1.

INTRODUCERE
Biotehnologia poate fi considerat ca o ramur a tehnologiei, care rezult din utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i a tehnologiei chimice, n scopul exploatrii economice i orientate a potenialului biochimic al sistemelor biologice (microorganisme, esuturi vegetale i animale, fracii microbiene). Federaia European de Biotehnologie definete biotehnologia ca fiind aplicarea integrat a tiinelor naturale i inginereti n scopul utilizrii tehnologice a organismelor vii, celulelor sau a unor pri ale acestora pentru obinerea de bunuri i servicii. Biotehnologia se ocup, deci, de transpunerea proceselor biologice n cadrul unor producii industriale, necesitnd temeinice cunotine nu numai tehnice, dar i cunotine referitoare la microorganismele industriale, la microbiologia lor i la principiile chimice ale schimbului lor de substane. De aici rezult, pe de o parte, complexitatea domeniului, care presupune o intreptrundere a tiinelor tehnice i ale naturii, dar, pe de alt parte, i fascinaia domeniului, care datorit multiplelor sale aspecte, permite rezolvarea unor mari probleme ale umanitii, cum ar fi asigurarea necesarului de hran i proteine, obinerea de substane cu aciune farmacologic, protecia biologic a plantelor, protecia mediului nconjurtor prin prelucrarea avansat a deeurilor i epurarea apelor reziduale i multe altele. Caracterul inter- i multidisciplinar al biotehnologiei este prezentat n figura 1.1.
Chimie, Biochimie Biologie molecular Genetic Microbiologie Inginerie de proces Tehnologie alimentar

Biotehnologie

Industrie energetic, Mediu

Industrie chimic

Industrie alimentar

Agricultur, Nutriie

Medicin, Diagnosticare

Figura 1.1. Biotehnologia domeniu interdisciplinar

Biotehnologia nu reprezint o noutate pentru sectorul alimentar sau agricol, ntruct oamenii, de secole, au exploatat sistemele vii pentru producerea, procesarea i conservarea alimentelor. Microorganismele (bacterii, drojdii i ciuperci) au fost utilizate nc de la nceputuri pentru obinerea alimentelor fermentate, a produselor din carne i vegetale, respectiv a buturilor fermentate, cum este berea i vinul. Multe ingrediente utilizate n alimente, ca vitamine, stabilizatori, arome, ntritori de arome, colorani i conservani sunt produse, de asemenea, de ctre microorganisme. La acestea se poate aduga utilizarea microorganismelor la degradarea deeurilor rezultate la procesarea alimentelor. Termenul de fermentaie provine de la verbul latin fervere - a fierbe, care descrie efectul aciunii drojdiilor asupra extractelor de fructe sau de cereale ncolite, aspectul de fierbere fiind datorat degajrii bulelor de dioxid de carbon, rezultat din descompunerea anaerob a zaharidelor din extract. Termenul s-a extins cu rapiditate i s-a diversificat. Semnificaia biochimic se refer la generarea de energie prin catabolizarea compuilor organici, n timp ce semnificaia termenului n microbiologia industrial este mult mai larg . Catabolismul zaharidelor este un proces oxidativ ce conduce la obinerea de acid piruvic, care necesit reoxidare pentru ca procesul s continue. n condiii aerobe reoxidarea are loc prin transfer de electroni, proces n care oxigenul joac rol de acceptor terminal de electron. n condiii anaerobe, oxidarea este cuplat cu reducerea unui compus organic, care adesea, la rndul su este un produs de catabolism. Reducerea acidului piruvic poate avea loc pe diferite ci microbiene, obinndu-se o gam larg de produi finali, aa cum rezult din schema prezentat n figura 1.2. Microbiologia industrial a extins termenul de fermentaie pentru descrierea oricrui proces de obinere a unui produs prin cultur n mas de microorganisme. Procesele fermentative se caracterizeaz printr-o continu expansiune, att n ceea ce privete numrul de produse obinute, ct i al volumului produciei. Dei numrul proceselor fermentative studiate este de ordinul miilor, importan industrial prezint doar cteva sute, care pot fi mprite n cinci categorii: 1. biomase (drojdii, biomase proteice); 2. 3. metabolii primari i secundari (acizi organici, amino-acizi, antibiotice, vitamine); produse de bioconversie (transformarea unor substane sau grupe de substane n altele sub aciunea microorganismelor, exemplu obinerea de steroizi); 4. enzime microbiene (amilaze, lipaze, proteaze etc.); 5. produse obinute prin modificri genetice de microbi (proteine terapeutice, polipeptide, hormoni). 2

Acetat

Acetil-CoA
CO2 2H CO2 2H

B
Acrilat
H2O

A
Lactat
CO2

2H

C
Acetaldehida Etanol

PIRUVAT

F
CO2

Oxalacetat

2H

Acetolactat

B
2H

D
Malat

F
Acetoina

CO2

Fumarat

Formiat + Acetil-CoA + CO2+ H2

F, G
4H

2H

D
Succinat

2,3 Butandiol

H
H2 CO2 Acetoacetil-CoA
4H

Etanol

I
Propionat
CO2

Acetat

Acetona
2H

Butiril-CoA
4H

Butirat

i-Propanol

n-Butanol

Fig.1.2. Produii de fermentaie ai acidului piruvic A - bacterii lactice (Lactobacillus, Streptococcus); B - Clostridium propionicum; C - drojdii, Acetobacter, Zymomonas; D - Enterobacteriaceae; E - Clostridii; F - Klebsiella; G - drojdii; H - Clostridii (butyricum, acetobutylicum); I - bacterii propionice acide

Procesele fermentative ofer o serie de avantaje fa de procesele chimice dintre care cele mai importante constau n utilizarea unor materii prime ieftine i regenerabile, care de cele mai multe ori constituie subproduse sau deeuri ale unor ramuri industriale, precum i posibilitatea sintezei unor structuri chimice complexe (antibiotice, vitamine etc.) n condiii blnde de lucru, structuri a cror obinere prin sintez chimic nu este posibil, sau obinerea este extrem de anevoioas, necesitnd un numr mare de etape de transformri chimice, realizate n condiii drastice de operare, care de cele mai multe ori se realizeaz cu randamente sczute. Dezvoltarea cronologic a proceselor fermentative poate fi divizat n cinci etape majore. Prima etap poate fi considerat perioada anterioar anilor 1900, n care principalele produse obinute erau alcoolul etilic, oetul, berea i produsele lactate. Dei berea era cunoscut din antichitate, prima producie de bere pe scar larg a aprut abia la nceputul anilor 1700. Apar primele ncercri de control al proceselor, prin msurarea temperaturii cu termometre (1757) i construcia primelor schimbtoare de cldur (1801). La mijlocul anilor 1800 este demonstrat importana drojdiilor n fermentaia alcoolic, independent de ctre Cagniard-Latour, Schwann i Kutzing, dar Pasteur a fost cel care a reuit s conving lumea tiinific de rolul microorganismelor n procesele fermentative. Abia la sfritul anilor 1800, la berria Carlsberg, i ncepe Hansen lucrrile sale de pionierat n domeniul izolrii i apoi a propagrii celulei de drojdie n vederea obinerii de culturi pure, ce stau la baza obinerii culturilor starter. Obinerea oetului, iniial s-a realizat prin depozitarea vinului n vase deschise sau parial umplute, oxidarea lent datorndu-se dezvoltrii unei flore naturale. O dat cu stabilirea importanei aerului n porcesul de fermentaie acetic, au aprut aa zisele fermentatoare aerobe, constnd din vase umplute cu material inert (crbune, cocs sau talaj) peste care se scurgea vinul. La sfritul anilor 1800, nceputul anilor 1900, mediul iniial, pasteurizat, s-a inoculat cu 10% oet, acidularea crescnd i rezistena la contaminare. ntre 1900 i 1940, considerat a fi a doua etap, principalele producii noi au condus la obinerea biomaselor de drojdii, a acidului citric, lactic, gluconic, a butanolului i acetonei. Cele mai importante realizri ale acestei perioade se refer la obinerea culturilor de drojdie de panificaie i a solvenilor organici pe cale fermentativ . Obinerea drojdiei de panificaie este un proces aerob i foarte curnd s-a relizat faptul c o cretere celular rapid conduce la srcirea mediului n oxigen i concomitent cu obinerea de alcool etilic n detrimentul biomasei. Producerea de alcool a fost cu timpul minimizat prin reglarea creterii celulare, limitnd concentraia sursei de carbon din substrat i dozarea acesteia pe parcursul procesului. Primele sisteme de aerare au fost aplicate tot la obinerea drojdiei de panificaie, alimentarea cu aer fiind realizat cu ajutorul unor tuburi perforate. 4

Cercetrile lui Weizmann, din perioada primului rzboi mondial, au condus la dezvoltarea procesului de fermentaie butiric , prima fermentaie cu adevrat aseptic. Toate procesele discutate pn acum puteau fi realizate cu o minim contaminare cu condiia utilizrii unui inocul corespunztor i a respectrii unor minime msuri de igien . Fermentaia butiric anaerob este ns susceptibil la contaminare cu bacterii aerobe, n primele sale stadii, respectiv cu bacterii anaerobe productoare de acid n fazele ulterioare ale pocesului. Posibilitatea de contaminare a fost drastic redus prin utilizarea de fermentatoare, construite din oel, care permiteau o sterilizare cu abur sub presiune. Tehnica dezvoltat pentru fermentaia butiric a constituit un progres important n biotehnologie, netezind calea pentru introducerea proceselor aerobe aseptice. A treia perioad apare ca un rezultat la necesarul producerii de penicilin din perioada celui de-al doilea rzboi mondial. Producia de penicilin , n culturi submerse, este un proces aerob extrem de vulnerabil la contaminare. Dei experiena cptat de la fermentaia butiric era foarte util, au rmas ns nc de nvins dificultile legate de aerarea culturii cu un volum mare de aer steril i de amestecare a unui mediu foarte vscos. De asemenea, spre deosebire de solvenii organici, penicilina se sintetiza n cantiti foarte mici de ctre tulpinile izolate iniial. Acest lucru a impus dezvoltarea programului de imbuntire a tulpinilor productoare, direcie care devine o preocupare major a cercettorilor din domeniu n urmtorii ani. Un pas important n perfecionarea tehnologiilor a fost fcut prin punerea la punct, la scar industrial, a procedeului de extracie a penicilinei din mediul de fermentaie. Aceast perioad a reprezentat poate etapa n care s-au realizat cele mai semnificative modificri n tehnologia de fermentaie i n care au aprut un numr mare de produse noi (antibiotice, vitamine, gibereline, aminoacizi, enzime etc) Decizia unui numr de companii multinaionale, de la nceputul anilor 1960, de investigare a produciei de biomas microbian, ca o posibil surs de suplimentare a proteinelor alimentare, deschide cea de-a patra etap de progres a biotehnologiei. Fermentatoarele cu amestecare realizate n aceast perioad aveau capaciti cuprinse ntre 80 i 150 m3. Preul de vnzare sczut al biomaselor proteice a impus obinerea lor n cantiti mult mai mari dect a celorlalte produse de fermentaie. Are loc i o lrgire a bazei de materii prime, lundu-se n considerare i hidrocarburile ca o posibil surs de carbon. Utilizarea acestora a atras dup sine un consum crescut de oxigen, ceea ce a determinat apariia unor noi tipuri de fermentatoare (airlift, cu recirculare intern sau extern) cu funcionare continu. Operarea continu a unor fermentatoare de mare capacitate a ridicat ns serioase probleme cu privire la asigurarea

condiiilor aseptice, care au fost ns depite prin introducerea sistemelor continue de sterilizare a mediului i implementarea sistemului computerizat de control al procesului. Ultima perioad, a cincea, de dezvoltare se caracterizeaz prin apariia ingineriei genetice, tehnic care permite nu numai transferul de gene ntre dou organisme strine, dar permite i modificri foarte precise ale genomului unui organism, realiznd o adevrat revoluionare a biotehnologiilor. Dezvoltarea fr precedent a acestui domeniu demonstreaz atractivitatea

biotehnologiilor, care reprezint nu numai o alternativ la tehnologiile clasice, n multe cazuri, neeconomice i poluante, dar reprezint i viitorul tehnologiilor neconvenionale. Biotehnologia convenional const n metode tradiionale de ameliorare a speciilor de plante i animale, respectiv utilizarea microorganismelor pentru a obine produse alimentare prin procese tradiionale de fermentaie. Biotehnologia modern dezvolt aceste tehnici utiliznd ingineria genetic pentru a adapta proprietile microorganismelor, plantelor i animalelor prin intervenie direct asupra purttorului principal de informaie a oricrui organism i anume ADN. Dezvoltarea i diversificarea domeniului biotehnologiei a determinat introducerea unei clasificri. Astfel se definesc: biotehnologia industrial acea ramur a biotehnologiei moderne care are ca obiect producerea la scar industrial de substane chimice i bioenergie, utiliznd procese, aa numite curate, cu consum energetic redus i generare mai redus de deeuri. Aceste tehnologii utilizeaz preferenial, dar nu exclusiv, materii prime regenerabile, pe care le transform cu ajutorul microorganismelor (modificate sau nu genetic) i a enzimelor acestora n produse i materiale utile din domeniul chimic, alimentar, energetic, sntate etc. Aceste celule sunt factori de nanoscal pentru conversia industrial a materiilor prime regenerabile, cum ar fi zaharuri i uleriuri n chimicale, preparate farmaceutice, biocombustibili, bioplastice etc. Din ce n ce mai des se utilizeaz pentru descrierea acestor produse termenul de biotehnologie alb, albul simboliznd tehnologia curat, ecologic. biotehnologia roie orientat n scopuri medicale la obinerea de substane de diagnosticare, vaccinuri, hormoni etc. biotehnologia verde care se ocup de modificarea genetic a culturilor i speciilor de plante, respectiv animale, cu apicaii n sectorul alimentar.

Biotehnologia industrial n cadrul biotehnologiilor industriale transformarea materiilor prime se realizeaz prin procese fermentative (fermentaii) sau enzimatice (bioconversii). Procesele fermentative utilizeaz microorganismele la scar industrial pentru obinerea unei game variate de produse, substane chimice de baz i de sintez fin cum sunt alcoolul etilic, acidul lactic, citric, acetic, vitamine, aminoacizi, solveni, antibiotice, biopolimeri, biopesticide, enzime industriale, biocolorani, biosurfactani alcaloizi, steroizi, etc. Pentru unele din aceste produse procesul de fermentaie este singura cale de obinere (ex. acidul citric, lactic, anumite clase de antibiotice etc), multe obinndu-se n tonaje apreciabile. Preul produselor de fermentaie variaz, de asemenea, n limite largi, de la produse ieftine la produse extrem de scumpe. Iat cteva exemple: Producia mondial Pre, EUR/kg t/an Alcool etilic de fermentaie 26.000.000 0.4 Acid L-glutamic, sare monosodic 1.000.000 1.5 Acid citric 1.000.000 0.8 L-lizin 350.000 2.0 Acid lactic 250.000 2.0 Vitamina C 80.000 8.0 Acid gluconic 50.000 1.5 Antibiotice de baz 30.000 150.0 Antibiotice specifice 5.000 1500.0 Xantan 20.000 8.0 L-hidroxifenilalanin 10.000 10.0 Dextran 200 80 Vitamina B12 10 25.000 Produs Procesele enzimatice (de bioconversie) utilizeaz la transformarea substratului enzime in vivo sau in vitro, libere sau imobilizate. Enzimele sunt acceleratori naturali ai reaciilor biochimice, fiind denumite biocatalizatori. Enzimele sunt proteine cu activitate catalitic extrem de selectiv n condiii normale (nu necesit temperaturi extreme, presiuni ridicate, nu creeaz mediu coroziv), devenind extrem de importante n variate sectoare industriale cum ar fi: industria alimentar, spre exemplu -amilazele se utilizeaz la lichefierea amidonului, glucozeizomeraza la conversia glucozei n fructoz (producia mondial de fructoz situndu-se la nivelul anului 2003 la 15 mil.t); producia de surfactani (detergeni) adaosul de proteaze i lipaze faciliteaz descompunerea grsimilor i a proteinelor;

zootehnie fitaza se folosete ca adaos n furaje n scopul eliberrii de fosfat din acidul fitic, avnd ca efect direct reducerea cantitii de fosfat suplimentat n furaje i cu efect ecologic benefic; industria chimic utilizarea n procese catalitice, datorit aciunii extrem de specifice i de selective. Viitorul biotehnologiei industriale const n prelucrarea materiilor prime regenerabile, valorificarea deeurilor de natur vegetal i animal prin procese ecologice. Datorit problemelor ridicate de cantitile n cretere a deeurilor industriale i impactul lor ecologic, orientarea spre obinerea de produse finale sau intermediare biodegradabile este n continu cretere. Avantajul produselor biodegradabile const n descompunerea lor natural i reintrarea n circuit, spre deosebire de produsele persistente. Majoritatea produselor biodegradabile se obin din materii prime regenerabile, diminund importana principalei baze de materii prime actuale i anume combustibilii fosili. Modificarea structurii compuilor chimici de baz pentru industria chimic i nu numai este relevat i de producia mondial estimat i preul de cost pentru anul 2004. Materii prime de baz din resurse regenerabile Producie, mil.t/an celuloz 320 zahr 140 amidon 55 glucoz 30 bio-etanol 26 acid L-glutamic 1 Compusul Pre, EUR/t 500 180 250 300 400 2000 obinute din petrochimie Producie, mil.t/an eten 85 propen 45 benzen 23 acid tereftalic 12 i-propanol 2 caprolactam 3 Compusul Pre, EUR/t 400 350 700 700 700 2000

Dezvoltarea i diversificarea biotehnologiei industriale are ca impact crearea de noi locuri de munc; reducerea semnificativ a polurii mediului prin procesarea materiilor prime regenerabile prin tehnologii curate, obinerea de produse biodegradabile, reducerea semnificativ a polurii aerului, solului i apelor, reducerea efectului de ser prin scderea emisiilor de gaze; reducerea costurilor afernte materiilor prime, costurilor de investiie i producie; diversificarea gamei de produse, ecologice, cu caliti mbuntite.