1

CURSUL 3. LIMFOCITELE Limfocitele sunt principalele celule implicate n rspunsul imun. Din punct de vedere histologic ele fac parte din esutul limfoid. esutul limfoid cuprinde organele limfoide centrale i periferice. Organele limfoide centrale sunt mduva hematogen i timusul. Mduva hematogen este sursa tuturor limfocitelor care populeaz esuturile limfoide. Organele limfoide periferice sunt : Splina Ganglionii limfatici esutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous associated lymphoid tissue) esutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin associated lymphoid tissue). Populaiile limfocitare Limfocitele reprezint 20-40% din totalul leucocitelor, sau n cifre absolute ntre 1500-3000/mmc, n medie 2500/mmc. Limfocitele apar la microscopul optic, pe frotiul colorat policromatic (Giemsa sau Wright), cu dou morfologii : limfocite mici i mari. Limfocitele tipice sunt cele mici. Aceast categorie cuprinde limfocitele T (LT) i limfocitele B (LB). Limfocitele mici reprezint peste 95% din totalul limfocitelor i au urmtoarele caractere : Au diametrul de 6-10 microni. Au un nucleu ovoid sau reniform, care ocup cam 90% din suprafaa celulei i prezint cromatin nuclear dens. Perinuclear apare un inel de citoplasm colorat albastru deschis. Citoplasma conine organite celulare i 5-15 granulaii azurofile. n citoplasm se detecteaz o serie de enzime : fosforilaze, hidrolaze acide, enzime mitocondriale. Citoplasma nu conine peroxidaze, enzime caracteristice pentru monocite i granulocite. Limfocitele mari, numite i large granular lymphocytes sau LGL, reprezint cam 3% din totalul limfocitelor. Din aceast clas cele mai importante sunt celulele NK (natural killer), cu rol n imunitatea denumit nnscut sau nespecific, ndreptat contra celulelor infectate viral i tumorale, n cadrul RIC. Alturi de NK, grupul LGL cuprinde celulele K, NK-like i LAK (lymphokineactivated killer). Limfocitele mari au urmtoarele caractere comune : Au diametrul de 10-15 microni. Au mai mult citoplasm, care conine granulaii dense.

Limfocitele mici se mpart funcional n LB i LT. Aceste dou tipuri de limfocite nu se pot diferenia morfologic, prin microscopie optic, ci funcional, prin testele de rozetare : Dac se pun n contact limfocitele cu hematii de oaie sau berbec, numai LT se leag de aceste hematii, adic rozeteaz. La microscop se vizualizeaz mici conglomerate celulare formate dintr-un LT central nconjurat de o coroan de hematii de oaie, care se numesc rozete E. Dac se pun n contact limfocitele cu hematii de oarece, numai LB se leag de aceste hematii, producndu-se rozete M. LIMFOCITELE T Limfocitele T (LT) reprezint funcional o populaie celular heterogen. Clasele de LT seamn morfologic i toate rozeteaz cu hematiile de oaie. Ele se difereniaz numai prin receptorii sau markerii de suprafa, care se evideniaz cu anticorpi monoclonali. Receptorii sau markerii de suprafa sunt notai cu CD (clas de difereniere sau cluster of differentiation). n funcie de prezena lor selectiv pe diferitele subgrupuri limfocitare, markerii sunt de mai multe categorii : Markerii panantigenici sunt comuni pentru toate subtipurile limfocitare din grupele B i T, indiferent de etapa de maturare. Markerii de maturare se sintetizeaz i sunt represai succesiv, n timpul ontogeniei limfocitare, adic pe parcursul maturrii de la precursorii medulari spre formele adulte. Markerii de activare se exprim numai pe limfocitele activate n cursul rspunsului imun. n funcie de markerii de suprafa, LT se mpart n patru subclase : LTH helper LTS supresor LTCS contrasupresor LTC citotoxic

Toate subclasele de LT posed o serie de caractere comune : LT reprezint populaia majoritar dintre limfocitele mici din periferie, respectiv ntre 55-75% din limfocitele mici sanguine, 100% din populaia limfocitar a timusului i circa 25% din limfocitele din mduva hematogen. LT au via lung, de ani sau zeci de ani. LT sunt celule intens recirculante, adic se deplaseaz continuu ntre organele limfoide secundare i esuturi, n cutarea antigenelor pentru care sunt programate. LT rozeteaz cu hematiile de oaie. Receptorii de suprafa ai LT mature

LT care prsesc timusul se numesc de repaus , naive sau virgine , pentru c ele nu au venit nc n contact cu antigenul corespunztor. Receptorii lor de suprafa sunt de trei categorii (tabelul 3) : Receptorii de recunoatere a epitopului reprezint principala cale de activare a LT. Acest grup cuprinde complexul TCR-CD3 i coreceptorii CD4 i CD8. Complexul TCR-CD3 recunoate epitopul i este prezent pe toate subtipurile de LT. CD4 i CD8 sunt coreceptori care recunosc moleculele MHC aezate pe APC sau pe celulele somatice. Moleculele MHC prezint epitopul. CD4 recunoate MHC II, iar CD8 recunoate MHC I. Pentru c simultan sunt recunoscute antigenele i moleculele MHC, spunem c recunoaterea antigenic realizat de LT este asociativ. Receptorii cu rol accesor n activarea LT sunt CD28 i CD45. Receptorii cu rol n adeziunea intercelular permit LT s adere intim de alte celule : APC, celule somatice, celule int. Receptorii de adeziune ai LT sunt CD2 i LFA1. I. Receptorii cu rol n recunoaterea epitopului Recunoaterea epitopului de ctre LT are cteva caracteristici generale : LT recunosc un epitop ca non-self dup structura liniar sau primar. LT recunosc epitopii numai dac acetia sunt prezentai n complex cu moleculele prezentatoare MHC, de pe membranele APC sau a celulelor somatice. Spre deosebire de receptorii BCR cu structur de imunoglobuline de pe suprafaa LB, receptorii TCR-CD3 nu pot recunoate antigenele native, ci numai fragmentele peptidice prelucrate de celulele APC. Recunoaterea epitopului este obligatoriu asociativ, adic LT recunosc simultan epitopul i molecula MHC. Prezentarea epitopului se poate produce numai ntre celule care aparin aceluiai organism, n condiii de restricie de histocompatibilitate. Moleculele MHC sunt expuse numai pe membranele celulare. Din acest motiv LT pot s recunoasc numai antigenele membranare. Antigenele prezentate pe membrane pot fi : Antigene expuse pe moleculele MHC. Antigene constitutive, adic structuri proteice ale membranei. Antigene ataate accidental de membran, de exemplu haptene. LT recunosc numai antigenele expuse n complex cu moleculele MHC self. LT realizeaz o recunoatere antigenic MHC-dependent. TCR

Molecula TCR (T-cell receptor) este format din dou lanuri : Receptorul TCR2 este format din lanurile i , fiind prezent la 95% dintre LT. Receptorul TCR1 este format din lanurile i , fiind prezent la 5% dintre LT, mai ales pe LT din tegumente i mucoase. Lanurile care compun TCR au structur Ig-like : Lanurile i seamn cu lanurile L ale imunoglobulinelor. Lanurile i seamn cu lanurile H ale imunoglobulinelor. Fiecare lan are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, un segment transmembranar, un segment de legtur i cte dou domenii extracelulare, de cte 100 de aminoacizi, aezate fa n fa : Domeniile dinspre exterior sunt variabile i se noteaz cu V. Domeniile dinspre membran sunt constante i se noteaz cu C. Regiunea dintre buclele constante C i inseria pe membrana limfocitar a lanurilor TCR se numete zona balama a TCR. Ea d mobilitatea TCR, foarte important pentru recunoaterea antigenelor. Moleculele TCR sunt mobile n toate planurile, fcnd micri de baleiere. n zona balama lanurile i , respectiv i , se asociaz prin puni disulfurice. Cele dou domenii variabile se asociaz i formeaz o cavitate numit situsul de recunoatere pentru antigen, sau paratop, asemntor cu paratopul imunoglobulinelor. Genele care codific domeniile variabile ale TCR seamn structural cu genele domeniilor variabile ale imunoglobulinelor, iar variabililitatea este de asemenea obinut prin procese de recombinare genic. Situsurile de recunoatere nu se leag de molecula de antigen pe toat lungimea. De fapt contactele sunt punctiforme, prin 6 secvene scurte de aminoacizi care proemin n interiorul situsului combinativ, cte trei secvene pe fiecare domeniu V. Aceste secvene scurte se numesc CDR (complementarity determining regions) i sunt hipervariabile. CDR1 i CDR2 se leag cu domeniile polimorfe ale MHC (1 + 2 ale MHC I i 1 + 1 n cazul MHC II). CDR3 se leaga de epitop, avnd structuri complementare. Funciile receptorilor TCR sunt : TCR recunosc antigenul. TCR declaneaz stimulii activatori pentru LT. Dupa ce buclele V i V recunosc complexul MHC-epitop, apar n TCR modificri conformaionale i se produc stimuli activatori care sunt transmii n citoplasma LT. TCR nu poate s transmit singur semnalul activator pentru c TCR are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, iar enzimele care activeaz LT sunt aezate profund n citoplasma LT. De aceea transducia semnalului se face prin intermediul receptorului CD3.

CD3 CD3 este un receptor membranar cu structur complex, aezat lng receptorul TCR. CD3 face transducia semnalului activator primit de TCR spre interiorul LT. CD3 este format din cinci lanuri scurte : gama () , delta () , epsilon (), eta (), zeta (). Domeniul intracitoplasmatic al lanului zeta are funcie de PTK (proteinkinaz). Aceast enzim fosforileaz n prezena ATP unele proteine i le modific activitatea. Toate cele 7 lanuri din complexul TCR-CD3 (dou ale TCR i cinci ale CD3) se asociaz prin puni disulfurice sau prin legturi necovalente. Ele formeaz un complex unitar care transmite stimulul activator n interiorul LT. CD4 CD4 este un coreceptor care particip la recunoaterea antigenic asociativ. CD4 este receptorul de suprafa sau markerul caracteristic pentru LTH. CD4 are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar i un segment extracelular. Segmentul extracelular al CD4 are trei domenii sau bucle de mrime diferit. Prin bucla exterioar N-terminal, CD4 se leag de domeniul monomorf al MHC II, care este domeniul 2. Segmentul intracitoplasmatic al CD4 este foarte lung. El particip la activarea metabolic a LTH, prin activarea unor enzime intracelulare. CD4 este i receptorul de care se ataeaz virusul HIV. CD8 CD8 este un coreceptor care participa la recunoaterea antigenic asociativ. El se gsete mai ales pe LTC, dar i pe LTS i LTCS. CD8 este marker definitoriu pentru LTC. CD8 are dou lanuri, i . Fiecare dintre lanuri are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar i un segment extracelular. Cele dou segmente extracelulare au cte un domeniu. Cele dou domenii se asociaz i au un aspect Ig-like. Ele particip la cooperarea dintre LTC sau LTS i APC. n timpul cooperrii, segmentul extracelular al CD8 se leag de domeniul monomorf al MHC I, care este 3. Segmentul intracitoplasmatic al CD8 este foarte lung. El particip la activarea metabolic a LTC i LTS, prin activarea unor enzime intracelulare. II. Receptorii cu rol accesor

CD28 CD28 se gsete pe LTH i pe LTC, care mpreun reprezint cam 80% din LT circulante. CD28 nu se gsete pe LTS. CD28 are o structur de tip Ig-like, cu un segment intracitoplasmatic lung, un segment transmembranar i un segment extracelular care are un domeniu. Prin domeniul extracelular, CD28 se leag cu un contrareceptor de pe APC, notat CD80. Prin segmentul intracelular lung, CD28 activeaz mesagerii secunzi proteici din LTH sau LTC care induc producia de citokine. CD45 CD45 se gsete pe toate clasele de LT i de aceea se mai numete LCA (antigenul comun leucocitar). El este legat prin puni disulfurice de lanurile zeta ale CD3. CD45 activat devine o enzim transmembranar numit PTP (proteintirozin-fosfataz). PTP mpreun cu PTK sunt principalele enzime implicate n activarea LT. Ele formeaz un cuplu funcional care controleaz durata i intensitatea activrii limfocitare prin stabilirea echilibrului dintre fosforilrile i defosforilrile celulare. III. Receptorii de adeziune intercelular Aceti receptori permit stabilirea de contacte ntre LT i APC sau celulele somatice i permit cooperarea dintre ele. Principalii receptori implicai n aderarea LT sunt : LFA1, CD2, VLA. LFA1 LFA1 sau antigenul asociat funciei limfocitare face parte din familia integrinelor. Integrinele sunt receptori celulari care permit aderarea de endoteliu, de proteinele matricei extracelulare i de alte celule (APC, celulele int). LFA1 este prezent pe membrana LT, LB, MO, MF, PMN. El este un heterodimer format dintr-un lan (CD11a) cu greutate molecular de 180 kDa i un lan (CD18) cu greutate molecular de 95 kDa. LFA1 se leag de ICAM (intercellular adhesion mollecule) prin segmentul extracelular, care are dou bucle cu structur Ig-like. Exist dou tipuri de ICAM : ICAM 1 se afl pe suprafaa tuturor celulelor din organism. ICAM 2 se afl n special pe celulele endoteliale. Aderarea intercelular mediat de LFA1 este inductibil, adic ea este stimulat de recunoaterea antigenului i legarea lui la complexul TCR-CD3.

Recunoaterea antigenului declaneaz n LT cascada fosfatidil-inozitol, care n final duce la eliberarea ionilor de calciu din reticulul endoplasmic i la activarea proteinkinazei C (PKC), care prin fosforilare activeaz receptorul LFA1. Dac stimularea antigenic nu se produce, activitatea PKC este inhibat, receptorul LFA1 devine inactiv i LT se desprinde de celula cu care era n contact. Acest fenomen permite ca LT s vin n contact succesiv cu o multitudine de celule somatice sau APC, n cutarea antigenului. LFA1 are rol i n extravazarea i migrarea intratisular a LT. LFA1 ader de liganzii ICAM1, a cror expresie este mult crescut pe celulele endoteliale din focarele inflamatorii. VLA Receptorii VLA fac parte din familia integrinelor. Moleculele VLA1 i 2 sunt caracteristice pentru LT. VLA sunt molecule de adeziune la endoteliu (VLA4) i la proteinele din matricea extracelular. Ele dau LT posibilitatea s se deplaseze prin esuturi i s se concentreze intratisular n zona unde se gsesc antigenele. CD2 Receptorul CD2 se mai numete LFA2. CD2 face parte din superfamilia imunoglobulinelor i se gsete pe membrana tuturor LT i pe NK. CD2 are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar i un segment extracelular. CD2 este i receptorul LT pentru hematiile de oaie. Prin segmentul extracelular, CD2 se leag de receptorul LFA3 de pe APC sau de pe celulele somatice. Prin segmentul intracitoplasmatic, CD2 stimuleaz PLC (fosfolipaza C). Dup stimulare, PLC declaneaz cascada fosfatidil-inozitol. Moleculele de aderare au o serie de funcii eseniale pentru rspunsul imun : Prin aceste molecule LT stabilesc permanent contacte cu APC sau cu celulele somatice pe care le controleaz dac prezint sau nu antigene. Contactele sunt antigen-independente, adic se fac indiferent dac APC sau celula somatic prezint sau nu antigene pe suprafa. Cuplurile de adeziune LFA1-ICAM1 i CD2-LFA3 au rol n aceast etap iniial a recunoaterii antigenice. Receptorii de adeziune nu particip direct la recunoaterea epitopilor, dar au un rol esenial n recunoatere pentru c realizeaz un contact intim ntre LT i APC. Contactul se face pe suprafee mari de membran i dureaz mult, favoriznd contactul moleculelor MHC i TCR, care sunt aezate n locuri diferite pe membrane i pentru a se ntlni fac micri de difuzie lateral. Cuplurile de adeziune se desfac dup recunoaterea antigenelor, sau dac celula APC sau somatic nu prezint antigene. n acest fel LT i continu circuitul prin organism, adic se face recircularea LT.

Receptorul CD2 are rol i n activarea metabolic a LT. Rolul activator al CD2 este indispensabil mai ales cnd concentraia de epitopi prezentai spre TCR este sczut, astfel c numai recunoaterea epitopilor de ctre TCR-CD3 nu este suficient pentru activarea LT. LIMFOCITELE B LB reprezint 15-30% din totalul limfocitelor mici circulante. Ele au o serie de caractere generale : LB au durata de via scurt, de cteva sptmni. LB sunt celule puin recirculante, ele sunt cantonate n ariile burso-dependente din organele limfoide secundare - ganglionii limfatici i splina. Denumirea de limfocite B vine de la bursa lui Fabricius , care este un organ limfoid la psri, n care se matureaz LB formate n mduva hematogen. La mamifere s-a stabilit c nu exist un echivalent al bursei lui Fabricius, ci LB se matureaz tot n mduva hematogen. Receptorii de suprafa ai LB sunt de trei categorii : Receptorii cu rol n recunoaterea antigenelor i n activarea LB : BCR Receptorii de adeziune intercelular : LFA1 Receptorii cu rol accesor n activare : CD45, CD25 Recunoaterea antigenelor de ctre LB are unele caractere : LB recunosc epitopii dupa structura lor conformaional, spaial sau tridimensional. LB recunosc antigene solubile native, adic neprelucrate de APC, spre deosebire de LT. Pentru LB nu este necesar prezentarea antigenelor pe moleculele MHC. BCR Receptorul principal de recunoatere a antigenelor este BCR (B-cell receptor). BCR este o molecul de imunoglobulin monomeric transmembranar, cel mai frecvent monomer de IgM sau IgD. BCR are urmtoarea structur : Dou lanuri grele H, transmembranare, care au un segment extracelular, un segment transmembranar hidrofob i un scurt segment intracitoplasmatic. Dou lanuri uoare L, strict extracelulare.

Spre exterior, la captul N-terminal, lanurile H i L au bucle variabile V care se asociaz i formeaz dou situsuri combinative identice pentru determinantul antigenic expus la suprafaa antigenului nativ. Dup recunoaterea antigenului, BCR particip la activarea LB. Lanurile H ale BCR sunt asociate cu doi receptori numii Ig i Ig , care au acelai rol ca CD3 la LT, adic fac transducia semnalului activator spre interiorul LB. Semnalul se transmite de la BCR la Ig si Ig i mai departe la CD45 care se activeaz i devine PTP. n continuare CD45 declaneaz cascada fosfatidilinozitolilor care activeaz o serie de factori nucleari care induc n final proliferarea LB din clona activat i transformarea lor n plasmocite, adic celule productoare de imunoglobuline. PLASMOCITELE Plasmocitele apar prin activarea LB i diferenierea lor terminal n urma stimulrii antigenice i de ctre LTH. Procesul de difereniere implic modificri morfologice i imunofenotipice. LB trec prin stadiile succesive de : imunoblast B, plasmoblast, pre-plasmocit i plasmocit. Pe parcurs celulele pierd antigenele LB de repaus i de activare. Apar noi markeri de suprafa, de exemplu CD38 i CD71 cu rol n proliferare. Diferenele morfologice i structurale ale plasmocitelor fa de LB exprim funcia lor de sintez i de secreie a imunoglobulinelor, care asigur RIU. Caracterele morfologice ale plasmocitelor sunt : Plasmocitele sunt ovale i au diametrul de 7-25 microni. Nucleul este sferoidal, cu zone dense de heterocromatin orientat n spie de roat . Citoplasma este abundent i intens bazofil, datorit coninutului mare de ARN. Caracteristic citoplasma conine reticul endoplasmic rugos abundent, cu muli ribosomi implicai n sinteza imunoglobulinelor.