Quantificar a protena em cada uma das fraces de YtfG obtidas na purificao:

Mtodo do BCA para quantificao de protena

A curva padro foi feita com BSA (protena albumina do soro bovino)
Protocolo

curva padro [prot] Abs ng/ul 562nm 0 0,07 30 0,125 120 0,278 250 0,438 500 0,805 750 1,058 1000 1,311 0 0,075 30 0,132 120 0,246 250 0,47 500 0,776 750 1,055 1000 1,278

Preparar uma soluo de padro de protena a 1 mg/ml (diluir 1 / 80 a soluo stock 80 mg/ml : 10 + 790) [protena] H20 padro branco 40,0 Preparar o reagente por 30 38,8 1,2 mistura 50 + 1, protegido da 120 35,2 4,8 Adicionar 800 ul de reagente a 250 30,0 10,0 40 ul de amostra. Vortex. 500 20,0 20,0 Incubar 30 min a 37 C. 750 10,0 30,0 Ler a absorvncia a 562 nm 1000 40,0

YtfG YtfG YtfG

A B C

dil 10 20 10

Abs 1,234 1,47 1,07

dil 10 20 10

Abs 1,48 1,87 0,946

[conc.] ug/ul 10,08 25,24 7,25

uM 339,2 849,1 244,1

A concentrao em uM foi calculada usando a Massa Molecular prevista da protena (29700 Da).

Determinao do coeficiente de extino a 280 nm da protena YtfG

Traou-se o espectro fe absoro das fraces YtfG A e B diludas 1/10. Registaram-se apenas bandas de absoro na regio dos 280 nm, com picos mximos a 280 nm. Amostra Abs (280nm) YtfG A 1,78 YtfG B 2,72 Sabendo que as protenas estavam diludas 1/10 e que o percurso ptico (l)da cuvette 1 cm, determine o coeficiente de absortividade () de cada fraco, faa a mdia para obter o da protena YtfG em M-1 cm-1 Lei de Lambert-Beer : Abs = c . . l

Medir a reaco enzimtica de oxidao de NADPH usando um aceitador de electres no especfico (o ferricianeto)
A reaco feita em tampo fosfatos de potssio 20mM pH 7.5, e na presena de ferricianeto de potssio (1mM) e NADPH (1mM). A reaco incubada a 25C e seguida por espectrofotometro, ao comprimento de onda 420 nm ao qual o ferricianeto absorve com um coeficiente de absortividade de 1020 M-1cm-1.
Cada reaco feita num volume final de 1 ml. Esquema da reaco catalizada pelo YtfG: YtfG

NADPH

ferricianeto

NADP

ferrocianeto

Cada ensaio enzimtico iniciado com o tampo, o ferricianeto e NADPH. Aps 90 s, adiciona-se a protena. A actividade enzimtica corresponde ao consumo de ferricianeto por min, aps retirar o declive (consumo de ferricianeto) da actividade qumica.

Foram efectuados ensaios enzimticos para a YtfG fraco A e fraco B obtidas na purificao Actividade NADPH:ferricianeto oxidoreductase declive (Abs/min) Actividade Actividade especifica YtfG - A branco amostra vol.YtfG umol/min umol/min umol/min /umol /mg protena protena #1 0,0392 0,2103 41,5 #2 0,0386 0,2509 41,5 #3 0,0386 0,3244 62

declive YtfG - B branco #1 #2 #3 #4 0,0346 0,0346 0,0345 0,0345

(abs/min) amostra Vol. YtfG 0,0609 0,0864 0,0951 0,1359 11,8 23,6 23,6 47,2

Actividade umol/min

Actividade especifica umol/min umol/min /mg protena /umol protena

Foram feitos estes ensaios. Calcule a mdia da actividade especfica e diga qual a preparao de protena YtfG com maior actividade especfica.