatman
No 541 ou N 1). Agiter l'chantillon d'urine en le secouant doucement ou
en remplissant et en vidant la seringue deux reprises.
2. Aspirer 10 ml d'urine dans la seringue et fixer le porte-filtre sur la serin-
gue. (Si l'chantillon fait moins de 10 ml, le mentionner dans le cahier de
laboratoire.)
3. En maintenant le tout vertical, faire passer l'urine de la seringue dans le
porte-filtre au-dessus d'une cuvette ou d'un vier.
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; Pour obtenir les tmres de polycarbonate et le porte-filtre, s'adresser : Sartorius GmbH, PO Box, D-3400
Gttingen, Allemagne; Millipore lntertech lnc., Ashby Road, PO Box 225, Bedford, Massachusetts 31730,
Etats-Unis d'Amrique. On peU1 se procurer les filtres en nylon (Ny1rel Tl HO 20), en rouleaux ou en paquets
de 500, auprs de l'Union Gazes Bluter, BP. 2, F-42360 Panissires, France.
35
4. Dvisser soigneusement le porte-filtre, remplir la seringue d'air, la refixer
ensuite au porte-filtre et expulser l'air. (Cette manipulation est importante,
car elle permet d'liminer l'excs d'urine et de bien plaquer les ufs, s'il y
en a, sur le filtre.)
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5. Dvisser le porte-filtre, retirer le filtre avec une pince et le dposer (face fil-
trante vers le haut) sur une lame. Ajouter une goutte de Lugol et attendre
15 secondes que le colorant pntre dans les ufs.
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6. Examiner immdiatement toute la surface du filtre au microscope (objec-
tif x 40). On voit nettement les ufs de schistosomes colors en orange. On
dfinit la charge parasitaire comme tant le nombre d:ufs pour 10 ml
d'urine. Il est donc important de noter la quantit d'urine examine, si elle
est infrieure 10 ml. Pour faire une estimation de l'intensit de l'infesta-
tion, diviser le nombre d'ufs obtenu par 10. Si l'on a examin moins de
10 ml d'urine, appliquer l'quation suivante:
Nombre d'ufs pour 10 ml= Nombre d'oeufs compts x 10
x
dans laquelle x= nombre de ml d'urine filtre examins.
Rutilisation des filtres
Enlever le filtre immdiatement aprs usage et le laisser tremper toute la nuit
dans une solution d'hypochlorite 1% (eau de Javel domestique). Le laver
ensuite soigneusement dans une solution dtergente et le rincer plusieurs fois
l'eau propre. Vrifier au microscope qu'il est dbarrass de tout parasite
avant de le rutiliser.
36
URINES
Identification
Les ufs de Schistosoma haematobium sont grands; ils mesurent environ 120
150 j.lm de long, et possdent un peron terminal l'une de leurs extrmits.
On peut voir l'intrieur de l'uf un embryon (le miracidium).
Il est parfois ncessaire de dterminer si les ufs sont viables. C'est possible
si l'chantillon est frais et qu'aucun conservateur ne lui a t ajout.
Observer attentivement les ufs pour voir si les embryons bougent. C'est la
meilleure indication de leur viabilit. Si aucun mouvement n'est visible,
rechercher les cellules flammes vibratiles>>. Il y en a quatre, situes aux qua-
tre coins de l'embryon. Travailler fort grossissement, diminuer lgrement la
lumire et rechercher le mouvement rapide des cils (petits poils) de ces cellu-
les.
Examen quantitatif
Les rsultats des examens d'urine, effectus par filtration la seringue pour
dceler les infestations S. haematobium, peuvent tre rangs dans les catgo-
ries suivantes:
Infestation lgre: 1 49 ufs pour 10 ml d'urine
Forte infestation:> 50 ufs pour 10 ml d'urine
Une troisime catgorie pour les chantillons renfermant plus de 500 ou plus
de 1000 ufs de S. haematobium pour 10 ml d'urine est parfois ncessaire dans
les rgions o l'intensit de l'infestation atteint frquemment ce niveau (c'est-
-dire dans plus de 10% des cas).
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Prlvements vaginaux et urtraux
On examine les prlvements vaginaux et urtraux la recherche de Trichomo-
nas vaginalis, un flagell parasite du systme gnito-urinaire. Il parasite aussi
bien l'homme que la femme, mais l'homme est habituellement asymptomati-
que. Trichomonas vaginalis est en gnral identifi dans des prparations non
fixes de prlvements vaginaux ou urtraux. (Dans les prparations colores
ces parasites sont trs dforms, et peuvent ne pas tre identifiables.)
Matriel
Centrifugeuse avec couronne et adaptateurs pour tubes de 100 x 13 mm (les
mmes adaptateurs porteront les tubes coniques de 15 ml et les tubes de
100 x 13 mm)
Ecouvillons, striles (coton)
Lames porte-objets
Pipettes Pasteur, avec poire de caoutchouc
Tubes essais, petits, 100 x 13 mm, avec bouchons de coton ou bouchons vis-
ss, et contenant chacun 3 ml de solut physiologique strile.
Technique
1. Avec un couvillon strile, effectuer le prlvement vaginal ou urtral.
2. Mettre immdiatement l'couvillon dans un tube strile contenant environ
3 ml de solut physiologique strile. Briser l'extrmit du btonnet s'il est
trop long pour le tube.
3. Si on le souhaite, on peut prparer des frottis colorer. Pour cela recueillir
davantage de matriel au moyen d'un second couvillon strile et faire le
frottis sur une lame. Laisser scher.
4. Inscrire les nom et prnom ou le numro du malade et la date du prlve-
ment sur le tube et sur la lame.
NOTE:
Si le malade peut se rendre au laboratoire, on procde un examen direct de
prparations l'tat frais. Les tubes sont alors inutiles.
Examen direct de frottis vaginaux et urtraux
1. Si le malade peut se rendre au laboratoire, recueillir un peu d'coulement
vaginal ou urtral l'aide d'un couvillon strile et le dposer sur une
lame dans une goutte de solut physiologique.
2. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 la recherche
de flagells mobiles.
Matriel centrifug ou sdiment
1. Si l'on reoit un couvillon dans du solut physiologique, rcuprer le
liquide en pressant le coton contre les parois du tube. Jeter ensuite l'cou-
villon.
2. Centrifuger le tube pendant 2 minutes. S'il n'y a pas de centrifugeuse, lais-
ser reposer le tube pendant 10 minutes afin de laisser les particules ven-
tuelles se dposer au fond.
38
PRLVEMENTS VAGINAUX ET URTRAUX
3. A l'aide d'une pipette, liminer le surnageant sans toucher au culot.
4. Prlever une goutte de culot et la dposer sur une lame.
5. Recouvrir d'une lamelle et examiner aux objectifs x 10 et x 40 la recherche
de flagells mobiles.
Dans les prparations l'tat frais, on peut identifier les flagells grce leurs
mouvements caractristiques. Les formes vgtatives de Trichomonas ont un
mouvement nerveux et saccad. Comme T. vaginalis est la seule espce de Tri-
chomonas parasitant le systme gnito-urinaire, il est inutile d'tudier les carac-
tres morphologiques qui permettent de la diffrencier de T. hominis, qui vit
dans l'intestin. Il arrive parfois, mais c'est rare, que l'on prenne les corps cilis
des cellules pithliales du tractus gnital pour des parasites.
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Prlvements de sang
et autres prlvements
On recherche dans le sang les parasites suivants:
- Plasmodium
- Microfilaires
- Trypanosoma
- Leishmania
Les frottis colors restent la technique d'examen du sang la plus couramment
employe. On emploie en gnral le Giemsa (l'un des colorants de Romanowsky)
pour ces frottis. Lorsqu'on a besoin d'un diagnostic rapide, on peut galement
employer la coloration de Field. L'hmatoxyline de Delafield est utilise pour
les microfilaires. Selon les circonstances, on emploiera des gouttes paisses ou
des frottis minces. Les premires permettent une meilleure dtection des
parasites et font gagner du temps lors de l'examen. Toutefois, la technique du
frottis mince dforme trs peu le parasite et permet une identification de
l'espce lorsque c'est impossible avec les gouttes paisses; son seul inconv-
nient est qu'il faut examiner de nombreux champs pour dceler la prsence
des parasites lorsqu'il y en a peu. Par consquent, on ralisera toujours les
deux types de prparations lorsqu'on recherche Plasmodium et trypanosomes;
s'il est impossible d'identifier prcisment le parasite sur la goutte paisse, on
examinera alors le frottis mince. Pour rechercher les microfilaires, on fera des
gouttes paisses.
Le plus conomique consiste associer goutte paisse et frottis mince sur la
mme lame. Toutefois, ils doivent tre compltement secs (8 10 heures ou
toute la nuit) avant de pouvoir tre correctement colors. Pour le paludisme,
les lames seront colores le jour mme. Parfois, le mdecin peut avoir besoin
d'un diagnostic rapide. En pareil cas, faire le frottis mince et la goutte paisse
sur des lames spares.
Les frottis minces schent rapidement et peuvent tre immdiatement colors.
Utiliser la coloration de Field rapide et examiner la lame tandis que le Giemsa
est en cours. Rechercher les Plasmodium. S'ils sont visibles, un diagnostic de
paludisme peut tre pos et l'espce de Plasmodium identifie par le Giemsa.
Si les parasites sont invisibles dans le frottis mince, colorer la goutte paisse
au colorant de Field. Rechercher les Plasmodium.
Il est parfois difficile d'identifier l'espce dans les gouttes paisses et il arrive
que l'on doive les envoyer un autre laboratoire pour avoir l'avis d'un spcia-
liste.
Les prparations directes de sang total frais (ou de sang centrifug) sont en
gnral utiliss pour dceler microfilaires et trypanosomes. Ils ne font que per-
mettre le diagnostic d'infestation, et il faut faire des frottis colors pour savoir
en prsence de quelle espce on se trouve.
Dans les rgions o il est possible de trouver la fois Plasmodium, trypanoso-
mes et/ ou microfilaires, on fera des prparations l'tat frais et des frottis
colors. S'il n'y a ni trypanosomes, ni microfilaires dans la rgion, il suffit de
faire des frottis colors pour rechercher les Plasmodium.
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Frottis sanguins colors
Prlvements
Il convient d'appliquer des techniques rigoureuses de prlvement du sang et
de prparation des frottis. Ne jamais oublier qu'il existe un risque de transmis-
sion d'un certain nombre de maladies virales, bactriennes et parasitaires par
le sang.
Matriel et ractifs
Bloc de bois rainur (support pour lames)
Flacon, petit (30 100 ml) avec compte-gouttes et bouchon viss, ou petit fla-
con de verre (30 100 ml) avec bouchon viss et compte-gouttes spar (avec
ttine en caoutchouc)
Eprouvettes gradues, 10 mt 25 ml et 50 ml
Pinces
Compresses de gaze
Baguette de verre
Hmostyles striles
Crayon ou feutre pour Y tiquetage
Lames porte-objets
Registre ou fiche d'enregistrement
Botes coloration
Papier buvard
Alcoot thanol 70% ou isopropanol
Tampon phosphate (ractif N 3)
Mthanol dans un flacon compte-gouttes.
Colorant dilu (voir Coloration des frottis sanguins au Giemsa, p. 44-45).
Les directives relatives la prparation de la dilution ncessaire pour chaque
type de frottis y figurent, accompagnes de dtails relatifs l'aspect technique
de la coloration
1
. Les solutions dilues de Giemsa ne se conservent que 8 heu-
res. Elles doivent donc tre prpares extemporanment et non l'avance. On
les jettera en fin de journe.
Prparation d'une goutte paisse
et d'un frottis mince sur la mme lame
En microscopie paludenne courante, on prpare sur la mme lame un frottis
mince et une goutte paisse. Le frottis sert d'une part l'tiquetage, mais s'il
est bien prpar, il peut galement servir la confirmation de l'espce. L'exa-
men portera sur la goutte paisse.
Technique
Aprs avoir consign les donnes relatives au malade sur la fiche ou le registre
appropri, on prpare les frottis sanguins de la manire suivante:
1. En tenant la main gauche du malade, paume tourne vers le haut, choisir
le troisime doigt aprs le pouce (pour les nourrissons, on peut employer
le gros orteil. Mais on ne prendra jamais le pouce, ni chez l'adulte, ni chez
l'enfant).
Nettoyer le doigt avec un coton inbib d' alcoot en appuyant fermement
pour liminer la salet et la graisse du bout du doigt.
Essuyer le doigt avec un chiffon de coton propre, en appuyant fermement
pour stimuler la circulation sanguine.
1
La solution-mre de Giemsa s'achte gnralement sous forme de solution toute prte.
41
PRLVEMENTS DE SANG ET AUTRES PRLVEMENTS
2. A l'aide d'un hmostyle strile, piquer le bout du doigt d'un mouvement
de rotation rapide.
En appuyant lgrement sur le doigt, exprimer la premire goutte de sang
et l'essuyer avec un tampon de coton sec. S'assurer qu'il ne reste aucun
brin de coton sur le doigt.
3. En procdant rapidement et en manipulant les lames propres par leurs
bords, recueillir le sang comme suit:
42
Appuyer doucement sur le doigt et recueillir une petite goutte de sang de
cette taille peu prse au milieu de la lame: elle servira faire le frottis
mince.
Appuyer de nouveau pour recueillir deux ou trois gouttes plus grosses,
ayant peu prs cette taille , sur la lame environ 1 cm de la goutte
destine au frottis mince, comme indiqu sur la figure.
Essuyer le sang restant sur le doigt avec du coton.
4. Frottis mince. En prenant une autre lame propre pour taler, et en mainte-
nant la lame sur laquelle se trouvent les gouttes de sang sur une surface
plane et dure, toucher la petite goutte et laisser le sang se rpartir le long
du bord.
Pousser fermement la lame utilise pour taler sur la lame porte-objet dans
le sens oppos aux grosses gouttes, en le tenant inclin 45. S'assurer que
le bord de la lame utilise pour taler soit bien en contact avec la surface
de la lame porte-objet pendant qu'on procde l'talement. Le frottis ne
doit pas aller jusqu'au bord de la lame portant les gouttes, afin d'viter que
la personne qui la manipule ne s'infecte.
5. Goutte paisse. Toujours tenir les lames par leurs bords, ou par un coin,
pour raliser la goutte paisse comme suit:
En prenant le coin de la lame utilise pour taler, rassembler rapidement
les grosses gouttes et les taler de manire obtenir un frottis pais et uni-
forme. Ne pas trop mlanger le sang, mais l'taler en cercle ou en rectangle
en 3 6 mouvements.
6. Laisser la goutte paisse scher plat, l'abri des mouches, de la poussire
et d'une chaleur excessive. Une fois que le frottis mince est sec, y inscrire
au crayon ou au feutre les nom et prnom ou le numro du malade et la
date en travers de la partie la plus paisse (comme montr ci-dessous). Ne
pas employer de stylo bille.
7. Envelopper la lame sche dans du papier propre et l'envoyer au plus vite,
au laboratoire accompagne de la fiche du malade.
43
8. La lame utilise pour taler le frottis doit tre dsinfecte et peut ensuite
tre rutilise pour le malade suivant, une autre lame propre du paquet
servant alors pour taler.
Coloration des frottis sanguins au Giemsa
Mthode classique de coloration de la goutte
paisse et du frottis mince sur la mme lame
Pour obtenir la meilleure coloration possible, ces deux types d'talements doi-
vent tre prpars sur des lames spares et la coloration est alors ralise avec
des concentrations et des temps de coloration diffrents. Il est souvent impos-
sible de procder ainsi, et on fait en gnral les deux sur la mme lame. En
pareil cas, il importe surtout de bien colorer la goutte paisse. On obtient de
meilleurs rsultats si les talements ont sch toute la nuit.
1. Fixer le frottis mince en y ajoutant trois gouttes de mthanol, ou en le trem-
pant quelques secondes dans un rcipient de mthanol. Une fixation pro-
longe peut rendre difficile la mise en vidence des granulations de
Schffner et des taches de Maurer. Pour que la dshmoglobinisation
puisse avoir lieu, la goutte paisse ne doit pas tre fixe; on vitera donc
tout contact de celle-ci avec le mthanol ou des vapeurs de mthanol.
2. Disposer les lames dos dos dans une bote coloration.
3. Prparer une solution de Giemsa 3% dans de l'eau distille ou dsionise
tamponne pH 7,2 (ractif N 3), en quantit suffisante pour remplir les
botes utilises. Mlanger soigneusement le colorant.
4. Verser doucement le colorant dans la bote, jusqu' ce que les lames soient
entirement recouvertes.
5. Laisser colorer pendant 30 45 minutes l'abri de la lumire du soleil.
6. Verser doucement de l'eau propre dans la bote pour faire dborder la
mousse irise qui s'est fm::rne la surface du colorant. Ou bien, plonger
doucement toute la bote dans un rcipient rempli d'eau propre.
7. Vider doucement l rest de colorant et rincer de nouveau l'eau propre
pendant quelques secondes. Vider l'eau.
8. Retirer les lames une une et les mettre goutter sur un support, le ct
portant les talements vers le bas, en s'assurant que ces derniers ne tou-
chent pas le support.
Mthode rapide de coloration de la goutte paisse
et du frottis mince sur la mme lame
Cette mthode convient la coloration rapide de la goutte paisse dans un
laboratoire trs actif lorsqu'on a besoin de rsultats urgents, mais elle ncessite
beaucoup plus de colorant.
1. Laisser la goutte paisse scher compltement; si l'on a besoin de rsultats
rapides, on peut acclrer le schage avec un ventilateur, ou en exposant
brivement la lame une chaleur douce, comme par exemple celle de la
lampe du microscope. On prendra soin d'viter toute surchauffe, pour vi-
ter que la goutte paisse ne soit fixe par la chaleur.
2. Fixer le frottis mince en le tamponnant doucement avec un coton imbib
de mthanol, ou en le trempant quelques secondes dans un rcipient de
mthanol. Pour que la dshmoglobinisation puisse avoir lieu, la goutte
paisse ne doit pas tre fixe; par consquent, viter de l'exposer au
mthanol ou des vapeurs de mthanol.
44
3. Prparer une solution de Giemsa 10% dans de l'eau distille ou dsioni-
se tamponne pH 7,2; s'il n'en faut qu'une petite quantit, 3 gouttes de
colorant par ml d'eau tamponne permettront d'obtenir une solution de
Giemsa la bonne concentration. Il faut environ 3 ml de solution par lame.
4. Verser doucement le colorant sur la lame, par exemple l'aide d'une
pipette. On peut galement disposer les lames face vers le bas sur une pla-
que coloration concave et introduire le colorant sous la lame.
5. Laisser colorer pendant 5 10 minutes.
6. Rincer doucement le colorant en ajoutant quelques gouttes d'eau propre;
ne pas renverser le colorant puis rincer, car cela laisserait un dpt
d'cume sur le frottis.
7. Mettre la lame sur le support, talements vers le bas, pour qu'elle s'goutte
et sche, en s'assurant que les talements ne touchent pas le support.
Coloration de Field
La coloration de Field permet une dtection rapide des Plasmodium (mais elle
ne colore pas toujours les granulations de Schffner).
Mthode de coloration des gouttes paisses
Matriel
Une bote coloration remplie de colorant de Field A
Une bote coloration remplie de colorant de Field B
Deux rcipients remplis d'eau propre.
Technique
1. Plonger la lame dans le colorant de Field A pendant 3 secondes.
2. Rincer doucement en la trempant une fois dans l'eau propre.
3. Plonger dans le colorant de Field B pendant 3 secondes.
4. Rincer doucement comme en 2.
5. Mettre la lame en position verticale dans un gouttoir et la laisser scher
l'air.
Mthode de coloration des frottis minces
Ractifs
Colorant de Field A
Colorant de Field B dilu - 1 volume de colorant plus 4 volumes d'eau tam-
ponne (pH 7,2)
Eau tamponne pH 7,2.
Technique
1. Fixer le frottis dans le mthanol pendant une minute.
2. Rincer le mthanol avec de l'eau.
3. A l'aide d'une pipette, recouvrir le frottis de colorant de Field B dilu.
4. Ajouter immdiatement un volume gal de colorant de Field A et mlan-
ger soigneusement en inclinant la lame plusieurs reprises.
5. Laisser colorer pendant 1 minute.
6. Rincer le colorant l'eau propre.
7. Mettre la lame en position verticale dans un gouttoir et la laisser scher
l'air.
45
Coloration l'hmatoxyline de Delafield
pour la mise en vidence des microfilaires
Matriel et ractifs
Cinq botes coloration
Ether-thanol (fixateur) (ractif N 8)
Solution dcolorante d'acide chlorhydrique-eau (ractif No 15)
Hmatoxyline de Delafield (ractif No 6). Ce colorant peut tre achet tout prt.
Technique
1. Prparer des gouttes paisses
1
obtenues par piqre au doigt. Laisser
scher 8 10 heures ou toute la nuit.
2. Prparer les botes coloration de la manire suivante:
Bote N 1 -Eau du robinet
Bote N 2 - Ether-thanol
Bote No 3 - Hmatoxyline de Delafield
Bote No 4 -Acide chlorhydrique-eau (0,05% d'Hel)
Bote No 5 -Eau du robinet
3. Plonger la goutte paisse sche dans l'eau du robinet (bote No 1) pendant
5 10 minutes. Les hmaties se lysent et la prparation s'claircit ou blan-
chit lorsque la lyse est complte.
4. La laisser scher.
5. La plonger dans l'ther-thanol pendant 10 minutes (bote No 2).
6. La laisser scher.
7. La plonger dans l'hmatoxyline de Delafield pendant 15 minutes (bote
N 3).
8. La dcolorer dans l'acide chlorhydrique-eau (bote No 4).
La plonger deux reprises dans la solution. Agir RAPIDEMENT. La pr-
paration vire au rouge.
9. Plonger immdiatement la lame dans l'eau du robinet (bote No 5) pour li-
miner l'acide. Mettre la bote sous l'eau du robinet jusqu' ce que la pr-
paration vire au bleu. Fixer au robinet un embout de caoutchouc
suffisamment long pour atteindre le haut de la bote et laisser l'eau couler
doucement; si elle coule trop fort, la goutte paisse se dcollera.
Si l'on ne dispose pas d'eau courante, changer l'eau du rcipient plu-
sieurs reprises, jusqu' ce que l'talement vire au bleu. Mettre le doigt en
travers de la bote pour viter que la lame ne tombe, vider l'eau et remplir
nouveau.
10. Laisser la prparation scher et l'examiner l'objectif x 10 et l'objectif
immersion, la recherche des microfilaires.
Examen
Gouttes paisses
1. Mettre au point avec l'objectif x 10 et rechercher les microfilaires.
Elle sont faciles trouver ce grossissement.
2. S'il y a des microfilaires, passer l'objectif immersion et identifier
l'espce. Rechercher galement la prsence de Plasmodium avec ce mme
objectif. On examinera au moins 100 champs microscopiques.
L'examen microscopique de la goutte paisse doit rvler les lments sui-
vants:
- Le fond doit tre propre, dbarrass de tout dbris et de couleur gris
ple mouchet par suite de la lyse des hmaties.
1
Si l'on colore des frottis prpars partir de culot de sang concentr, commencer l'tape 5.
46
- Les noyaux des leucocytes sont colors en violet fonc.
- Les Plasmodium sont bien distincts avec une chromatine rouge fonc et
un cytoplasme bleu-violet clair. Dans les infestations P. vivax et P. ovale,
la prsence de granulations de Schffner dans le fantme de l'hma-
tie hte peut parfois s'observer sur les bords de la prparation.
Frottis minces
1. Mettre au point avec l'objectif x 10 sur l'extrmit la plus mince du frottis,
dans laquelle les hmaties ne forment qu'une couche.
2. Mettre une goutte d'huile immersion sur la lame et passer l'objectif
immersion.
Lorsque l'on recherche des Plasmodium et des trypanosomes, il faut exami-
ner au moins 200 champs microscopiques. L'examen microscopique doit
rvler les lments suivants:
Le fond doit tre propre et dbarrass de tout dbris; les hmaties sont
de couleur rose-gristre ple.
Les granulocytes neutrophiles ont un noyau violet fonc et des granules
bien distincts.
- La chromatine des Plasmodium est colore en rouge-violet fonc et leur
cytoplasme en bleu-violet clair.
- Les granulations de Schffner doivent apparatre comme des pointills
dans les rythrocytes contenant P. vivax ou P. ovale, de mme que les
taches de Maurer dans les rythrocytes contenant les formes annulaires
plus grandes de P. falciparum.
Contrle de la qualit des examens de sang
Pour faire en sorte que les examens qu'il effectue soient fiables, le technicien
de laboratoire doit tre attentif aux points suivants:
1. Le matriel doit tre propre. Les lames doivent tre dbarrasses de tout ce
qui peut les souiller (poussire, graisse, savon, empreintes digitales et
dbris), sinon le sang peut ne pas bien adhrer la lame ou ne pas se colo-
rer correctement. On emploiera des hmostyles striles pour piquer le
doigt (ou l'oreille ou le gros orteil), afin d'viter toute transmission de
maladie d'un sujet l'autre. La piqre sera suffisamment profonde pour
qu'il y ait assez de sang pour prparer les frottis. On nettoiera soigneuse-
ment le doigt avant de le piquer pour liminer les salets, moisissures et
autres contaminants. On peut utiliser du sang prlev par ponction vei-
neuse, condition de prparer les frottis immdiatement, car les anticoa-
gulants modifient les proprits adhsives du sang et la coloration.
2. Les frottis doivent avoir une densit satisfaisante. Le frottis mince doit avoir
une extrmit plus fine dans laquelle les hmaties sont en une seule cou-
che, ce qui permet de bien observer leur morphologie. Si le frottis est trop
pais, les hmaties vont s'empiler>> et l'on distinguera mal leur morpho-
logie. S'il est trop mince, elles risquent d'tre grossirement dformes et
seront souvent mal colores. En outre, dans les zones trop minces, les
parasites sont en gnral dforms.
Il doit tre possible de lire de petits caractres d'imprimerie travers une
goutte paisse. Si l'talement est trop pais, le sang peut s'cailler ou se
dtacher en cours de coloration et l'on peut perdre ainsi des fragments de
prparation. S'il est trop mince, l'avantage de la goutte paisse qui est de
contenir un chantillon plus important, est perdu.
3. Pour obtenir de bons rsultats, il faut laisser scher les frottis en position hori-
zontale pendant la dure indique. Si l'on incline ou si l'on renverse les gout-
tes paisses, le sang peut couler d'un ct de la lame et la prparation sera
irrgulire. La partie paisse peut s'cailler. De plus, s'ils ne schent pas
compltement, les frottis ne se coloreront pas correctement.
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47
En cours de schage, il faut mettre les frottis l'abri de la poussire, des
moisissures et de tout autre dbris qui pourrait tomber dessus et entraner
par la suite des problmes de diagnostic. n faut galement les protger contre
les mouches et tous les autres insectes susceptibles de les endommager.
Les frottis minces doivent tre fixs au mthanol avant coloration, pour
viter que les hmaties ne se lysent. On prendra du mthanol absolu anhydre.
Sinon, les hmaties seront abmes et la coloration mauvaise. Ne jamais
fixer les gouttes paisses. Faire en sorte que le mthanol ne les touche pas.
4. Les colorants dilus et l'eau tamponne utiliss pour la coloration doivent
tre prpars soigneusement, et la solution-mre de colorant doit tre de
bonne qualit. On conservera le flacon de solution-mre de Giemsa herm-
tiquement ferm et l'abri de la lumire du soleil. La moindre humidit
qui pntrerait dedans le rendrait inutilisable. En gnral, on recommande
de verser une partie de la solution-mre dans un flacon propre et sec; c'est
cette portion qu'on utilisera. On protge ainsi le reste de la solution-mre
contre toute contamination accidentelle par de l'humidit ou des dbris.
Ne jamais introduire une pipette mouille dans le flacon de solution-mre.
Le Giemsa dilu est utilisable pendant environ 8 heures. Par consquent,
on prparera les dilutions le jour mme o elles seront utilises.
Le pH du colorant est un facteur trs important pour obtenir des frottis
bien colors. On le contrle au moyen d'une eau tamponne pH 7,2, qui
donne les meilleurs rsultats. Cette eau tamponne peut se conserver un
certain temps si le flacon est hermtiquement ferm. Cependant, on vri-
fiera de temps en temps son pH, pour s'assurer qu'il est bien neutre.
5. Il faut suivre scrupuleusement le mode opratoire de la coloration. Bien s'assurer
qu'on utilise la mthode mise au point pour le type de frottis que l'on
colore. Rincer le colorant exactement de la manire indique dans le mode
opratoire. Si les frottis minces sont trop rincs, le colorant va tre limin;
si les gouttes paisses ne le sont pas suffisamment, des rsidus cellulaires
et du colorant vont rester sur la lame et gner par la suite l'examen micros-
copique. S'assurer que les lames contenant les deux types d'talements
schent en position verticale, la goutte paisse vers le bas. Autrement,
l'eau coulera sur le frottis mince et entranera le colorant.
Techniques spciales pour les Plasmodium
Identification
On peut observer trois structures l'intrieur des parasites. Ce sont: le cyto-
plasme color en bleu, la chromatine en rouge ou en violet et les grains ou les
btonnets de pigment brun ou noir. A l'exception des stades annulaires pr-
coces (jeunes), ces trois structures doivent pouvoir tre visibles. (Les anneaux
prcoces ne possdent en gnral pas de pigment). n est important d'observer ces
trois structures pour pouvoir distinguer les Plasmodium des cellules de l'hte (leu-
cocytes) et des artfacts qui peuvent apparatre en cours de prparation.
Dans les frottis minces, regarder l'aspect des parasites et celui des hmaties
qui les contiennent. Observer:
1. L'aspect des hmaties contenant le parasite.
48
- Dimensions. L'hmatie parasite est-elle de la mme taille que celles qui
ne le sont pas (c'est--dire, de taille normale) ou est-elle plus grande?
- Taches. L'hmatie est-elle remplie de granulations roses ou rouges? Ce
sont les granulations de Schffner que l'on ne rencontre que dans les
infestations P. vivax et P. ovale. (Elles sont absentes dans les hmaties
non parasites). Les cellules contenant les stades tardifs des trophozo-
tes de P. falciparum contiennent souvent des granulations rouge-mauve
irrgulires. Ce sont les taches de Maurer.
2. Aspect du parasite
- Les stades de croissance du trophozote ont-ils un contour irrgulier?
Sont-ils rguliers ou lisses?
De quelle couleur est le pigment des trophozotes gs, des schizontes
et des gamtocytes?
- Combien y a-t-il de mrozotes (s'il y en a) dans le schizonte mr?
- Quelle est la forme des gamtocytes, s'il y en a?
- Quels sont les stades prsents (annulaires, trophozotes gs, schizon-
tes, gamtocytes)?
Laisser scher compltement les frottis avant de les examiner. Si l'on est dans
une rgion o la filariose existe, on balaiera la goutte paisse l'objectif x 10,
la recherche de microfilaires (voir pp. 59-60). Il est ncessaire d'employer
l'objectif immersion pour observer la morphologie des parasites.
Examiner d'abord la portion centrale de la goutte paisse. Les parasites sont
plus faciles dceler dans cette zone plus paisse. Si leur morphologie n'est
pas assez distincte, examiner les bords extrieurs plus fins, pour rechercher
des parasites ayant un aspect plus caractristique.
Dans les gouttes paisses, les hmaties sont lyses et ont donc disparu. La cou-
che de sang est plus paisse que dans les frottis minces et les Plasmodium peuvent
donc tre situs diffrentes profondeurs. Mettre au point soigneusement
dans les diffrents plans pour observer les parasites. Dans les gouttes paisses,
ils apparaissent souvent plus petits que dans les frottis minces, mais on
emploie les mmes caractristiques pour distinguer les espces. Ceux qui se
trouvent sur les bords extrieurs de la goutte paisse ressemblent parfois plus
ceux des frottis minces qu' ceux situs au centre de la goutte paisse. De
temps en temps, on peut voir les contours des hmaties sur ces bords minces.
Les caractristiques prcises utilises pour identifier les espces de Plasmodium
dans les gouttes paisses et les frottis minces sont exposes dans la deuxime
partie, pp. 83-91, o sont galement voqus les problmes de diagnostic.
Surveillance de la chloroquinorsistance
dans le paludisme falciparum
Un Plasmodium pharmacorsistant survivra et continuera se multiplier chez
un malade en dpit d'un traitement mdicamenteux une posologie qui suffit
normalement gurir l'infestatm. L'preuve de terrain classique couram-
ment utilise ncessite l'examen d'une goutte paisse par jour pendant les
7 premiers jours de traitement. Si les formes asexues ont disparu du sang
priphrique au 7e jour, on poursuivra l'examen jusqu'au vingt-huitime jour
pour liminer tous les risques de rsistance RI avec recrudescence tardive. Il
est plus simple d'examiner une goutte paisse au 2e jour chez les malades gra-
vement atteints, ou au 4e jour chez ceux qui le sont moins. Si la numration
parasitaire est dans les deux cas de 20 25% plus leve qu'avant le traite-
ment, cela indique que l'on a affaire une souche rsistante et qu'il faut modi-
fier le traitement.
Technique - L'preuve de terrain classique
1. Faire une numration leucocytaire et calculer le nombre de leucocytes par
Jll de sang (L).
2. Prparer une goutte paisse (parasitmie avant traitement) et compter le
nombre de Plasmodium (P) et de leucocytes jusqu' avoir dnombr
300 leucocytes. Le nombre de Plasmodium par Jll de sang est donn par la
formule: Lx P /300.
49
3. Administrer au malade 10 mg de chloroquine (base) par kg de poids cor-
porel, par voie orale, une fois par jour, pendant les 2premiers jours, puis
5 mg par kg de poids corporel au troisime jour (soit au total 25 mg de
chloroquine base par kg de poids corporel en 3 jours).
4. Faire une goutte paisse par jour pendant les 7 premiers jours, puis au 14e
et au 28e jours, si aucun signe de rmission n'est apparu pendant les deux
premires semaines.
Interprtation de l'preuve de terrain classique
1. Si l'on ne retrouve aucune forme asexue au 6e jour et aucun parasite (for-
mes annulaires et gamtocytes) au 7e jour, la souche est soit sensible (S)
soit rsistante (rsistance de type RI). Pour savoir dans quel cas l'on se
trouve, l'observation sera poursuivie jusqu'au 28e jour. Si les formes annu-
laires ne sont pas rapparues au 28e jour, la souche est sensible; si elles
rapparaissent, la souche prsente une rsistance RI.
2. Si les formes annulaires disparaissent pendant au moins 2 jours de suite,
mais rapparaissent et sont prsentes au 7e jour, on est en prsence d'une
rsistance de type RI.
3. Si les formes annulaires ne disparaissent pas, mais si leur nombre passe
moins de 25% de ce qu'il tait avant le traitement pendant les premires
quarante-huit heures de traitement, il y a rsistance de type RII.
4. Si le nombre des formes annulaires diminue de moins de 75% au cours des
premires 48 heures, ou s'il ne bouge pas, ou s'il continue augmenter, les
parasites sont rsistants la dose normale de mdicament et l'on est en
prsence d'une rsistance de type RIII.
Techniques spciales pour les trypanosomes1
On peut identifier les trypanosomes dans:
- les frottis sanguins
- le liquide cphalorachidien (LCR)
- le suc ganglionnaire
Recherche des trypanosomes dans le sang
Parmi les espces de trypanosomes rencontres en Afrique, il est impossible de
distinguer Trypanosoma brucei gambiense de Trypanosoma brucei rhodesiense sur
le plan morphologique. On peut les identifier dans des talements pais ou
minces. Toutefois, dans les gouttes paisses ils peuvent tre dforms et diffi-
ciles diffrencier des dbris cellulaires. Trypanosoma cruzi, rencontr dans les
Amriques, est trs dform dans les gouttes paisses, mais plus facile iden-
tifier dans les zones paisses des frottis minces.
Tout comme pour les Plasmodium, le cytoplasme des trypanosomes se colore
en bleu. Le noyau et le kintoplaste sont colors en rouge ou en violet. Recher-
cher un organisme allong ayant un noyau prominent situ prs de son cen-
tre et une tache plus petite, le kintoplaste, situe prs d'une extrmit. Le
flagelle est issu de la partie postrieure du trypanosome, proche du kinto-
plaste. Il est attach la paroi cellulaire, sauf son extrmit antrieure, o il
se termine par un bout libre. Comme le flagelle remue constamment, il provo-
que des extensions irrgulires de la paroi cellulaire, connues sous le nom de
membrane ondulante. Le trypanosome peut tre ondul (deux ou trois cour-
bes) ou tre en forme de Cou de U. La forme, la position du noyau et la dimen-
sion et la situation du kintoplaste sont des caractristiques qui permettent de
1
Inspires du Manuel pour la lutte contre la trypanosomiase, 1983, document OMS non publi.
50
diffrencier les espces. On trouvera davantage de dtails sur cette question
dans la deuxime partie, pp. 91-92
Le frottis de sang frais
Cette mthode est la plus facile mettre en uvre et la moins onreuse des
techniques de mise en vidence des parasites dans le sang, mais c'est aussi la
moins sensible.
Matriel
Hmostyle
Tampons de coton
Lames porte-objets
Solut physiologique (ractif No 24)
Ethanol
Mthode
1. Prendre l'annulaire (troisime doigt partir du pouce). Le nettoyer avec
un tampon de coton lgrement imbib d'thanol. Scher correctement.
Piquer avec l'hmostyle.
2. Recueillir la premire goutte de sang qui apparat, directement au centre de
la lame.
3. Ajouter une goutte de solut physiologique. Mlanger le sang et le solut
avec le coin de la lamelle. Couvrir la prparation avec la lamelle.
4. Prparer deux gouttes paisses sur une autre lame en prenant 2 autres
gouttes de sang. Examiner le frottis frais de manire systmatique au
51
microscope (objectif x 10 avec ouverture rduite du condenseur). Le pre-
mier signe de la prsence de trypanosomes ou de microfilaires vivants est
un mouvement rapide au sein des hmaties.
L'illustration de droite montre une vue (x 40) d'un trypanosome au milieu
d'hmaties: celle de gauche, des microfilaires (x 10).
5. Balayer de manire systmatique toute la prparation. Les trypanosomes
sont rfringents et difficiles voir. On les voit mieux en diminuant un peu
l'clairage.
La goutte paisse
C'est une technique plus sensible que le frottis de sang frais car on examine
davantage de sang dans chaque champ microscopique.
1. Dposer une goutte de sang sur une lame propre et sche.
2. Prparer et colorer une goutte paisse de la mme faon que pour les
hmatozoaires (voir pp. 41-45).
3. Examiner l'ensemble de la prparation avec l'objectif immersion.
4. Les trypanosomes sont visibles au sein de la masse d'hmaties lyses et on
peut les reconnatre leur forme typique et leur couleur bleutre clair,
ainsi qu' leur noyau et leur kintoplaste foncs.
Mthode au microhmatocrite
Matriel et ractifs
Ruban adhsif
Tube capillaire
Centrifugeuse pour microhmatocrite
Pte obturer
Solution de citrate de sodium (ractif N 26)
Cette preuve ne ncessite qu'une petite quantit de sang; on peut donc
employer du sang obtenu par piqre au doigt si la ponction veineuse est
impossible. Cependant, on a besoin d'une centrifugeuse spciale pour les
tubes microhmatocrite.
Mthode
1. Piquer le doigt de faon obtenir 2 gouttes de sang sur une lame. Ajouter
1 goutte de solution de citrate de sodium 2% et mlanger. Remplir le
tube capillaire aux trois quarts. Si l'on a recueilli du sang veineux, remplir
le tube capillaire au trois quarts avec du sang prlev.
2. Sceller l'extrmit ouverte du tube en la chauffant ou la pte obturer.
3. Centrifuger dans une centrifugeuse pour microhmatocrite pendant
2 minutes pour les microfilaires, ou 4 minutes pour les trypanosomes.
4. Poser le tube capillaire sur une lame et en fixer les extrmits avec du
ruban adhsif pour viter qu'il ne roule.
52
5. Examiner la limite sparant les hmaties du plasma, l'objectif x 10. On
peut y voir des microfilaires ou des trypanosomes mobiles. Passer un
grossissement plus fort pour une meilleure observation.
Micro-technique de centrifugation 1 change d'anions
(m-AECT)
Cette mthode est l'preuve la plus sensible dveloppe jusqu'ici pour dceler
les trypanosomes dans le sang humain. Les colonnes prpares au laboratoire
et fournies dans les trousses avec des ractifs striles ne ncessitent aucune
rfrigration. Une fois ouverts, la colonne et le tampon doivent tre utiliss
immdiatement. On prendra soin de passer chaque ustensile dans une solu-
tion dsinfectante (par exemple, eau additionne d'eau de Javel 2 %).
Matriel et ractifs
Le ncessaire d'preuve doit comprendre le matriel et les ractifs pour une
preuve, savoir:
Colonne strile dans un tube, dans du solut physiologique tamponn au
phosphate
Tube contenant du glucose ou une solution de glucose prpess
Tube capillaire hparin (tube de Caraway) pour prlvements de sang
Hmostyle
Rservoir et tube centrifuger
Pipette en plastique pour manipuler le tampon.
Par ailleurs, on aura galement besoin du matriel suivant:
Centrifugeuse manuelle
Support pour colonne
Bon microscope, permettant un grossissement jusqu' x 150
Lames porte-objets
Ruban adhsif
Pte modeler pour fabriquer la cellule d'observation.
Technique
1. Retirer la colonne de son tube et la mettre au premier rang du support; la
laisser s'goutter.
~ - - - - - - - - - - - - ~ - - ~ - - - - r - ~
2. Ajouter le glucose ou la solution de glucose prpess au tampon restant
dans le tube et mlanger soigneusement. Mettre le tube de ct, derrire la
colonne, sur le support. A l'aide d'une pipette, ajouter un peu de solution
53
de glucose-solut physiologique tamponn la colonne et la laisser
s'goutter. Rpter l'opration. Le reste du tampon sera utilis ultrieure-
ment.
3. Aprs avoir piqu le doigt, remplir le tube capillaire (tube de Caraway) de
sang jusqu' la marque rouge et le vider immdiatement dans la colonne.
Laisser imbiber le filtre suprieur jusqu' ce que la colonne arrte de cou-
ler. Ajouter la pipette quelques gouttes de tampon, et disposer immdia-
tement le rservoir sur la colonne; le remplir avec du tampon.
La colonne va commencer couler goutte goutte. Compter 6 ou 7 gouttes
et mettre le tube centrifuger sous la colonne, en s'assurant qu'aucune
bulle d'air ne se forme. Seule l'extrmit de la colonne doit pntrer dans
le tube (la hauteur de la colonne peut tre ajuste), ce qui permet d'viter
la formation d'une bulle d'air et toute perte de l'luat hors du tube. Rem-
plir le rservoir de tampon et laisser la colonne fonctionner toute seule,
lentement.
4. Lorsque le tube centrifuger est plein, le retirer et le mettre dans la gaine
de la centrifugeuse manuelle. Equilibrer la centrifugeuse en mettant un
poids quivalent dans la gaine oppose. Centrifuger pendant 5 minutes.
0
~ - - ~ ~ - - - - - - . _ - - - - - - - - - - - - ~ ~
54
5. Retirer le tube de la centrifugeuse et enlever la protection de plastique.
Mettre l'extrmit du tube dans une cellule d'observation et ajouter de
l'eau entre lame et lamelle. L'examiner ensuite au microscope, au grossis-
sement x 10.
6. On repre facilement les trypanosomes: ce sont des petits organismes qui
ondulent au fond du tube. Il arrive que des particules de cellulose aient
travers le filtre de la colonne et viennent compliquer l'examen. Dans ce
cas, tourner le tube.
7. Croquis d'une cellule d'observation.
0
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ATTENTION
NE PAS OUBLIER D'IDENTIFIER le tube centrifuger au moyen
d'une tiquette ou d'un crayon feutre spcial
NE PAS OUBLIER D'QUILIBRER le rotor de la centrifugeuse
si l'on centrifuge un nombre impair de tubes
NE PAS OUBLIER DE JETER tous les ustensiles contamins
dans une bassine de solution dsinfectante.
Recherche des trypanosomes dans le suc ganglionnaire
La mthode classique de diagnostic de la maladie du sommeil dans ses stades
prcoces consiste rechercher les trypanosomes dans le suc des ganglions
lymphatiques cervicaux hypertrophis. Le prlvement est examin entre
lame et lamelle et les trypanosomes identifis grce leurs mouvements.
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Matriel
Tampons de coton hydrophile
Ouate
Lames porte-objets
Aiguille (pour injection sous-cutane), 25 G, 0,5 x 16 mm
Seringue, 5 ou 10 ml
Ethanol 70%
Technique
1. Prparer la seringue; tirer le piston en arrire au maximum.
2. Se laver les mains au savon.
3. Demander au sujet de s'asseoir. Dsinfecter l'endroit du cou choisi
l'thanol 70%.
4. De la main gauche, saisir le ganglion entre le pouce et l'index et le faire
ressortir sous la peau. Tenir fermement.
5. De la main droite, tenir l'aiguille entre le pouce et l'index, l'introduire
angle droit au centre du ganglion. Percer d'abord la peau, puis pntrer
au centre du ganglion. S'assurer qu'on a vit les veines jugulaires et les
artres.
6. De la main gauche, masser lgrement le ganglion. De la main droite faire
pivoter l'aiguille.
7. Le suc ganglionnaire va pnter dans l'aiguille. L'opration doit durer
environ une minute.
8. Retirer l'aiguille d'un mouvement rapide, l'index sur la garde. Appliquer
un tampon imbib de dsinfectant au point d'injection. Ne jamais appli-
quer de dsinfectant avant d'avoir retir l'aiguille, car il pourrait venir au
contact de l'extrmit de l'aiguille et immobiliser les trypanosomes.
9. Fixer l'aiguille la seringue, piston tir en arrire. Pousser le piston dou-
cement mi-hauteur de la seringue pour faire couler le suc ganglionnaire
sur une lame.
56
10. Recouvrir la prparation d'une lamelle. Examiner immdiatement au
microscope en grossissant environ 400 fois, avec l'objectif x 40.
11. Attendre jusqu' ce que les courants de convection cessent. Il est impos-
sible de reprer le mouvement des trypanosomes dans des cellules en
mouvement. Commencer l'examen par la priphrie de la prparation, le
long des bords de la lamelle, car les trypanosomes ont tendance se diri-
ger vers eux. Examiner ensuite le reste de la prparation .
.A a
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12. La prparation contiendra des hmaties et des leucocytes. Les trypanoso-
mes ont environ 20 Jlm de long et sont souvent cachs par les globules
qu'ils font bouger avec le mouvement de leur flagelle. Tout mouvement
dans la prparation est donc suspect. Les trypanosomes disparaissent
parfois, se cachant derrire des amas de globules. Observer trs attentive-
ment!
dans l liquide cphalorachidien (LCR)
Lorsque les trypanosomes ont travers la barrire hmato-encphalique et
envahissent le systme nerveux centrat le malade est au second stade de la
maladie: La seule faon de diagnostiquer les trypanosomes dans le systme
nerveux consiste examiner le liquide cphalorachidien. Trois examens sont
couramment pratiqus:
57
Numration leucocytaire;
Mesure de la protinorachie;
Dtection des trypanosomes.
Les leucocytes et les trypanosomes sont rapidement lyss. La numration doit
donc tre effectue rapidement aprs la ponction. Les trypanosomes sont
recherchs aprs concentration du LCR par centrifugation simple ou double.
On dcrira ici la technique de centrifugation simple, qui est la plus pratique.
Le nombre de parasites trouvs dans le LCR du malade un stade avanc
montre des variations considrables.
Technique de centrifugation simple
1. Aprs avoir procd la numration leucocytaire, centrifuger le LCR
recueilli par ponction lombaire pendant 10 minutes 900 g. Transvaser le
surnageant et le conserver pour d'autres examens.
0
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2. Remettre le culot en suspension dans le peu de LCR qui reste au fond du
tube en tapotant avec le doigt.
3. Dposer une goutte de cette suspension sur une lame propre et sche.
Recouvrir immdiatement d'une lamelle. Attendre quelques minutes,
jusqu' ce que la convection cesse.
4. Poser la lame sur la platine du microscope et l'examiner l'objectif x 10.
Employer l'objectif x 40 pour confirmer la prsence des trypanosomes.
Balayer l'ensemble de la prparation en commenant par les bords, car on
retrouve souvent les trypanosomes sur l'extrme bord de la prparation.
Si l'on observe des trypanosomes mobiles dans le LCR, cela signifie que le
malade a atteint le dernier stade de la maladie et que le systme nerveux cen-
tral est touch.
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Dtection indirecte
On utilise l'inoculation de matriel biologique provenant de l'homme, d'ani-
maux htes, ou de vecteurs, des animaux rceptifs pour dceler les trypano-
somes. C'est une mthode qui est plus sensible pour T. b. rhodesiense que pour
T. b. gambiense.
Plusieurs systmes de culture ont t mis au point pour les trypanosomes,
mais ces systmes in vitro ne sont pas d'un usage courant pour l'isolement des
trypanosomes chez les sujets atteints de maladie du sommeil.
Techniques spciales pour les microfilaires
Prlvements de sang
pour la recherche de microfilaires
En cas de filariose prsume, le moment de la journe auquel on effectuera le
prlvement de sang est important. Certaines espces ont une priodicit-
c'est--dire que .les microfilaires ne sont prsentes dans le sang qu' certains
moments de la journe, et que pour les dceler il faut recueillir le sang au bon
moment (voir tableau 2).
Tableau 2. Moments auxquels il faut prlever le sang
des sujets prsums atteints de filariose
Espce
Wuchereria bancrofti
Wuchereria bancrofti (var. pacifica)
Brugia malayi
Laa loa
Filaires dont la pathognie est douteuse :
- Mansonella perstans
- Mansonella ozzardi
a Ces priodes ne sont pas immuables.
Moment auquel
le prlvement
doit tre fait
2
La nuit
(entre 22 h et 0 h)
A tout moment
Surtout la nuit
(entre 22 h et 0 h)
Pendant la journe
(entre 1 0 h et 12 h)
A tout moment
A tout moment
Rpartition
gographique
Afrique tropicale, Asie,
Amrique centrale et
du Sud, Ocan Indien
Ocan PacifiqUe
Chine du Sud, Inde du
Sud, Asie du Sud-Est
Afrique centrale et de
l'Ouest
Afrique tropicale
Amrique intertropicale,
Antilles
Recherche des microfilaires dans le sang priphrique
En microscopie, trois mthodes sont couramment utilises pour la recherche
des microfilaires dans le sang priphrique:
- la goutte paisse
- l'examen du sang capillaire
- l'examen du sang veineux hmolys.
Pour que l'on puisse confirmer l'espce en cause les micro filaires doivent tre
colores.
La goutte paisse
La prparer et la colorer comme dcrit pp. 41-45.
59
Examen du sang capillaire
Faire une prparation en mlangeant du sang capillaire frais prlev au doigt
avec du solut physiologique, mettre entre lame et lamelle, et examiner au
microscope la recherche de microfilaires mobiles. On peut galement
concentrer les microfilaires dans du sang veineux. L'examen se fera comme
pour les trypanosomes (voir p. 51-52), en choisissant bien le moment du pr-
lvement.
Examen du sang veineux hmolys
Matriel et ractifs
Flacon, 10 ml
Centrifugeuse
Tubes centrifuger, coniques, 15 ml
Lames porte-objets
Aiguilles pour ponction veineuse
Support pour tubes centrifuger
Seringue, 5 ml
Anticoagulant- solution de citrate de sodium 2% (ractif No 26)
Solution de formol 2% (ractif No 10)
Giemsa (ractif No 11)
Ether
Ethanol
Mthode
1. Verser 1 ml de sang veineux dans 9 ml de formol 2%; attendre 5 minutes
que les hmaties soient lyses, puis centrifuger grande vitesse.
2. Vider le surnageant. Tapoter le tube pour mlanger le culot.
3. Dposer 1 goutte de culot sur une lame. L'taler pour former un frottis
mince. Laisser scher l'air. Fixer le frottis avec un mlange parts gales
d'ther et d'thanol. Laisser scher pendant 2 minutes. Colorer immdia-
tement au Giemsa. Les microfilaires se colorent bien.
D'autres techniques de filtration ont t mises au point pour isoler les micro-
filaires, mais elles ne concernent que les laboratoires spcialiss et leur des-
cription n'entre pas dans le cadre de ce manuel. On trouvera le dtail de ces
techniques dans le travail de Melvin & Brooke.l
Techniques spciales pour les leishmanies
La leishmaniose est une parasitose provoque par des protozoaires flagells
du genre Leishmania. Selon l'espce en cause, on distinguera les leshmanioses
cutanes, cutano-muqueuses et-viscrales. Ce sont les formes promastigotes
du parasite qui sont transmises pqr la piqre des phlbotomes. Elles pntrent
dans les cellules du systme moponucl phagocytaire de la peau ou des vis-
cres, o elles se dveloppent pour donner des formes amastigotes. Bien que
ces dernires puissent tre occasionnellement dceles dans les mononuclai-
res du sang priphrique, l'examen microscopique d'chantillons prlevs par
aspiration ou par ponction-biopsie de moelle osseuse, des ganglions lympha-
tiques et de la rate, est plus sensible. Pour l'examen, on peut concentrer les leu-
cocytes en une couche leucocytaire ( buffy coat) par le microhmatocrite
dcrit pour la dtection des trypanosomes (voir p. 52).
1
MELVIN, D. M. & BROOKE, M. M., ed. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal parasites. Atlanta, US
Department of Health and Human Services, 1982 (HHS Publication N. (CDC) 82-8282).
60
La symptomatologie clinique ne permet pas de diffrencier la leishmaniose
viscrale des autres causes de splnomgalie fbrile. On peut mettre en vi-
dence les leishmanies dans des chantillons prlevs par ponction-biopsie de
la rate (98% de positivit), de la moelle osseuse (54 86%), ou de ganglions
lymphatiques hypertrophis (64%). La ponction de la rate peut tre une tech-
nique haut risque et il n'existe aucun consensus concernant son utilisation,
bien que certains la prfrent en raison de sa sensibilit leve. Elle ne nces-
site aucun matriel spciat est moins douloureuse que la ponction de moelle
osseuse et relativement facile raliser lorsque le mdecin est expriment et
que les prcautions correctes sont prises. Dans la leishmaniose viscrale aigu,
lorsque la rate est petite et molle ou difficile palper, on recommande la ponc-
tion de moelle osseuse ou de suc ganglionnaire.
La ponction de la rate ne sera ralise chez un malade qu'aprs mesure du
temps de Quick et numration plaquettaire. Elle ne doit pas tre tente si le
temps de Quick dpasse de plus de 5 secondes le tmoin, ou si la numration
plaquettaire est infrieure 40 x 109 par litre (40000/mm3).
Les deux prcautions importantes prendre si l'on veut oprer en toute scu-
rit sont les suivantes:
- Agir rapidement, de manire que l'aiguille reste moins d'une seconde
dans la rate; et
- s'assurer que les axes de pntration et de sortie de l'aiguille soient
identiques, pour viter de dchirer le pritoine splnique.
Matriel
Tampons de coton hydrophile
Lames porte-objets
Aiguille, 21 G (32 x 0,8 mm)
Crayon ou feutre
Seringue, 5 ml
Tubes pour milieux de culture
Milieu de Novy, McNeal et Nicolle (NNN)
1
Milieu enrichi de Schneiderl
Technique
1. Nettoyer 3lames de verre et y inscrire le nom du malade, la date et ponction
de rate. Les milieux de culture doivent tre prts (un tube de NNN et un tube
de Schneider) et tiquets de la mme manire. Les laisser atteindre latem-
prature ambiante. Fixer une aiguille de 21G (32 x 0,8 mm) une seringue
de 5 ml. Disposer tout le matriel sur une table, au chevet du malade.
2. Recueillir le consentement clair du malade. Palper la rate et en dessiner les
contours sur l'abdomen du malade avec un stylo. Pour des raisons de scurit,
la rate doit tre palpable au moins 3 cm sous le rebord costal l'expiration.
Nettoyer la peau avec un coton imbib d'alcool l'endroit de la ponction et
laisser scher.
3. Avec l'aiguille fixe la seringue, pntrer juste sous la peau, gale dis-
tance des bords de la rate, 2 4 cm sous le rebord costal. Incliner l'aiguille
vers le haut sous un angle de 45 avec la paroi abdominale. La ponction est
ralise de la manire suivante: tirer le piston de la seringue en arrire vers
la graduation d'1 ml pour obtenir une force d'aspiration et d'un mouve-
ment rapide enfoncer totalement l'aiguille dans la rate puis la retirer rapi-
dement, en maintenant l'aspiration.
4. Pour les jeunes enfants qui sont agits, s'assurer de l'aide de deux assis-
tants qui maintiendront l'enfant (bras croiss sur la poitrine, chemise rele-
ve pour empcher toute vision et bassin tenu fermement). Effectuer la
1
Pour la prparation des milieux de c u ~ u r e , voir l'annexe 3.
61
ponction en une fois, en prenant les mmes repres, les mmes angles, les
mmes techniques que dans le point 3, en un mouvement rapide. L'inser-
tion de l'aiguille doit tre en phase avec la respiration du malade, de
manire viter tout mouvement du diaphragme; si l'enfant crie, on
piquera au moment de l'expiration bloque. On n'obtient ainsi qu'une
quantit trs faible de matriel splnique, mais qui est suffisante pour la
mise en culture et la prparation d'un frottis.
5. Tirer doucement le piston de la seringue vers les graduations de 2 et 3 ml
et, aseptiquement, insrer l'aiguille dans un tube de milieu de culture et
appuyer brusquement sur le piston pour expulser le contenu de l'aiguille
sur les parois du tube. Si ncessaire, rpter une ou deux fois l'opration
jusqu' ce que le matriel de ponction soit visible dans le tube. Refermer
le tube et le retourner pour rcuprer le matriel restant sur les parois.
Rpter cette l'opration pour le second tube de milieu de culture. Il est
indispensable d'employer des techniques aseptiques.
6. Dposer doucement le reste du matriel de ponction sur des lames de
verre en appuyant l'extrmit de l'aiguille sur la surface de la lame. Etaler
immdiatement et uniformment avec l'aiguille d'un mouvement linaire
(et non circulaire). Le frottis ne doit pas tre aussi pais qu'une goutte
paisse pour le paludisme. Retirer l'aiguille et utiliser son extrmit pour
rcuprer le matriel rest au fond de la seringue et l'taler sur une lame.
On peut encore trouver du matriel de ponction l'extrmit du piston :
le mettre directement sur une lame et l'taler. Laisser les lames scher.
7. Inscrire l'heure de la ponction sur la carte du malade, suivie des instruc-
tions suivantes: noter le pouls et la pression sanguine toutes les 30 minu-
tes pendant 4 heures, puis toutes les heures pendant 6 heures. Le malade
doit rester alit pendant 12 heures. S'assurer que le malade comprend les
instructions. Inscrire l'opration dans le dossier et signer.
8. Envoyer les lames et les milieux de culture au laboratoire. Les cultures sont
incubes 25C et examines rgulirement pendant deux semaines. Les
lames sont colores au Giernsa ou au colorant de Field et examines
l'immersion (voir illustration ci-dessous). Le pH du solut physiologique
tamponn employ dans la coloration de Giemsa doit tre de 6,8 pour Leish-
mania (et non de 7,2 comme pour les Plasmodium). On distingue diffrents
degrs de densit parasitaire, comme indiqu dans le tableau 3.
A. Leishmania_: Formes amastigotes. B. Leishmania: Formes promastigotes
Pour les leishmanioses viscrales, les mthodes srologiques apportent une
aide certaine au diagnostic. Le srodiagnostic est moins intressant pour les
leishmanioses cutano-muqueuses et ne prsente aucun intrt pour les leish-ma-
nioses cutanes.
62
Tableau 3. Degrs de densit parasitaire (Leishmania)
Degr
+6
+5
+4
+3
+2
+1
0
a En prenant l'oculaire x1 0 et l'objectif immersion x1 00.
Densit parasitaire moyenne
>100 parasites/champa
10-100 parasites/champ
1- 10 parasites/champ
1- .1 0 parasites/10 champs
1- 10 parasites/1 00 champs
1- 1 0 parasites/1 000 champs
0 parasite/1 000 champs
La description dtaille des nombreuses techniques immunologiques dont on
dispose n'entre pas dans le cadre de ce manuel. Le titrage immunoenzymatique
(ELISA) et l'preuve d' immunofluorescence indirecte (IFI) sont les plus utiles.
L'preuve peut tre pratique sur du srum ou sur un volume dtermin de
sang prlev par ponction digitale sur des bandes de papier absorbant que l'on
laisse scher. L'chantillon est lu au laboratoire et test une dilution uni-
que, dtermine auparavant comme tant celle qui donne une sensibilit et
une spcificit acceptables dans la rgion en question. Des ractions croises
peuvent se produire avec les infestations Trypanosoma cruzi. On peut en
gnral les liminer par dilution, ou les identifier en testant les chantillons en
parallle en prsence d'antignes de T. cruzi.
63
Prlvements cutans
Dans l'onchocercose (ccit des rivires), une filariose humaine que l'on
retrouve en Afrique, en Amrique centrale et du Sud et dans certaines parties
de la Rgion de la Mditerrane orientale, on examine de petits fragments de
peau. En effet, les vers vivent dans des nodules situs dans les tissus sous-
cutans. On prlve des fragments cutans de taille et d'paisseur uniforme
par biopsie cutane exsangue l'aide d'une pince sclrotomie.
Matriel et ractifs
Compresses de gaze
Lames porte-objets, ou plaques de microtitrage
Aiguilles, 22 G
Scalpel, lame de rasoir, ou pince sclrotomie
1
de 2mm
Ethanol 95%
Solut physiologique (ractif No 24) ou eau distille.
Malades prsentant des nodules
Rechercher les nodules:
- sur la poitrine (sur les ctes)
- sur les hanches,
- sur les jambes (mollets),
- dans le dos (omoplates).
Les nodules sont arrondis et durs, ont un diamtre de 1 5 cm; lorsqu'on les
pousse du bout des doigts, ils roulent sous la peau. Prlever l'chantillon au
centre du nodule.
Malades sans nodules
Prlever les biopsies cutanes exsangues:
- en haut de la fesse (partie suprieure externe, o l'on pratique les injec-
tions intramusculaires),
- au niveau des mollets (partie suprieure externe),
- dans le dos (milieu de l'omoplate).
Il est recommand d'examiner 6 prlvements (2 des fesses, 2 des mollets et 2
des omoplates).
1. Si l'on ne dispose pas d'une pince sclrotomie, employer un scalpel st-
rile jetable et des aiguilles ou des vaccinostyles. Si l'on ne dispose pas de
matriel jetable, l'instrument devra tre strilis avant usage pour chaque
malade. Pour cela onmet le scalpel, la lame de rasoir, le vaccinostyle ou
l'aiguille dans un peu d'alcool que l'on flambe.
1
La pince sclrotomie est fournie par : Karl Storz, Tuttlingen, Allemagne.
64
PRLVEMENTS CUTANS
2. Dsinfecter l'endroit choisi avec une compresse de gaze trempe dans l'alcool.
3. Enfoncer la pointe de l'aiguille de 2 3 millimtres dans la peau et la rele-
ver.
4. Poser la lame du scalpel ou la lame de rasoir sur la peau tendue au-dessus
de la pointe de l'aiguille. Couper d'un coup sec le morceau de peau relev
par la pointe de l'aiguille, aussi prs de l'aiguille que possible. Le prlve-
ment doit avoir 2 3 mm de large. Il doit rester accroch la pointe de
l'aiguille.
L'chantillon ne doit pas tre tach de sang. La biopsie doit tre exsangue
pour viter toute contamination par des parasites sanguins.
Examen des prlvements
1. Dposer une goutte d'eau distille ou de solut physiologique sur une lame.
2. Dposer le petit morceau de peau dedans et recouvrir d'une lamelle. Ne pas
appuyer sur le prlvement ni sur la lamelle. S'il n'y a pas assez de solut phy-
siologique pour recouvrir le morceau de peau, en rajouter au bord de la
lamelle, de manire qu'il pntre par-dessous.
3. Laisser la lame monte reposer 30 minutes, puis l'examiner l'objectif
x 10. S'il y a des microfilaires, on peut en gnral les voir se tortiller dans
le solut physiologique. S'il n'y en a pas, on laisse reposer les prlvements
de peau dans du solut physiologique pendant 4 heures temprature
ambiante, puis on les rexamine.
L'examen quantitatif peut tre effectu comme suit:
1. Peser le fragment cutan avec une balance (1-10 mg).
2. Le transvaser dans un godet de plaque de microtitrage.
3. Ajouter 0,1 ml de solut physiologique.
4. Recouvrir la plaque pour viter toute vaporation et laisser incuber tem-
prature ambiante pendant 24 heures.
5. Compter le nombre de microfilaires prsentes dans le solut physiologique
l'aide de l'objectif x 10, et exprimer le rsultat par rapport au poids du
prlvement.
65
Une digestion par la collagnase du fragment cutan pendant plus de 24 heu-
res peut augmenter la sensibilit de l'examen pour les prlvements prove-
nant de malades ayant une faible charge parasitaire. Cette digestion peut
galement tre pratique sur du matriel fix l'thanol et conserv temp-
rature ambiante.
66
Deuxime partie
Identification des espces
parasitaires
Parasites intestinaux
Helminthes
Il existe trois groupes d'helminthes importants sur le plan mdical-les nma-
todes (vers ronds), les cestodes (tnias) et les trmatodes (douves). En gnral,
les stades servant au diagnostic sont les ufs et les larves. Plus rarement, on
peut observer des vers adultes comme Ascaris et Enterobius et diagnostiquer
certaines tEniasis l'aide de segments ou de proglottis. Toutefois, dans la
majorit des helminthiases, ce sont les ufs qui servent l'identification.
Cl de dtermination des ufs
Les caractristiques utilises pour identifier les espces d'ufs sont les suivantes:
1. Dimensions. On mesure la longueur et la largeur, qui sont en gnral
situes dans un intervalle prcis.
2. Forme. Chaque espce a une forme particulire.
3. Stade de dveloppement au moment de l'mission des selles. Dans certaines esp-
ces, les ufs consistent en une cellule unique; dans d'autres, ils peuvent
tre pluricellulaires; enfin, une troisime catgorie d'espces possde des
ufs gnralement embryonns (c'est--dire contenant une larve) lorsqu'ils
sont mis dans les selles.
De temps en temps, si le prlvement de selles est vieux de plusieurs heu-
res ou d'un jour ou deux, les ufs peuvent se dvelopper jusqu' des sta-
des plus avancs. Par exemple, les ufs d'Ascaris sont en gnral
monocellulaires lorsqu'ils sont mis; mais cette cellule unique peut se divi-
ser et dans les chantillons qui ont attendu, on peut observer des ufs
2 ou 4 cellules. Dans les prlvements vieux de plusieurs heures, les ufs
d'ankylostomes peuvent contenir 16 cellules ou 32, voire davantage. En 12
24 heures, l'uf peut tre embryonn; par la suite il peut clore, donnant
naissance une larve. Par consquent, lorsqu'on observe les stades de
dveloppement des ufs d'helminthes, s'assurer que les prlvements de
selles sont frais. S'ils ont plusieurs heures ou mme un jour, s'attendre
des modifications dans les stades de dveloppement de certaines espces.
L'idal serait de n'accepter pour le diagnostic que des selles fraches.
4. Epaisseur de la coque de l'uf. Certaines espces, comme Ascaris, ont des
coques paisses; d'autres, comme les ankylostomes, ont des coques minces.
5. Couleur. Certains ufs sont incolores (par exemple, les ufs d'ankylosto-
mes et d'Enterobius), d'autres sor.t jaunes ou bruns (Ascaris, Trichuris).
6. La prsence d'lments caractristiques comme: opercules, perons, pro-
tubrances, petits crochets, ou parois externes mamelonnes.
Si l'on trouve un uf ou un objet qui ressemble un uf, on observera atten-
tivement ses divers traits distinctifs, de manire dterminer l'espce. On se
trouvera parfois en prsence d'ufs atypiques ou dforms. En pareil cas, il
faudra rechercher des formes plus typiques de manire poser un diagnostic
fiable. Ne pas oublier que plusieurs espces d'helminthes peuvent cohabiter
chez un mme malade.
La cl de dtermination (Fig. 3) et les diagrammes d'ufs d'helminthes de la
figure 4 seront utiles pour la dtermination des espces.
Observer attentivement la taille, la forme, le stade de dveloppement,
l'paisseur de la paroi, sa couleur et la prsence de structures particuli-
res comme: opercule, peron, protubrances, crochets et paroi externe bos-
sele, pour identifier les espces auxquelles les ufs appartiennent.
69
-...J
0
Fig. 3. Cl de dtermination des ufs d'helminthes
ufs
1 1
Non encapsuls,
Protubrance
chaque extrmit ?
1
1 1
Protubrance
chaque extrmit
Pas de protubrance
1
Encapsuls L Dipylidium caninum
(30-50 27-50 ou
lnermicapsifer sp.
Longueur de l'uf < 1 00 ---- Petit peron latral Schistosoma japonicum
(souvent invisible). Dans les selles.
ufs de Schistosoma
1
Avec peron
(68-100 45-80
ou
Schistosoma mekongi
(rare)
Eperon latral prominent, Schistosoma mansoni
paro1 transparente
Avec ou sans opercule ? --Sans opercule -- Avec ou sans peron ?------------------1
Longueur de l'uf > 110
l

1
Avec opercule
Extension de la paroi avec rebord-- Clonorchis sinensis
Longueur maximale de l'uf ?
Longueur de l'uf< 35
(=paulement marqu) (extrmit postrieure
(25-35 11-22 large et arrondie)
Allong, pas d'paulement ---- Opisthorchis fe/ineus
(25-35 8-12 (extrmit postrieure avec
bouton terminal pointu)
Epaulement moins distinct, Heterophyes heteraphyes
opercule large (petit bouton l'extrmit
(28-30 15-17 postrieure)
Pas d'paulement,
paroi mince
-------Metagonimus yokogawai
(26-30 15-20
Longueur de l'uf entre
35 et 118
-{
Ovode, jaune d'or
Paroi paisse, non embryonn
(58-76 40-51
Brun dor, non embryonn
Diphyllobothrium fatum
Paroi paisse, ovode, avec opercule
aplati ? Oui -- Paragonimus westermani
(68-118 40-51
L_ ___ Non --Echinostoma sp.
(83-120 58-90
Fascia/a hepatica
[
(130-145 70-90
Longueur de l'uf> 120 J.lm ------------------j ou
ovode, paroi mince, brun Jauntre Fasciolopsis buski
(125-140 70-90
Extrmits faisant nettement saillie Trichuris trichiura
(49-65 20-30
En forme de citron, les extrmits ne faisant pas une saillie nette ------
(36-45 x 21
c_ ______ En forme de citron mais lgrement rtrci au milieu
(36-45 20-30
Capillaria hepatica
Capillaria philippinensis
en gnral dans les urines ou (rare dans les selles)
. les biopsies vsicales
Eperon termmal (112-170 40-70
{
Extrmit antneure arrondie, -Sch1stosoma haematobwm
Sarns paisse ? Extr!"1t effile, -- S,chistosoma mtercalatum
pa
01
long eperon effile a (eperon plus long que
extrmit courbe chez S. haem.)
(140-240 50-85 Uniquement dans les selles
Strongy/oides stercoralis
C
Sans blastomres, Lou
larves partiellement dveloppes
P
. . (50-76 x 35-47 Strongyloides ful/eborm
aro1 mmce et
lisse, avec ou Necator americanus
sans blastomre i- Ovode avec 2 8 blastomres -f Ancy/ostoma duodenale
Paroi paisse,
grossire ou
lisse?
Avec blastomeres, (64-80 x 35-40 Temidens diminutus
ovode ou
ellipse allonge ? Paroi une membrane,---- Trichostrongylus sp.
ellipse allonge symtrique
(75-115 40-50
1
Paroi paisse grossire,
l'uf contient une cellule non segmente
possdant des granules grossiers (45-70 35-45
Ascaris lumbricoides
Paroi paisse lisse,
uf symtrique ou
(un ct convexe,
Dicracoelium /anceatum
(contient un miracidium)
asymtrique? ri Oeuf brun fonc
r
_ . (38-45 J.lm x 22-30
Asymetnque
un ct aplati) Oeuf incolore -------- Enterobius vermicularis
Paroi 4 couches (contient une larve)
(50-60 x 20-32
Symtrique
1
uf arrondi ou presque rond,
paroi 2 membranes,
avec ou sans embryophore ?
lr
Avec embryophore solium
jaune ple brun, . .
paroi 2 membranes Taema sagmata
(diam. = 44-77 (se d1stmgue par l'examen
des proglottis)
J
Avec filaments ------- Hymenolepis nana
polaires
(40-60 30-50
Sans embryophore,
avec ou filamen Sans filaments Hymeno/epis diminuta
polaires . polaires
(70-86 x 60-80

:u
l>
Ill
=i
rn

m

z
l>
c:
><
---1
......
Fig 4. Identification des helminthes intestinaux
60
30

MetagonimusHeterophyesOpisthorchis Clonorcllis
yokogawai heterophyes felinous s/nensis
DIMENSIONS RELATIVES DES UFS D'HELMINTHES*
Taenia Hymeno/epis Enterobius
nana verrnicu/aris
Trichuris
trichiura
Ascaris lumbricoides Ankylostome
fcond
Diphyllobothrium
fatum
Hymenolepis
diminuta
90
60
30
E 15o 15o
:i ___________ , ---
-----
120 120

------ ----
90
60
Paragonimus
westermani
Trichostrongy/us Ascaris lumbricoides
non fcond
Schlstosoma
japonicum
Schistosoma
haematobium
Schistosoma
manson/
Fascia/a
hepatica
Fasciolopsis
bus ki
WHO 91106
90
60
30
6
m

'ii
0

0
z
c
m
rJl
m
rJl
"tl
m
(")
m
rJl
"tl
)>
:u
ln

:u
m
rJl
PARASITES INTESTINAUX
Larves
Dans les selles fraches, les larves observes sont en gnral des larves rhabdi-
todes (=premier stade larvaire) de Strongyloides stercoralis. Cependant, si les
selles ont plus de 12 heures, ces larves peuvent muer en larves strongylodes
(stade infestant): il faut alors les diffrencier des larves d'ankylostomes qui
peuvent galement clore dans les selles au bout de 12 24 heures. La pr-
sence de larves strongylodes de Strongyloides stercoralis peut tre l'indication
d'une hyperinfestation gnralise.
La figure 5 et le tableau 4 montrent quels sont les caractres employs pour
diffrencier les espces.
Fig. 5. Larves d'helminthes
Ankylostome
strongy/ode

, rhabtfiJ_q_de strf!nJJx!ode
- cavit buccale -
- Ebauche gnitale
WHO 91705
Tableau 4. Caractristiques des larves d'helminthes
Ankylostome
Larves strongylodes
Dimension 500 x 14-20 l!m
Gaine
Extrmit postrieure effile
sophage reprsentant le tiers
du corps sans renflement
Larves rhabditoiaes
Dimension 100-150 x 15-171-!m
Cavit buccale longue (15 l!m)
sophage reprsentant le tiers de la longueur du
corps et deux renflements
Ebauche gnitale petite (7 l!m)
Pore anal situ 80 !!ffi de l'extrmit postrieure
Strongyloides
Larves strongylodes
Dimension 500 x 14-20 l!m
Pas de gaine
Extrmit postrieure bifide ou tronque
sophage reprsentant la moiti
du corps sans renflement
Larves rhabditoiaes
Dimension 200-300 x 15-18 l!m
Cavit buccale courte (4 l!m)
sophage reprsentant le tiers de la
longueur du cqrps et deux renflements
Ebauche grande (22 !!ffi)
Pore anal sih.J 50 l!m de l'extrmit
postrieure
C'est dans les prparations l'iode que l'on voit le mteux l'bauche gnitale.
L'iode va tuer les larves, ce qui permettra de mieux observer leurs caractris-
tiques. Pour voir ces structures, il faut un fort sans immersion.
- si l'on observe une larve ayant une cavit buccale courte et une bauche
gnitale nettement visible, il s'agit de Strongyloides.
72
IDENTIFICATION DES ESPCES PARASITAIRES
-si Yon observe une larve ayant une cavit buccale longue sans que l'bauche
gnitale soit visible, il s'agit d'un ankylostome.
Protozoaires
Les protozoaires intestinaux comprennent les amibes et les flagells. Deux sta-
des permettent le diagnostic, ce sont: la forme vgtative ou trophozote et le
stade quiescen tou kyste. Ces deux stades peuvent tre prsents dans les selles.
On trouve en gnral les formes vgtatives dans les diarrhes ou les selles trs
molles, et les kystes dans les selles moules. Toutefois, on peut retrouver la
prsence de ces deux stades dans un mme chantillon.
Formes vgtatives et kystes peuvent tre observs dans des prparations de
selles fraches en solut physiologique. L'identification des espces ncessite
parfois une coloration. On trouvera dans le tableau 5 les diffrents types de
montages gnralement employs pour dceler et identifier les protozoaires,
ainsi que les caractristiques que l'on peut observer dans chacun d'eux.
Tableau 5. Caractristiques des protozoaires visibles
dans diffrents types de prparations
Amibes
Formes vgtatives
Mobilit
Cytoplasme
Inclusions
Noyaux
Kystes
Noyaux
Cristallodes
8
Glycogne
Flagells
Formes vgtatives
Mobilit
Forme
Noyau
Kystes
Forme
Noyaux
Filaments
Solut
physiologique
+
+
+
+
+
+
+
Colorations temporaires
Bleu de
mthylne
tamponna
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Coloration
permanente
(Trichrome)c
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
a On n'utilise la coloration au bleu de mthylne tamponn que pour les amibiens vivants.
bOn !lmploie l'iode pour colorer les kystes, bien que les trophozotes de flagells puissent galement tre
colores par cette methode.
c Les techniques de coloration permanente ne sont pas employes couramment dans les laboratoires de diag-
nostjc, rr'ais sont rsery!'S des circonstances particulires, comme indiqu dans le texte (par exemple, diag-
nostic dune cryptospond1ose).
d Les cristallodes des kystes d'amibes s'obseJVent mieux dans les prparations en solut phy:siologique que
dans celles l'iode. C'est dans les talements colors de faon permanente qu'on les voit le mieux.
Le gJycogne est dissous pendant la coloration et dans les talements colors de faon permanente on ne
verra a sa place que des espaces vides (vacuoles).
1
On obseJVe parfois des fibrilles (filaments) dans les prparations en solut physiologique.
73
Formes vgtatives d'amibes
Prparations l'tat frais en solut physiologique
On peut observer des formes vgtatives d'amibes mobiles dans des prpara-
tions de selles fraches en solut physiologique. Elles vont apparatre lgre-
ment verdtres et rfringentes (brillantes). A fort grossissement, on peut
observer leur mobilit et des inclusions telles qu'hmaties et levures. Il est
impossible de distinguer le noyau. (Les macrophages peuvent galement contenir
des hmaties et bouger.)
Lorsqu'une forme vgtative se dplace rapidement dans une direction et
forme des pseudopodes galement rapidement, il peut s'agir d'Entamoeba his-
tolytica. Les autres espces d'amibes ne se dplacent en gnral pas de cette
manire. Si la forme vgtative se dplace comme dcrit plus haut et si l'on
observe la prsence d'hmaties dans son cytoplasme, on peut considrer qu'il
s'agit d'E. histolytica. Il est parfois ncessaire de colorer le noyau au bleu de
mthylne tamponn pour confirmation.
Prparation en solut physiologique:
MOBILIT DIRECTIONNELLE PRCISE
+
HMATIES INGRES
= E. histolytica
Prparation l'tat frais dans le bleu
de mthylne tamponn
Si l'on souponne la prsence de formes vgtatives d'amibes, examiner une
prparation dans le bleu de mthylne tamponn (voir tableau 5). Les formes
vgtatives peuvent s'arrondir et demeurer immobiles, mais leur noyau et les
inclusions qu'ils contiennent se coloreront en bleu fonc, alors que le cytoplasme
sera bleu clair. Rechercher les grains de chromatine nuclaire priphrique
(situs le long de la membrane autour du noyau); s'ils sont prsents, il s'agit
d'une espce d'Entamoeba. S'il n'y a pas de chromatine priphrique, ce n'est
pas un Entamoeba. Lorsque la chromatine nuclaire priphrique est visible, il
faut identifier l'espce. Pour cela, utiliser la cl de dtermination des formes
vgtatives d'amibes dans les colors (Fig. 6).
Les formes vgtatives d'E. histolytica ont environ 12 40 Jlm de long. Le
noyau se prsente comme un cercle bleu fonc portant un point fonc (le
caryosome) en son centre. Si les grains de chromatine nuclaire priphrique
sont fins et rguliers, et si le caryosome central est petit, il s'agit probablement
d'E. histolytica, mais il faut observer plusieurs spcimens pour s'en assurer. Si
l'on voit des hmaties dans le cytoplasme, cela permettra de confirmer le
diagnostic. Ces hmaties vont apparatre en bleu fonc dans les prparations
colores au bleu de mthylne tamponn.
Entamoeba coli a peu prs la mme taille qu'E. histolytica et possde galement
un noyau avec chromatine priphrique. En revanche, il a un cytoplasme gros-
sier contenant souvent des bactries ou des champignons. La chromatine
nuclaire priphrique est irrgulire et le caryosome n'est pas au centre du
noyau.
74
Etalements colors au trichrome
Dans les talements colors, les formes vgtatives peuvent avoir une forme
ronde, allonge ou irrgulire. Les formes vgtatives d'amibes se colorent
gnralement en vert ou en bleu-vert avec un noyau violet ou rouge. Les
noyaux des espces d'Entamoeba ont des grains de chromatine priphrique
(comme dans les prparations au bleu de mthylne tamponn), qui peuvent
former un cercle ou un collier de perles. Le caryosome peut apparatre
comme une tache rouge ou violette l'intrieur du noyau. ChezE. histolytica,
le caryosome est en gnral au centre du noyau mais peut parfois tre excentr
et seule l'observation de plusieurs spcimens permet de faire la distinction
entreE. histolytica etE. coli.
On peut observer, en plus des formes vgtatives d'amibes, d'autres cellules
qui leur ressemblent et qu'il faut bien diffrencier des amibes. Comparer les
structures observes dans les talements colors avec les figures de la cl de
dtermination et de la p. 82. Problmes d'identification, pour savoir s'il
s'agit de formes vgtatives d'amibes, de cellules d'origine tissulaire, ou
d'autres lments.
Les formes vgtatives appartiennent l'espce
E. histolytica si les structures suivantes sont visibles:
- Chromatine nuclaire priphrique
et
prsence d'hmaties dans le cytoplasme
ou
- chromatine nuclaire priphrique uniforme
et
- petit caryosome central dans le noyau
et
cytoplasme lisse, finement granuleux
et
- longueur de la forme vgtative= 2 6 fois le diamtre
Kystes d'amibes
Il est indispensable de mesurer exactement les kystes pour pouvoir les identifier
correctement.
Prparation l'tat frais en solut physiologique
Si l'on travaille l'objectif x 40, mettre au point diffrentes profondeurs de
la prparation et rechercher des objets ronds et brillants ayant un diamtre
peu prs gal une trois fois le diamtre d'une hmatie. Rechercher galement
les cristallodes (structures en btonnets), que l'on voit mieux fort grossisse-
ment. Ils sont plus distincts dans les prparations en solut physiologique que
dans celles l'iode. Ces lments ont un aspect caractristique et on les trouve
chez E. histolytica et E. coli. Dans la premire espce, les cristallodes ont des
extrmits arrondies tronques, alors que chez E. coli elles sont pointues. On les
observe moins souvent dans les kystes d'E. coli que dans ceux de E. histolytica.
Les noyaux ne sont pas faciles voir en solut physiologique, mais sont bien
visibles dans les prparations l'iode. L'aspect du noyau est important pour
diffrencier les espces d'amibes. Par consquent, si l'on observe des kystes
75
Fig. 6. Cl de dtermination des formes vgtatives d'amibes
Forme vgtative avec ou sans
chromatine nuclaire priphrique
Avec chromatine
nuclaire priphrique
Sans chromatine
nuclaire priphrique
1 1
Cytoplasme grossirement Cytoplasme finement Un noyau dans toutes las
formes vgtatives
Deux noyaux dans
plus de 50% des
formes vgtatives
granuleux, granuleux avec ou sans
bactries et levures, hmaties, pas de
1
pas d'hmaties bactries
1
Entamoeba coli
Taille >15 ~ m
Taille 8 15 ~ m
Entamoeba
hartmanni
Petit endosome,
granules priphriques
dans le noyau disposs
rgulirement
Taille 15 30 ~ m
Entamoeba
histolytica
Noyau avec
granules
priphriques
Grand endosome
irrgulier
1
Endolimax
nana
Noyau sans granules
priphriques, grand
endosome
/odamoeba
btschlii
Grande masse de
chromatine dans un
espace transparent
1
r ~ .
,f-c. )
0 :;f
.
.
Dientamoeba
fragilis*
Taille 5 15 ~ m
WHO 91082
* Dientamoeba fragi/is, bien que class parmis les flagells, a t inclus dans ce tableau pour des raisons pratiques.
(ou des lments qui leur ressemblent) dans la prparation en solut physio-
logique, examiner une prparation l'iode.
Tout kyste observ doit tre mesur.
Prparations l'tat frais dans l'iode
Mettre au point avec l'objectif x 40 et rechercher des kystes. Ds qu'on en a
trouv, ou que l'on voit des objets qui leur ressemblent, passer au fort grossis-
sement afin de distinguer les dtails permettant d'identifier l'espce. Mesurer
les kystes.
76
--.1
--.1
Fig. 7. Cl de dtermination des kystes d'amibes et de flagells
Kyste
1
1
Avec filaments internes Sans filaments,
Kyste de flagell Kyste amibien
1 1 1 1 .
1
1
En forme de poire, En forme de citron, Kyste ovale Absence de chromatine Prsence de chromatine
1 noyau, 1 noyau Coque paisse nuclaire pnphnque nuclaire priphrique
Taille4711m Taille59flm 1 1 1
1 1 1 1
4 noyaux, masses Gros noyau Taille <1 0 11m Taille 10 15 11m Taille 15 30 ~ t m
de chromatine excentr 1 1 1
vacuole colore 1 1
l'iode
-
'
2 ou 4 noyaux 5 noyaux 1 , 2 ou 4 noyaux
masse de glycogne masse de glycogne ou davantage
Retortamonas Ch/lomastix
ln test/na lis
Taille 4 1 0 ~ t m ,
1 4 noyaux
(en gnral
2 noyaux)

.
'
'
Enteromonas
homlnls
Taille 10 14flm,
corps parabasaux,
2 4 noyaux
rassembls une
des extrmits
Giardia
Endolimax
nana
lodamoeba
bOtschlii
(kyste immature)
Entamoeba hartmann/
4 noyaux avec chromatine
priphrique rgulire
(kyste immature ) (kyste mr)
Entamoeba histolytica
WH091083
6
m
~
l!
~
0
z
c
m
Ill
m
Ill
"tl
m-
o
m
Ill
"tl
,.
:D
~
~
jj
m
Ill
Pour identifier l'espce laquelle appartiennent les kystes trouvs, employer
la cl de dtermination des kystes d'amibes et de flagells dans les prpara-
tions l'iode et les talements colors (Fig. 7), ainsi que la description ci-avant.
Les kystes d'E. histolytica ont un diamtre de 10 15 J.Lm. A maturit, ils pos-
sdent quatre noyaux ayant chacun un caryosome central et de la chromatine
nuclaire priphrique uniforme. Les noyaux ne sont en gnral pas dans le
mme plan, il faut donc les rechercher en faisant varier la mise au point. Pour
cela, relever soigneusement l'objectif jusqu' ce que le kyste cesse d'tre net.
Mettre au point soigneusement, puis descendre l'objectif lentement pour pou-
voir examiner les diffrents plans du kyste. Compter les noyaux au fur et
mesure qu'ils apparaissent.
On voit parfois des kystes immatures d'E. histolytica, qui peuvent avoir 1 ou
2 noyaux. S'il n'y a qu'un noyau, il est en gnral assez grand. Souvent, les
kystes un noyau possdent de grosses masses de glycogne et plusieurs petits
cristallodes qui ne se sont pas encore transforms en corps en btonnets typi-
ques. Mesurer le kyste.
Les kystes d'E. coli sont en gnralement plus grands que ceux d'E. histolytica
(15-30 J.Lm). Les premiers possdent huit noyaux ayant une chromatine pri-
phrique irrgulire et grossire avec un caryosome qui n'est pas central. Ils
sont en gnral situs dans diffrents plans et il faut donc tudier soigneuse-
ment ces diffrents plans pour les apercevoir et les compter.
On peut observer des kystes immatures d'E. coli, qu'il ne faut pas confondre
avec ceux d'E. histolytica. La forme immature la plus couramment rencontre
est le kyste deux noyaux (les kystes d'E. coli un noyau sont rares), poss-
dant une masse de glycogne importante et plusieurs petits cristallodes.
Comme pour E. histolytica, ces lments ne sont pas encore constitus en
cristallodes typiques. Une mesure exacte permettra de distinguer les kystes
d'E. coli de ceux d'E. histolytica.
Les kystes d'E. hartmanni sont semblables ceux d'E. histolytica, mais ils sont
plus petits (7 9 J.Lm).
Dans les prparations l'iode, les kystes d'Iodamoeba btschlii montrent une
masse compacte de glycogne, qui les diffrencie de ceux d'E. histolytica. Ils ne
possdent pas de cristallodes et contiennent un seul noyau.
Si l'on trouve d'abord des kystes immatures, rechercher des formes arrives
maturit. On peut en gnral en t r o u v ~ r et identifier l'espce. Si les kystes pos-
sdent cinq noyaux ou davantage, ils appartiennent l'espce E. coli.
Ces dernires annes, plusieurs cas de mningo-encphalite amibienne primi-
tive provoqus par des amibes vivant l'tat libre, Acanthamoeba sp. et Naegle-
ria sp., ont t rapports dans le monde. La plupart des infections ont t lies
de l'eau pollue. Le diagnostic de laboratoire fait appel l'examen micros-
copique du liquide cphalorachidien purulent contenant des polynuclai-
res mais pas de bactries. Les amibes sont visibles sur frottis color au Giemsa.
Blastocystis hominis, un protozoaire galement retrouv dans les selles, se dis-
tingue des kystes amibiens du fait que son centre se colore en vert (ou parfois
reste incolore), avec des granules rfringents sur le bord.
00
.......... , ..
.: ...
. .. . :; .
. -. . . .. ~ - - ~ . ::; ' :
Blastocystis hominis
78
Flagells
a) Prparations l'tat frais en solut
physiologique pour la dtection et l'identification
des formes vgtatives
Le meilleur critre d'identification des formes vgtatives de flagells (Fig. 8)
est la faon dont ils se dplacent dans les prparations en solut physiologi-
que. Les flagelles sont en gnral invisibles, tout comme les noyaux.
- Les formes vgtatives de Giardia intestinalis (pathognes) ont un mou-
vement en chute de feuille>>; elles basculent d'avant en arrire.
- Celles de Chilomastix mesnili (non pathognes) se dplacent en effec-
tuant des rotations.
- Celles de Trichomonas hominis (rarement pathognes) ont un mouve-
ment dsordonn.
NOTE:
Le bleu de mthylne tamponn ne colore pas les formes vgtatives de flagells;
ce type de prparation ne prsente donc aucun intrt pour leur mise en vidence.
b) Prparations l'tat frais dans l'iode
pour la dtection et l'identification des kystes
On emploie surtout les solutions d'iode pour colorer les kystes et rendre visi-
ble la structure des noyaux. Pour l'identification, employer la cl d'identification
des kystes d'amibes et de flagells (Fig. 7).
Fig. 8. Cl d'identification des formes vgtatives de flagells
dans les talements colors
211agelles,
1 noyau
taille4- 9

.
. G:'c-\

.
Retortamonas
intestinalis
NOTE:
Forme vgtative avec
moins 2 flagelles
411agelles

Taille 4-8
1 noyau
Enteromonas
hominis
Taille 6- 20
1 noyau,
1 cytostome
Chilomastix
mesnili
au moins 5 flagelles
5 flagelles, Forme vgtative en
1 noyau, lorme de poire,
membrane ondulante 4 paires de flagelles,
(rarement visible), 2 noyaux, corps parabasaux,
taille 8-20 taille 10-20
Trichomonas
hominis
Giardia
intestinalis
Trichomonas hominis ne possde pas de stade kystique.
79
c) Formes vgtatives et kystes de Giardia
intestinalis dans les talements colors
Les Giardia sont caractristiques et correspondent en gnral aux illustrations
que l'on trouve dans les manuels et les ouvrages de parasitologie. Ils sont faci-
les identifier dans les talements colors.
Les autres espces de flagells intestinaux sont rarement pathognes.
Balantidium coli
C'est le seul cili parasiter l'tre humain et ces infestations sont rares. Il n'a
pas t voqu ailleurs dans ce manuel en raison de cette raret des cas (c'est
surtout un parasite du porc et du singe). Toutefois, comme on le rencontre par-
fois dans les chantillons de selles humaines, il sera brivement dcrit ici.
Balantidium coli possde des formes vgtatives et des kystes. Les formes
vgtatives sont grandes (50 200 11m de long sur 40 70 11m de large) et trs
actives et sont facilement identifiables dans les prparations en solut physio-
logique, faible grossissement (voir plus bas). Elles sont recouvertes de petits
poils courts (cils), qui battent rapidement et permettent ces lments parasi-
taires de se dplacer grande vitesse. Elles meurent trs rapidement une fois
sorties de l'organisme et les selles doivent donc tre examines dans l'heure
qui suit leur mission.
Les kystes ont un diamtre de 45 75 11m. Ni les formes vgtatives, ni les kys-
tes ne se colorent bien l'iode ni aux colorants permanents. La meilleure tech-
nique reste donc l'examen l'tat frais en solut physiologique.
0 20 40 J!m
Forme vgtative de Balantidium coli Kyste de Balantidium coli
lsospora belli et Cryptosporidium sp.
Isospora belli et Cryptosporidium, des coccidies, sont des parasites intestinaux.
L'homme est rarement infest par Isospora belli et lorsque cela se produit,
l'infestation est rarement grave et souvent asymptomatique. L'infestation par
Cryptosporidium est une cause importante de diarrhe chez l'enfant de moins
de 5 ans, et peut tre particulirement grave chez les immunodprims.
Diagnostic de laboratoire
On peut dceler les oocystes d'Isospora belli dans les talements frais de mati-
res fcales monts directement. Le cas chant, on peut les concentrer par la
technique au formol-ther (voir premire partie, pp. 16-17).
Mlanger une petite quantit de matire fcale dans du solut physiologique
l'extrmit d'une lame et dans un peu de solution iode l'autre extrmit.
80
Les oocystes d'Isospora belli sont ovales (environ 32 x 16 )lm) et contiennent
une masse centrale de protoplasme bien individualise (voir diagramme ci-dessous).
Oocyste immature d'lsospora belli Oocyste mr d'/sospora belli
NOTE:
Prparer une solution d'iode en mlangeant 10 ml de Lugol (ractif No 16)
10 ml d'acide actique 25% v/ v. Cette solution permet une bonne coloration
des noyaux.
Les oocystes de Cryptosporidium s'observent dans les talements de matire
fcale colors (voir premire partie, pp. 18-19).
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii est un parasite des animaux qui provoque la toxoplasmose.
Chez l'homme, la toxoplasmose est souvent asymptomatique. Elle peut pro-
voquer de la fivre, des ruptions, une adnopathie et une lymphocytose. Sa
forme la plus grave est la toxoplasmose congnitale qui provoque souvent des
lsions crbrales importantes chez le ftus. Si elle est contracte au dbut de
la grossesse, l'infestation peut provoquer l'avortement, alors qu'en fin de gros-
sesse, elle sera l'origine de symptmes d'infestation chez le nourrisson 2
3 mois aprs la naissance. Des manifestations cliniques graves, en particulier
crbrales, de la toxoplasmose se rencontrent souvent chez les malades at-
teints du sida.
Le diagnostic de laboratoire de la toxoplasmose fait appel :
1. Des preuves srologiques, parmi lesquelles le test de lyse (Dye test de
Sabin et Feldman), l'immunofluorescence indirecte (IFl), l'hmagglutina-
tion indirecte (IHA), la raction de fixation du complment (FC), et le
titrage immunoenzymatique (ELISA), plus rcent. La description de ces
techniques n'entre pas dans le cadre de ce manuel.
2. Des examens microscopiques, qui sont parfois utiles pour le diagnostic
d'une infestation aigu, et qui sont pratiqus sur des prparations de suc
ganglionnaire, de moelle osseuse, de liquide cphalorachidien, de liquide
pritonal, pleurale ou d'expectorations, colores au Giemsa ou au colo-
rant de Field. Cette recherche est surtout pratique en cas de sida.
Les toxoplasmes sont des organismes en croissant de petite taille (3 x 7 )lm). Ils
ont une extrmit arrondie, l'autre pointue. Leur cytoplasme se colore en bleu,
et leur noyau, qui est situ dans l'extrmit arrondie, en rouge fonc. Dans les
coupes tissulaires, ils peuvent parfois tre arrondis et ressembler aux formes
amastigotes de Leishmania.
Problmes d'identification
Dans les chantillons de selles, de nombreuses structures ressemblent des
parasites sans en tre.
Les cellules pithliales et les macrophages peuvent tre confondus avec des
formes vgtatives d'amibes, en particulier les seconds, qui montrent de lgers
81
mouvements amibodes et peuvent contenir des hmaties. Leurs noyaux, que
l'on peut observer dans les prparations colores au bleu de mthylne tam-
ponn, sont plus grands que les noyaux des amibes et contiennent en gnral
plusieurs grains ou particules de chromatine (voir ci-dessous).
Cellule pithliale Macrophage
On peut galement confondre des cellules de pus avec des kystes d'amibes.
Leurs noyaux forment 3 ou 4 expansions et se colorent en gnral trs forte-
ment. Leur cytoplasme montre un contour irrgulier et la membrane cellulaire
est souvent invisible. Les kystes d'amibes ont une paroi cellulaire nette.
On peut confondre les poils et les fibres avec des larves. Toutefois, les premiers
n'ont pas la mme structure interne que les secondes.
Les cellules vgtales (pollens, cellules de fculents, spores de champignons)
peuvent tre prises pour des kystes ou des ufs. Elles ont en gnral une paroi
paisse; les kystes ont une paroi mince. Les levures et les moisissures sont
beaucoup plus petites que les kystes d'amibes et ne possdent pas des noyaux
comparables ceux que l'on observe dans ces kystes.
NOTE:
Les formes vgtatives et les kystes d'E. histolytica ne sont souvent pas trs
typiques et il faut en examiner plusieurs avant d'tre certain de l'espce
laquelle on a affaire.
82
L'IDENTIFICATION PEUT NCESSITER
L'TUDE SOIGNEUSE DE PLUSIEURS KYSTES
OU FORMES VGTATIVES.
IL EST IMPRATIF DE LES MESURER.
Parasites sanguins
Paludisme
Identification des Plasmodium dans les frottis minces
Lorsque l'on examine des frottis minces la recherche de Plasmodium, il faut recher-
cher les hmaties infestes et les parasites (hmatozoaires) qu'elles contiennent.
Hmaties infestes
- Observer les dimensions des hmaties infestes.
- Les granulations de Schffner sont-elles prsentes?
Hmaties
infestes
Agrandies:
Granulations de Schffner
prsentes
1
P. vivax ou P. ovale.
Observer les hmatozoaires.
i_ Normales (P. falciparum): ---. P. malariae ou P. falciparum
Granulations de Schffner
absentes. Cellules infestes
pouvant avoir une taille infrieure
la normale dans les infestations
P. malariae
Hmatozoaires
Les stades annulaires des quatre espces principales peuvent se ressembler. Si
l'on observe des anneaux, rechercher les stades plus dvelopps. Chez les
malades atteints de paludisme P. falciparum, en gnral on ne voit que les sta-
des annulaires; les autres stades ne sont prsents que dans les infestations graves.
NOTE:
Si l'on observe Plasmodium falciparum, il est impratif d'enregistrer la parasit-
mie en pourcentage (sur cent hmaties observes, combien sont infestes).
Concernant les caractristiques qu'il faut rechercher dans les frottis minces et
les gouttes paisses pour le diagnostic, voir les tableaux 6 et 7 et les figures 9,
10, 11 et 12.
2
Identification des Plasmodium dans les gouttes paisses
Dans les gouttes paisses colores, les hmaties sont lyses; le diagnostic est
donc fond sur la seule morphologie des hmatozoaires. Ces derniers ont ten-
dance tre plus compacts et plus denses dans les gouttes paisses que dans
les frottis minces.
Mthodes de numration des hmatozoaires dans les
gouttes paisses
Nombre de Plasmodium par microlitre
La mthode que l'on va dcrire est une mthode pratique suffisamment
exacte. Elle est base sur le nombre de parasites par ).11 de sang dans une goutte
1
Dans les lames mal colores. les granulations de Schffner peuvent ne pas tre visibles: il est donc
indispensable d'employer de bennes mthodes de coloration. et surtout un pH de 7,27,3. Les granulations de
Schffner absentes dans les premiers stades annulaires de P. vivax.
2
Le tableau 7 et les figures 9 13 ont t tirs des Planches pour le diagnostic du paludisme, W 1 8, Genve,
Organisation mor.diale de la Sant, 1985.
83
PARASITES SANGUINS
Tableau 6. Caractristiques morphologiques des hmatozoaires
dans les frottis minces
Stade
Hmatie infeste
Stade annulaire
(trophozote jeune)
Trophozote g
Schizonte maturit
Gamtocytes
P. vivax P. ovale P. malariae P. falciparum
Taille augmente, Taille augmente; peut Taille normale ou Taille normale; les
granulations de tre ovale et frange; diminue; coloration taches de Maurer
Schffner prsentes granulations de fonce peuvent tre visibles
Schffner prsentes
Assez gros; une ou deux Petit; polyparasitisme Petit Petit et dlicat; prsente
taches de chromatine ; il assez frquent souvent deux taches de
peut y avoir deux chromatine en haltre;
anneaux par hmatie polyparasitisme frquent;
formes margines.
Grand; amibode ; Petit; non amibode; Petit; compact; souvent Taille moyenne; en
pigment sous forme de pigment grossier en bande quatoriale; gnral compact;
btonnets fins pigment grossier pigment granulaire
parfois prsent
Grand; mrozotes Plus petit que P. vivax, 6 Petit, mais avec grands Rare dans le sang
grands (12 24); 12 mrozotes; mrozones (6 12) ; priphrique; mrozotes
pigment en amas; corps pigment plus fonc que aspect caractristique en (B 26) petits; masse
en rosace chez P. vivax "marguerite, ; pigment pigmentaire unique
grossier
Sphriques; compacts; Semblables ceux de P. Ressemblent ceux de En forme de croissant;
noyau unique; pigment vivax mais plus petits P. vivax mais plus petits, noyau unique
grossier moins nombreux et sans
granulations de Schffner
paisse, ces derniers tant compts par rapport un nombre prdtermin de
leucocytes. On prend comme rfrence une moyenne de 8000 leucocytes
par 111. Malgr des inexactitudes dues aux variations du nombre de leucocytes
d'un individu en bonne sant l'autre, et des variations encore plus grandes
en cas de maladie, cette valeur de rfrence permet d'effectuer des comparaisons
valables. Avant de commencer la numration, on examinera l'quivalent de
0,25!11 de sang (environ 100 champs microscopiques l'aide d'un oculaire x 7 et
d'un objectif immersion x lOO) sur la goutte paisse, afin de dterminer
l'espce en cause et les stades prsents. Une fois cette opration termine, la
mthode de comptage suivante devra tre employe pour les talements positifs:
1. Il faut deux compteurs main, l'un pour les Plasmodium, et l'autre pour les
leucocytes.
2. a) Si, aprs avoir compt 200 leucocytes, 10 Plasmodium au moins ont t
identifis, enregistrer les rsultats sur le formulaire, en indiquant le nom-
bre de parasites pour 200 leucocytes.
b) Si, aprs avoir compt 200 leucocytes, on n'a compt que 9 Plasmodium
au plus, continuer compter jusqu' avoir enregistr 500 leucocytes et
noter le nombre de parasites pour 500 leucocytes.
3. Dans chaque cas, le rapport de la numration parasitaire la numration
leucocytaire peut tre converti en nombre de Plasmodium par 111 de sang,
au moyen de la formule mathmatique simple suivante:
Nombre de Plasmodium x 8 000 N b d Pl d 1
N b d 1
= om re e asmo zum par Il
om re e eucocytes
Cela signifie que si l'on compte 200 leucocytes, le nombre de Plasmodium
compts est multipli par 40 et que si l'on en compte 500, il est multipli par 16.
4. D'ordinaire, on compte tous les stades prsents, qu'il s'agisse de formes
sexues ou asexues. Parfois, on fait une numration spare pour les
gamtocytes de Plasmodium falciparum, mais lorsque c'est le cas, ils sont
tout de mme compris dans la numration parasitaire gnrale. Il est rare-
ment possible de distinguer les gamtocytes de P. vivax ou de P. malariae
des formes asexues avec suffisamment d'exactitude pour justifier un
comptage spar.
84
Le systme des plus
Il existe une mthode plus simple pour estimer les parasites dans les gouttes
paisses; il s'agit du systme des plus. Il donne des indications sur la numra-
tion parasitaire relative et ncessite l'emploi d'un code comprenant 1
4 signes plus; ainsi:
+ = 1 10 Plasmodium pour 100 champs de la goutte paisse
++ = 11 100 Plasmodium pour 100 champs de la goutte paisse
+++ = 1 10 Plasmodium par champ de la goutte paisse
++++ =plus de 10 Plasmodium par champ de la goutte paisse
Ce systme ne doit tre employ que lorsqu'il est impossible d'effectuer une
numration parasitaire par ~ l de sang.
Structures pouvant tre confondues avec des Plasmodium
Dans les frottis sanguins, les structures qui peuvent ressembler des Plasmo-
dium sont les suivantes (voir galement Fig. 13):
- plaquettes sur les hmaties dans les frottis minces,
- agrgats plaquettaires,
- fragments de leucocytes dans les gouttes paisses,
- colorant prcipit sur les hmaties,
- cellules cutanes du. malade, poussires, bactries, levures, spores et
autres lments ayant pu se dposer sur le frottis pendant qu'il schait,
- algues et autres micro-organismes provenant de solutions colorantes
contamines.
Tous ces lments peuvent ressembler aux hmatozoaires dans les frottis colo-
rs et peuvent tre pris pour eux. Cependant, ils ne prsentent en gnral pas
les trois caractristiques des Plasmodium: cytoplasme color en bleu, chroma-
tine colore en rouge ou en violet et pigment brun ou noir. Ces trois caractres
doivent tre visibles pour pouvoir affirmer qu'on est en prsence d'un Plasmo-
dium, sauf pour les formes annulaires (qui ne sont pas pigmentes). En cas de
doute, rechercher des spcimens plus typiques. Si aucun lment ne permet
d'affirmer la prsence d'hmatozoaires, enregistrer le frottis comme sans
Plasmodium visibles, de prfrence aprs avoir prpar, color et examin un
second frottis. La figure 13 montre certaines des structures pouvant tre prises
pour des hmatozoaires.
Il faut mettre les frottis l'abri pendant qu'ils .schent pour viter que des
poussires ou des micro-organismes, tels que spores ou bactries, ne viennent
les contaminer. En outre, on s'assurera que les flacons de colorant (solution-
mre et eau tamponne) sont bien bouchs, de faon que les poussires et les
micro-organismes prsents dans l'air ne les contaminent pas, risquant ainsi de
contaminer le frottis au moment de la coloration.
Trypanosomes
Les trypanosomes peuvent tre dforms dans les gouttes paisses. S'il est
impossible de les reconnatre dans ces dernires, les rechercher dans les zones
les plus paisses du frottis mince. On les trouve entre les hmaties. Observer
quelle est la longueur, la forme et les dimensions du kintoplaste des trypano-
sames. (suite page 92)
85
PARASITES SANGUINS
Tableau 7 Dtermination des espces de Plasmodium dans des frottis pais
colors au Giemsa
Stades du parasite dans le sang priphrique
Espce
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Trophozo'lles
0 ,.
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Taille : petits moyens; nombre : souvent
nombreux; forme : couramment formes
annulaires en virgule ; chromatine: souvent
deux taches ; cytoplasme: rgulier, fin
charnu ; formes matures: quelquefois
prsentes dans le paludisme grave,
compactes, avec pigment en masse ou sous
forme de quelques gros grains.
..
....
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, .

- .. 0
..
Taille: petits grands ; nombre: faible
moyen; forme: couramment, anneaux
ouverts ou forme irrgulire ; chromatine:
une tache, parfois deux ; cytoplame:
irrgulier ou fragment; formes matures:
compactes, denses; pigment: dispers, fin.
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Taille: peuvent tre plus petits que ceux de
P. vivax; nombre: habituellement peu
nombreux; forme: forme annulaire arrondie
et compacte ; chromatine: une seule tache
nettement visible ; cytoplasme: assez
rgulier, charnu; pigment: dispers, en gros
grains.
.... :-
.
Taille: petits, nombre: gnralement peu
nombreux; forme: annulaire arrondie et
compacte ; chromatine: une seule grosse
tache ; cytoplasme: rgulier, dense; pigment:
dispers, abondant, de nuance jauntre chez
les formes ges.
86
Schizontes

-c.:"Jf:
. ::
Habituellement associs de nombreuses
formes annulaires jeunes. Taille: petits,
compacts; nombre; peu nombreux, peu
courants, en gnral dans le paludisme
grave ; formes matures : 12-30 ou
plus, en amas compacts ; pigment: une seule
masse sombre.
.- ..
v
Taille: grands; nombre: faible moyen ;
formes matures: 12-24 gn-
ralement 16, en amas irrguliers; pigment:
masse diffuse.
' .
/:;' .. .
.. . ...
.....:....
..
: ... ::
Taille : voisine de P. malariae; nombre: peu
nombreux ; formes matures: 412 mro-
gnralement 8, en amas diffus;
pigment: masse concentre.

.. ..

...
Taille: petits, compacts; nombre: gnrale-
ment peu nombreux ; formes matures : 6-12
gnralement 8, en amas diffus ;
certaines formes apparemment sans
cytoplasme; pigment: concentr.
Gamtocytes
Formes immatures extrmit en pointe peu
courantes ; formes matures: en forme de
banane ou arrondies; chromatine; une seule
tache bien dfinie ; pigment: dispers, en gros
grains en forme de grains de riz, avec
quelquefois une excroissance rose. Pr-
sence frquente en formes uses ne
contenant que la chromatine et le pigment.
..... :1
-::.
... .:'<' .

Formes immatures difficiles distinguer des
matures. Formes matures:
rondes, grandes; chromatine: une seule
tache bien dfinie; pigment: dispers, fin.
Prsence de formes uses avec un
cytoplasme rare ou absent et ne contenant
que la chromatine et le pigment.
Formes immatures difficiles distinguer des
rondes, peuvent tre plus petites que celles
de P. vivax; chromatine: une seule tache bien
dfinie ; pigment: dispers, en gros grains.
Prsence de formes uses ne contenant que
la chromatine et le pigment.

.
...
Formes immatures et certaines formes
matures difficiles distinguer des
rondes, compactes; chromatine: une seule
tache bien dfinie; pigment: dispers, en gros
grains, peut tre rparti la priphrie.
Prsence de formes uses ne contenant que
la chromatine et le pigment.
Fig. 9. Plasmodium falciparum
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SCHIZONTES
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Frottis mince Frottis pais
87
PARASITES SANGUINS
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Frottis mince
88
Fig. 1 O. Plasmodium vivax
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TROPHOZOTES
SCHIZONTES
GAMTOCYTES
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Frottis pais

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Fig. 11. Plasmodium malariae
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TROPHOZOTES
SCHIZONTES
GAMTOCYTES
Frottis mince
89

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Frottis pais
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PARASITES SANGUINS
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Frottis mince
90
Fig. 12. Plasmodium ovale
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. . . .... ., .
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TROPHOZOTES
SCHIZONTES
GAMTOCYTES

Frottis pais
Fig. 13. Aspect des lments cellulaires dans les frottis sanguins minces et pais
colors au Giemsa : effet du pH sur la coloration des Plasmodium au Giemsa
. .
N
L
Frottis mince LEUCOCYTES Frottis pais
N = Neutrophile, E = Eosinophile, M = Monocyte, L = Lymphocyte, P = Plaquettes
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.

MP

. .
CJ
PC
Frottis mince RYTHROCYTES
.
. . .
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......
NR

..
Frottis pais
..
* p

NC = Normocyte, MC = Microcyte, MP = Macrocyte polychromatophile, PC = Po'1kilocyte, GB = Granulocyte basophile,
AC =Anneau de Cabot, CJ = Corps de Jolly, NR = "Nuages" rticuls et corps chromatodes dans l'anmie svre.
pH 64
91
68
..
. .
. .
72
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. . .
pH ET COLORATION
76
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. ... .
. ... .. ..... ~
. .
. .
PARASITES SANGUINS
Grand kiMtoplaste
Noyau Membrane Flagelle
ondulante
Flagelle antrieur
Membrane ondulante
Trypanosoma cruzi Trypanosoma brucei
Attention
1. En Afrique, les deux sous-espces de Trypanosoma qui infestent l'homme
sont identiques. Il est impossible de les diffrencier dans les frottis colors.
2. En Amrique centrale et du Sud, T. cruzi et T. rangeli doivent tre distin-
gus l'un de l'autre.
3. T. rangeli est plus long que T. cruzi.
4. T. cruzi possde un kintoplaste trs grand, bien visible et a souvent une
forme de C, de U ou de S dans les frottis colors.
Micro filaires
Pour identifier les microfilaires on utilise les caractristiques suivantes (voir
Fig. 14):
- prsence ou absence de gaine,
- prsence ou absence de noyaux terminaux,
corps interne - visible ou non,
- dimensions de la microfilaire.
On est parfois oblig d'utiliser d'autres caractristiques pour identifier les
espces. Malheureusement, elles ne sont pas toutes visibles dans les prpara-
tions colores au Giemsa et il faut quelquefois procder des colorations sp-
ciales, comme la coloration l'hmatoxyline de Delafield, pour les mettre en
vidence, en particulier pour la gain.
Attention
1. Localiser les microfilaires avec l'objectif x l.
2. Balayer le frottis de faon systmatique.
3. Identifier les espces de microfilaires fort grossissement (x 40), ou l'aide
d'un objectif immersion.
A. Wuchereria bancrofti (Asie, Afrique, Amrique centrale et du Sud, Antilles).
La gaine est colore ou non au Giemsa; se colore l'hmatoxyline. Noyaux
distincts. Espace libre entre les noyaux et la cuticule.
Absence de noyaux l'extrmit caudale.
Corps interne souvent visible au Giemsa. Ne se colore pas l'hmatoxyline.
L'espace cphalique est aussi long que large.
L'extrmit caudale peut tre recourbe en arrire sous le corps. Visible dans
le sang.
92
(()
(.
Fig. 14. Microfilaires retrouves chez l'homme
Cellule A,
Gaines Non gaines

Anneau nerveux Pore excrteur Cellule excrtrice
a_
.----- ---
Dans le sang
1
r -- ---- - - '
Dans r peau
Avec gaine Sans gaine Sans gaine
1
1
1
li 1 1 r -----.
Noyaux allant jusqu' Noyaux n'allant pas jusqu' Noyaux allant
l'extrmit caudale l'extrmit caudale jusqu' l'extrmit
1
Espace cphalique aussi long caudale
1 1 que large Queue arrondie
Queue renfle possdant Queue de largeur uniforme
deux noyaux distincts Espace cphalique aussi
Espace cphalique deux long qua large
fois plus long que large
((
Brugia
mafayi
! J
Mansonefla
perstans
Noyaux n'allant pas
jusqu' l'extrmit
caudale
Filaire et fine
Manso nef/a
ozzardi
Noyaux allant jusqu'
l'extrmit caudale
Filaire petite et fine
Queue en "crosse d'vque"
Noyaux n'allant pas
jusqu' l'extrmit caudale
Grosse filaire
Espace cphalique
plus long que large
Mansoneffa
streptocerca
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PARASITES SANGUINS
B. Brugia malayi (Asie du Sud-Est, Inde)
Microfilaire tortille,
Gaine se colorant en rose fonc au Giemsa.
Noyaux nombreux, serrs, remplissant l'ensemble du corps. Espace vide entre
les noyaux et la paroi du corps.
Espace cphalique deux fois plus long que large.
Corps interne se colorant souvent; lorsqu'il se colore, il est prominent. Visible
dans le sang.
C. Laa laa (uniquement en Afrique)
Microfilaire gaine.
La gaine ne se colore pas au Giemsa; se colore l'hmatoxyline.
Noyaux nombreux et serrs allant jusqu' l'extrmit caudale; extrmit cau-
dale effile. Espace cphalique aussi long que large.
Corps interne difficile voir. Visible dans le sang.
D. Mansonella perstans (Afrique et Amrique du Sud)
Microfilaire petite et fine.
Ne possde pas de gaine.
Noyaux allant jusqu' l'extrmit caudale, le dernier tant plus gros; extrmit
caudale arrondie.
Noyaux se colorant fortement et chevauchants. Visible dans le sang.
E. Mansonella ozzardi (Amrique centrale et du Sud)
Les noyaux ne vont pas jusqu' l'extrmit caudale; extrmit caudale effile.
Se colore trs lgrement; extrmit caudale difficile voir. Visible dans le
sang et la peau.
F. Mansonella streptocerca (Afrique centrale et de l'Ouest)
Noyaux allant jusqu' l'extrmit caudale.
Queue en crosse d'vque; extrmit caudale arrondie ou bifide; visible
uniquement dans la peau.
G. Onchocerca volvulus
Grosse microfilaire non gaine.
Tte souvent spatule. Espace cphalique long, de 1,5 2 fois la largeur du
corps
Noyaux n'allant pas jusqu' l'extrmit caudale pointue.
Visible uniquement dans la peau.
94
Bibliographie
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1985 (document non publi WHO/PDP /85.2)
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14. THIENPONT, D., ET AL., Diagnosing helminthiasis by coprological examina tian, 2e
d. Beerse, Belgique, Janssen Research Foundation, 1986.
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Organisation mondiale de la Sant, 1983.
16. OMS, Srie de Rapports techniques, No 793, 1990. (Lutte contre les leishmanio-
ses: rapport d'un comit OMS d'experts).
17. OMS, Srie de Rapports techniques, No 739, 1986. (La trypanosomiase afri-
caine: pidmiologie et lutte: rapport d'un comit d'experts de l'OMS).
18. OMS, Srie de Rapports techniques No 752, 1987 (Comit OMS d'experts de
l'Onchocercose: troisime rapport).
1
Disponible sur demande auprs de la Division de la Lutte contre les Maladies tropicales, Organisation mondiale
de la Sant, 1211 Genve 27, Suisse.
2
Disponible sur demande auprs du Service de la Lutte contre les Maladies diarrhiques, Organisation mondiale
de la Sant. 1211 Genve 27. Suisse.
95
ANNEXE 1
Matriel de parasitologie diagnostique
ncessaire dans les centres de sant et
les laboratoires des hpitaux de district
Instruments
Microscopes munis d'un clairage suffisant, de prfrence avec source lumi-
neuse incorpore.
On aura besoin de microscopes munis de miroirs ajustables si la source lumi-
neuse est spare, par exemple s'il s'agit de la lumire du soleil ou d'une
lampe. Les microscopes devront tre munis d'un diaphragme ajustable et d'un
condenseur, d'oculaires x 10, et d'objectifs x 10, x 40, et immersion.
Centrifugeuse - de table ou sur pied - avec couronne et adaptateurs pour
tubes centrifuger de 15 ml. On choisira de prfrence des gaines couvercle.
Centrifugeuse pour microhmatocrite.
Rfrigrateur, 4-5C.
Petit matriel
Abaisse-langue (ou cuillres en plastique)
Agitateur en verre
Aiguilles, 25 G, 0,5 x 16 mm, pour injection sous-cutane
Aiguilles biopsie (rate)
Aiguilles pour ponction veineuse
Bandes de cellophane mouillables de 25 x 30-35 mm et de 40 50 11m d'pais-
seur
Botes coloration
Bouchons en caoutchouc pour tubes centrifuger de 15 ml (en gnral, de
taille 0 ou 1)
Cellophane adhsive transparente, de 2 cm de large, pour couvillonage anal
Chiffon de coton non pelucheux
Compresses de gaze strile pour nettoyage des doigts
Crayons et feutres pour l'tiquetage
Ecouvillons de coton
Entonnoir
Eprouvettes gradues, 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml et 1000 ml
Etiquettes
Filtre membrane, 12 !lill ou 15 11m et support pour filtre
Filtre, laiton, de 7,5 cm de diamtre, maille 40 (425 !lm)
Fioles, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml et 5000 ml
Flacons, 1000 ml
Flacons vis, 20 ml, avec capsule ajuste trs serre
Flacons compte-gouttes ou pissettes en polythylne, 100 ml, 250 ml et 500 ml
Flacons compte-gouttes pour solut physiologique, iode, bleu de mthylne
tamponn et mthanol (coloration du sang)
Flacons en verre, avec bouchons de verre, 250 ml et 1000 ml
96
MATRIEL
Flacons, petits, 25 ml, 30 ml, 50 ml et 100 ml, avec bouchons de caoutchouc ou
bouchons compte-gouttes avec capsule visse
Hmostyles jetables sous emballage individuel
Huile immersion, viscosit faible
Lamelles couvre-objets, 20 22 mm de ct
Lames porte-objets - 25 mx 75 mm, 50 x 75 mm (facultatif)
Micropipettes capillaires, d'environ 14 cm de long avec poires en caoutchouc
(pour la mthode de concentration et l'usage gnral)
Minuterie
Papier absorbant ou ponges
Papier hyginique, serviettes dmaquiller ou papier optique
Pinces
Pipettes Pasteur, avec poires en caoutchouc
Pipettes Sahli
Pipettes srologiques, 1 ml, 5 ml, 10 ml avec poires en caoutchouc
Plaque chauffante (plaque mtallique avec lampe alcool)
Plaque perfore en acier inoxydable, plastique ou carton, de 20 50 mm
R te lier lames en bois
Registre ou formulaires d'enregistrement
Scalpel ou lames de rasoir
Seringue 5 ou 10 ml
Support en bois pour scher les frottis
Support pour agitateurs en verre ou petits flacons
Support pour tubes centrifuger
Tamis en acier inoxydable, nylon, ou plastique, avec ouverture de maille de 60
105
Tubes centrifuger, coniques, gradus, 15 ml
Tubes essais, grands, 150 x 13 mm, pour bullition.
Tubes essais, petits, 100 x 13 mm, avec bouchons de coton ou bouchons visss
Tubes capillaires
Tubes pour ractifs
Vaseline
Verres pied coniques pour urines
Produits chimiques et solutions ncessaires
pour la prparation des ractifs
(prparation dcrite dans l'annexe 2).
Acide actique glacial
Acide chlorhydrique concentr (HCl)
Alcool polyvinylique (APV)
Chlorure de sodium (NaCl)
Chlorure mercurique cristallis (HgCh)
Colorants:
- Bleu de mthylne tamponn
- Colorant de Field A
- Colorant de Field B
- Giemsa, solution-mre
- Glycrol-vert malachite.
- Hmatoxyline de Delafield, solution-mre.
- Solution de safranine.
- Trichrome, solution-mre.
Colorants (en poudre) :
- Bleu Azur I - pour le colorant de Field A
- Chromotrope 2R - pour le trichrome
- Eosine - pour le colorant de Field B
97
ANNEXE1
- Vert lumire SF - pour le trichrome
- Vert solide FCF - pour le trichrome
- Vert malachite
- Bleu de mthylne
Cristaux d'acide phosphotungstique (fu[P04(W1236)]. 5Hz0)
Cristaux d'iodure de potassium (KI)
Cristaux de citrate de sodium (C6Hs07NA3.2Hz0)
Cristaux de phnol (acide phnique)
Dihydrognophosphate de potassium (KHzP04) (pour l'eau tamponne)
Eau distille
Ethanol (alcool thylique) 70 %, 95 %, 100% (absolu)
Ether, anesthsique ou technique, ou actate d'thyle
Formol (formaldhyde)
Glycrol
Hydrognophosphate de disodium (Naz HP04) (pour eau tamponne)
Iode en paillettes (lz)
Isopropanol (alcool isopropylique)
Mthanol (alcool mthylique)
Poudre d'actate de sodium (CH3COONa) ou cristaux d'actate de sodium
(CH3COONa.3Hz0)
Xylne
Si l'hmatoxyline de Delafield est prpare au laboratoire, les produits sui-
vants seront ncessaires :
- sulfate d'aluminium-ammonium pour prparer une solution sature.
- poudre ou cristaux d'hmatoxyline.
98
ANNEXE 2
Prparation des ractifs et solutions
Alcool acide actique, solution dcolorante
{N 1}
Ethanol 95% ............................................................................................. 600 ml
Acide actique glacial (CH3COOH) ............................................................ 4 ml
Eau distille ................................................................................................. 350 ml
Verser l'thanol 95% dans une prouvette gradue de 1000 ml. Complter
950 ml avec de l'eau distille. Verser dans un flacon de 1000 ml. Ajouter l'acide
actique glacial et mlanger.
Etiqueter le flacon : DCOLORANT ALCOOL ACIDE et inscrire la date.
Conserver sur une tagre ou dans une armoire. Cette solution se conservera
au moins un an.
ATTENTION :L'acide actique glacial est extrmement corrosif.
L'thanol est inflammable.
Bleu de mthylne tamponn (No 2)
Solution A (solution d'acide actique)
Acide actique glacial (CH3COOH) ......................................................... 1,2 ml
Eau distille ................................................................................................ 98,8 ml
Verser 98,8 ml d'eau distille dans une fiole ou un flacon propre, ajouter 1,2 ml
d'acide actique glacial et mlanger soigneusement. Conserver dans un flacon
propre.
ATTENTION: L'acide actique glacial est extrmement corrosif.
Solution B (solution d'actate de sodium)
Actate de sodium (CH3COONa) ............................................................... .1,6 g
(actate de sodium cristallis (CThCOONa 3H20)) ................................. 2,6 g
Eau distille ................................................................................................. .1 00 ml
Verser les 100 ml d'eau distille dans une petite fiole. Peser 1,6 g d'actate de
sodium (ou 2,6 g de la forme cristallise) et dissoudre dans l'eau ; mlanger
soigneusement. Conserver dans un flacon propre.
Solution de travail (pour la coloration)
Solution A (solution d'acide actique) ................................................. .46,3 ml
Solution B (solution d'actate de sodium) .............................................. 3,7 ml
Bleu de mthylne ......................................................................................... 0,5 g
Eau distille ................................................................................................... 50 ml
Verser les 50 ml d'eau distille dans une fiole ou un bcher de 150 ou 200 ml.
Ajouter les solutions A et B et mlanger soigneusement. Ajouter ensuite envi-
99
ANNEXE2
ron 0,5 g de bleu de mthylne et remuer jusqu' ce que le colorant se soit dis-
sous. S'il n'est pas entirement dissous au bout de 15 minutes, filtrer la solu-
tion. Verser ou filtrer dans un flacon propre muni d'un bouchon et inscrire sur
l'tiquette : SOLUTION DE BLEU DE MTHYLNE TAMPONN. Inscrire la
date. Cette solution se gardera indfiniment. Si des particules de colorant se
dposent au fond du flacon, on filtrera la solution. En verser une petite quan-
tit (20 mD dans un flacon compte-gouttes pour l'utilisation immdiate. Le fla-
con compte-gouttes doit tre muni d'une pipette avec poire en caoutchouc.
NOTE: Les tampons d'actate ayant un pH de 3,6 donnent les meilleurs rsul-
tats pour ce type de coloration.
Tampons pour la coloration des Plasmodium
{N 3)
Un tampon phosphate, ajust pH 7,2 est indispensable pour le Giemsa (colo-
ration des Plasmodium).
Prparation d'une solution de travail
1. Dissoudre 1 g d'hydrognophosphate de disodium anhydre (Na2HP04)
et 0,7 g de dihydrognophosphate de potassium (KH2P04) dans 1 litre
d'eau distille ou dminralise. On peut utiliser de l'eau de pluie filtre,
ou mme de l'eau du robinet, si l'on ne dispose de rien d'autre.
2. Vrifiet le pH l'aide d'un pH-mtre ou d'un indicateur color, tel que le
comparateur Lovibond.
3. Si le pH est infrieur 7,2, ajouter un peu de solution de Na2HP04 2%;
s'il estsuprieur 7,2 ajouter un peu de solution de KH2P04 2%.
4. Lorsque le pH est ajust 7,2, conserver dans un flacon hermtiquement
bouch, de prfrence en verre brun, dans un endroit frais l'abri du
rayonnement solaire direct.
Cette solution se conservera quelques semaines, mais doit tre rgulirement
vrifie pour s'assurer qu'aucune prolifration microbienne ni moisissure ne
s'est installe. Pour cela, on agitera la solution; si elle est trouble, la jeter.
Prparation d'une solution-mre concentre
(utile pour les voyages sur le terrain ou pour l'envoi
des laboratoires loigns)
1. Dissoudre 30 g de Na2HP04 anhydre et 2,1 g de KH2P04 dans 25 ml d'eau
distille ou dminralise.
2. Ajuster le pH 7,2 de la faon dcrite au point 3 ci-dessus.
3. Conserver dans un flacon en verre brun l'abri de la lumire du soleil ; la
solution se conservera plusieurs semaines.
4. Pour obtenir une solution de travail, diluer 1 ml du concentr dans 20 ml
d'eau distille ou dminralise.
Prparation de produits prpess
Les deux phosphates peuvent tre pess l'avance et dposs ensemble dans
un tube, un flacon ou un sac de plastique hermtiquement ferm et clairement
tiquet, lui-mme conserv dans un bocal muni d'un bouchon viss.
Pour obtenir la solution, verser le contenu de ce conditionnement dans 1 litre
d'eau et ajuster le pH 7,2.
100
RACTIFS ET SOLUTIONS
Fuchsine phnique, solution de (No 4)
Fuchsine basique ............................................................................................. 10 g
Ethanol absolu, produit technique .......................................................... 100 ml
Phnol .............................................................................................................. 50 g
Eau distille ......................................................................................................... 1 1
Prparation
1. Peser la poudre de fuchsine basique et la verser dans un flacon de 1,5litre.
2. Ajouter 100 ml d'thanol absolu et dissoudre compltement le colorant.
3. Peser le phnol dans un bcher et le dissoudre dans un peu d'eau distille.
4. Ajouter la solution aqueuse de phnol la solution de colorant et mlan-
ger soigneusement.
5. Ajouter le reste de l'eau, mlanger soigneusement et tiqueter le flacon. La
solution de colorant restera stable indfiniment.
NOTE: L'thanol est inflammable. Le phnol est toxique et corrosif.
Xylne phniqu, solution de (No 5)
NOTE : Cette solution doit tre prpare dans des laboratoires de niveau inter-
mdiaire en raison du danger prsent par les ractifs auxquels elle fait appel.
Ouvrir le bouchon d'un flacon de cristaux de phnoP (acide phnique) et met-
tre le flacon au bain-marie. Chauffer l'eau afin de liqufier les cristaux. NE
PAS CHAUFFER LES CRISTAUX DE PHNOL DIRECTEMENT SUR UNE
FLAMME. TOUJOURS METTRE LE FLACON AU BAIN-MARlE.
Phnol liquide ............................................................................................. 200 ml
Xylne ........................................................................................................... 600 ml
Verser le phnol liquide dans un flacon de 1000 ml bouch l'meri. Ajouter
le xylne. Dans la mesure du possible, prendre un flacon de xylne non
entam. Mlanger en agitant le flacon.
Etiqueter le flacon : XYLNE PHNIQU et inscrire la date. Conserver dans
une armoire ou sur une tagre, l'abri de la lumire. La solution se conserve
au moins un an, mais le flacon doit tre hermtiquement ferm. On peut
entourer le bouchon de ruban adhsif afin d'viter toute humidit. Si de
l'humidit pntre dans la solution, celle-ci devient inutilisable.
ATIENTION: Le phnol est extrmement toxique et corrosif.
Hmatoxyline de Delafield (No 6)
Cristaux d'hmatoxyline ................................................................................. .1 g
Ethanol absolu .............................................................................................. .10 ml
Solution sature de sulfate d'aluminium- ammonium
(NH4Al(S04h) dans l'eau distille ............................................................ lOO ml
Glycrol (C3Hs(OH3) ..................................................................................... 25 ml
Mthanol absolu ............................................................................................ 25 ml
Dissoudre les cristaux d'hmatoxyline dans l'thanol absolu. Ajouter goutte
goutte la solution obtenue la solution sature de sulfate d'aluminium -
1
Ne pas utiliser le phnol liquide que l'on trouve dans le commerce. Il contient de l'eau, ce qui le rend impropre
la coloration.
101
ANNEXE2
ammonium. Laisser le flacon contenant cette solution ouvert, la lumire
directe du soleil, ou dans une tuve 37 C pendant 3 4 mois pour que
l'hmatoxyline s'oxyde et donne de l'hmatine.I
Boucher, puis tiqueter le flacon : HMA TOXYLINE DE DELAFIELD et ins-
crire la date. Au moment de sa rouverture filtrer la solution, y ajouter le gly-
crol et l'alcool mthylique ; le colorant est alors prt l'emploi. Reboucher le
flacon pour viter toute vaporation. Ce colorant se conservera au moins 18 mois.
Ethanol 70% (N 7)
Ethanol 95% ............................................................................................. 726 ml
Eau distille ................................................................................................. 274 ml
Verser l'thanol dans une prouvette gradue de 1000 ml. Complter 1000 ml
avec de l'eau distille. Verser dans un flacon de 1000 ml bouch l'meri
Etiqueter le flacon : THANOL 70% et inscrire la date. Cette solution se
conservera indfiniment condition que le flacon soit hermtiquement ferm.
Entreposer sur une tagre ou dans une armoire.
ATTENTION :L'thanol est inflammable.
Ether-alcool, fixateur (No 8)
Ether ............................................................................................................... 20 ml
Ethanol 95% ............................................................................................... 20 ml
Ajouter l'ther l'alcool dans une prouvette gradue et mlanger. Verser
dans un bocal bouchon viss ou bouchon de verre rod.
ATTENTION :L'ther est trs inflammable et potentiellement explosif.
Field, colorant de (N 9)
Colorant de Field A
Prparation partir de poudre toute prte :
Poudre de colorant de Field A .................................................................... 5,9 g
Eau distille chaude ................................................................................... 600 ml
Mlanger jusqu' dissolution. Laisser refroidir et filtrer.
Prparation partir de colorants et produits chimiques :
Bleu de mthylne (mdicinal) ................................................................... .1,6 g
Bleu Azur 1 ...................................................................................................... 1,0 g
Hydrognophosphate de disodium (Na2HP04), Anhydre .................. 10,0 g
Dihydrognophosphate de potassium (KH2P04) ................................... 12,5 g
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
1
Ne pas confondre hmatine et hmatine.
102
Dissoudre les deux phosphates dans l'eau. Verser environ la moiti de la solu-
tion de phosphate dans un flacon d'un litre contenant quelques billes de verre.
Ajouter les poudres de colorants et mlanger soigneusement. Ajouter le reste
de la solution de phosphate. Mlanger soigneusement et filtrer.
Colorant de Field B
Prparation partir de poudre toute prte :
Poudre de colorant de Field B ..................................................................... A,8 g
Eau distille chaude ................................................................................... 600 ml
Mlanger jusqu' dissolution. Laisser refroidir, puis filtrer.
Prparation partir de colorant et produits chimiques :
Eosine (jaune, soluble dans l'eau) .............................................................. 2,0 g
Hydrognophosphate de disodium (Na2HP04), anhydre .................... 10,0 g
Dihydrognophosphate de potassium (Kl-hP04) ................................... 12,5 g
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
Dissoudre les deux phosphates dans l'eau. Verser dans un flacon d'un litre.
Ajouter l'osine. Mlanger jusqu' dissolution. Filtrer.
Formol, solutions de (No 10)
Solution de formol 1 0/o pour la conservation des selles
Formol du commerce (formaldhyde neutre, au moins 37%) ........ .100 ml
Eau distille ................................................................................................. 900 ml
Mesurer la solution aqueuse de formol dans une prouvette gradue et la ver-
ser dans un flacon de 1000 ml, bouch l'meri ou muni d'un bouchon viss.
Ajouter l'eau distille et mlanger.
Etiqueter le flacon :FORMOL 10% et inscrire la date. Entreposer sur une
tagre ou dans une armoire. La solution se conservera pendant au moins
deux ans.
Formol 2/o (mthode de concentration pour les
microfilaires)
Formol (formaldhyde neutre, au moins 37%) .................................... 20 ml
Eau distille ................................................................................................. 980 ml
Mesurer la solution aqueuse de formol dans une prouvette gradue et la ver-
ser dans un flacon de 1000 ml, bouch l'meri ou muni d'un bouchon viss.
Ajouter l'eau distille et mlanger.
Etiqueter le flacon :FORMOL 2% et inscrire la date. Entreposer sur une ta-
gre ou dans une armoire. La solution se conservera pendant au moins deux
ans.
ATIENTION :Le formol est corrosif et toxique.
103
ANNEXE2
Giemsa (solution-mre) (No 11)
Le Giemsa est le colorant classique le plus sr pour la coloration de routine des
frottis sanguins (diagnostic du paludisme). Toutefois, la qualit de ce colorant,
dans les solutions prtes l'emploi ou sous forme de poudre, varie selon les
sources d'approvisionnement et il est conseill de se le procurer auprs d'un
fabricant de bonne rputation. Mme dans ce cas, il faut s'assurer de la qualit
du colorant en testant chaque lot ds qu'il a t reconstitu et avant de colorer
un grand nombre de frottis.
Poudre de Giemsa ......................................................................................... 3,8 g
Mthanol ...................................................................................................... 250 ml
Glycrol ........................................................................................................ 250 ml
On utilisera de prfrence un flacon en verre brun mais, si on n'en a pas, on
prendra un flacon en verre blanc pais ou en polythylne, chimiquement pro-
pre et sec, de la taille convenable. Il faut galement environ 50 billes de verre
de 5 mm de diamtre.
1. Introduire les billes de verre dans le flacon ; verser la quantit de mthanol
ncessaire et ajouter le colorant en poudre.
2. Fermer hermtiquement le flacon. Laisser la poudre s'enfoncer lentement
travers le mthanol et se dposer au fond du flacon. Agiter le flacon d'un
mouvement circulaire pendant 2 3 minutes.
3. Ajouter le glycrol et agiter de nouveau. Continuer agiter 2 3 minutes
toutes les demi-heures, au moins 6 reprises.
4. Pendant 2 3 jours, agiter le flacon 3 4 fois par jour jusqu' ce que le colo-
rant soit entirement mlang. Conserver une partie de cette solution-
mre dans un petit flacon pour l'usage courant, afin d'viter toute
contamination de la solution-mre.
Chaque nouveau lot de colorant prpar doit tre correctement tiquet, sa
date de prparation figurant sur l'tiquette, et doit tre test afin de dtermi-
ner la dilution la meilleure et le temps de coloration optimal. Toujours conser-
ver le flacon hermtiquement ferm, dans un endroit frais, l'abri de la
lumire solaire directe. On peut recouvrir les flacons en verre blanc d'une
paisse couche de papier fonc pour viter qu'ils ne soient exposs la
lumire.
Glycrol-vert malachite ou glycrol-bleu de
mthylne, solution de (N 12)
Glycrol ........................................................................................................ 100 ml
Vert malachite en solution aqueuse 3%,
ou bleu de mthylne en solution aqueuse 3% .................................... .1 ml
Eau distille ................................................................................................. .100 ml
Piler de la poudre de vert malachite ou de bleu de mthylne dans un mortier
propre et sec. Peser 3 g de poudre, les verser dans un flacon et complter
100 ml avec de l'eau distille. Boucher le flacon et l'tiqueter : VERT MALA-
CHITE 3% ou BLEU DE MTHYLNE 3%. Entreposer dans une armoire
l'abri de la lumire.
Pour prparer la solution : verser 1 ml de solution 3% dans un flacon de
250 ml. Ajouter 100 ml de glycrol et 100 ml d'eau distille et boucher le fla-
con; mlanger soigneusement avant usage.
104
Acide chlorhydrique-thanol, solution d' (No 13)
Acide chlorhydrique (concentr) ................................................................. 1 ml
Ethanol 95% ............................................................................................. .100 ml
Verser 100 ml d'thanol 95% dans un flacon propre de 250 ml bouch
l'meri. Ajouter 1 ml d'acide chlorhydrique concentr et mlanger.
AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrmement corrosif. L'thanol est
inflammable.
Acide chlorhydrique-mthanol, solution (No 14)
Acide chlorhydrique (concentr) ................................................................. 3 ml
Mthanol absolu ......................................................................................... .100 ml
Verser 100 ml de mthanol absolu dans un flacon propre de 250 ml bouch
l'meri. Ajouter 3 ml d'acide chlorhydrique concentr et mlanger.
AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrmement corrosif. Le mthanol est
inflammable.
Acide chlorhydrique-eau, solution dcolorante
{N 15}
Acide chlorhydrique (HCl), concentr .................................................... 0,5 ml
Eau distille ................................................................................................. .100 ml
Verser l'eau distille dans un flacon de 1000 ml bouch l'meri. Ajouter
l'acide chlorhydrique : mlanger soigneusement.
Etiqueter le flacon : HCl 0,5% et inscrire la date.
AITENTION: L'acide chlorhydrique est extrmement corrosif.
Iode dans l'alcool, solution d' (No 16)
Ethanol 70%, ................................................................................................ 40 ml
Cristaux d'iode ............................................................................... .quelques-uns
Verser l'alcool 70% dans une petite fiole. Au moyen de deux btonnets appli-
cateurs prendre quelques cristaux d'iode et les plonger dans l'alcool. Agiter ou
remuer le mlange et rajouter de l'iode le cas chant, jusqu' ce que la solu-
tion prenne la couleur d'un th fort. Cette couleur est importante.
Cette solution d'iode dans l'alcool a pour but d'liminer les restes de chlorure
mercurique laisss par le fixateur et elle doit donc tre suffisamment forte
pour pouvoir le faire. Si la solution n'est pas assez forte, elle n'liminera pas
ces rsidus qui vont gner l'examen de la prparation. Si elle est trop forte,
l'iode va pntrer dans les protozoaires et empchera la coloration par le tri-
chrome.
Etiqueter le flacon : IODE dans l'ALCOOL et inscrire la date. Cette solution
doit tre renouvele toutes les trois semaines.
105
ANNEXE2
Lugo/ (solution-mre 5%) (N17)
Iode ..................................................................................................................... .5 g
Iodure de potassium (KI) .............................................................................. 10 g
Eau distille ....................................................................................... q.s.p. 100 ml
Peser l'iode dans un creuset en porcelaine ou un verre de montre. Piler l'iode
et l'iodure de potassium secs dans un mortier. Ajouter de l'eau, raison de
quelques millilitres la fois, et piler soigneusement aprs chaque addition
jusqu' ce que l'iode et l'iodure se dissolvent. Verser la solution obtenue dans
une bouteille de verre gradue et complter 100 ml avec de l'eau.
Ou bien: Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dans environ 30 ml d'eau.
Ajouter l'iode et mlanger jusqu' dissolution. Complter 100 ml avec de
l'eau et mlanger soigneusement. Conserver dans un flacon en verre brun.
Lugo/ (solution 1% pour prparations
l'tat frais) (N 18)
La solution-mre de Lugol est trop forte pour le montage des selles fraches.
Elle provoque l'agrgation des matires fcales, pigeant ainsi les parasites qui
deviennent alors invisibles. Par consquent, il faut la diluer.
Lugol (solution-mre 5%) (N 17) ............................................................ 5 ml
Solut physiologique (N 24) ...................................................................... 20 ml
Verser le solut physiologique dans un flacon compte-gouttes. Ajouter la solu-
tion-mre de Lugol 5%. Mlanger soigneusement. On obtient ainsi une solu-
tion d'iode 1% qui permettra de colorer les kystes de faon satisfaisante.
Etiqueter le flacon : LUGOL 1% et inscrire la date. La solution 1% doit tre
renouvele tous les 15 jours.
Bleu de mthylne-phosphate, solution de
{N 19}
Poudre de bleu de mthylne
1
....................................................................... .1 g
Hydrognophosphate de disodium (Naz HP04) ......................................... 3 g
Dihydrognophosphate de potassium (KHz P04) ...................................... 1 g
Eau distille ................................................................................................. 300 ml
Verser la poudre de bleu de mthylne dans un mortier propre et sec. Ajouter
l'hydrognophosphate de disodium et le dihydrognophosphate de potas-
sium. Avec un pilon, piler les poudres de colorant et de phosphate ensemble
et les mlanger soigneusement. Rpartir le mlange en fractions d'1 g que l'on
dposera dans des petits flacons bien bouchs.
Etiqueter les flacons : BLEU DE MTHYLNE-PHOSPHATE et inscrire la
date. Le mlange sec se gardera longtemps si les flacons sont hermtiquement
ferms. Entourer le bouchon de ruban adhsif afin d'viter toute humidifica-
tion.
1
On prendra de prfrence de la poudre de bleu de mthylne mdicinal, mais tout bleu de mthylne de bonne
qualit peut convenir.
106
Pour prparer la solution
Verser 1 g du mlange dans une fiole de 500 ml. Ajouter l'eau distille et agiter
la fiole ou remuer avec une baguette de verre pour dissoudre le mlange colo-
rant. Filtrer travers un papier-filtre dans un flacon de 500 ml propre, sec et
bouch l'meri.
Etiqueter le flacon : SOLUTION DE BLEU DE MTHYLNE-PHOSPHATE et
inscrire la date. Entreposer dans une armoire, l'abri de la lumire. Cette solu-
tion se conservera au moins deux ans.
Bleu de mthylne-solut physiologique
{N 20)
Bleu de mthylne ......................................................................................... 0,1 g
Solut physiologique ................................................................................. .100 ml
Verser le bleu de mthylne dans un flacon propre. Ajouter le solut physio-
logique et mlanger jusqu' ce que les cristaux de colorant soient complte-
ment dissous.
Pour l'utiliser :Filtrer une petite quantit de solution colorante dans un flacon
compte-gouttes.
Iodure de potassium 10%, solution d' ( ~ 21)
Iodure de potassium (KI) ........................................................................ .100 mg
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
Peser l'iodure de potassium. Verser l'eau distille dans un flacon propre bou-
ch l'meri. Dissoudre l'iodure de potassium dans l'eau.
tiqueter le flacon : IODURE DE POTASSIUM 10% et inscrire la date.
(Entourer le bouchon d'un morceau de papier ou d'une ficelle pour viter qu'il
ne colle.) Conserver dans une armoire ou sur une tagre, l'abri de la
lumire. Aprs avoir repos, la solution peut lgrement jaunir, ce qui n'a
aucune incidence sur la qualit.
APV, mlange fixateur l' (No 22)
NOTE : Cette prparation doit tre effectue dans un laboratoire de niveau
intermdiaire en raison du danger que prsentent les ractifs.
Fixateur de Schaudinn modifi
Cristaux de chlorure mercurique (HgCh) .................................................. 1,5 g
Ethanol 95% ............................................................................................ 31,0 ml
Acide actique glacial ................................................................................ .5,0 ml
Dissoudre le chlorure mercurique dans l'thanol dans une fiole bouche (50 ou
125 ml) en remuant de temps en temps d'un mouvement circulaire. Ajouter
l'acide actique, reboucher et mlanger d'un mouvement circulaire.
ATTENTION: Le chlorure mercurique est extrmement toxique. L'acide acti-
que glacial est extrmement corrosif.
107
ANNEXE2
Mlange l' APV
Glycrol ......................................................................................................... .1,5 ml
Poudre d'alcool polyvinylique (APV) (de faible viscosit) .................... 5,0 g
Eau distille ................................................................................................ .62,5 ml
Dans un petit bcher, verser le glycrol sur la poudre d' APV et mlanger soi-
gneusement l'aide d'une baguette de verre, jusqu' ce que toutes les particu-
les paraissent recouvertes de glycrol. Transvaser le mlange dans une fiole de
125 ml. Ajouter l'eau distille, boucher et laisser temprature ambiante pen-
dant 3 heures ou toute la nuit. Agiter de temps en temps pour mlanger.
La poudre d' APV et les solutions fixatrices l' APV existent dans le commerce.
On trouve sur le march des poudres d' APV de qualits diverses, mais les plus
satisfaisantes pour prparer le mlange fixateur pour les protozoaires sont cel-
les qui sont fortement hydrolyses et qui ont une viscosit faible ou moyenne.
Solution de travail de mlange fixateur I'APV
1. Chauffer un bain-marie (ou un grand bcher rempli d'eau) jusqu' 70-75 C.
Ajuster la chaleur de manire maintenir cette temprature.
2. Couvrir (sans la boucher compltement) la fiole contenant le mlange
l' APV et la mettre au bain-marie pendant environ 10 minutes en la
remuant frquemment d'un mouvement circulaire.
3. Lorsque la poudre d' APV semble p r e s q u ~ entirement dissoute, verser
dessus la solution de Schaudinn modifie, reboucher et remuer pour
mlanger.
4. Continuer remuer le mlange au bain-marie pendant 2 3 minutes afin
de dissoudre le reste d' APV, de permettre aux bulles de s'chapper et la
solution de devenir limpide.
5. Enlever la fiole du bain-marie et la laisser refroidir. Conserver le mlange
fixateur l' APV dans un flacon bouchon viss ou bouch l'meri. Ins-
crire sur l'tiquette: FIXATEUR l'APV et la date. Le fixateur se conser-
vera 6 12 mois.
Pour le mlange, il est souhaitable de disposer d'un agitateur haute vitesse
qui provoquera un tourbillon dans la solution.
Safranine, solution de (N 23)
Solution-mre
Safrartine 0 ...................................................................................................... .2,5 g
Ethanol 95% ............................................................................................. .100 ml
Peser la poudre de safranine et la dissoudre dans les 100 ml d'thanol. Conser-
ver dans un flacon tiquet.
Solution de travail
Solution-mre ............................................................................................... .10 ml
Eau distille ................................................................................................... 90 ml
Solut physiologique (No 24)
Chlorure de sodium (NaCl) ......................................................................... 8,5 g
108
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
Peser le chlorure de sodium. Verser l'eau distille dans un flacon propre bou-
ch l'meri. Dissoudre le chlorure de sodium dans l'eau et mlanger soigneu-
sement. Entourer le bouchon d'une ficelle ou d'une bande de papier pour
viter qu'il ne colle au flacon.
Etiqueter le flacon: SOLUT PHYSIOLOGIQUE et inscrire la date. Conserver
sur une tagre ou dans une armoire. En verser dans un flacon compte-gouttes
pour l'usage courant. Inscrire la date sur l'tiquette. Ce flacon compte-gouttes
doit tre muni d'une pipette avec poire en caoutchouc.
Schaudinn, fixateur de (No 25)
NOTE : Ce fixateur doit tre prpar dans des laboratoires de niveau interm-
diaire en raison du danger prsent par les ractifs.
Solution-mre
Chlorure mercurique, solution aqueuse sature (HgCh)
1
.................... 600 ml
Ethanol 95% ............................................................................................. 300 ml
Verser la solution aqueuse sature de chlorure mercurique dans un flacon
d'un litre bouch l'meri. Ajouter l'thanol 95% et mlanger en agitant le
flacon.
Etiqueter le flacon: FIXATEUR DE SCHAUDINN- SOLUTION-MRE et ins-
crire la date. La solution-mre se conserve indfiniment (au moins un an).
Solution de travail pour la coloration
Solution-mre de fixateur de Schaudinn ................................................ 100 ml
Acide actique glacial (CH3COOH) ............................................................ 5 ml
Verser la solution-mre dans un flacon de 250 ml bouch l'meri. Ajouter
l'acide actique glacial et mlanger en agitant le flacon.
Etiqueter le flacon: FIXATEUR DE SCHAUDINN +ACIDE ACTIQUE, et
inscrire la date. Cette solution se conserve 2 3 mois.
ATTENTION :Le chlorure mercurique est extrmement toxique. L'acide acti-
que glacial est extrmement corrosif et l'alcool thylique est inflammable.
Citrate de sodium 2%, solution de (No 26)
Cristaux de citrate de sodium (C6HsNa3. 2H20) ........................................ 20 g
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
Verser l'eau distille dans un flacon propre (bouch l'meri ou bouchon
viss). Peser les cristaux de citrate de sodium et les verser dans l'eau. Mlanger
jusqu' dissolution.
1
Verser environ 80 g de chlorure mercurique cristallis dans 1 000 ml d'eau distille et chauffer pour dissoudre
les cristaux. Laisser refroidir. La solution est sature lorsque des cristaux se forment au fond de la fiole.
109
ANNEXE2
Etiqueter le flacon: CITRATE DE SODIUM 2% et inscrire la date. Conserver
sur une tagre ou dans une armoire. La solution se conserve au moins un an.
Trichrome, solution de (IJO 27)
Chromotrope 2R ............................................................................................. 6,0 g
Vert lumire SF ............................................................................................... 1,5 g
Vert solide FCF ............................................................................................... 1,5 g
Cristaux d'acide phosphotungstique (H3[P04(W12036)]. 5H20 ................ 7 g
Acide actique glacial (CH3COOH) .......................................................... 10 ml
Eau distille ............................................................................................... .1000 ml
Peser chaque colorant sparment et les verser dans une fiole d'l litre.
Peser les cristaux d'acide phosphotungstique, et les ajouter aux colorants. Me-
surer l'acide actique glacial et le verser dans le flacon. Agiter la fiole de
manire que l'acide actique mouille bien tous les colorants. Laisser reposer
30 minutes. Ajouter l'eau distille et mlanger. Verser le colorant dans un fla-
con propre d'un litre bouch l'meri.
Etiqueter le flacon: TRICHROME et inscrire la date. Conserver sur une tagre
ou dans une armoire, l'abri de la lumire. Une bonne solution de trichrome
possde une couleur violet-fonc noir. Ce colorant se conserve au moins un an.
ATTENTION: L'acide actique glacial est extrmement corrosif.
110
ANNEXE 3
Prparation des milieux de culture
Milieu de Schneider
enrichi pour la culture in vitro de Leishmania
Matriel
Milieu de Schneider pour Drosophila
1
....................................................... 80 ml
Srum de ftus de veau
1
............................................................................ 20 ml
Solution antibiotique-antifongique
1
........................................................ 1,2 ml
La solution antibiotique-antifongique contient de la pnicilline, de la strepto-
mycine et de l' amphotricine.
Prparation
1. Inactiver le srum de ftus de veau pendant 30 minutes 56C et laisser
refroidir.
2. Mlanger 20 ml de ce srum inactiv 80 ml de milieu de Schneider.
3. Ajouter 1,2 ml de la solution antibiotique-antifongique, mlanger, rpartir
aseptiquement ce milieu en fractions de 3 ml dans des tubes striles de
16 x 100 mm et boucher.
4. Etiqueter et congeler - 20C. Ce milieu peut se conserver jusqu' un an
- 20C, mais seulement 6 semaines 4- 6C.
NOTE : La prparation du milieu doit se faire dans des conditions rigoureuses
d'asepsie.
Utilisation
1. Rchauffer 2 tubes de milieu temprature ambiante.
2. Inoculer chaque tube avec 0,1 ml de prlvement.
3. Laisser incuber les cultures 24C ( 2C), dans l'obscurit, pendant
14 jours. La temprature ambiante convient en gnral.
4. Examiner 1 lame par jour la recherche de formes promastigotes. Pour
cela, prlever une goutte de culture l'aide d'une anse de platine et la
dposer sur une lame. Recouvrir d'une lamelle et rechercher les promasti-
gotes mobiles flagells.
NOTE : Les cultures ngatives doivent tre repiques au bout de 4 jours dans
du milieu frais, et nouveau examines tous les jours pendant encore 10 jours.
Milieu de Novy, McNeal et Nicolle (NNN)
pour la culture in vitro de Leishmania
Matriel
Blood agar base Difco
2
............................................................................ 8 g
1
Tous les ingrdients peuvent tre commands Pasteur Diagnostic Sanofi, 3, boulevard Raymond Poincar,
BP 3, F-92430 Marnes-la-Coquette, France.
2
On peut se la procurer auprs de Difco Laboratories, PO Box 10587, Detroit, Michigan 48233, Etats-Unis
d'Amrique.
111
ANNEXE3
Eau distille ................................................................................................. 200 ml
Sang de lapin dfibrin .......................................... 0,6 ml pour 5 ml de milieu
Prparation du sang de lapin dfibrin
Recueillir 20 ml de sang de lapin dans une fiole strile contenant environ
100 billes de verre de 4 mm de diamtre. Dfibriner le sang l'aide d'un agi-
tateur rotatif pendant 5 minutes. Ajouter 200 UI de pnicilline, 200 mg de gen-
tamicine et 2 mg de streptomycine par ml de sang dfibrin.
Prparation
1. Verser 200 ml d'eau dans une fiole, ajouter la glose, mlanger et chauffer
la fiole dans de l'eau bouillante jusqu' ce que la glose soit compltement
dissoute.
2. Rpartir le milieu en fractions de 5 ml dans des tubes essais bouchon
viss (contenance 20 ml). Striliser l'autoclave (bouchons dvisss lg-
rement) 121 oc pendant 15 minutes et laisser la glose refroidir jusqu'
45- 50C.
3. Ajouter 0,6 ml de sang de lapin dfibrin strile dans chaque tube et
mlanger doucement. Laisser le milieu se solidifier dans les tubes en incli-
nant ces derniers.
4. Laisser les tubes debout temprature ambiante pendant 24 heures, pour
que la condensation puisse se faire. Les tubes doivent tre ensuite conser-
vs 4- 6 C jusqu' ce qu'ils soient utiliss.
NOTE: Ce milieu doit tre prpar dans des conditions rigoureuses d'asepsie.
Utilisation
1. Inoculer aseptiquement environ 0,1 ml d'chantillon dans le liquide de
condensation de deux flacons temprature ambiante.
2. Incuber les cultures 24 ( 2C) l'obscurit.
3. Examiner tous les 4 jours. Pour cela, prlever une goutte de culture au
moyen d'une anse de platine strile et la dposer sur une lame pour
rechercher les promastigotes.
NOTE : Les cultures ngatives doivent tre repiques au bout de 8 jours sur un
milieu frais, puis examines tous les 4 jours pendant encore 20 jours.
112
ANNEXE 4
Nettoyage et conservation
des lames porte-objets
Nettoyage
Il convient d'insister sur la ncessit de disposer de lames de verre propres et
de bonne qualit pour prparer les talements de sang destins un examen
microscopique. Toutes les lames doivent tre parfaitement propres et
dbarrasses de toute graisse ou humidit. Cela permettra d'viter la plupart
des artfacts qui gnent le diagnostic du paludisme, et empchera que les
gouttes paisses ne se dtachent et soient perdues en cours de coloration. Il
faut rejeter toutes les lames dfectueuses, c'est--dire:
celles qui prsentent des parties irises ou un aspect dpoli;
- les lames mal nettoyes, qu'elles soient neuves ou anciennes;
les vieilles lames rayes ou brches.
Lames neuves
Il est plus prudent de nettoyer toutes les lames neuves (y compris les lames
prnettoyes que l'on trouve dans le commerce) en les trempant dans de Y eau
additionne d'un bon dtergent
1
, puis en les rinant l'eau courante, ou en les
changeant plusieurs fois d'eau en quelques heures. Chaque lame doit tre
essuye avec un chiffon sec et propre, non pelucheux. Toujours manipuler les
lames propres par leurs bords pour viter les empreintes digitales.
Lames usages
Avant de les laver on fera tremper les lames usages dans une solution
d'hypochlorite pendant au moins 60 minutes. On les lavera ensuite l'eau
chaude savonneuse, en brossant bien leurs deux faces. N'en laver que quel-
ques unes la fois pour viter de les rayer ou de les brcher. Les frotter une
par une avec de la gaze ou du coton. Puis les tremper dans une solution frache
de dtergent, les rincer l'eau courante, ou les changer plusieurs fois d'eau,
avant de les scher avec un chiffon de coton propre. Les lames lgrement
rayes qui ne sont pas utilisables pour les frottis sanguins peuvent tre trans-
mises la section d'entomologie pour l'usage courant.
Conservation des lames
En climat tropical humide, les lames de verre ne doivent pas tre conserves
dans les conditions ambiantes pendant plus de quelques semaines. Autre-
ment, elles vont se coller les unes aux autres en raison de l'humidit et elles
perdront de leur transparence cause du phnomne de dpolissage. Aprs
les avoir nettoyes, le mieux est de les conserver dans un endroit sec ou dans
une armoire chauffante.
Il est recommand de conserver les lames propres par paquets de 10, envelopps
dans du papier fin et attachs avec du ruban ou avec un lastique, prtes l'emploi.
Les paquets de lames peuvent tre rangs dans les botes en carton d'origine,
ou dans toute autre bote servant Y expdition ou au transport, mais il faut
les protger avec du carton ondul, du polystyrne expans ou du coton.
1
Il est dconseill d'employer du bichromate-acide comme solution de nettoyage.
113
Index
APV (voir aussi alcool polyvinylique)
mlange fixateur l' 107-108
Acmztlumzoeba 78
Acide, chlorhydrique-eau, solution dcolo-
rante 103
chlorhydrique-thanol, solution d' 105
Alcool, acide actique, solution dcolorante
99
polyvinylique (APV), matriel fix l'
19,22-23,30
pour fixer les prlvements de selles 19,
22-23,30
Ascaris
ufs 29, 69, 71
Balantidium coli,
forme vgtatives 80, 81
kystes 80-81
Bilharzioses
diagnostic 16,26---29,34
intestinales 71, 72
dimensions relatives des oeufs 71
talement pais de matire fcale sous
cellophane pour le diagnostic, techni-
que de Kato-Katz 26---29
larves, caractristiques 72
en solut physiologique 13-14
identification 72
ufs, en solut physiologique 13-14
identification 69-71
stade de dveloppement 69
recherche, dans les prlvements d'uri-
nes 34-37
dans les prlvements de selles 16,
26---29
Blastocystis hominis 24, 78
Bleu de mthylne tamponn 99
prparation, l'tat frais 11, 13, 15,74
Bleu de mthylne-phosphate, solution de
106---107
Bleu de mthylne-solut physiologique 107
Bru gia malayi
caractristiques 93, 94
moments auxquels le prlvement de
sang doit tre fait sei
Cellules
flammes vibratiles 37
de pus dans les prlvements de selles
82
pithliales dans les prlvements de
selles 81-82
Ccit des rivires (voir Onchocerca volvulus)
Chilomastix, kystes, identification 77
Chilomastix mesnili, formes vgtatives, identi-
fication 77, 79
Chloroquinorsistance 49-30
Chromatine, dans Entamoeba 15, 74, 76
dans les Plasmodium 47, 48
Citrate de sodium 2 %, solution de 109-110
Clonorchis sinensis, ufs 71
Colorant
de Field A 102
de Field B 103
Colorants 97-98
prparations (voir les colorants individuels)
115
Coloration, l'hmatoxyline de Delafield,
pour la mise en vidence des microfilaires
46, 47, 92,94
au Giemsa 41, 44--45, 48
pH 48,62
prparation 41, 48
au trichrome 19-25,73
caractristiques des protozoaires 73
ractifs ncessaires 98
deField 40
frottis minces 45
gouttes paisses 45
Conservation, des lames porte-objets 113
des prlvements de selles 30--31
des ractifs (voir les ractifs individuels)
Contrle de la qualit, des examens coprolo-
giques 31-32
des prlvements de selles 31-32
Cristallodes 25, 75
Cryptosporidium 80-81
oocystes, techniques de coloration per-
manente 17-18
Cytoplasme de Trypanosoma 50, 85,92
Dsinfectants pour le nettoyage des surfaces
de travail 2
Dtermination de la taille des parasites 8
Dientamoeba fragilis, formes vgtatives 76
Digestion par la collagnase 66
Diphyllobothrium latum, ufs 71
Ecouvillonnage anal, la recherche des
ufs d'oxyures 25-26
Elimination, des lames porte-objets 3
des prlvements 2-3
Endolimax nana
formes vgtatives 76
kystes 77
Entamoeba hart1nanni
formes vgtatives 76
kystes 77,78
Entamoeba coli
formes vgtatives 74
identification 76
kystes
cristallodes 75
dans les talements colors au trichrome
24
identification 75, 77,78
Entamoeba histolytica
formes vgtatives 73, 74
identification 73-75, 76, 77
kystes, cristallodes 75
Enteromonas hominis
formes vgtatives 79
kystes 77
Enterobius vennicularis
couvillonnage anal 25-26
ufs, identification 70
Epreuve d'immunofluorescence indirecte,
(IFl) 63
Etalement pais de matires fcales sous cel-
lophane, technique de Kata-Katz 26---29
Ethanol 70% 102
Ether-alcool, fixateur 102
Ether, prcautions 17
INDEX
Field, colorant de 102-103
Fascia/a hepatica
ufs 71
Fascialapsis buski
ufs 71
Filtres, examen d'urines 35
Fixateur de Schaudinn modifi 107
Fixer les frottis sanguins 44, 48
Formes vgtatives
d'amibes (voir aussi les diffrentes esp-
ces) 73-75
dgnrescence 31
caractristiques dans diffrents colorants
73
dans les prlvements de selles 9, 10,
14--15
identification 73-75, 76
problmes 81
mobilit 14, 73-74
de flagells, caractristiques dans diff-
rents types de prparations 73
dans le systme gnito-urinaire 39
identification 78, 79
motilit 14, 78
Formol, solutions de 103
2 %, mthode de concentration pour les
microfilaires 103
-ther, technique de concentration 16
Fragments cutans 64
Frottis de sang frais
pour la recherche des microfilaires 59
pour la recherche des trypanosomes 51-52
Frottis sanguins 41-52
coloration, au Giemsa 44-45
l'hmatoxyline de Delafield 46-47
deField 45
contrle de la qualit 47-48
examen 46-47, 52
prparation 41-43,51
Fuchsine phnique, solution de 101
Giardia intestinalis 77, 79, 80
Giardia
kystes 77
Giemsa (solution-mre) 104
Glycrol-vert malachite ou glycrol-bleu de
mthylne, solution de 104
Glycogne 24, 73
Granulation, chromatique 15
de Schffner 44, 47, 48, 83
Helminthes, larves, identification 72
ufs, identification 69-71
Heterophyes heteraphyes
ufs 71
Hmaties, dans les talements colors 24--25,
74
Hmatoxyline de Delafield 101-102
Hmaturie 34
Hymenalepis diminuta
ufs 71
Hymenalepis nana
ufs 71
Iadamaeba btschlii
formes vgtatives, identification 76
kystes, identification 76
Iode dans l'alcool, solution d' 105
Iodure de potassium 10 %, solution d' 107
Isaspora belli
oocystes 80--81
116
Kato-Katz, ncessaire 28
technique, talement pais de matires
fcales sous cellophane 26-29
Kystes
d'amibes, (voir aussi les diffrentes esp-
ces) 73, 75-78
caractristiques dans diffrents colorants
73
danslesprelvementsdeselles 9-10,14--17
problmes 81
flagells, (voiraussilesdiffrentesespces)
caractristiques dans diffrents types
de prparations 73
identification 77, 78, 79
Lames porte-objets, conservation 113
limination 3
nettoyage 113
Leishmania
amastigotes 60, 62
degr de densit 63
promastigotes 60,62
recherche dans la rate 60--62
tests ilnmunologiques pour 63
Liquide cphalo-rachidien (LCR), recherche
des trypanosomes 57-59
Laa laa,
sang doit tre fait 59
Lugol, solution 1 % pour prparations
l'tat frais 106
solution-mre 5 % 106
Macrophages dans les prlvements de selles
81-82
Mansanella azzardi
Mansanella perstans
Mansanella streptacerca
Matriel de parasitologie diagnostique 96-97
Mlange l' APV 108
Membrane ondulante, des trypanosomes 50, 92
Metaganimus yakogawai
ufs 71
Mthanol, fixation du frottis mince 44, 48
Mthode, de filtration la seringue, pour les
examen d'urines 35-37
de sdimentation des urines 34-35
Mthodes de coloration, contrle de la qualit
32-33,47-48
frottis sanguins 41-48
prlvements de selles 17-24
Micro-technique de centrifugation/ change
d'anions (rn-AECT) 53-55
Microfilaires, identification 92-94
prlvements de sang la recherche de 59
recherche 40
dans le sang capillaire 60
dans le sang veineux hmolys 60
dans les frottis sanguins 45-46,59
Microhmatocrite 52-53
Micromtre oculaire 8
Microscope, entretien 7
talonnage 8
prvention des moisissures 7
Milieu, de Novy, McNeal et Nicolle (NNN)
INDEX
pour la culture in vitro de Leishmania
111-112
de Sclmeider enrichi pour la culture in
vitro de Leishmania 111
Miracidiwn, dans les ufs de S. haematobium
37
Naegleria 78
Nettoyage, lames porte-objets 113
surfaces de travail 2
Nodules sous-cutans, onchocercose 64
Onchocerca volvulus
recherche dans les prlvements cuta-
ns 64-65
Oocystes, Cryptosporidium 17-18, 80-S1
Isospora belli 80--81
Opistlrorchis felin eus
ufs 71
Paragonimus westennani,
ufs 71
Parasites (voir aussi les diffrentes espces)
intestinaux 69--82
sanguins 83-94
comptage 84, 85
Parasitologie diagnostique, matriel de 96-98
pH du colorant au Giemsa 48, 62, 92, 94,97
Plasmodium, (voir aussi les diffrentes espces)
caractristiques morphologiques 84, 85
comptage 84, 85
identification 48-49,83-91
recherche dans les frottis sanguins 40,
48--50,83-84
stade annulaire 84
structures 48-49
Plasmodium falcipantm
caractristiques morphologiques 84, 85, 87
chloroquinorsistance 49-50
parasitmie 84
stade annulaire 84
Plasmodium malariae
Plasmodium ovale
Plasmodium vivax
Ponction, de la rate, teclmique spciale
pour la recherche des Leishmmzia 61-62
veineuse 47
Ponction-biopsie, de moelle osseuse, la
recherche de Leishmania 60-61
des ganglions lymphatiques, la recher-
che de Leishmania 61
la recherche de trypanosomes 55-57
Prlvements
117
cutans 64-65
examen 65
de sang 2, 40-63
prcaution pour la manipulation 2
de selles 9-10,30
coloration 17-25
conditions de conservation 10, 32
conservation 27-30, 103
consignes de scurit pour la manipula-
tion 2
consistance 10, 12
diffrentes sortes de parasites trouvs 9
limination 29-30
emballage pour le transport 30
tiquetage 9, 31
examen 1G-15, 32
macroscopique 10
microscopique 1G-13
mucus dans les 10, 12
rcipients 9, 30
teclmique de concentration 16--17,33
des urines 34
consignes de scurit pour la manipula-
tion 3
examen 34-37
manipulation des 2-3
sur cellophane 25-26
urtraux 38
examen 38--39
vaginaux 38
centrifugation/ sdimentation 38--39
examen 38--39
Prparation, l'tat frais, contrle de la qualit 31
limination des lames porte-objets uti-
lises 29
examen 13
identification des protozoaires 14-15
l'iode 10, 11-12
caractristiques des protozoaires 73
indications 11-12
kystes, d'amibes 15,75-76,78
flagells 15, 77, 78
du sang de lapin dfibrin 112
Protozoaires, dans les prparations l'tat
frais 14-15
identification, (voir aussi les diffrentes
espces) 73--82
problmes 81-82
teclmique de coloration au trichrome
19-24
Retortamonas intestinalis
formes vgtatives, identification 79
kystes, identification 77
Ractifs 97-98
prparation des 32
Schaudinn, fixateur de 109
Safranine, solution de 108
Schistosoma haematobium
intensit de l'infestation 36, 37
ufs,
recherche dans les prlvements d'urines
34-37
Schistosoma intercalatum
ufs 29
Schistosama japonicum
ufs 29,71
Schistosama mansoni
ufs 29,71
Scurit au laboratoire 2-3
Solut physiologique 108--109
prparation l'tat frais 10-12
formes vgtatives, d'amibes 73-74,76
de flagells 73, 77
identification des parasites 13-15
kystes d'amibes 73,75-76
prparation 11
Solution, d'actate de sodium 99
d'acide actique 99
de formol 10% pour la conservation des
selles 103
de travail de mlange fixateur l' APV 108
de travail pour la coloration 99-100
Strongyloides stercoralis
larves 72
INDEX
dans les prparations en solut physio-
logique 13
identification 72
Taches de Maurer 44, 47, 48
Taenia,
dcel dans les prlvements de selles 16
ufs 71
Tampons pour la coloration des Plasmodium
100
Technique, la safranine-bleu de mthylne
18-19
de concentration, contrle de la qualit 33
prlvements de selles 16-17
de Kato-Katz 26-29
de Ziehl-Neelsen modifie 18
Techniques immunologiques, pour Toxoplasma
gondii 81-82
pour Leishmania 63
Titrage immunoenzymatique (ELISA) pour
Leishmania 63
Toxoplasma gondii
diagnostic de laboratoire 81-82
Toxoplasmose 81
Trichomonas vaginalis 38, 39
Trichomonas hominis
formes vgtatives
identification 79
prparations l'tat frais en solut phy-
siologique 79
Trichostrongylus
ufs 71
118
Trichrome, solution de 110
Trichuris
ufs, dimensions 71
talement pais sous cellophane 29
Trypanosoma brucei
structure morphologique 50-51, 92
Trypanosoma cruzi
structure morphologique 50-51, 92
Trypanosoma rangeli 92
Trypanosomes, identification 85--92
recherche, dans le liquide cphalorachi-
dien (LCR) 50,57-59
dans le sang 40, 50-55
dans le suc ganglionnaire 55--57
Urines contaminant les prlvements de selles
10
Wuchereria bancrofti
Xylne phniqu, solution de 101
Ziehl-Neelsen, technique de, modifie 18
Imprim en France. -JOUVE, 18, rue Saint-Denis, 75001 PARIS
No 247782V.- Dpt lgal :Juin 1997

OMS.93 Parasitologie Med Tech Base Labo 9242544108

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