Sunteți pe pagina 1din 325

CRISTIAN RADU SISEA DORU PAMFIL

TESTAREA OMG




Editura Bioflux
Cluj-Napoca
2009
Testarea OMG

2


Autori:
Cercet. dr. Cristian Radu Sisea
Prof. dr. Doru Pamfil

Refereni tiinifici:
Prof. dr. Constantin Botez
Prof. dr. Ioan Ha

Director editur:
Cercet. dr. Ioan Valentin Petrescu-Mag

Consilier editorial:
Lector. dr. Ruxandra Mlina Petrescu-Mag


ISBN 978-606-92029-5-1

Editura Bioflux, Cluj-Napoca
2009

Testarea OMG

3

CUPRINS


INTRODUCERE........................................................................................................... 9
CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL N DOMENIUL OMG-URILOR..................... 17
1.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC.................................................... 17
1.1.1. Introducerea OMG-urilor............................................................................. 17
1.1.2. Metode de obinere a PMG-urilor ................................................................ 18
1.1.2.1. Transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens.......................... 21
1.1.2.2. Transferul direct de ADN...................................................................... 22
1.1.2.3. Transferul genelor prin metoda biolistic............................................... 24
1.1.3. Generaiile de PMG-uri ............................................................................... 25
1.1.4. Elementele genetice introduse n OMG-uri .................................................. 26
1.1.5. Rspndirea PMG-urilor.............................................................................. 29
1.1.6. Impactul potenial al PMG-urilor................................................................. 32
1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR ................................................................ 43
1.2.1. Legislaia european i cea romneasc referitoare la OMG-uri................... 43
1.2.2. Procedura integrat de testare OMG a produselor alimentare....................... 48
1.2.3. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testrii OMG............................... 52
CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CONSIDERENTE TEORETICE .................... 55
2.1. LABORATORUL DE TESTARE ..................................................................... 55
2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TESTRII
OMG............................................................................................................... 58
2.3. EANTIONAREA............................................................................................ 60
2.4. PREGTIREA PROBELOR............................................................................. 65
2.5. EXTRACIA ADN-ULUI ................................................................................ 66
2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN...................................................... 68
2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric ................................................................. 69
2.6.2. Evaluarea strii de fragmentare a moleculelor de ADN................................ 72
2.6.3. Confirmarea absenei substanelor inhibitoare.............................................. 75
2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE N CADRUL TESTRII OMG ............. 75
2.7.1. Detecia OMG-urilor cu ajutorul biotestelor ................................................ 77
2.7.2. Detecia OMG-urilor prin analiza proteinelor .............................................. 79
2.7.3. Testarea OMG bazat pe analiza ADN-ului ................................................. 82
2.7.4. Alte principii de analiz a OMG-urilor ........................................................ 85
2.8. TESTAREA OMG CALITATIV BAZAT PE TEHNICA PCR.................... 86
2.8.1. Utilizarea reaciei PCR n cadrul testrii OMG............................................ 86
2.8.2. Structura i modul de replicare a ADN-ului ................................................. 88
Testarea OMG

4
2.8.3. Principiul reaciei PCR................................................................................ 91
2.8.4. Instrumentele i componentele necesare reaciilor PCR............................... 94
2.8.5. Reacii PCR specializate............................................................................ 100
2.8.6. Identificarea contaminrii, validarea i interpretarea rezultatelor ............... 102
2.9. TESTAREA OMG CANTITATIV BAZAT PE TEHNICA REAL-
TIME PCR.................................................................................................... 106
2.9.1. Introducerea analizei real-time PCR .......................................................... 106
2.9.2. Principiul real-time PCR............................................................................ 107
2.9.3. Eficiena amplificrii n analizele real-time PCR ....................................... 110
2.9.4. Cuantificarea OMG-urilor ......................................................................... 112
2.9.5. Analiza grafic a datelor experimentale ..................................................... 113
2.9.6. Metode de calcul........................................................................................ 117
2.9.7. Materialele de referin certificate ............................................................. 124
2.9.8. Instrumentele real-time PCR...................................................................... 129
2.9.9. Sisteme de detecie .................................................................................... 132
2.10. INTERPRETAREA I RAPORTAREA REZULTATELOR OBINUTE
N URMA TESTRII OMG......................................................................... 141
2.11. EVALUAREA I VALIDAREA METODELOR ANALITICE .................... 142
2.11.1. Importana metodelor analitice validate ................................................... 142
2.11.2. Validarea i acreditarea metodelor analitice............................................. 144
2.11.2.1. Validarea........................................................................................... 144
2.11.2.2. Acreditarea........................................................................................ 149
2.11.3. Prametri validrii ..................................................................................... 151
2.11.4. Incertitudinea de msurare....................................................................... 157
2.11.4.1. Considente generale........................................................................... 157
2.11.4.2. Factorii care contribuie la IM............................................................ 159
2.11.4.3. Estimarea incertitudinii de msurare.................................................. 165
2.11.5. Strategii de evaluare in-house a performanelor unei metode analitice ..... 168
2.11.5.1. Strategia utilizat de CRL-GMFF...................................................... 168
2.11.5.2. Alte modele....................................................................................... 172
CAPITOLUL III. TESTAREA OMG APLICAII PRACTICE.............................. 174
3.1. ETAPELE ANALITICE ALE METODOLOGIEI DE TESTARE OMG......... 174
3.2. MATERIALUL BIOLOGIC............................................................................ 175
3.2.1. Soia Roundup Ready (evenimentul de transformare GTS 40-3-2).............. 175
3.2.2. Tipuri de probe analizate ........................................................................... 178
3.3. EANTIONAREA.......................................................................................... 181
3.4. PREGTIREA PROBELOR TEST................................................................. 181
3.5. EXTRACIA ADN-ULUI .............................................................................. 183
3.5.1. Metode de extracie a ADN-ului utilizate n testarea OMG........................ 183
3.5.1.1. Metoda de extracie pe baz de CTAB................................................. 186
Testarea OMG

5
3.5.1.2. Extracia ADN-ului cu DNeasy Plant Mini Kit .................................... 189
3.5.1.3. Extracia ADN-ului cu QIAamp DNA Stool Mini Kit ......................... 191
3.5.1.4. Extracia ADN-ului utiliznd kitul High Pure GMO Sample
Preparation.................................................................................................... 192
3.5.1.5. Extracia ADN-ului pe platforma MagNA Pure LC............................. 193
3.5.1.6. Extracia ADN-ului pe platforma Maxwell 16..................................... 195
3.5.2. Testarea metodelor de extracie a ADN-ului .............................................. 197
3.5.2.1. Design experimental ............................................................................ 198
3.5.2.2. Analiza spectrofotometric.................................................................. 200
3.5.2.3. Starea de fragmentare.......................................................................... 203
3.5.2.4. Confirmarea absenei inhibitorilor PCR............................................... 205
3.5.2.4.1. Design experimental ...................................................................... 205
3.5.2.4.2. Metoda de lucru............................................................................. 207
3.5.2.5. Compararea metodelor de extracie pe baza criteriilor economice........ 212
3.5.2.6. Considerente generale refertioare la testarea metodelor de extracie .... 213
3.5.3. Extracia ADN-ului n cadrul testrii OMG ............................................... 215
3.5.3.1. Design experimental ............................................................................ 215
3.5.3.2. Rezultate i considerente generale ....................................................... 216
3.6. TESTAREA OMG CALITATIV.................................................................. 220
3.6.1. Design experimental .................................................................................. 220
3.6.2. Detecia ADN-ului specific taxonului ........................................................ 224
3.6.3. Detecia rapid (screeningul) a OMG-urilor............................................... 228
3.6.3.1. Detecia promotorului P-E35S............................................................. 228
3.6.3.2. Detecia terminatorului T-nos.............................................................. 229
3.6.3.3. Screeningul OMG utiliznd kitul Biogenics Standard.......................... 230
3.6.4. Identificarea evenimentelor de transformare .............................................. 233
3.6.5. Considerente generale referitoare la testarea calitativ............................... 236
3.7. TESTAREA OMG CANTITATIV............................................................... 237
3.7.1. Design experimental .................................................................................. 237
3.7.2. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000............................................. 240
3.7.3. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480 .............................................. 245
3.7.4. Considerente generale referitoare la testarea cantitativ ............................. 247
3.8. PREZENTAREA REZULTATELOR GENERALE ALE TESTRII OMG.... 251
CAPITOLUL IV. CONCLUZII REFERITOARE LA ACTIVITATEA DE
TESTARE OMG........................................................................................... 252
BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................... 259
ANEXE ..................................................................................................................... 288

Testarea OMG

6

TABLE OF CONTENTS


INTRODUCTION.......................................................................................................... 9
CHAPTER I. CURRENT STATUS IN THE FIELD OF GMOs ..................................... 17
1.1. GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS....................................................... 17
1.1.1. Introduction of GMOs.................................................................................. 17
1.1.2. Methods for obtaining GMCs ...................................................................... 18
1.1.2.1. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation............................ 21
1.1.2.2. Direct tranfer of DNA............................................................................ 22
1.1.2.3. Gene transfer using the biolistic method................................................ 24
1.1.3. Generations of GMCs.................................................................................. 25
1.1.4. Genetic elements inserted n GMOs............................................................. 26
1.1.5. Status of GMCs adoption............................................................................. 29
1.1.6. Potential impact of GMCs ........................................................................... 32
1.2. GMO MONITORING......................................................................................... 43
1.2.1. European and Romanian legislation on GMOs............................................ 43
1.2.2. Integrated procedure for the GMO testing of foodstuffs............................... 48
1.2.3. Labelling decission based on GMO testing results....................................... 52
CHAPTER II. GMO TESTING THEORETICAL CONSIDERATIONS....................... 55
2.1. TESTING LABORATORY.................................................................................. 55
2.2. TYPES OF SAMPLES THAT CAN BE SUBJECTED TO GMO TESTING......... 58
2.3. SAMPLING........................................................................................................ 60
2.4. SAMPLE PREPARATION................................................................................. 65
2.5. DNA EXTRACTION........................................................................................... 66
2.6. EVALUATION OF DNA EXTRACTS................................................................. 68
2.6.1. Spectrofotometric quantification.................................................................. 69
2.6.2. Assessment of DNA fragmentation............................................................... 72
2.6.3. Confirming the absence of PCR inhibitors................................................... 75
2.7. ANALYTICAL METHODS EMPLOYED FOR GMO TESTING......................... 75
2.7.1. Bioassay-based detection of GMOs ............................................................. 77
2.7.2. Protein-based detection of GMOs................................................................ 79
2.7.3. DNA-based testing of GMOs........................................................................ 82
2.7.4. Other principles of GMO analysis ............................................................... 85
2.8. QUALITATIVE TESTING OF GMOs BASED ON CONVENTIONAL PCR........ 86
2.8.1. Using the PCR reaction for GMO testing..................................................... 86
2.8.2. DNA structure and replication..................................................................... 88
2.8.3. Principles of PCR reaction.......................................................................... 91
Testarea OMG

7
2.8.4. Instruments and components of a PCR reaction........................................... 94
2.8.5. Specialized PCR reactoins......................................................................... 100
2.8.6. Contamination identification, result validation and interpretation............. 102
2.9. QUANTITATIVE TESTING OF GMOs BASED ON REAL-TIME PCR............ 106
2.9.1. Introduction of real-time PCR analysis...................................................... 106
2.9.2. Real-time PCR principles .......................................................................... 107
2.9.3. Amplification eficiency in real-time PCR analyses..................................... 110
2.9.4. GMO quantification................................................................................... 112
2.9.5. Graphical analysis of experimental data.................................................... 113
2.9.6. Calculus .................................................................................................... 117
2.9.7. Certified reference materials ..................................................................... 124
2.9.8. Real-time PCR instruments........................................................................ 129
2.9.9. Detection systems ...................................................................................... 132
2.10. INTERPRETATION AND REPORT OF GMO TESTING RESULTS .............. 141
2.11. ANALYTICAL METHOD EVALUATION AND VALIDATION....................... 142
2.11.1. The importance of validated analytical methods ...................................... 142
2.11.2. Validation and accreditation of analytical methods ................................. 144
2.11.2.1. Validation.......................................................................................... 144
2.11.2.2. Accreditation..................................................................................... 149
2.11.3. Validation parameters ............................................................................. 151
2.11.4. Measurement uncertainty......................................................................... 157
2.11.4.1. General considerations...................................................................... 157
2.11.4.2. Factors contributing to the measurement uncertainty........................ 159
2.11.4.3. Estimation of measurement uncertainty............................................. 165
2.11.5. Strategiile for in-house evaluation of analytical method performance...... 168
2.11.5.1. The CRL-GMFF strategy................................................................... 168
2.11.5.3. Other approaches.............................................................................. 172
CHAPTER III. GMO TESTING THEORETICAL CONSIDERATIONS ................... 174
3.1. ANALYTICAL STEPS OF THE GMO TESTING METHODOLOGY................ 174
3.2. BIOLOGICAL MATERIAL .............................................................................. 175
3.2.1. Roundup Ready soybean (GTS 40-3-2 transformation event)..................... 175
3.2.2. Types of samples used for the analyses ...................................................... 178
3.3. SAMPLING...................................................................................................... 181
3.4. TEST SAMPLE PREPARATION...................................................................... 181
3.5. DNA EXTRACTION......................................................................................... 183
3.5.1. DNA extraction methods used in GMO testing........................................... 183
3.5.1.1. CTAB-based DNA extraction method .................................................. 186
3.5.1.2. DNA extraction using the DNeasy Plant Mini Kit ................................ 189
3.5.1.3. DNA extraction using the QIAamp DNA Stool Mini Kit....................... 191
3.5.1.4. DNA extraction using High Pure GMO Sample Preparation Kit ......... 192
Testarea OMG

8
3.5.1.5. DNA extraction on the MagNA Pure LC platform................................ 193
3.5.1.6. DNA extraction on the Maxwell 16 platform........................................ 195
3.5.2. Testing of DNA extracion methods............................................................. 197
3.5.2.1. Experimental design............................................................................ 198
3.5.2.2. Spectrofotometric analysis................................................................... 200
3.5.2.3. Fragmentaion state of DNA................................................................. 203
3.5.2.4. Confirming the absence of PCR inhibitors........................................... 205
3.5.2.4.1. Experimental design....................................................................... 205
3.5.2.4.2. Working method............................................................................. 207
3.5.2.5. Comparizon of extraction methods based on economical criteria........ 212
3.5.2.6. General considerations on the testing of DNA extraction methods....... 213
3.5.3. DNA extraction for GMO testing ............................................................... 215
3.5.3.1. Experimental design............................................................................ 215
3.5.3.2. Results and general considerations ..................................................... 216
3.6. QUALITATIVE GMO TESTING...................................................................... 220
3.6.1. Experimental design .................................................................................. 220
3.6.2. Taxon-specific DNA detecion..................................................................... 224
3.6.3. GMO screening ........................................................................................... 228
3.6.3.1. Detection of the P-E35S promoter....................................................... 228
3.6.3.2. Detection of the T-nos terminator........................................................ 229
3.6.3.3. GMO screening using the Biogenics Standard Kit ............................... 230
3.6.4. Identification of transformation events....................................................... 233
3.6.5. General considerations regarding the qualitative analysis ........................ 236
3.7. QUANTITATIVE GMO TESTING.................................................................... 237
3.7.1. Experimental design .................................................................................. 237
3.7.2. Quantification on the Rotor-Gene 3000 platform....................................... 240
3.7.3. Quantification on the LightCycler 480 platform......................................... 245
3.7.4. General considerations regarding the quantitative analysis ...................... 247
3.8. GENERAL RESULTS OF GMO TESTING...................................................... 251
CHAPTER IV. CONCLUSIONS ON GMO TESTING................................................ 252
REFERENCES........................................................................................................... 259
ANNEXES.................................................................................................................. 288

Testarea OMG

9

INTRODUCERE
INTRODUCTION


Obinerea primului organism modificat genetic (OMG) (genetically modified
organism/GMO), la specia Escherichia coli, de ctre Cohen, Boyer i Berg, n anul 1973
(Genome News Network, 2004), a demonstrat c transferul informaiei genetice poate
depi cu mult barierele naturale i a constituit primul pas n acest nou domeniu. n 1978,
compania Genentech, fondat de Boyer, a creat o linie transgenic de E. coli, capabil s
sintetizeze insulina uman (Wikipedia, 2009j), iar astzi majoritatea aplicaiilor
biotehnologice moderne sunt destinate sistemului sanitar. Cu toate acestea, plantele (de
cultur) modificate genetic (PMG) (genetically modified crop/GMC) se bucur de cea
mai mare notorietate, reprezentnd subiectul celor mai intense controverse referitoare la
introducerea i utilizarea biotehnologiilor moderne.
Plantele transgenice reprezint tehnologia agricol cu cea mai rapid rspndire
din istorie (Raney, 2006). Acestea au fost obinute nc din anii 1980, momentul
introducerii pentru prima dat n cultura comercial fiind ns discutabil. Hails i
Kinderlerer (2003) afirm c pn la sfritul anilor 1980 varieti de tutun i tomate
rezistente la virusuri erau cultivate n China, iar Zhou et al. (1995), citai de Nap et al.
(2003), susin c tutunul rezistent la Virusul Mozaicului Castravetelui (Cucumber Mosaic
Virus) a fost cultivat n scop comercial n China, ncepnd din 1992. James i Krattiger
(1996) susin de asemenea c varieti de tutun i tomate rezistente la virusuri au fost
comercializate n China, de la nceputul anilor 1990. Pe de alt parte, conform
informaiilor publicate de Chen et al. (2000), oficial, plantele transgenice au fost
comercializate n China ncepnd cu anul 1996 (Nap et al., 2003). n ceea ce privete
utilizarea n alimentaia uman, tomatele FlavrSavr, cu coacere ntrziat, reprezint
primele plante de cultur modificate genetic destinate acestui scop (Lthy, 1999; James i
Krattiger, 1996). Aprobarea a fost obinut de Calgene n SUA, n anul 1994, tomatele
procesate sub form de past fiind introduse pe pia n 1996.
Testarea OMG

10
Odat cu rspndirea PMG-urilor n culturile comerciale, a crescut considerabil
numrul liniilor transgenice disponibile (AGBIOS, 2009a; Bruderer i Leitner, 2003). A
crescut de asemenea i numrul speciilor din care deriv liniile transgenice destinate
cultivrii, printre acestea enumerndu-se plante cu o importan deosebit n economia
mondial, ca porumbul, orezul, soia, bumbacul, grul, tomatele, prunul, inul, floarea
soarelui sau rapia, dar i plante cu impact economic mai mic, cum sunt papaia, broccoli,
pepenele galben sau cicoarea (AGBIOS, 2009a; Bruderer i Leitner, 2003).
Cu toate c PMG-urile au cunoscut o rspndire spectaculoas, utilizarea acestora
i a produselor biotehnologice n general, a generat numeroase controverse, opiniile pe
aceast tem ncadrndu-se n dou curente. Pe de o parte, cultivarea la scar larg este
vzut ca avnd numeroase beneficii economico-sociale i ecologice. Susintorii
biotehnologiilor n principal companiile productoare, precum i o mare parte a
comunitii academice afirm c utilizarea plantelor de cultur transgenice va
determina creterea productivitii agricole globale, va contribui la asigurarea securitii
alimentare, scderea srciei n rile n curs de dezvoltare i va reduce dependena
agriculturii de inputurile chimice, ajutnd la diminuarea polurii (Altieri i Rosset, 1999).
De cealalt parte, opozanii noii tehnologii, reprezentai n principal de adepii micrilor
ecologiste i ai agriculturii biologice, contest beneficiile menionate mai sus, insistnd
asupra potenialelor efecte negative pe care PMG-urile le pot provoca asupra echilibrului
ecosistemelor, economiei, sntii etc.
Complexitatea aspectelor referitoare la avantajele i dezavantajele culturilor de
plante transgenice, se datoreaz n principal faptului c aceast tehnologie este relativ
nou, iar implicaiile ei nu au fost nc pe deplin nelese. Pn n prezent, activitatea
diferitelor organisme sau organizaii comerciale, tiinifice, guvernamentale i
neguvernamentale, a avut ca rezultat publicarea unor evaluri i fundamentri
contradictorii ale beneficiilor, riscurilor i limitelor plantelor transgenice, care au generat
controverse la toate nivelurile, referitoare la introducerea deliberat n mediu i utilizarea
OMG-urilor ca alimente i furaje (Ponti et al., 2005). Aceste controverse au proiectat o
imagine lipsit de transparen asupra OMG-urilor, motiv pentru care sunt privite cu
scepticism de ctre opinia public din ntreaga lume. Diferenele de opinie se regsesc i
n strategiile politico-ecomice ale diferitelor state, prin poziia fa de OMG-uri i modul
Testarea OMG

11
n care legifereaz i sprijin utilizarea biotehnologiilor moderne n cadrul sectorului
public sau a celui privat.
n 1998, invocnd noul concept bazat pe principiu precauiei (precautionary
principle) adoptat n metodologia de evaluare a riscurilor (risk assessment) asociate
organismelor transgenice (Ponti et al., 2005), UE a introdus un moratoriu care interzicea
cultivarea i comercializarea OMG-urilor n spaiul comunitar, rspunznd astfel
ngrijorrilor referitoare la: posibilele efecte adverse asupra mediului i sntii omului,
durabilitatea noii tehnologii agricole, impactul pe care adoptarea ei l poate avea asupra
societii n general (Hails i Kinderlerer, 2003). Ulterior, Organizaia Mondial a
Comerului (World Trade Organization) a deliberat c moratoriul mpiedic libera
circulaie a mrfurilor, fiind necesar ridicarea interdiciilor referitoare la OMG-uri
(GMO Compass, 2006a).
Retragerea moratoriului a coincis cu adoptarea, la 18 aprilie 2004, a noii ligislaii
referitoare la OMG-uri, i.e. Regulamentul 1829/2003 i Regulamentul 1830/2003 (Jank et
al., 2005). Conform acestor acte normative, n cadrul UE, cultivarea OMG-urilor i
procesarea sau comercializarea sub form de alimente, furaje sau material sditor se face
doar dup autorizare. Pentru a fi autorizate, OMG-urile trebuie s ndeplineasc anumite
cerine referitoare la siguran i libera alegere, care au de fapt rolul de a asigura
coexistena, la orice nivel, cu produsele convenionale (Wikipedia, 2009s; GMO
Compass, 2006c). Este astfel protejat dreptul productorilor, comercianilor i
consumatorilor de a alege, iar instrumente ca trasabilitatea, etichetarea sau monitorizarea
post-market, introduse prin noile acte normative, au rolul de a permite identificarea
OMG-urilor de-a lungul lanului de producie i consum. Modul concret prin care li se
asigur consumatorilor posibilitatea de face o alegere informat este etichetarea
corespunztoare a produselor, aceasta trebuind efectuat chiar i n cazul n care
ingredientul MG nu poate fi detectat n produsul final. Previziunea este pus n practic
cu ajutorul trasabilitii care nlocuiete astfel, unde este cazul, dovezile analitice (GMO
Compass, 2007). Un alt instrument esenial n contextul etichetrii, este reprezentat de
testarea OMG.
Din cele prezentate anterior se poate concluziona c ingineria genetic i
produsele derivate din aceasta reprezint deja un domeniu important la nivel global, care
Testarea OMG

12
se dezvolt continuu, avnd potenialul de a genera numeroase beneficii dar i efecte
negative. Cu toate c pn n momentul de fa nu exist dovezi clare care s
fundamenteze temerile legate de posibile urmri nefavorabile ale utilizrii OMG-urilor,
se recomand o abordare prudent.



Fig. 1. Situaia global a culturilor transgenice la nivelul anului 2009.
Fig. 1. Global status of commercialized GM crops in 2009.
Surs: James (2009b).


n 1996, culturile comerciale de PMG-uri au ocupat 1,7 milioane ha, fiind
prezente n SUA, China, Canada, Argentina, Australia i Mexic (Nap et al., 2003; James,
1998). Ulterior, plantele transgenice s-au rspndit rapid, fiind utilizate n prezent pe
Testarea OMG

13
toate continentele globului. Cea mai mare parte din culturile de plante transgenice este
concentrat n SUA, Argentina, Brazilia, India i Canada care, mpreun cu alte cteva
ri, sunt considerate marile cultivatoare de plante transgenice ale lumii (biotech mega-
countries) (Figura 1).
n ara noastr, soia i porumbul au fost singurele plante MG cultivate n scop
comercial. Dei opoziia publicului fa de aceste culturi este, n general, evident,
fermierii susin c beneficiile economice obinute sunt considerabile. Aceste aspecte au
fost evideniate de rapoartele Serviciului Strin de Agricultur din cadrul
Departamentului de Agricultur al Statelor Unite (USDA Foreign Agricultural Service)
(Cionga, 2005; Higgins, 2000), precum i de publicaii de diverse tipuri. Astzi,
cultivarea PMG-urilor n Romnia se face pe suprafee relativ restrnse, n principal
datorit implementrii legislaiei europene care, odat cu aderarea rii noastre la UE, la 1
ianuarie 2007, a impus renunarea la soia MG. Aceast legislaie reglementeaz strict
domeniul biotehnologiilor, n special cultivarea PMG-urilor, astfel c, n cadrul UE i
implicit n Romnia, doar dou evenimente de transformare la porumb (i.e. MON810 i
T25) mai dein nc autorizare pentru cultivare (Comisia European, 2009; GMO
Compass, 2009). Trebuie ns remarcat c au fost deja fcute demersurile pentru
acordarea/nnoirea autorizaiei de cultivare, conform legislaiei adoptate n anul 2004, a
peste 100 de evenimente de transformare, inclusiv a celor dou menionate anterior
(Comisia European, 2009; GMO Compass, 2009).
n ceea ce privete activitatea de testare OMG, s-au creat i n Romnia premisele
dezvoltrii unui sistem adecvat, capabil s asigure punerea n aplicare a noilor prevederi
legislative europene (i.e. trasabilitatea, etichetarea i monitorizarea post-market a
produselor alimentare care conin OMG-uri) menite s asigure o alegere informat i
contient (informed choice) de-a lungul lanului de producie i comercializare (Lee et
al., 2006; Zafar et al., 2004). Concomitent, prin aceste mijloace se asigur i
implementarea prevederii Protocolului asupra Biosecuritii de la Cartagena (Cartagena
Protocol on Biosafety/CPB), referitoare la punerea la dispoziia statelor semnatare a
informaiilor necesare pentru luarea unor decizii informate n ceea ce privete importul
OMG-urilor pe teritoriul lor (el et al., 2008).
Testarea OMG

14
n vederea armonizrii politicilor naionale cu cele europene, n ara noastr, au
fost demarate procese de acreditare a unor laboratoare de testare OMG, care s
corespund standardelor acceptate la nivel internaional.
Activitatea de monitorizare presupune efectuarea unor analize moleculare
specifice, concretizate prin detecia, identificarea i cuantificarea materialului MG. n
practica testrii OMG sunt folosite metode analitice imunologice, bazate pe analiza
proteinelor, sau metode bazate pe tehnologia PCR (polymerase chain reaction) ce
utilizeaz ADN-ul ca analit, cele mai performante i deci cele mai utilizate fiind metodele
din a doua categorie (Morisset et al., 2009; el et al., 2008).
Etapa de detecie stabilete dac proba analizat conine sau nu material derivat
din OMG-uri. n acest scop se utilizeaz metode screening, iar rezultatul este calitativ
(pozitiv/negativ). Se efectueaz apoi o alt analiz calitativ care permite identificarea
precis a evenimentului de transformare, pentru a determina dac prezena acestuia pe
pia este autorizat. Ultima etap este reprezentat de cuantificarea coninutului de
OMG-uri, pe baza rezultatului acestei analize lundu-se decizia de etichetare a
produselor, n conformitate cu legislaia n vigoare. Cele mai utilizate protocoale de
cuantificare sunt bazate pe tehnica real-time PCR. n laboratoarele de testare, aceste etape
se desfoar secvenial, fiind integrate n cadrul unor metodologii specifice.
Datorit implicaiilor pe care le atrage dup sine, testarea OMG reprezint unul
dintre cele mai complexe tipuri de analize din cadrul controlului oficial al alimentelor i
furajelor (el et al., 2008). Un aspect foarte important referitor la procesul de acreditare
al laboratoarelor OMG este reprezentat de necesitatea validrii metodelor analitice.




Testarea OMG

15
Din cele prezentate anterior se poate desprinde concluzia c testatea calitativ i
cantitativ reprezint o component esenial a cercetrilor i aplicaiilor actuale n
domeniul OMG-urilor.
Prezenta lucrare descrie aspecte teoretice i practice referitoare la detecia i
cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 (soia Roundup Ready),
elemente ce au constituit una dintre direciile de activitate ale Universitii de tiine
Agricole i Medicin Veterinar (USAMV) Cluj-Napoca, n scopul implementrii
acestora n cadrul unui laborator naional pentru evaluarea i certificarea conformitii
produselor alimentare de origine vegetal ce conin OMG-uri. Laboratorul a fost denumit
CERT-OMG. Aceast direcie se nscrie n contextul armonizrii politicilor naionale
cu cele europene.
n capitolele urmtoare vor fi prezentate particularitile teoretice i practice ale
etapelor testrii OMG, n conformitate cu principiile descrise n literatura de specialitate
(ex. Querci et al., 2005, sau Querci, 2004):
- identificarea i caracterizarea materiilor prime i a produselor alimentare ce
vor fi testate;
- revizuirea procedurilor de eantionare;
- pregtirea probelor pentru analiz;
- extracia ADN-ului;
- evaluarea caracteristicilor extractelor obinute;
- detecia OMG-urilor i identificarea evenimentelor de transformare utiliznd
metode bazate pe reacia PCR;
- cuantificarea coninutului MG prin real-time PCR;
- validarea in-house a metodelor de lucru n vederea parcurgerii procesului de
acreditare.
Activitile descrise n aceast lucrare au avut ca surse principale de finanare
urmtoarele granturi de cercetare: CEEX, Modul IV (229/2006), Laborator naional de
referin pentru evaluarea i certificarea conformitii produselor de origine vegetal care
conin organisme modificate genetic CERTOMG, director Doru Pamfil, USAMV
Cluj-Napoca; Platforme MEC (97/2006), Platform de biotehnologii bazat pe
cunoatere, director Doru Pamfil, USAMV Cluj-Napoca; CNCSIS/BD (BD-129),
Testarea OMG

16
Studiul coninutului de organisme modificate genetic din unele produse alimentare pe
baz de soia i porumb, director Cristian Radu Sisea; CNCSIS/TD (TD-414), Studiul
coninutului de organisme modificate genetic din unele produse alimentare pe baz de
soia i porumb, director Cristian Radu Sisea.
Dorim s mulumim pe aceast cale colegilor din cadrul USAMV Cluj-Napoca i
din afara universitii, precum i tuturor celor care, ntr-un fel sau altul, s-au implicat i
au avut o contribuie pozitiv n activitatea noastr din acest domeniu.

Cluj-Napoca 2009
Autorii

Testarea OMG

17

CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL N DOMENIUL OMG-URILOR
CHAPTER I. CURRENT STATUS IN THE FIELD OF GMOs


1.1. ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC
1.1. GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS

1.1.1. Introducerea OMG-urilor
1.1.1. Introduction of GMOs

Exceptnd liniile modificate genetic (MG), rspndite astzi n aproape toate
regiunile globului, cultivarurile utilizate la scar larg pentru obinerea produselor
alimentare sunt rezultatul domesticirii formelor slbatice iniiale. Acest lucru se poate
realiza printr-un proces continuu de selecie i ameliorare, n vederea creterii
productivitii i calitii recoltelor, a rezistenei la atacul duntorilor i la condiiile
nefavorabile de mediu, precum i a pretabilitii la tehnologiile moderne de cultur
(Querci et al., 2004a). Procesele de selecie i ameliorare, presupun transferul sau
recombinarea caracteristicilor dorite prin ncruciri, n cadrul speciei, sau ntre grupuri
de specii nrudite i compatibile din punct de vedere sexual.
Metodologia clasic de recombinare a genelor responsabile pentru expresia
caracterelor de interes, necesit un consum semnificativ de timp i resurse materiale
(Querci et al., 2004a). Un dezavantaj major este reprezentat de incapacitatea introducerii
unei singure caracteristici, fr a fi necesar recombinarea genoamelor ntregi. De aceea,
selecia i introducerea pe pia a unor varieti noi, ct mai stabile din punct de vedere
genetic, este nc un proces ndelungat. Cel mai important neajuns al ameliorrii clasice
este reprezentat ns de imposibilitatea transferului de material genetic ntre organisme
ndeprtate din punct de vedere taxonomic. Aceste dou limite pot fi depite, cel puin n
parte, prin aplicarea tehnologiilor de transformare genetic.
n Articolul 3 al Protocolului asupra Biosecuritii de la Cartagena, organismele vii
modificate (living modified organisms/LMOs) sunt definite ca fiind acele entiti vii
Testarea OMG

18
(inclusiv cele sterile, virusurile i viroizii) ce posed o nou combinaie de material
genetic obinut prin utilizarea biotehnologiilor moderne (CPB, 2000). Dei face referire
la aceeai categorie de fiine, Directiva Consiliului 2001/18/CE le numete organisme
modificate genetic, denumire care a fost preluat i este astzi utilizat n ntreaga lume,
la toate nivelurile. Conform Directivei, sintagma organism modificat genetic descrie
entitile vii, exceptnd fiinele umane, al cror material genetic a suferit modificri ce nu
pot fi generate prin mecanisme naturale de hibridare sau recombinare. n acest caz,
termenul organism subliniaz capacitatea entitii biologice n cauz de a se nmuli i
de a-i trasmite informaia genetic n descenden. Aplicat speciilor cultivate, sintagma
se refer la plantele n genomul crora a fost introdus stabil, prin transformare genetic,
informaie genetic provenit de la o alt specie, efectul dorit fiind exprimarea acesteia n
organismul gazd. Procesul de introducere i funcionare (exprimare) a genelor n specii
nenrudite este denumit transformare genetic. Evenimentele de transformare pot avea
un caracter temporar (tranzitoriu) sau permanent (integrativ), pentru aceast lucrare
prezentnd interes doar cele din a doua categorie.
Tehnologia, care s-a dezvoltat rapid n ultimii ani, ofer aplicaii pentru studierea
structurii i funcionrii genelor, dar mai important, pentru experimentele de inginerie
genetic la bacterii, drojdii, animale i plante superioare (Bruderer i Leitner, 2003). n
cazul plantelor, ingineria genetic presupune parcurgerea mai multor etape: identificarea
genei, construirea vectorului, transformarea, regenerarea eficient, analiza expresiei
genice, studiul transmiterii n descenden, evaluarea n cmp, comercializarea. Indiferent
de carateristicile nou introduse, PMG-urile joac un rol important n lrgirea fondului de
germoplasm al speciilor cultivate, oferind astfel soluii la anumite probleme legate de
tehnologia de obinere sau prelucrare i facilitnd sporirea beneficiile productorilor i
consumatorilor (Querci et al., 2004a; Bruderer i Leitner, 2003).

1.1.2. Metode de obinere a PMG-urilor
1.1.2. Methods for obtaining GMCs

Conform CPB (2000), prin biotehnologii moderne se nelege aplicarea:
Testarea OMG

19
- tehnicilor in vitro care utilizeaz acizii nucleici; sunt incluse n aceast
categorie tehnica ADN-ului recombinant i injectarea direct de acizi
nucleici n celule sau organite celulare;
- tehnicilor care depesc barierele naturale de recombinare sau reproducere
fiziologic, dar nu sunt utilizate n procedeele tradiionale de ameliorare i
selecie.
Tehnicile de modificare genetic la care se face referire n Anexa I a Directivei
2001/18/CE sunt aceleai cu cele menionate n Protocol, fcndu-se ns o delimitare
clar ntre ADN-ul recombinant i introducerea direct a ADN-ului ntr-un organism.
Fuziunea celular este de asemenea menionat separat.
Transformarea presupune deci introducerea unui segment de ADN care reprezint
o combinaie sintetic de elemente, ca promotori, gene structurale i terminatori, n
genomul unui organism denumit receptor (Bruderer i Leitner, 2003). Genele inserate
sunt preluate din organisme n care sunt prezente n mod natural, uneori putnd suferi o
serie de modificri nainte de a fi efectiv introduse n genomul receptor (ex. variantele
genei Cry care confer rezistena de tip Bt). Secvena promotoare, situat naintea
regiunii codificatoare, are rolul de a controla expresia acesteia n plant. Prezena
secvenei terminatoare, responsabil de ntreruperea transcripiei i poliadenilarea
captului moleculei de ARNm, este de asemenea necesar la sfritul regiunii
codificatoare. Aceast construcie, promotor-gen-terminator, se numete caset genic
(gene cassette) (Figura 2). n mod frecvent, dou sau mai multe casete genice sunt
utilizate pentru realizarea unui insert (construcie genic). Pe lng gena de interes i
elememntele regulatoare ale acesteia, ntr-un insert pot fi prezente i alte elemente
genetice, rolul acestora fiind de a controla i stabiliza funcia genei, sau de a facilita
combinarea diferitelor elemente ale construciei genice (Bruderer i Leitner, 2003).
Insertul va fi integrat doar pe unul dintre cromozomii prezeni n genomul di- sau
poliploid (inserare neomoloag) al organismului transformat care este astfel heterozigot
(hemizigot). De aceea, transformarea este deseori urmat de backcrossing, n vederea
obinerii unei linii transgenice homozigote. Ulterior, cel puin n cazul porumbului,
companiile productoare de semine ncrucieaz elita transgenic homozigot cu linii
netransformate, n vederea producerii unor hibrizi comerciali care prezint, att
Testarea OMG

20
secvenele transgenice, ct i caracteristicile superioare obinute prin ameliorare clasic.
Aceti hibrizi comerciali sunt astfel hemizigoi pentru caracterul transgenic (Moens et al.,
2005; Berdal i Holst-Jensen, 2001).




(a)











(b)

Fig. 2. Reprezentare simplificat a unui insert/unei construcii genice. (a) Insert format dintr-
o singur gen i elementele sale necesare pentru exprimare, i.e. promotorul i terminatorul.
(b) Prezena a dou casete genice, n cadrul aceluiai insert.
Fig. 2. Simplified representation of a typical insert/gene construct. (a) Insert containing a
single gene and its necessary components for expression, i.e. the promoter and the
terminator. (b) Two gene cassettes as part of the same construct.
Dup Bruderer i Leitner (2003), modificat.


Prima metodologie folosit pentru modificarea genetic a plantelor a fost creat n
anii 1980 i utiliza specia bacterian Agrobacterium tumefaciens pentru integrarea genei
de interes n organismul gazd (Querci et al., 2004a). Agrobacterium infecteaz n mod
natural doar anumite specii dicotiledonate, multe plante de interes economic fiind la
nceput inaccesibile acestui tip de transformare (ex. cerealele). Pentru inducerea
modificrilor genetice la aceste specii, au fost create alte metode de transformare, directe
sau indirecte, caracterizate ns print-o frecven redus a transformrilor stabile (Davey
et al., 1989). Cel mai important avantaj al transformrii mediate de Agrobacterium
rmne ns reducerea numrului de copii ale transgenei inserate n genomul receptor
(Querci et al., 2004a).
Testarea OMG

21
Tehnicile menionate mai sus permit doar introducerea aleatorie a genelor de
interes n genomul plantelor (Bruderer i Leitner, 2003). Casetele genice sunt inserate
ntr-o singur copie sau repetate n tandem, n forme trunchiate sau rearanjate, n unul sau
mai muli loci. Inseria aleatorie n genomul receptor poate cauza efecte pleiotrope i de
poziie, neprevzute. O posibil rezolvare pentru inseria aleatorie este reprezentat de
tehnica ZNF (zinc-finger nuclease) care permite manipularea precis a genomului unui
organism. Aplicaiile ZNF sunt nc reduse. Pentru mai multe informaii se pot consulta
urmtoarele surse: Sigma-Aldrich (2009), Wikipedia (2009t), Zinc Finger Consortium
(http://www.zincfingers.org/default2.htm).
Metodele de transformare disponibile n prezent permit introducerea sau
modificarea caracteristicilor asociate cu expresia unei singure gene. Cele mai importante
caracteristici agronomice au ns o expresie poligenic. Manipularea acestora prin
metodele ingineriei genetice necesit aprofundarea cercetrilor i crearea tehnicilor de
izolare, reconstruire i transfer n complex al poligenelor.
Pentru obinerea plantelor transformate genetic, cele mai utilizate metode sunt
urmtoarele: transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens, transferul indirect
prin bombardare cu microparticule (metoda biolistic sau metoda tunului de particule),
trasferul direct de ADN (Zafar et al., 2004).

1.1.2.1. Transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens
1.1.2.1 Agrobacterium tumefaciens mediated transformation

A. tumefaciens este o specie de bacterii patogene aerobe, care triete n sol i are
capacitatea natural de a transfera un segment de ADN, denumit T-ADN (transfer
DNA) i localizat la nielul plasmidului Ti (tumor inducing), n genomul plantelor
superioare pe care le infecteaz (Zafar et al., 2004; Bruderer i Leitner, 2003). T-ADN-ul
este integrat stabil ntr-unul dintre cromozomii celulei gazd i exprimat ulterior,
determinnd proliferarea excesiv a esuturilor, sub forma de rdcini sau excrescene
canceroase specifice (McClean, 1998). Ptrunderea celulelor bacteriene n planta gazd
se realizeaz doar prin rni deschise. A. tumefaciens infecteaz n mod natural peste 330
de genuri i 640 de specii de plante, majoritatea fiind dicotiledonate (McClean, 1998).
Testarea OMG

22
Procesul de transfer are loc doar la nivelul materialului genetic al celulelor
infectate din cadrul organismelor gazd i a constituit punctul de plecare pentru crearea
unui protocol de transformare la plante (Zafar et al., 2004). Ulterior, procedeul de
transformare a fost optimizat, realizndu-se progrese considerabile n obinerea OMG-
urilor, iar transformarea mediat de bacteriile din specia A. tumefaciens a devenit,
probabil, cea mai eficient metod de tranformare (Bruderer i Leitner, 2003).
Strategia transformrii mediate de A. tumefaciens presupune eliminarea genelor
bacteriene care produc tumora, n locul lor fiind plasat insertul ce trebuie transferat.
Aceasta are deci la baz proprietatea conform creia orice fragment strin de ADN plasat
ntre secvenele ce mrginesc iniial T-ADN-ul, poate fi transferat n celulele plantelor
prin infecie. Este astfel posibil introducerea genei de interes n celulele plantei fr a
cauza tumora (Querci et al., 2004a). Secvenele ce mrginesc T-ADN-ul sunt denumite
TR (T-ADN right) i TL (T-ADN left), doar prima fiind considerat indispensabil
procesului de transfer (McClean, 1998).
Dezavantajul major al acestui eficient sistem de transformare rezid n capacitatea
natural a bacteriilor A. tumefaciens de a infecta doar anumite specii de plante (Bruderer
i Leitner, 2003). Din aceast cauz se ntmpin dificulti n generalizarea metodei de
transformare la toate plante de cultur, cea mai important excepie fiind grupa
cerealelor. Cercetrile din ultimii ani au determinat ns perfectarea unor protocoale de
transformare i pentru speciile considerate recalcitrante (ex. Pcurar et al., 2008).
Sistemul a fost intens utilizat pentru trasformarea ctorva specii importante de
cultur ca tomate, canola, bumbac i cartofi, obinndu-se peste 40 de linii MG (Bruderer
i Leitner, 2003).

1.1.2.2. Transferul direct de ADN
1.1.2.2. Direcet tranfer of DNA

Transferul direct de ADN n celulele plantelor se poate realiza utiliznd ageni
fizici sau chimici, care au rolul de a media ptrunderea i integrarea informaiei genetice.
Pe aceste ci (n special prin electroporare), au fost obinute o serie de varieti
transgenice de porumb i orez (ex. Bt11, MS3, MS6, T14 sau T25, respectiv LLRICE05
Testarea OMG

23
sau LLRICE62). Pentru ca transferul s aib loc, pereii protectori ai celulelor receptoare
trebuie ndeprtai, rezultnd astfel protoplatii. Acest tip de celul reprezint stuctura
ideal pentru introducerea ADN-ului i selecia evenimentelor transgenice deoarece
pereii celulari constituie un impediment major n calea integrrii informaiei genetice
strine n celul (Zafar et al., 2004). Dezavantajul metodei este reprezentat de rata
sczut de regenerare a plantelor din protoplati (Querci et al., 2004a), motiv pentru care
aceast metod nu s-a rspndit foarte mult n practic.
Cele mai utilizate metode din aceast categorie sunt prezentate n continuare.

Transformarea cu ajutorul substanelor chimice

Un exemplu din aceast categorie este polietilenglicolul (PEG), substan care are
capacitatea de a modifica proprietile membranei plasmatice, determinnd
permeabilizarea reversibil a acesteia, ceea ce permite ptrunderea macromoleculelor
strine n citoplasm. Primul succes utiliznd aceast metod a fost nregistrat n 1984 i
a constat n transferul i exprimarea T-ADN-ului provenit de la A. tumefaciens n
protoplati de tutun (Zafar et al., 2004).

Transformarea prin microinjecie

Acest tip de transformare a cunoscut o larg rspndire odat cu crearea i
dezvoltarea tehnicilor de micromanipulare (Zafar et al., 2004). Primele rezultate de
transformare genetic utiliznd aceast metod au fost obinute la oarece, specie la care
microinjecia a devenit o procedur de rutin. La plante ns, situaia difer mult datorit
particularitilor celulelor vegetale: pereii celulari conin straturi de lignin i celuloz
care sunt mai greu de penetrat cu instrumentele disponibile n prezent, iar vacuolele
conin diferite hidrolaze i compui toxici a cror eliberare accidental n citoplasm
poate determina moartea celulei/protoplastului. O soluie pentru cea de-a doua problem,
este evacuolarea protoplatilor, eficiena regenerrii scznd ns i mai mult. Metoda a
fost aplicat cu succes pentru transformarea celulelor germinale, precum i a
grunciorilor de polen, folosii ulterior pentru fertilizri in vitro.
Testarea OMG

24
Transformarea prin electroporare

Metoda const n expunerea protoplatilor la impulsuri electrice care determin
permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice, facilitnd transferul ADN-ului
(Zafar et al., 2004). Principalele avantaje ale acestei metode, comparativ cu tratamentele
chimice, sunt simplitatea i frecvena mai mare de intregrare a ADN-ului (Zafar et al.,
2004). Electroporarea aplicat protoplatilor prezint totui anumite limite, cauzate de
specificitatea sistemului de cultur al acestora, motiv pentru care transferul de ADN prin
electroporare nu s-a extins semnificativ.

1.1.2.3. Transferul genelor prin metoda biolistic
1.1.2.3. Gene transfer using the biolistic method

O cale de eliminare a limitelor datorate dificultilor regenerrii plantelor din
protoplati i capacitii bacteriilor Agrobacterium de a infecta doar anumite specii de
plante, este reprezentat de utilizarea bombardamentului cu microparticule. Procedeul se
numete i metoda tunului de particule sau metoda biolistic. n acest caz, transformarea
poate fi aplicat unei game foarte variate de explante, ca: suspensii de celule
embriogenice, meristeme, embrioni, embrioni imaturi i polen (Zafar et al., 2004;
Bruderer i Leitner, 2003).
n principiu, metoda presupune bombardarea celulelor sau esuturilor cu particule
de tugsten sau aur, de dimensiuni micoscopice, cptuite cu ADN-ul care trebuie
transferat. Avantajul acestei metode este faptul c aproape orice tip de esut care are
potenialul de a regenera plante poate fi utilizat ca int pentru ADN-ul strin.
Primul dispozitiv folosit pentru transformare utiliza ncrcturi cu praf de puc
pentru accelerarea particulelor. Ulterior, au fost create sisteme n cadrul crora
accelerarea particulelor se face prin intermediul aerului sau a altor gaze comprimate sau
prin descrcri electrice (puls electrostatic) (Zafar et al., 2004; Bruderer i Leitner, 2003).
n anul 1988, soia a fost prima specie modificat genetic, utiliznd metoda
biolistic (Zafar et al., 2004), iar ulterior au fost obinute linii transgenice la ali peste 20
de taxoni printre care i porumbul, tutunul su bumbacul (Bruderer i Leitner, 2003).
Testarea OMG

25
Unii autori includ metoda biolistic n grupa metodelor de transfer direct (Zafar et
al., 2004).

1.1.3. Generaiile de PMG-uri
1.1.3. Generations of GMCs

n vederea evalurii riscurilor i beneficiilor asociate plantelor transgenice, este n
primul rnd necesar s deosebim diferitele tipuri sau generaii de PMG-uri. O astfel de
clasificare a fost fcut de Pretty (2000).
Prima generaie de PMG-uri a fost comercializat nc din a doua jumtate a
anilor 1990, servind n principal ca produse comerciale care s aduc beneficii materiale
companiilor productoare (ex. soia Roundup Ready produs de Monsanto).
Principalele caracteristici noi introduse n plantele transgenice din prima generaie
sunt:
- tolerana la ierbicide (herbicide tolerance/HT);
- rezistena la insecte (insect resistance/IR);
- coacerea rapid, introdus la tomate;
- modificarea enzimelor bacteriene pentru utilizarea n diferite ramuri ale
industriei;
- culoare modificat a speciilor floricole (ex. garoafe).
PMG-urile din a doua generaie au aprut spre sfritul anilor 1990, fiind mai
puin rspndite ca produse comerciale. Principalele caracteristici introduse sunt:
- rezistena viral, introdus la orez, manioc, papaia sau prun;
- rezistena la nematozi, introdus la cereale i alte plante de cultur;
- genele terminator;
- tolerana la nghe introdus la cpuni, sfecla de zahr, tomate sau cartof;
- producerea substanelor cu importan farmaceutic (pharming).
PMG-urile din a treia generaie sunt n curs de dezvoltare, direciile de inovare
fiind urmtoarele:
- tolerana la stresul abiotic;
Testarea OMG

26
- modificri fiziologice ale plantelor de cultur pentru a crete eficiena
utilizrii resurselor naturale (ap, nutrieni, lumin), determinndu-se astfel,
o cretere mai rapid, o prelungire a duratei de vegetaie, modificri ale
coninutului hormonal sau ntrzierea mbtrnirii frunzelor n scopul
producerii unor cantiti mai mari de carbohidrai;
- obinerea plantelor de cultur apomictice care permit reutilizarea smnei
hibride;
- obinerea plantelor vaccin;
- crearea i utilizarea unor gene marker noi, care s le nlocuiasc pe cele de
rezisten la antibiotice (antibiotic resistant marker genes/ARMGs);
- extinderea aplicaiilor n domeniul farmaceutic.
n contrast cu primele dou generaii de PMG-uri, cea de-a treia este mult mai
bine direcionat nspre beneficiul utilizatorului final (Pretty, 2000). Exist astfel direcii
de cercetare ce vin n ntmpinarea unor probleme cu care se confrunt rile n curs de
dezvoltare. Un exemplu n acest sens este stresul abiotic (i.e. seceta, ngheul, excesul de
sruri i metale grele) care reprezint o limit major pentru producia agricol din
regiunile srace (FAO, 2002) i care primete tot mai mult atenie n ultima vreme.
Acelai trend se remarc i n cazul aa-numitelor plante vaccin.

1.1.4. Elementele genetice introduse n OMG-uri
1.1.4. Genetic elements inserted n GMOs

Analiza elementelor genetice introduse n plantele de cultur MG aprobate pentru
comercializare, reprezint baza pentru crearea i dezvoltarea metodelor de testare OMG.
Elementele frecvent ntlnite n plantele MG pot fi utilizate pentru crearea unor metode
de screening (i.e. detectarea concomitent a prezenei ct mai multor OMG-uri). Trebuie
totui avut n vedere faptul c ntre elemente genetice de acelai tip pot exista deosebiri
de secven (Morisset et al., 2009; Bruderer i Leitner, 2003). Ulterior deteciei,
evenimentele de transformare vor fi identificate specific pe baza elementelor care le
compun. Aceste secvene vor fi utilizate i n protocoalele de cuantificare.
Testarea OMG

27
n continuare sunt prezentate genele i elementele regulatoare (promotori i
terminatori) utilizate la obinerea plantelor transgenice pentru care exista aprobare de
comercializare la nivelul anului 2003. Datele au fost publicate de Bruderer i Leitner
(2003).
Cele mai rspndite elemente genetice prezente n PMG-uri provin de la A.
tumefaciens i Virusul Mozaicului Conopidei (Cauliflower Mosaic Virus/CaMV). Dintre
cele 66 de PMG-uri analizate n studiul menionat, 62 conin cel puin o secven genic
derivat de la unul dintre organismele menionate anterior. Datele statistice prezentate n
studiu nu au luat n considerare PMG-urile cultivate n Japonia i China i nici plantele
decorative, informaiile moleculare aferente acestor categorii fiind lipsite de certitudine.
Unul dintre cei mai importani factori pentru atingerea nivelelor dorite de expresie
a transgenelor, este reprezentat de promotorul ales pentru a controla transcripia. Datele
prezentate n Figura 3 indic prezena cte unei copii a promotorului constitutiv 35S (P-
35S) de la CaMV, sau a unui promotor derivat din acesta, ntr-un numr ridicat de plante
transgenice comerciale. Din acest motiv, P-35S este des utilizat ca int pentru
screeningul OMG-urilor. Compararea secvenelor promotorului P-35S prezent n diferite
OMG-uri a evideniat faptul c acestea nu sunt perfect identice (ex. Morisset et al., 2009).


P-35s
56
P-nos
11
P-FMV
8
P-Ssu
9
altele
23
P-TA29
6
nda
1
bacterian
22
Fig. 3. Frecvena promotorilor utilizai n plantele de cultur
transgenice autorizate pentru comercializare nainte de 2003.
Fig. 3. Frequency of occurrence of the most often used promoters
in the genetically engineered crop plants authorized before 2003.
Dup Bruderer i Leitner (2003).


Testarea OMG

28
Trebuie menionat de asemenea c dintre cei 29 de promotori utilizai n
transgenez, 20 erau prezeni doar n cte un eveniment de transformare.
Peste 40 de gene distincte au fost utilizate pentru obinerea evenimentelor de
transformare (Figura 4). Transgena cea mai frecvent utilizat este nptII, provenit de la
specia E. coli. Aceasta confer rezisten la anumite antibiotice aminoglicozidice, fiind
prezent, n 1996, n 61% din plantele MG analizate. Conform sursei menionate anterior,
doar 44% din plantele transgenice conineau aceast gen. Dup nptII, cele mai frecvent
transgene sunt cele denumite generic Cry. Aceast categorie include foarte multe
variante optimizate ale genelor native de la Bacillus thuringiensis, care produc forme
diferite ale endotoxinei delta. Dintre genele Cry, cele utilizate sunt formele Cry1A(b) i
Cry3A. Dup nptII i Cry urmeaz genele CP4 EPSPS i bar, prezente fiecare n peste
zece evenimente de transformare.


cry
20
pat
11
aad
7
bla
6
nitrilaza
5
barnase
8
gox
7
bar
15
nptll
29
altele
37
CP4EPSPS
12

Fig. 4. Frecvena utilizrii transgenelor n plantele de cultur
transgenice autorizate pentru comercializare nainte de 2003.
Fig. 4. Frequency of occurrence of the most often used genes in
the genetically engineered crop plants authorized before 2003.
Dup Bruderer i Leitner (2003).


n Figura 5 sunt prezentai terminatorii utilizai, menionndu-se originea i
numrul OMG-urilor n care au fost utilizai.


Testarea OMG

29
T-35s
17
T-tml
4
nda
3
T-cos
5
T-E9
12
bacte rian
22
T-nos
37
altele
19

Fig. 5. Frecvena utilizrii terminatorilor n plantele de cultur transgenice
autorizate pentru comercializare nainte de 2003.
Fig. 5. Frequency of occurrence of the most often used terminators introduced
into the genetically engineered crop plants authorized before 2003.
Dup Bruderer i Leitner (2003).


1.1.5. Rspndirea PMG-urilor
1.1.5. Status of GMCs adoption

Biotehnologiile moderne reprezint sectorul asociat sistemului medical i agro-
alimentar cu cea mai rapid dezvoltare, iar transgeneza are potenialul de a revoluiona n
continuare aceste segmente, dar i de a produce efecte negative asupra mediului i
sntii (Pretty, 2000). Exist aproximativ 2000 de companii n SUA i peste 700 n UE
care i desfoar activitatea n domeniul biotehnologiilor, majoritatea aplicaiilor fiind
ns destinate sistemului sanitar. n sectorul agro-alimentar piaa este dominat doar de
cteva companii multinaionale (ex. Monsanto, Syngenta Seeds, Aventis CropSciences,
DuPont, DOW AgroSciences, Bayer CropScience sau Pioneer Hi-Bred), unele fiind lideri
i pe piaa de material semincer i pesticide (Pretty, 2000).
Majoritatea plantelor transgenice comercializate n momentul de fa prezint cel
puin una dintre urmtoarele caracteristici (James, 2007; James, 2005; Ponti et al., 2005;
James, 2003; Querci et al., 2004a; Pretty, 2000):
- rezistena la un ierbicid total (ex. soia, sfecla de zahr i bumbacul Roundup
Ready sau rapia LibertyLink); permite utilizarea ierbicidului pentru
combaterea buruienilor far a afecta cultura; reprezint cea mai rspndit
caracteristic a PMG-urilor;
Testarea OMG

30
- rezistena la insecte, n special n cazul porumbului i a bumbacului, prin
expresia unei gene de la Bacillus thuringiensis (rezisten de tip Bt); toxina Bt
cu aciune insecticid este exprimat n toate tesuturile plantei, eliminnd
insectele erbivore i reducnd necesitatea aplicrii pesticidelor convenionale.
La mijlocul anilor 1990, cultivarea n scop comercial a OMG-urilor era aproape
inexistent, extinderea acestora n culturile agricole fcndu-se ns foarte rapid n anii
care au urmat introducerii lor pe pia. Astfel, din 1996 i pn la sfritul anului 2008,
suprafaa global cultivat cu OMG-uri a crescut de aproape 80 ori, ajungnd n prezent
la 134 milioane hectare (Figura 6), ceea ce reprezint aproximativ 8% din suprafaa
agricol mondial. Principalele ri cultivatoare de PMG-uri au fost i n 2009 SUA,
Argentina, Brazilia, India, Canada i China (James, 2009b).



Fig. 6. Evoluia suprafeei (milioane ha) globale cultivate cu plante transgenice.
Fig.6. Global area (million hectares) of biotech crops.
Surs: James (2009b).


n UE, cultivarea OMG-urilor se face la scar mult mai mic, importurile pentru
procesare sub form de alimente i furaje fiind ns foarte frecvente.
n prezent, la nivelul UE, au fost autorizate sau sunt n curs de autorizare 118
notificri (62 pentru evenimente de transformare la porumb, 22 la bumbac, 12 la rapi,
11 la soia, cinci la plante decorative, trei la sfecl de zahr, dou la cartof i unul la orez)
Testarea OMG

31
(Comisia European, 2009; GMO Compass, 2009). Date actualizate referitoare la situaia
procesului de autorizare, compania notificatoare i modul de utilizare pot fi accesate pe
site-ul Comisiei Europene (vezi Comisia European, 2009) i pe site-ul GMO Compass
(vezi GMO Compass, 2009). Trebuie menionat ns c numrul real al evenimentelor de
transformare prezente n aceast list este mai mic, deoarece unele au fost autorizate n
conformitate cu legislaia n vigoare nainte de 24 aprilie 2004, iar n prezent sunt
naintate pentru autorizare i sub noua legislaie, introdus dup data menionat anterior.
Speciile la care se ntlnesc cele mai mari suprafee cu linii transgenice sunt soia,
bumbacul, porumbul i rapia (James, 2009a; James 2009b; James 2008; Cardarelli et al.
2005). Situaia suprafeelor aferente acestor culturi, la nivelul anului 2008, este prezentat
n Figura 7.



(a) (b)
Fig. 7. Situaia principalelor culturi transgenice. (a) Rata de introducere n cultur a cultivarurilor transgenice.
(b) Evoluia suprafeelor (milioane ha) cultivate cu principalele plante transgenice.
Fig. 7. Status of principal biotech crop species. (a) Global adoption rates for principal biotech crops. (b) Global
area (million hectares) of biotech crops.
Surs: James (2009a).


Cionga (2005) precizeaz c, n 2001, n ara noastr erau cultivate cu soia
transgenic aproximativ 15.000 ha, suprafaa ajungnd la peste 50.000 ha la nivelul
anului 2004. Romnia s-a meninut n categoria rilor cu peste 50.000 ha culturi
transgenice i n anii urmtori (James, 2008), soia Roundup Ready deinnd n continuare
cea mai mare proporie n aceast categorie. Aceste informaii corespund celor oferite de
Direcia General Elaborare Strategii, Politici Sectoriale i de Pia, din cadrul Ministerul
Testarea OMG

32
Apelor, Pdurilor i Dezvoltrii Rurale (MAPDR), cu ocazia celei de-a VII-a Conferine
a Asociaiei Bioagricultorilor din Romnia Bioterra (Dinu, 2006). Conform datelor
prezentate, n 2005, culturile de soia Roundup Ready ocupau o suprafa de circa 86.000
ha, preconizndu-se c suprafaa va ajunge la 126.000 ha spre sfritul anului 2006, ceea
ce reprezenta aproximativ 10% din suprafaa agricol total a rii. n perioada respectiv
existau peste 1.100 de cultivatori de soia transgenic, rspndii n 31 de judee ale rii,
cele mai importante suprafee fiind localizate n Brila (~31.000 ha), Clrai (~24.000
ha), Ialomia (~20.000 ha), Timi (~17.000 ha) i Iai (~6.000 ha). Au fost de asemenea
identificate peste 4.000 ha de culturi neautorizate de soia MG. Pentru acelai an, recolta
de soia transgenic a fost estimat la aproximativ 200.000 t. Cultivarea soiei Roundup
Ready n ara noastr nu mai este posibil ncepnd cu 1 ianuarie 2007, data aderrii
Romniei la UE. De aceea, n anii 2008 i 2009, suprafaa atribuit culturilor transgenice
n ara noastr, a sczut sub nivelul de 50.000 ha (James, 2009a; James 2009b; James,
2008).

1.1.6. Impactul potenial al PMG-urilor
1.1.6. Potential impact of GMCs

Biotehnologiile reprezint o colecie de tehnici ce pot fi utilizate n domeniile
agro-alimentar, sanitar i industrial. Unele tehnologii, ca markerii moleculari,
manipularea i transferul genelor, pot fi aplicate n toate sectoarele agro-alimentare, n
timp ce altele sunt specifice doar anumitor ramuri: reproducerea vegetativ pentru
cultivarea plantelor, transferul de embrioni pentru creterea animalelor, schimbarea
sexului n piscicultur (FAO, 2002).
Opiniile referitoare la utilitatea i riscurile inerente utilizrii PMG-urilor sunt
foarte diferite. Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure i necesare
societii umane, n timp ce opozanii le consider neeseniale i potenial cauzatoare de
efecte negative asupra sntii i mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi ns
corect din simplul considerent c PMG-urile nu reprezint o categorie omogen, punerea
n balan a beneficiilor i riscurilor trebuind fcut pentru fiecare caz n parte (Pretty,
2000). Este de asemenea foarte important ca utilizarea la scar larg a PMG-urilor s se
Testarea OMG

33
fac dup o evaluare judicioas, existnd numeroase exemple ce evideniaz
oportunitatea acestei abordri: introducerea iepurilor n Australia, introducerea albinei
africane n America de Sud, introducerea zambilei de ap (Eichhornia spp.) n America
de Nord i Africa de Vest, introducerea rchitanului (Lythrum salicaria) n Noua
Zeeland i America de Nord.

Implicaii tehnice pentru practica agricol

Cele mai importante categorii de PMG-uri utilizate pn n acest moment prezint
caracteristici de rezisten la atacul unor duntori (ex. rezistena Bt mpotriva unor
lepidoptere), sau la aciunea anumitor erbicide totale (ex. glifosat sau glufosinat). Pe
lng acestea, au fost i vor fi mbuntite i alte caracteristici de producie
(AgResearch, 2000a; Deisingh i Badrie 2005):
- valoarea nutritiv;
- capacitatea de producie;
- perioada de pstrare, lucru ce poate favoriza transportul pe distane mai
mari;
- rezistena la lovire (ex. tomate), n vederea reducerii pierderilor;
- rezistena la condiii extreme de mediu (ex. secet, exces de sruri sau
temperaturi sczute).
Pentru productori, cultivarurile transgenice rezistente la ierbicide, boli sau
duntori nseamn n primul obinerea unor recolte mai profitabile (MAF, 1996), ceea ce
se poate reflecta n reducerea preurilor de vnzare ctre consumatorul final (AgResearch,
2000a).
n urma studiilor efectuate, Raney (2006) a concluzionat c utilizarea PMG-urilor
prezint avantaje deosebite pentru fermele cu suprafee mai reduse comparativ cu fermele
de dimensiuni mari, precum i pentru micii cultivatori din rile n curs de dezvoltare.
Totui, pentru ca fermierii s poat beneficia de pe urma culturilor transgenice, este
necesar existena unui sistem instituional capabil s asigure i s favorizeze accesul
acestora la resursele i inovaiile potrivite.
Testarea OMG

34
Un alt avantaj oferit de tehnologia transgenic este posibilitatea de a reduce durata
programelor de ameliorare, grbind introducerea unor genotipuri superioare n circuitul
comercial (Querci et al., 2004a; MAF, 1996M).
n ceea ce privete posibilele dezavantaje ale PMG-urilor rezistente la erbicide,
exist o serie de factori care favorizeaz adaptarea populaiilor de buruieni la metoda de
control, ceea ce va face inutilizabil evenimentul de transformre. Va fi astfel necesar
nlocuirea varietilor care au ncorporat transgena, aciune foarte costisitoare, mai ales
dac acestea sunt utilizate la scar larg. Pericolul ca metoda de control s devin
ineficient exist i n cazul rezistenei de tip Bt (AgResearch, 2001; AgResearch,
2000b). n ambele situaii este ns posibil aplicarea unor strategii menite s reduc
presiunea de selecie. Pentru culturile Bt este recomandat asocierea cu liniile
convenionale, care s reprezinte refugii pentru dezvolarea indivizilor susceptibili la
msura de control, iar n cazul rezistenei la erbicide sunt necesare msuri integrate
pentru controlul buruienilor.

Inputurile din agricultur

PMG-urile rezistente la boli, duntori sau ierbicide vor necesita utilizarea unor
cantiti mai reduse de pesticide, favorizndu-se astfel reducerea inputurilor (substane de
combatere, combustibili fosili) i implicit a coninutului de reziduuri din produse i
mediu (Deisingh i Badrie, 2005; AgResearch, 2000a; MAF, 1996). n ceea ce privete
plantele rezistente la ierbicide, numeroase studii au artat ns c nivelul de utilizare a
substanelor de combatere nu a sczut n mod semnificativ, n unele cazuri nregistrndu-
se chiar creteri (Duke i Cerdeira, 2005; Pretty, 2000). Acest aspect nu este singurul care
trebuie avut n vedere. Astfel, Duke i Cerdeira (2005) consider c rata de utilizare a
unei substane active are o importan mai redus, accentul trebuind pus pe gradul de
toxicitate al acesteia. n acest context, glifosatul i glufosinatul de amoniu, singurele
substane de combatere utilizate n combinaie cu PMG-urile rezistente la ierbicide, nu se
caracterizeaz printr-o rat redus de aplicare, dar sunt considerate cu risc sczut n ceea
ce privete toxicitatea pentru consumatori i efectele asupra mediului.

Testarea OMG

35
Fluxul de gene

Dintre toate riscurile asociate PMG-urilor, acesta este probabil cel mai important
deoarece urmrile sale sunt ireversibile i dificil de controlat (Duke i Cerdeira, 2005). n
procesul de modificare genetic se utilizeaz ca markeri pentru selecie gene de rezisten
la antibiotice. Odat introduse n mediu i alimentaie, genele pot fi preluate de bacterii,
ducnd la apariia microorganismelor rezistente la antibiotice (superbugs) care nu vor
mai fi controlate eficient de sistemul medical (AgResearch, 2000b; Pretty, 2000; MAF,
1996). Trebuie avut ns n vedere c majoritatea acestor gene au fost larg rspndite n
natur nainte de utilizarea lor de ctre ingineria genetic (ex. nptII), fr a determina
efectele adverse amintite anterior. Apariia transferului orizontal de material genetic de-a
lungul filogeniei a fost demonstrat tiinific de diferii autori, prin modelare. Un astfel de
studiu a fost publicat de Drge et al. (1998), care au concluzionat c premisele
transferului orizontal a ADN-ului recombinant exist, frecvena de apariie fiind ns
neglijabil.
Un alt aspect de acest fel este reprezentat de posibila migrare (introgresie) a
genelor de rezisten la ierbicide, de la speciile cultivate la plante slbatice nrudite,
conferindu-le acestora din urm rezisten la aciunea ierbicidelor. n cazul n care
plantele respective se dezvolt pe suprafee cultivate, pot constitui o problem greu de
ndeprtat, fiind necesar modificarea sau chiar nlocuirea tehnologiei de baz
(AgResearch, 2001; Pretty, 2000). n cazul n care aceste plante constituie populaii
slbatice exist posibilitatea modificrii echilibrului natural n respectivele ecosisteme.
Totui, se apreciaz c genele de rezisten la ierbicide nu pot conferi singure avantaje
majore pentru supravieuire, care s influeneze selecia natural (Duke i Cerdeira,
2005). De asemenea, trebuie subliniat c fluxul de gene este un fenomen foarte complex,
pe lng simpla nrudire taxonomic a celor dou specii i prezena lor n acelai
ecosistem existnd un numr foarte mare de factori care influeneaz introgresia. n acest
context, Conner et al. (2003) numesc 24 de caracteristi genetice sau fiziologice, pe care le
grupeaz n urmtoarele categorii:
- factori care determin hibridarea i intervin naintea fecundrii;
- factori care determin hibridarea i intervin dup fecundare;
Testarea OMG

36
- factori care influeneaz apariia i dezvoltarea hibrizilor;
- factori care influeneaz persistena i propagarea plantelor hibride.
Dei clasificarea acestor factori este fcut diferit n alte lucrri (ex. Wilkinson i
Ford, 2007, sau Wilkinson et al., 2003), complexitatea fluxlui de gene reiese clar i n
aceste cazuri.

Impactul economic al PMG-urilor i investiiile n domeniul biotehnologiilor
agricole

Biotehnologiile moderne reprezint n primul rnd o surs foarte important de
venituri. Piaa global a PMG-urilor a fost estimat pentru anul 2008 la 7,5 miliarde USD
(James, 2008), ea avnd un mare potenial pentru rezolvarea anumitor probleme cu care
se confrunt domeniul agro-alimentar. De aceea, implicaiile de natur economic pe care
PMG-urile le genereaz, la toate nivelurile, sunt nsemnate, iar activitatea de cercetare i
dezvoltare este n continu cretere.
n domeniul biotehnologiilor agricole, existena marilor corporaii multinaionale
creaz premisele unei monopolizri a pieei libere, precum i impunerea unor dependene
restrictive pentru fermierii sraci (AgResearch, 2001). Un astfel de exemplu controversat
l reprezint aa-numita tehnologie terminator (genetic use restriction
technology/GURT) (Rao, 2008; ISF, 2003) care constituie o soluie extrem de eficient i
sigur de eliminare a fluxului de gene (MAF, 1996). n acest context, tehnologia
terminator presupune de fapt crearea unor linii transgenice sterile (MAF, 1996) utiliznd
mecanisme moleculare de inactivare genic (gene switching mechanisms) ce mpiedic
germinarea seminelor. Pentru companiile productoare de semine aceast tehnologie ar
putea constitui ns i un mijloc foarte eficient de protejare a drepturilor de proprietate
intelectual (intelectual property rights/IPRs), dat fiind faptul c majoritatea fermierilor
din rile n curs de dezvoltare, precum i un numr surprinztor de mare de fermieri din
rile industrializate, pstreaz o parte din recolta de semine pentru nfiinarea culturilor
urmtoare (Pretty, 2000). Datorit faptului c reprezint un subiect controversat,
tehnologia nu a fost deocamdat comercializat, dei aplicaii patentate exist nc din
anul 1998 (Rao, 2008).
Testarea OMG

37
Un alt subiect sensibil, determinat de complexitatea problematicii drepturilor de
proprietate intelectual, este reprezentat de posibilitatea creterii preurilor de vnzare a
produselor biotehnologice prin perceperea unor redevene de ctre companiile
productoare.
Majoritatea informaiilor publicate, referitoare la investiiile n activitile de
cercetare din domeniul biotehnologiilor agricole, conin date ce vizeaz doar plantele de
cultur. n cadrul acestei ramuri, majoritatea fondurilor (aproximativ 90%) provin din
sectorul privat al rilor dezvoltate (FAO, 2002). Tot acestui sector i este atribuit cea
mai mare pondere n ceea ce privete desfurarea activitilor de cercetare (65-80%). De
aceea, produsele sunt destinate n principal fermierilor din rile dezvoltate, acetia
dispunnd de mai multe resurse financiare ce le permit achiziionarea unor tehnologii
scumpe. Anumite componente ale biotehnologiilor prezint ns un potenial extraordinar
i pentru rezolvarea unor probleme cu care se confrunt fermierii din rile n curs de
dezvoltare (FAO, 2002). n urma cercetrilor efectuate, Raney (2006) a concluzionat c
tehnologia poate avea impact pozitiv pentru agricultorii sraci, acesta fiind ns foarte
dependent de anumii factori instituionali, ca legislaia referitoare la securitatea mediului
i a alimentelor, capacitatea naional de cercetare agricol, problematica drepturilor de
proprietate intelectual i piaa inputurilor agricole. De aceea, ultimii ani, n special 2008,
s-au remarcat printr-o cretere semnificativ a utilizrii PMG-urilor n ri srace sau n
curs de dezvoltare (James 2009a; James 2009b; James, 2008).
n cazul rilor n curs de dezvoltare se remarc o activitate intens din partea
sistemelor naionale de cercetare n domeniul biotehnologiilor agricole (FAO, 2002). n
acest context merit amintit exemplul Chinei, care datorit sprijinului acordat de guvern,
beneficiaz de o mare capacitate pentru cercetare n biologie molecular. China a ajuns s
dein mai mult de jumtate din investiiile n biotehnologiile vegetale realizate n rile
n curs de dezvoltare (Pray et al., 2002, n FAO, 2002), fondurile provenind aporape n
ntregime din sectorul public. De asemenea guvernul chinez dorete s investeasc n
continuare n activitile de cercetare-dezvoltare din acest domeniu (GMO Compass,
2008b), avndu-se n vedere ca pn n anul 2050 biotehnologiile s contribuie la
creterea economic ntr-o proporie de 25%.
Testarea OMG

38
Pn n 1996, cu excepia Chinei, toate aprobrile pentru comercializarea liniilor
MG au fost acordate unor companii din sectorul privat (James i Krattiger, 1996).
Aceast tendin s-a meninut pn n prezent. Se dorete ns tot mai mult dezvoltarea
aplicaiilor n sectorul public, att n cazul statelor dezvoltate (ex. SUA, Australia, Rusia
sau UE), ct i al celor n curs de dezvoltare (ex. China, India, Brazilia, Argentina, Mexic
sau Africa de Sud i alte ri din Africa), ca o msur de contracarare a influenei i
controlului companiilor multinaionale i n vederea favorizrii agricultorilor sraci.
Ca muli ali autori, Duke i Cerdeira (2005) subliniaz variabilitatea n timp i
spaiu a riscurilor i beneficiilor asociate utilizrii PMG-urilor. De asemenea numeroase
studii au artat c biotehnologiile agricole genereaz o serie de efecte negative, fr ns
a aduce beneficii substaniale. Concluzia care se desprinde din cele prezentate anterior
este cea evidenait de Pretty (2000) i anume, posibilitatea ca tehnologia s nu
funcioneze ntotdeauna conform ateptrilor. De aceea este foarte important utilizarea
raional i judicioas a acesteia, ntr-un mediu economico-social adecvat, crendu-se
astfel un potenial impresionant de profitabilitate la toate nivelurile la care este utilizat.

Biodiversitatea

Biodiversitatea este esenial pentru continuitatea vieii pe Terra, reprezetnd
practic fondul genetic care va permite organismelor s se adapteze i s fac fa
schimbrilor viitoare din ecosisteme (MAF, 1996). Oponenii biotehnologiilor
promoveaz ns ideea c introducerea OMG-urilor n mediu va afecta biodiversitatea i
astfel sustenabilitatea vieii.
Utilizarea la scar larg a liniilor transgenice va determina ngustarea numrului
de genotipuri existente n culturi (AgResearch, 2000b), existnd posibilitatea pierderii
acestora pentru totdeauna. Problema apare doar dac varietile transgenice sunt extrem
de performante, caz n care nu trebuie trecut cu vederea faptul c se vor obine recolte
mai mari i de calitate mai bun. De asemenea, trebuie remarcat similitudinea acestei
situaii cu strategia agricol modern care promoveaz cultivarea varietilor ameliorate
n defavoarea celor tradiionale (ex. Revoluia Verde n Mexic i India) (Wikipedia,
2009l). Pentru a contracara acest fenomen au fost constituite bnci de gene (ex.
Testarea OMG

39
Biodiversity International, http://www.bioversityinternational.org/, sau banca de gene
destinat speciilor rare i pe cale de dispariie din Transilvania, care este n curs de
construcie n cadrul USAMV Cluj-Napoca) care au ca obiectiv conservarea cultivarurilor
locale n vederea meninerii biodiversitii speciilor (MAF, 1996). Soluia este valabil i
n cazul OMG-urilor. De asemenea, sporirea produciilor la unitatea de suprafa
presupune reducerea ratei de luare n cultur a unor noi suprafee, favoriznd astfel
conservarea ecosistemelor naturale i implicit a biodiversitii (James, 2005; James,
2003).

Avantaje pentru sistemul sanitar

Vaccinarea clasic reprezint o strategie foarte scump pentru rile srace. O
alternativ mult mai ieftin i uor de aplicat o constituie producerea vaccinurilor n
plante (Checkbiotech, 2005). Concret, prin intermediul tehnicilor de inginerie genetic, se
realizeaz transferul unei pri din informaia genetic a agentului patogen n genomul
plantei. PMG-ul astfel obinut, denumit plant vaccin, va sintetiza o nou molecul,
care dup ingerare va funciona ca antigen. Aceast alternativ prezint potenialul de a
facilita accesul la imunizare prin inoculare n rile srace (AgResearch, 2001;
AgResearch, 2000a).
O alt direcie de cercetare este trasformarea plantelor n scopul mbuntirii
valoarii nutritive prin modificarea coninutului de vitamine, minerale, proteine,
carbohidrai sau grsimi. Un astfel de exemplu este orezul Golden Rice, concept introdus
de Ingo Potrykus n vederea creterii aportului de provitamin A n alimentaia
populaiilor cu diete deficitare din acest punct de vedere (ex. China) (Golden Rice
Project, 2009; Wikipedia, 2009k; AgResearch, 2000a).

Riscuri pentru sntatea consumatorilor i organismele non-int

Aceste riscuri sunt discutate pe larg n numeroase articole sau rapoarte oficiale
(ex. Deisingh i Badrie, 2005, SOT, 2003, Pretty, 2000, Altieri i Rosset, 1999, sau
Pretty, 1998). n ceea ce privete sntatea consumatorilor, exist posibilitatea ca PMG-
Testarea OMG

40
urile i produsele derivate din acestea s prezinte proprieti toxice sau alergenice
(AgResearch, 2001; AgResearch, 2000b; Pretty, 2000). Un exemplu n acest sens este
varietatea de soia n care a fost introdus o gen de la Bertholletia excelsa n vederea
mbuntirii calitilor nutriionale. Ulterior transformrii s-a constatat c proteina
introdus prezint proprieti alergenice, linia transgenic nemaifiind comercializat
(MAF, 2006; Pretty, 2000). Influena asupra organismelor non-int a constituit de
asemenea obiectul a numeroase studii i este o surs de intense controverse.
Cu toate c majoritatea autorilor au argumentat clar faptul c potenialul toxic sau
alergenic al OMG-urilor nu este diferit de cel al varietilor convenionale (SOT, 2003),
exist o serie de cercetri (vezi Wikipedia, 2009b, 2009i) care evideniaz apariia
efectelor adverse ca urmare a cultivrii PMG-urilor sau utilizrii acestora n alimentaie.
Comunitatea tiinific internaional consider ns incorect fundamentarea multora
dintre problemele reliefate (ex. Wikipedia, 2009b), unele fiind infirmate de cercetri
ulterioare (ex. Hellmich, 2008, sau Losey et al., 1999).

Asigurarea securitii alimentare

Fondul ONU pentru Populaie (UN Population Fund/UNFPA) preconizeaz c
pn n anul 2050 populaia Terrei va depi 9,2 miliarde, iar din aceasta aproximativ
80% se va regsi n rile n curs de dezvoltare (UNFPA, 2009), ceea ce va reprezenta o
provocare major pentru asigurarea necesarului de hran (Pretty, 2000). n acest context,
promovarea utilizrii PMG-urilor este determinat de potenialului acestora de a contribui
pozitiv la mbuntirea calitativ i cantitativ a recoltelor (Royal Society, 2003b, n
Deisingh i Badrie 2005; Pretty, 2000).
Un prim aspect care trebuie avut n vedere n aceast dezbatere este producia
global actual de hran. Astfel, dei la nivel mondial se produc alimente care pot asigura
o diet adecvat pentru toi locuitorii planetei (doar pentru cereale se produceau 354 kg
pe cap de locuitor anual, nainte de 2000), exist totui peste 800 milioane de oameni fr
hran suficient (Pretty, 2000). La nivelul perioadelor 2004-2005 i 2005-2006, producia
mondial de cereale pe cap de locuitor a sczut, meninndu-se ns n jurul valorii de
300 kg (FAO, 2005). Se desprinde astfel concluzia c lipsa hranei nu este cauzat de
Testarea OMG

41
insuficiena produciei agricole globale, ci doar de randamentul sczut n anumite zone i
de imposibilitatea distribuirii eficiente a surplusului de alimente, din cele cu excedent
spre cele deficitare. n aceste condiii, sporirea produciei trebuie s se realizeze n primul
rnd n zonele srace cu hran insuficient. Inovaiile tehnologice din ultimii ani, bazate
sau nu pe transgenez, nu reprezint ns soluia cea mai eficient pentru aceast
problem datorit preului ridicat de achiziie (Pretty, 2000). Cele mai potrivite tehnologii
sunt cele simple, ieftine i bazate pe principii agro-ecologice cu impact redus asupra
mediul nconjurtor (Pretty, 2000; Altieri i Rossett, 1999). Nu se sugereaz prin aceasta
c agricultura ecologic reprezint o soluie mai bun, aceasta fiind deja utilizat n
regiuni din Africa, Asia i America Latin, dar fr a reui ns s acopere necesarul de
hran. n concluzie, se recomand combinarea judicioas a diferitelor tehnologii de
cultur, n msura n care acest lucru este posibil, ntr-un cadru politico-economico-social
adecvat (James, 2005; James, 2003), fiind necesare n primul rnd msuri pentru
mbuntirea sistemului de distribuie al hranei la nivel global. n ceeea ce privete strict
ingineria genetic, trebuie acordat prioritate obinerii plantelor care s tolereze condiii
excesive de mediu (temperatur, secet, terenuri srturate etc.), n vederea valorificrii
supafeelor de teren inutilizabile n condiiile actuale (Atkinson, 1998, n Deisingh i
Badrie, 2005).

Implicaii de natur etic sau cultural (ethical, legal, and social issues/ELSI)

Utilizarea OMG-urilor poate afecta anumite convingeri sau valori culturale
(AgResearch, 2001 i 2000b). Aceste probleme pot fi ns depite prin etichetarea
corespunztoare a produselor i punerea la dispoziia publicului a informaiilor referitoare
la caracterul evenimentelor de transformare.
n sfera chestiunilor de natur etic sunt incluse: moralitatea aplicaiilor
biotehnologice, riscurile sociale, implicarea publicului n luarea deciziilor, utilizarea
drepturilor de proprietate intelectual n cadrul tiinelor vieii etc.
O problem semnificativ este reprezentat de modalitile de protest adoptate de
opozanii biotehnologiilor moderne, care mbrac deseori forme extreme (Anexa I). Unul
dintre cele mai evidente exemple de acest fel este termenul Frankenfood, inventat de
Testarea OMG

42
Paul Lewis nc din 1992 (Wikipedia, 2009i), care a devenit un laitmotiv al opoziiei fa
de PMG-uri i de alimentele derivate din acestea. Considerm c aceste opinii, exprimate
cu att de mare vehemen, sunt nefundamentate tiinific i contraproductive, iar
utilizarea lor contribuie mai degrab la derutarea opiniei publice dect la informarea
acesteia. Este regretabil c astfel de manifestri au avut loc i n Romnia i au dus la
pierderea unor culturi sau la stoparea unor activiti de cerceare.

Efecte asupra mediului nconjurtor

Numeroase studii au abordat aceast problematic din foarte multe puncte de
vedere (ex. Ferry i Gatehouse, 2009, Mishra, 2007, Thomson, 2006, sau Dale, 2002).
Concluzia general care se poate desprinde este c agricultura n sine reprezint o
activitate cu impact negativ asupra mediului natural, n acest context neexistnd de fapt
diferene semnificaive n cazul culturilor de PMG-uri, comparativ cu cele tradiionale.

Concluzie

Din cele prezentate anterior se poate concluziona c utilizarea PMG-urilor, ca n
cazul oricrei alte tehnologii, prezint o serie de avantaje, dar poate genera i riscuri
pentru mediu i sntate. Trebuie de asemenea subliniat c pericolul nu este reprezentat
ntotdeauna de tehnologia n sine, ci mai degrab de utilizarea iraional.
O serie din situaiile prezentate demonstreaz clar posibilitatea formulrii unor
preri diferite, sau chiar opuse, pe baza aceleiai informaii, datorit deosebirilor n ceea
ce privete percepia, valorile sociale, orientrile politice, sistemul legislativ i
capacitatea de aciune colectiv (Yogendra, 2004 n Deisingh i Badrie 2005). De aceea
considerm c informarea corect a publicului, precum i implemetarea metodologiei de
testare n laboratoare, sunt dou obiective importante n conjunctura comercializrii
PMG-urilor ca atare sau sub form de produse alimentare derivate, iar lucarea de fa
reprezint o contribuie la eforturile de atingere a acestora n ara noastr.

Testarea OMG

43
1.2. MONITORIZAREA OMG-URILOR
1.2. GMO MONITORING

1.2.1. Legislaia european i cea romneasc referitoare la OMG-uri
1.2.1. European and Romanian legislation on GMOs

Introducerea deliberat n mediu, cultivarea, schimburile transfrontaliere i
utilizarea n alimentaie a OMG-urilor sunt reglementate la nivelul UE de un set de
proceduri stricte ce alctuiesc un larg cadru legislativ (Mazzara et al., 2008). Primele acte
normative Comunitare, elaborate n 1990, cu scopul de a proteja sntatea oamenilor, a
animalelor i mediul, au fost Directiva Consiliului 90/219/CEE i Directiva Consiliului
90/220/CEE (Querci et al., 2004a).
n prezent, n cadrul UE, principalul instrument legal orizontal de reglementare n
domeniul biotehnologiilor este Directiva 2001/18/CE a Parlamentului European i a
Consiliului din 12 martie 2001 referitoare la introducerea deliberat n mediu a OMG-
urilor. Aceasta abrog Directiva Consiliului 90/220/CEE i ntrete reglementrile
existente referitoare la introducerea n mediu a OMG-urilor, aducnd totodat o serie de
principii noi, a cror implementare este obligatorie: evaluarea riscului (risk assessment)
asupra mediului i sntii, informarea cetenilor, etichetarea (labelling) i trasabilitatea
(traceability) n toate etapele plasrii pe pia, monitorizarea post-market (post-market
monitoring). Scopul Directivei este acela de a proteja sntatea oamenilor i mediul
nconjurtor, din perspectiva utilizrii deliberate a PMG-urilor, precum i asigurarea
coexistenei, la toate nivelurile, a produselor derivate din biotehnologii cu cele
convenionale. Se pun de asemenea bazele ntocmirii unui registru unic de eviden
molecular.
Directiva 2001/18/CE, implementat n fiecare stat membru prin acte normative
naionale, face referire, att la experienele n cmp, la scar mic (i.e. introducere
voluntar n scopuri experimentale) (seciunea B a Directivei), ct i la comercializarea
OMG-urilor (seciunea C a Directivei). Totodat, autorizaiile deja existente conform
Directivei Consiliului 90/220/CE sunt valabile pn la expirarea perioadei pentru care au
fost acordate, putnd fi apoi nnoite, conform noii legislaii. Acordarea autorizaiei se
Testarea OMG

44
face pentru o perioad de maxim zece ani ncepnd cu data la care este emis, putnd fi
nnoit. Amintim c situaia proceselor de autorizare a OMG-urilor pentru comercializare
n cadrul UE poate fi consultat pe site-ul Comisiei Europene sau pe site-ul GMO
Compass (vezi Comisia European, 2009, GMO Compass, 2009).
Pe lng directivele deja menionate, au fost elaborate i implementate o serie de
instrumente legale verticale care introduc norme specifice privitoare la aprobarea i
utilizarea n siguran a PMG-urilor destinate consumului. Astfel, plasarea pe piaa
comunitar a alimentelor i ingredientelor alimentare noi, a fost reglementat iniial prin
Regulamentul 258/97, ulterior fiind adoptat Regulamentul 1139/98, act normativ care a
introdus un model de etichetare pentru produsele alimentare derivate din OMG-uri.
Regulamentul 1139/98 a fost amendat de aa-numitul regulament al pragului limit
Regulamentul 49/2000 care aborda problema contaminrii accidentale. Aceasta fcea
obligatorie etichetarea produselor al cror coninut MG, la nivel de ingredient, depea
pragul de 1%. Pentru a ntri caracterul accidental al prezenei OMG-urilor, operatorii
aveau i obligativitatea de a prezenta dovezi care s ateste adoptarea msurilor de evitare
a contaminrii.
Treptat, s-a fcut simit nevoia adoptrii unor acte normative complete, unificate
i aduse la zi. n cele din urm, n octombrie 2003, dou noi Regulamente au fost
publicate, amendnd sau nlocuind legislaia deja existent n domeniu. Acestea sunt:
- Regulamentul 1829/2003 al Parlamentului European i al Consiliului din 22
septembrie 2003 privind produsele alimentare i furajele MG;
- Regulamentul 1830/2003 al Parlamentului European i al Consiliului din 22
septembrie 2003 privind trasabilitatea i etichetarea OMG-urilor i
trasabilitatea alimentelor destinate alimentaiei umane sau animale, produse
din OMG-uri, i de modificare a Directivei 2001/18/CE.
Cele dou regulamente, intrate n vigoare din 18 aprilie 2004, introduc, ca
elemente principale, reglementri referitoare la etichetare, trasabilitate i autorizarea
evenimentelor de transformare pentru comercializare. Tot n aprilie 2004 a fost adoptat i
Regulamentul 641/2004 care face referire la normele de aplicare a Regulamentului
1829/2003 n ceea ce privete cererea de autorizare a noilor produse alimentare i a noilor
furaje MG, notificarea produselor existente i prezena ntmpltoare sau tehnic
Testarea OMG

45
inevitabil a material MG care a fcut obiectul unei evaluri de risc i a obinut un aviz
favorabil.
UE recunoate dreptul consumatorilor la informare i etichetare, ca un instrument
ce faciliteaz luarea deciziilor informate/contiente, Regulamentul 1830/2003 ntrind
prevederile referitoare la aceste aspecte. Obligativitatea de etichetare a fost extins pentru
toate alimentele i furajele care consist, conin sau au fost obinute din OMG-uri, chiar
dac detecia materialului MG nu este posibil n produsul final. Se introduce n acest fel
conceptul de trasabilitate, ceea ce nseamn abilitatea de a identifica OMG-urile i
produsel derivate, precum i sursa acestora n toate etapele plasrii pe pia, prin
intermediul reelelor de producie i distribuie. Conceptul de trasabilitate presupune,
dac este cazul, nlocuirea dovezilor analitice produse de metodele de testare cu
nregistrrile efectuate de-a lungul lanului de aprovizionare (GMO Compass, 2007).
Regulamentul 1829/2003 definete i un nou prag limit pentru etichetatarea
OMG-urilor autorizate, respectiv 0,9%, la nivel de ingredient, cu condiia ca aceast
prezen s fie accidental sau tehnic inevitabil. Tot aici, precum i Anexa I a
Regulamentului 641/2004, se stipuleaz obligativitatea aplicantului de a pune la
dispoziie, n cadrul dosarului pentru obinerea autorizaiei, o metodologie validat de
detecie i cuantificare a evenimentului de transformare, precum i materiale de referin
corespunztoare. n cadrul procedurii de autorizare, dosarul este evaluat de Autoritatea
European pentru Siguran Alimentar (European Food Safety Authority/EFSA;
http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_home.htm), iar metodele
de testare vor fi evaluate i validate de ctre Laboratorul Comunitar de Referin pentru
Alimente i Furaje Modificate Genetic (Community Reference Laboratory for
Genetically Modified Food and Feed/CRL-GMFF; http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/)
(CRL-GMFF, 2009a). CRL-GMFF reprezint un alt element introdus de noua legislaie
n domeniul OMG. n contextul Regulamentului 1829/2003, Centrul Comun de Cercetare
(al Comisiei) (Joint Research Centre/JRC; http://ec.europa.eu/dgs/jrc/index.cfm) asistat
de Reeaua European de Laboratoare OMG (European Network of GMO
Laboratories/ENGL; http://engl.jrc.ec.europa.eu/), a fost numit Laborator de Referin
Comunitar pentru Alimente i Furaje Modificate Genetic, avnd rolul de a evalua i
valida metodele de testare (Regulamentul 1981/2006), astfel nct aceastea s corespund
Testarea OMG

46
normelor n vigoare i s poat reprezenta instrumente pentru punerea n aplicare a
legislaiei referitoare la OMG-uri. Procesele de evaluare i testare menionate anterior
sunt cele incluse n procedura de autorizare de ctre Comisia European a comercializrii
OMG (Regulamentul 1829/2003).
Conducerea GMO-CRL a fost atribuit Unitii pentru Biologie Molecular i
Genomic (Molecular Biology and Genomics Unit/MBG) (MBG, 2009) a Institutului
pentru Sntate i Protecia Consumatorului (Institute for Health and Consumer
Protection/IHCP, JRC-Ispra; http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) din cadrul JRC, cea care a
propus i promovat, nc din 1999, formarea unei reele de laboratoare de control care s
asigure implementarea i respectarea legislaiei aferente OMG-urilor i problematicii
acestora (CRL-GMFF, 2009c).
Reeaua European de Laboratoare OMG a fost inaugurat oficial n decembrie
2002 i cuprinde n prezent peste 100 de laboratoare repartizate n cele 27 de state
membre UE, precum i n Norvegia i Elveia. Activitatea ENGL are ca scop crearea unei
platforme unice pentru experii implicai n eantionarea, detecia, identificarea i
cuantificarea OMG-urilor din seminele i produsele agricole utilizate ca material
semincer sau ca materie prim, din alimente i furaje, precum i din mediul nconjurtor.
Scopul acestei platforme este de a veni n sprijinul activitilor CRL-GMFF (ENGL,
2009).
Cele mai importante aspecte tehnice luate n considerare n cadrul activitii ENGL
sunt (Querci et al., 2004a):
- crearea metodelor de analiz calitativ i cantitativ;
- transferul tehnologic;
- instruirea i acordarea asistenei pentru dezvoltare;
- validarea i expertizarea metodelor screening pentru diferite matrici
alimentare sau a metodelor de estimare a coninutului OMG;
- punerea la dispoziie a materialelor de referin;
- optimizarea strategiilor i procedeelor de eantionare pentru diferite bunuri
de larg consum care pot conine OMG-uri;
- crearea unor baze de date i instrumente pentru bioinformatic.
Testarea OMG

47
Conform legislaiei, metodele analitice trebuie s fie accesibile, eficiente, precise
i versatile. Activitatea de cercetare are deci menirea de a asigura elaborarea unor
strategii i metode analitice armonizate i standardizate la nivelul tuturor laboratoarelor
de testare OMG din UE, necesitatea acestor proceduri fiind menionat de JRC ca
element esenial pentru asigurarea succesului funcionrii legislaiei n domeniu.
O alt instituie european important pentru domeniul OMG-urilor este Institutul
pentru Materiale de Referin i Msurtori (Institute for Reference Materials and
Measurements/IRMM, JRC-Geel; http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm),
nsrcinat cu producerea materialelor de referin certificate (MRC), necesare desfurrii
activitlor de testare OMG.
Site-ul EUR-Lex (http://eur-lex.europa.eu/ro/index.htm) ofer acces direct gratuit
la legislaia UE.
n ceea ce privete ara noastr, armonizarea legislaiei naionale n domeniul
OMG-urilor cu cea european a fost iniiat cu mult nainte de momentul aderrii, situaie
remarcat i de Cionga (2005), care sublinia dorina autoritilor de a introduce legi
corespunztoare celor europene, inclusiv n ceea ce privete etichetarea i trasabilitatea.
Conform Ministerului Agriculturii, Pdurilor i Dezvoltrii Rurale (MAPDR, 2008),
documentele legislative relevante n domeniul OMG sunt urmtoarele:
- Ordinul MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de plante
modificate genetic;
- Ordinul MAPDR nr. 471/2006 pentru completarea i modificarea Ordinul
MAPDR nr. 237/2006 privind autorizarea cultivatorilor de plante
modificate genetic;
- OUG nr. 43/2007 privind introducerea deliberata n mediu i introducerea
pe pia a organismelor modificate genetic;
- OUG nr. 195/2005 privind protecia mediului;
- Legea 265/2006 pentru aprobarea Ordonantei de urgen a guvernului nr.
195/2005 privind protecia mediului;
- HG nr. 173/2006 privind trasabilitatea i etichetarea organismelor
modificate genetic i trasabilitatea alimentelor i hranei pentru animale,
obinute din organisme modificate genetic.
Testarea OMG

48
La cele enumerate anterior se mai adaug:
- HG nr. 497/2007 privind stabilirea unor msuri pentru aplicarea
Regulamentului Parlamentului European i al Consiliului (CE) nr.
1946/2003 din 15 iulie 2003 privind micarea transfrontier a organismelor
modificate genetic;
- HG nr. 256/2006 privind hrana pentru animale i alimentele modificate
genetic;
- Legea nr. 3/2008 pentru aprobarea Ordonanei de urgen a Guvernului nr.
44/2007 privind utilizarea n condiii de izolare a microorganismelor
modificate genetic.

1.2.2. Procedura integrat de testare OMG a produselor alimentare
1.2.2. Integrated procedure for the GMO testing of foodstuffs

Dup cum s-a menionat anterior, necesitatea monitorizrii OMG-urilor i a
implementrii metodologiei de testare, att n cazul soiei i porumbului, ct i al altor
taxoni, rezid n principal din contextul geo-politico-economic n care se gsete
Romnia sau alte state membre UE. Astfel, dei legislaia cu privire la cultivarea OMG-
urilor este restrictiv, schimburile comerciale transfrontaliere ofer posibilitatea
introducerii acestui tip de produse pe piaa alimentar (Ujhelyi et al. 2007). Aceast
situaie accentueaz necesitatea existenei unui sistem de control oficial care s asigure
respectarea prevederilor legale n domeniul OMG-urilor.
Aplicarea legislaiei privitoare la etichetarea produselor care conin material
transgenic se face pe baza rezultatelor obinute de ctre laboratoare specializate. n
viziunea european, acreditarea laboratoarelor de testare OMG, n conformitate cu
standardele ISO specifice (i.e. ISO/CEI 17025), este considerat ca fiind un element
necesar pentru desfurarea controalelor oficiale (Directiva 93/99/EEC n Schulze, 2008;
Recomandarea 2004/787/CE). Este de asemenea necesar ca laboratoarele care asist
ENGL la testarea i validarea metodelor de detecie, s fie acreditate sau n curs de
acreditare n conformitate cu ISO/CEI 17025 (Regulamentul 1981/2006). Acest tip de
strategie este aplicat i n cazul laboratorului CERT-OMG al USAMV Cluj-Napoca, de
Testarea OMG

49
aceea etapele analitice, metodele i procedurile implementate n cadrul acestuia i
descrise n prezenta lucrare, urmeaz recomandrile i liniile directoare stabilite sau
acceptate la nivelul spaiului comunitar.
Pentru detecia elementelor genetice specifice OMG-urilor, majoritatea
laboratoarelor utilizeaz metodologii bazate pe reacia PCR i real-time PCR (Morisset et
al., 2009). Toate procedurile de acest fel identificate n literatura de specialitate, urmeaz
acelai principiu general, fiind ns diferite din perspectiva includerii/excluderii sau
complexitii anumitor etape. Hbner et al. (1999) au propus o metodologie care poate fi
utilizat pentru testarea oricrui tip de matrice alimentar i care a fost preluat de
Abdullah et al. (2006), Querci (2005), Querci et al. (2004), Lin et al. (2000), precum i
de ali autori. Acetia au fcut modificri i adugiri pentru mbuntirea schemei
iniiale, cea mai important fiind includerea etapei de testare cantitativ, prezent i la
Querci (2004) i Querci et al. (2005), surse folosite direct pentru elaborarea metodologiei
de lucru descris n aceast lucrare (Figura 8).
Un alt principiu metodologic pentru testarea OMG a loturilor de semine a fost
descris de Allnutt et al. (2006). Procedura este foarte potrivit pentru implementarea n
cadrul laboratoarelor (autoritilor naionale) implicate direct n testarea loturilor de
semine ce fac obiectul schimburilor comerciale transfrontaliere.
n ambele cazuri, metodele de testare au la baz tehnica PCR, principala diferen
regsindu-se la nivelul etapelor de eantionare i de pregtire a probelor. Astfel, prima
metodologie este mai potrivit pentru testarea matricilor alimentare procesate sau
compozite, comercializate sub forma produselor finale ambalate. De obicei, eantionarea
este efectuat de o entitate separat, specializat n aceast direcie. Din punct de vedere
tehnic, proba recepionat de laborator, obinut sau nu printr-un proces de eantionare,
este denumit prob de laborator, iar rezultatele produse n urma analizelor se vor referi
strict la acest eantion. Extrapolarea rezultatelor la ntregul lot din care provine proba
analizat rmne la latitudinea beneficiarului analizei.
A doua metodologie este mai complex deoarece rezulatele trebuie s reflecte
proprietile unui lot mai mare i neomogen. Acesta este de obicei cazul materiilor prime,
o mare importan trebuind acordat etapei de eantionare.
Testarea OMG

50
n schema urmtoare, etapa iniial este reprezentat de eantionare, dei, dup
cum s-a indicat anterior, aceast operaiune nu revine laboratorului de testare. Urmeaz
apoi pregtirea probelor recepionate. Att procedura de eantionare, ct i obinerea
probei test, sunt etape critice, influennd puternic concluziile formulate la final, pe baza
rezultatelor obinute (Burns i Valdivia, 2007).



Fig. 8. Succesiunea etapelor analitice n cadul metodologiei integrate de testare OMG.
Fig. 8. Flow chart of the integrated GMO testing methodology.
Dup Querci (2004), modificat.
Testarea OMG

51
Este binecunoscut faptul c ADN-ul poate fi degradat n timpul procesrii
alimentelor (Engel et al., 2006; Corbisier et al., 2005). Astfel, cantitatea de copii intacte
ale fragmentelor de interes scade cu ct matricea alimentar este mai intens procesat,
determinnd totodat i reducerea posibilitii de detecie i cuantificare a OMG-urilor.
Acest aspect este important deoarece majoritatea bunurilor alimentare de larg consum
sunt caracterizate printr-un grad mediu sau nalt de procesare. O metod corespunztoare
de izolare i purificare este deci esenial pentru a asigura prezena n extract a ADN-ului
amplificabil. Performanele diferitelor protocoale disponibile vor fi discutate i n alte
subcapitole ale prezentei lucrri.
Strategiile de detecie bazate pe reacia PCR difer n funcie de fragmentul int
amplificat. Metodele de detecie cu spectru larg de aciune metodele screening
presupun amplificarea unor secvene comune ct mai multor evenimente de transformare,
respectiv promotori, terminatori sau gene marker pentru selecie. Odat confirmat
prezena OMG-urilor, este necesar identificarea acestora, iar apoi cuantificarea n
vederea verificrii conformitii cu legislaia referitoare la etichetare (Morisset et al.,
2009).
Identificarea precis a evenimentelor de transformare presupune detecia unei
secvene unice caracteristice acestora, cum sunt regiunile corespunztoare jonciunii
dintre elementele insertului sau regiunile de integrare a insertului n cadrul ADN-ului
gazd. Cel mai ridicat grad de specificitate l confer cea de-a doua categorie care
constituie astfel secvenele int ideale pentru protocoalele de identificare a unui
eveniment de transformare.
Necesitatea cuantificrii coninutului MG dintr-o prob a determinat introducerea
metodelor ce permit obinerea unor informaii cantitative, cea mai utilizat tehnic n
acest scop fiind amplificarea real-time PCR (Reiting et al., 2007; Kubista et al., 2006).
Un mare numr de metode de testare OMG validate sunt deja disponibile pentru
analize de rutin (CRL-GMFF, 2009b; Bonfini, 2008a i 2008b; Bonfini et al., 2007; SR
EN ISO 21750:2006; SR EN ISO 21569:2006; SR EN ISO 21571:2006). De asemenea,
pentru fiecare dintre etapele protocolului de testare (ex. extracia ADN-ului, screening
sau cuantificare) sunt disponibile kituri comerciale de la diferii productori (ex. Roche,
Qiagen sau Biotools).
Testarea OMG

52
Cercetrile n domeniu sunt direcionate nspre perfecionarea metodelor existente,
precum i dezvoltarea unor metode care s vin n ntmpinarea problemelor nou aprute:
creterea numrului transgenelor, creterea numrului evenimentelor de transformare,
creterea numrului liniilor transgenice de tip stacked (OMG-uri obinute, de obicei, n
urma hibridrii dintre indivizi ce conin diverse evenimente de transformare, rezultatul
fiind prezena inserturilor multiple i exprimarea simultan a mai multor caracteristici
transgenice), necesitatea reducerii costurilor etc.

1.2.3. Decizia de etichetare pe baza rezultatelor testrii OMG
1.2.3. Labelling decission based on GMO testing results

Conform legislaiei europene (i.e. Directiva 18/2001/CE), OMG-urile introduse pe
pia ca produse n sine sau componente ale altor produse trebuie etichetate
corespunztor. Dup cum s-a menionat deja, noul prag limit pentru etichetatarea OMG-
urilor autorizate 0,9% a fost introdus de Regulamentul 1829/2003, prevederea
aplicndu-se:
- produselor alimentare care urmeaz s fie furnizate ca atare consumatorului
final i care conin sau constau din OMG-uri, sunt obinute din OMG-uri
sau conin ingrediente obinute din OMG-uri; aceast categorie include i
produsele organice;
- OMG-urilor destinate utilizrii ca furaje, furajelor care conin sau constau
din OMG-uri, furajelor produse din OMG-uri.
n acest context, odat ce un produs a fost identificat pozitiv pentru unul sau mai
multe evenimente de transformare, urmtoarele etape ale analizei au ca scop determinarea
cantitativ a coninutului OMG, la nivel de ingredient (vezi Figura 8).
n Figura 9 este prezentat o situaie n care etichetarea nu este necesar,
coninutul OMG nedepind proporia de 0,9%, la nivel de ingredient.
n cazul n care un produs conine mai multe evenimente de transformare derivate
din acelai taxon, pentru compararea cu pragul de 0,9% proporiile acestora sunt luate n
considerate mpreun (Figura 10).
Testarea OMG

53
n cazul evenimentelor de transformare neautorizate pentru comercializare n UE,
procedura de testare este similar cu cea descris anterior. Prezena acestora este ns
total interzis (zero tolerance policy) (GMO Compass, 2007).


Porumb GM
0,6%
Soia GM
0,6%
Porumbnon GM
98,8%
Soia non GM
99,4%

Fig. 9. Etichetarea nu este necesar deoarece coninutul materialului transgenic,
la nivel de ingredient (soia, respectiv porumb), este sub pragul de 0,9%.
Fig. 9. No labelling required. The amount of both GM soybean and GM maize
is below the legal threshold.
Dup Weighardt (2004).


Porumb Bt 176
0.6%
Porumb non GM
98.8%
Porumb Bt 11
0.6%
Soia non GM
100%

(a)

(b)
Fig. 10. Etichetarea produselor ce conin material derivat din OMG-uri. (a) Etichetarea este necesar pentru
porumb, deoarece suma materialului transgnic, derivat din Bt11 i Bt176, depete pragul legal pentru etichetare.
(b) Mod de etichetare a unui produs alimentar ce conine material derivat din OMG-uri.
Fig. 10. Labelling of products containing GMO-derived material. (a) Labelling is required for the maize
ingredient. The sum of the Bt-11 (0.6%) and Bt-176 (0.6%) events exceeds the 0.9% legal threshold for labelling.
(b) Example of labelling a product containg GMO-derived material.
Surse: Weighardt (2004); GMO Compass (2007).


n ultima decad, peste 40 de ri au adoptat norme legislative referitoare la OMG-
uri, caracteristicile acestora i gradul de implementare fiind foarte variate (Gruere i Rao,
Testarea OMG

54
2007, n el et al., 2008). Astfel, limite legale pentru etichetarea produselor alimentare n
funcie de coninutul de material MG sunt de 0,1% n India, 1% n Brazilia (Cardarelli et
al., 2005), 3% n Coreea (Onishi et al., 2005; Yoshimura et al., 2005a), 5% n Japonia
(Gruere i Rao, 2007, n el et al., 2008; Huang i Pan, 2005; Onishi et al., 2005;
Yoshimura et al., 2005a) i Taiwan (Huang i Pan, 2005). n SUA, legislaia nu prevede
obligativitatea etichetrii produselor alimentare care conin OMG-uri. Aceasta poate fi
ns fcut voluntar. Etichetarea voluntar a fost introdus i n Canada, dar peste pragul
de 5% (Smith i Maxwell, 2007; Rott et al. 2004).

Testarea OMG

55

CAPITOLUL II. TESTAREA OMG CONSIDERENTE TEORETICE
CHAPTER II. GMO TESTING THEORETICAL CONSIDERATIONS


2.1. LABORATORUL DE TESTARE
2.1. TESTING LABORATORY

Existena unui spaiu adecvat i cu dotare corespunztoare este esenial pentru
buna desfurare a fluxului analitic i obinerea unor rezultate de ncredere. De aceea,
urmarea liniilor directoare i respectarea normelor acceptate la nivel internaional sunt
aspecte de importan major, mai ales n cazul n care se dorete acreditarea metodelor
de testare. Cerinele de ordin tehnic care trebuie respectate de laboratoarele de testare ce
i desfoar activitatea n domeniul biologiei moleculare, n care este inclus i testarea
OMG, sunt prezentate n diverse lucrri tiinifice, dar mai ales n documente de
specialitate publicate de organisme ca Organizaia Internaional de Standardizare
(International Organization for Standardization/ISO), Comitetul European de
Normalizare (Comit Europen de Normalisation/CEN) sau Comisia Codex
Alimentarius. n aceast lucrare nu vor fi abordate cerinele referitoare la managementul
laboratorului.
Urmtoarele indicaii sunt considerate eseniale pentru testarea bazat pe
PCR/real-time PCR, putnd fi ns adaptate i pentru alte proceduri (ex. enzyme-linked
immunosorbent assay/ELISA).
Temerea principal n cadrul laboratorului de testare este reprezentat de apariia
contaminrilor (el et al., 2006; Querci et al., 2005). Principalele surse de contaminare
sunt reprezentate de: particule rezultate la pregtirea probelor, aerosoli, activitatea de
testare a mai multor probe n paralel. Msurile de prevenire trebuie s aib n vedere
ncperile, echipamentul, metodele de lucru i personalul.
Pentru a evita contaminarea, modul de organizare a laboratorului trebuie s fie
bazat pe separarea spaial a diferitelor etape metodologice i pe asigurarea unui flux
analitic unidirecional (SR EN ISO 24276:2006; el et al., 2006; Querci et al., 2005).
Testarea OMG

56
Ideal, pentru fiecare etap specific a procedurii de lucru ar trebui alocat un spaiu
separat, dotat cu echipamente dedicate (el et al., 2006; Querci et al., 2005). Standardul
SR EN ISO 24276:2006 recomand ca separarea activitilor s se fac n minim patru
categorii, fiecreia corespunzndu-i un spaiu de lucru dedicat:
- pregtirea probelor (mrunire, omogenizare, obinerea probei test);
- extracia ADN-ului (analitul) din proba test;
- pregtirea reaciilor de amplificare (PCR/real-time PCR);
- amplificrile PCR/real-time PCR i etapa post-PCR (dac este cazul).
Un exemplu de organizare a activitilor specifice testrii OMG, care respect
principiul fluxului unidirecional de lucru, este prezentat n Figura 11. n Figura 12 este
exemplificat modul de concepere a planului unui laborator de testare, iar n Figura 13 este
prezentat modul de organizare al laboratorului CERT-OMG situat n cadrul Institutului
pentru tiinele Vieii al USAMV Cluj-Napoca, care permite desfurarea activitilor n
condiiile necesare acreditrii metodelor de testare, proces care a fost de altfel iniiat.
O alt msur binevenit const n instalarea unor sisteme de ventilaie care s
asigure presiune atmosferic pozitiv sau negativ (+ i - n Figura 12), n funcie de
necesiti, n vederea evitrii rspndirii contaminanilor.



Fig. 11. Organizarea etapelor de lucru sub forma unui flux unidirectional.
Fig. 11. The forward flow system.
Dup Querci et al. (2005), modificat.

Testarea OMG

57

Fig. 12. Planul unui laborator de testare.
Fig. 12.Floor plan of a testing laboratory.
Surs: Querci et al. (2005).



Fig. 13. Organizarea spaiului de lucru n cadul laboratorului CERT-OMG.
Fig. 13. Key working areas of CERT-OMG laboratory.


Buna practic de laborator include de asemenea: utilizarea halatelor dedicate
fiecrei ncperi, schimbarea frecvent a mnuilor, utilizarea vrfurilor de pipet sterile
i cu barier de protecie mpotriva aerosolilor, decontaminarea i curarea spaiului de
lucru i a echipamentelor nainte i dup efectuarea fiecrei operaiuni (el et al., 2006).
Calibrarea sau etalonarea echipamentelor care necesit aceste operaii (ex. pipete, balane
sau platforma real-time PCR) este obligatorie, contribuindu-se astfel la asigurarea calitii
Testarea OMG

58
analizelor efectuate. Toate operaiunile menionate anterior trebuie fcute dup un
program prestabilit, iar executarea lor trebuie documentat.
Stocurile de reactivi i materiale consumabile trebuie pstrate n spaii n care
probele nu ptrund, evitndu-se astfel contaminarea cu analit (i.e. ADN).
Toate etapele de lucru trebuie s se desfoare n condiii optime de temperatur,
umiditate i presiune, atenie deosebit trebuind acordat setrii reaciilor de amplificare.
De asemenea, pentru a evita nghearea/dezghearea repetat a reactivilor se recomand
pstrarea acestora n volume separate mai mici.

2.2. TIPURILE DE PROBE CE POT CONSTITUI OBIECTUL TESTRII OMG
2.2. TYPES OF SAMPLES THAT CAN BE SUBJECTED TO GMO TESTING

Clasificarea produselor ce pot fi testate pentru prezena OMG-urilor se poate face
dup:
- gradul de procesare, existnd materii prime sau neprocesate (n general
boabe sau semine), matrici alimentare cu grad redus de procesare (ex.
fin), matrici alimentare cu grad mediu de procesare (ex. texturatele
proteice din soia) i matrici alimentare intens porcesate (ex. pate, crnai
vegetali, extract de lecitin, crem vegetal de brnz sau ulei); ultima
categorie poate fi la rndul ei mprit n alimente compozite sau rafinate;
- tipul ingredientelor (ex. pe baz de soia sau porumb);
- modul de prezentare, existnd produse n vrac (boabe/semine) i produse
ambalate (texturate proteice, tofu, biscuii etc.);
- gradul de umiditate, existnd produse uscate (produse de panificaie, fulgi),
produse umede (tofu, creme, ngheat) i produse lichide (ulei, bere).
Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoatere ct mai bun a proprietilor
intrinseci ale probelor ajut la alegerea celor mai potrivite metode de eantionare,
pregtire i izolare a analitului (ADN sau protein).
Materialele neprocesate sau cu grad redus de procesare (ex. seminele sau fina)
sunt uor de testat datorit posibilitii de obinere a unor extracte ADN sau proteice cu
caracteristici corespunztoare din punct de vedere analitic. n cazul matricilor alimentare
Testarea OMG

59
procesate, ca izolatele proteice, lecitina, uleiul, sosul de soia, derivatele din amidon,
analiza este dificil de efectuat, de multe ori chiar imposibil (Meyer, 1999), deorece:
- aciunea unor factori (enzimele, forele mecanice, temperatura, pH-ul,
srurile caotropice sau solvenii anorganici) specifici proceselor
tehnologice de obinere a acestor matrici determin degradarea sau
denaturarea excesiv a analitului;
- acestea pot reprezenta doar produse obinute prin rafinare, procedur ce are
ca scop o separare ct mai bun de orice alt material celular (ex. ADN);
- acestea pot reprezenta doar ingrediente ale unor matrici compozite,
materialul derivat din taxonul de interes constituind astfel doar o parte
redus din ntreaga prob.
Cu toate c produsele vegetale utilizate n alimentaie ajung la consumatorul final
de obicei sub form procesat, testarea materiilor prime (boabe/semine) este de
asemenea important deoarece conceptul de trasabilitate, impus de legislaia european n
vigoare, prevede ca etichetarea s fie fcut chiar dac materialul MG nu este detectabil
n produsul finit. De asemenea, importurile se fac de obicei sub form de semine/boabe.
Aceste dou aspecte subliniaz importana testrii materiilor prime.
O alt categorie de produse care pot conine material MG sunt cele de origine
animal, provenite de la animale hrnite cu furaje pe baz de OMG-uri. Agodi et al.
(2005) au demonstrat prezena ADN-ului provenit de la porumb sau soia MG n mai
multe tipuri de lapte de pe piaa italian. Autorii au concluzionat totui c prezena ADN-
ului transgenic nu apare ca efect direct al utilizrii OMG-urilor n alimentaia animalelor,
ci este datorat contaminrii laptelui dup recoltare. Identificarea precis a verigii
tehnologice n care a survenit contaminarea nu a fost ns posibil. Lipsa contaminrii cu
ADN MG a produselor (i.e. lapte, carne sau ou) provenite de la animale n a cror diet
au fost incluse ingrediente derivate din OMG-uri, a fost semnalat i n alte publicaii (ex.
Phipps et al., 2003 i 2002, Flachowsky i Aulrich, 2001, sau Faust, 2000, n Agodi et al.,
2005).
Materialele de referin reprezint matrici cu caracteristici cunoscute,
indispensabile pentru validarea metodelor sau rezultatelor. Detalii referitoare la acestea
sunt prezentate n subcapitolul 2.9.7.
Testarea OMG

60
2.3. EANTIONAREA
2.3. SAMPLING

n practica testrilor OMG, operaiunea de eantionare nu revine laboratoarelor,
fiind efectuat de personal specializat din cadrul instituiilor abilitate ale statului. n
continuare sunt prezentate elementele de baz ale acestei operaiuni care influeneaz
semnificativ etapele ulterioare desfurate n laborator, precum i corectitudinea
rezultatelor obinute.
Dei se desfoar n afara laboratorului, eantionarea poate fi considerat prima
etap a procesului analitic, constituind un pas important, complex i obigatoriu pentru
testarea tuturor categoriilor de produse comerciale. Obligativitatea acestei etape rezid
din imposibilitatea inspectrii tuturor produselor existente pe pia (Querci et al., 2005),
iar complexitatea este determinat de necesiatea obinerii unui eantion reprezentativ.
Eantionul (i.e. proba de laborator) reprezint o colecie de observaii (i.e. obiecte)
selectate din cadrul unei populaii, utiliznd o procedur corespunztoare, iar populaia
(i.e. lotul) este definit ca totatlitatea observaiilor (i.e. obiectelor) despre care se vor
trage concluzii n urma analizei (Querci et al., 2005).
Procesul de eantionare reprezint ntodeauna o surs de eroare care apare atunci
cnd din lotul de dimensiuni mari se izoleaz o parte ce va constitui proba utilizat de
ctre laborator n procesul analitic (Querci et al., 2005, Zafar et al., 2004). De accea, n
cadrul testrii OMG, ca de altfel n cadrul tuturor analizelor ce necesit eantionare, pe
lng eroarea analitic apare i eroarea de prelevare, iar mpreun acestea constituie
eroarea total (Querci et al., 2005). O bun practic de eantionare asigur reducerea
erorilor, ceea ce nseamn de fapt creterea gradului de reprezentativitate al probei pentru
populaia din care provine. n acest scop trebuie cunoscute n primul rnd proprietile
populaiei iniiale. n cazul testrii OMG caracterizarea poate fi extrem de dificil i
difer n funcie de tipul produsului luat n considerare (ex. batoane de ciocolat sau
loturi de semine).
Conform SR EN ISO 24576:2006, proba de laborator reprezint cantitatea
recepionat de laborator, iar proba test este cantitatea utilizat direct la o extracie. n
primul caz se realizeaz doar o reducere n dimensiuni (a lotului iniial, omogenizarea
Testarea OMG

61
fiind, de obicei, imposibil), iar cea de-a doua situaie corespunde unor operaiuni de
omogenizare i reducere n dimensiuni. n cazul loturilor de boabe de porumb, de
exemplu, se pornete de la 10
9
boabe, ajungndu-se la 10
3
molecule (Figura 14). Este
astfel evident dificultatea ntlnit n obinerea unei probe reprezentative pentru
populaia din care aceasta provine (Querci et al., 2005).



Fig. 14. Procedur general de eantionare i pregtire a probei.
Fig. 14. Basic sampling and sample preparation procedure.
Dup Querci et al. (2007) i Querci et al. (2005), modificat.


Cea mai important caracteristic a loturilor este reprezentat de modul de
distribuie a contaminailor (i.e. materialul MG), care influeneaz foarte mult eficiena
Testarea OMG

62
procedurilor de prelevare (Figurile 15 i 16). Diferite organisme internaionale (ex.
International Seed Testing Association/ISTA, US Department of Agriculture-Grain
Inspection, Packers and Stockyard Administration/USDA-GIPSA, ISO, CEN, Food and
Agriculture Organization/FAO sau Codex Alimentarius) au propus o gam foarte variat
de metode de eantionare pentru produsele neambalate, majoritatea fiind ns bazate pe
distribuia binomial a contaminanilor n masa total. Distribuia binomial poate fi
utilizat fr probleme doar n cazul loturilor omogene. n schimb, pentru bunurile
alimentare (n special materii prime n vrac), datele experimentale indic faptul c
distribuia este cel mai probabil de tip heterogen (randomizat) (Querci et al., 2005).



(a) (b) (c) (d)
Fig. 15. Modele de distribuie a contaminanilor (i.e. material transgenic) n cadrul loturilor de produse n vrac
(ex. semine/boabe) i influena acestora asupra prelevrii unui eantion. Materialul transgenic este reprezentat cu
puncte de culoare roie, albastr i verde. (a) Lot n care materialul transgenic deine o proporie relativ mare i este
distribuit uniform (distribuie omogen). Protocoalele clasice de eantionare pot fi utilizate cu succes. (b) Lot n care
materialul transgenic deine o proporie relativ redus i este distribuit uniform (distribuie omogen). Pot fi utilizate
protocoalele clasice de eantionare. n cazul unui numr redus de probe prelevate, efectele stocastice pot influena
reprezentativitatea eantionului. (c) Lot n care sunt prezente dou tipuri de materiale transgenice, unul (rou) fiind
distribuit omogen, iar cellalt (albastru) heterogen. Protocoalele clasice de eantionare nu pot fi aplicate n acest caz.
(d) Lot n care sunt prezente trei tipuri de materiale transgenice, toate fiind distribuite neomogen. Protocoalele
clasice de eantionare nu pot fi aplicate n acest caz.
Fig. 15. Distribution of contaminants (i.e. transgenic material) in lots of bulk commodities (e.g. seeds/grains).
The transgenic material is represented as red, blue and green colored dots. (a) The concentration of transgenic
material is high and its distribution is homogenous. Classical sampling procedures should provide adequate results.
(b) The concentration of transgenic material is relatively low and its distribution is homogenous. Classical
sampling procedures could be applied. However, if only a small number of increments are taken, the stochastic
effects could affect the representativeness of the sample. (c) Lot of bulk commodities containing two types of
transgenic material. The first one (red) is homogenously distributed, while the distribution of the second transgenic
material (blue) is heterogeneous. Classical sampling procedures cannot be applied. (d) Lot of bulk commodities
containing three types of transgenic material with heterogeneous distributions. Classical sampling procedures
cannot be applied.
Dup Querci et al. (2005), modificat.


Pentru asigurarea unor protocoale corespunztoare de prelevare din loturile
heterogene erau deci necesare metode statistice noi care s nu fie bazate pe distribuia
Testarea OMG

63
normal. n acest scop, Comisia European asistat de ENGL a conceput i introdus
software-urile KeLDA (Kernel Lot Distribution Assessment) i KeSTE (Kernel Sampling
Technique Evaluation), destinate evalurii strategiilor de prelevare a probelor n funcie
de proprietile loturilor, fr a face ns nicio presupunere referitoare la distribuie.
KeLDA este un instrument de estimare a distribuiei contaminrii cu OMG-uri n loturile
de semine, iar KeSTE are rolul de a investiga impactul distribuiei OMG-urilor asupra
eficienei schemelor de prelevare, de a estima eficiena protocoalelor de prelevare n
funcie de proprietile loturilor i de a pune la dispoziie criterii de alegere a procedurilor
de prelevare a eantioanelor (Querci et al., 2005).



Fig. 16. Influena efectelor stocastice asupra reprezentativitii unei pri (i.e. mas
de boabe/semine sau volum de soluie) extrase dintr-un amestec (i.e. lot de
boabe/semine sau extract de ADN) relativ omogen. Reprezentativitatea prii
extrase este influenat de proprietile subprobelor prelevate. Subliniem c
reprezentativitatea crete odat cu numrul subprobelor.
Fig. 16. Influence of stochastic effects on the representativeness of an increment
(i.e. seeds/grains or volume of solution) sampled from a relatively homogenous
mixture (i.e. bulk seeds/grains or DNA extract). The representativeness of the final
sample depends on the number and characteristics of the sampled increments.


n concluzie, eantionarea unui lot de produse n vrac, n vederea obinerii probei
de laborator, constituie o etap foarte problematic (Zafar et al., 2004) deoarece nu putem
fi siguri de corectitudinea procesului, adic de reprezentativitatea eantionului pentru
lotul din care provine (Querci et al., 2005). Reducerea probei de laborator pentru
obinerea probei test este ns un proces mult mai simplu, n acest caz fiind mai uor de
Testarea OMG

64
asigurat reprezentativitatea probei de dimensiuni mici pentru cea din care provine (Querci
et al., 2005).
n ceea ce privete produsele finite, problematica eantionrii este asemntoare,
fiind dificil definirea proprietilor unei populaii, iar ca i consecin, stabilirea
procedurilor care s asigure reprezentativitatea probelor este greu de realizat. Au fost
utilizate diferite metode de eantionare pentru alimentele procesate ambalate, niciuna
nefiind ns special destinat acestui scop.
Noua legislaie european referitoare la OMG-uri ofer indicaii clare pentru
modul de eantionare a diferitelor categorii de bunuri alimentare. Aceste protocoale de
eantionare sunt destinate aplicrii n cadrul testrilor OMG i iau n calcul posibila
distribuie heterogen. Recomandarea 2004/787/EC, anexat Regulamentului 1830/2003,
conine referiri la modul de eantionare a loturilor de semine sau boabe, precum i a
celor de produse neambalate (ex. fin). Protocoalele de eantionare care pot fi aplicate n
cazul produselor ambalate sunt definite n standardul ISO 2859:1985 (Querci et al., 2007;
Querci et al., 2005). CEN/TS 15568:2006 conine de asemenea informaii relevante
pentru tehnica de eantionare aplicabil n cazul testrii OMG.
Procedura general de eantionare a seminelor/boabelor sau bunurilor alimentare
neambalate i de obinere a probei analitice este descris de Querci et al. (2007) i Querci
et al. (2005). O procedur asemntoare este descris i de Trapmann i Emons (2005).
Din punct de vedere practic, eantionarea produselor neambalate este constituit
din urmtoarele etape:
- prelevarea eantioanelor dintr-un lot, conform schemei utilizate;
- potrivit recomandrilor, eantioanele prelevate anterior vor fi mprite n
dou pri egale, una fiind folosit la constituirea probei iniiale de laborator,
iar cealalt va fi pstrat pentru analiz n cazul n care este necesar
determinarea intervalului de ncredere n jurul coninutului estimat de OMG-
uri (Figura 14);
- evaluarea coninutului de material MG al probei iniiale de laborator;
- dac este nevoie, se efectueaz analiza individual a eantioanelor iniiale
pentru determinarea unui interval de ncredere n jurul valorii estimate.
Testarea OMG

65
n funcie de rezultatele obinute la testarea probei de laborator, ne putem
confrunta cu una dintre urmtoarele situaii (Querci et al., 2007):
- coninutul OMG (contaminarea probei de laborator) este apropiat de pragul
stabilit legal ( 50% din aceat valoare); n acest caz eantioanele
individuale trebuie analizate pentru stabilirea intervalului de ncredere (ca
abatere standard) n jurul valorii estimate;
- coninutul de OMG-uri este situat mult sub pragul limit (OMG < valoare
limit 50%); nu este necesar analiza eantioanelor individuale;
- coninutul de OMG-uri este situat mult deasupra pragului limit (OMG >
valoare limit + 50%); nu este necesar analiza eantioanelor individuale.
Cteva aspecte referitoare la eantionare sunt prezentate i n Anexa II.

2.4. PREGTIREA PROBELOR
2.4. SAMPLE PREPARATION

nainte de izolarea analitului este necesar aplicarea anumitor operaiuni de
pregtire a probelor (ex. reducerea mrimii, mrunire, umectare sau omogenizare), n
funcie de caracteristicile matricii supuse analizelor (Querci et al., 2005). Scopul acestora
este de a facilita sau mbunti izolarea i purificare analitului.
Un aspect important n aceast etap este reducerea probei de laborator rezultat
prin eantionare, n vederea obinerii probei test (proba analitic). Procesul de eantionare
trebuie s asigure reprezentativitatea probei de laborator pentru lotul din care provine, iar
operaiunile efecuate n laborator pe cea a probei analitice pentru fraciunea superioar
(Querci et al., 2005).
Reducerea probei presupune omogenizarea riguroas i cntrirea unei cantiti
mai mici ce constituie fraciunea inferioar. n cazul n care proba este constituit din
buci mari, cu grad redus de umiditate (ex. semine sau texturate proteice sub form de
cuburi), acestea vor trebui mrunite ct mai bine, deoarece n cele mai multe cazuri,
proba test utilizat direct n protocolul de extracie este mai mic dect prile ce compun
proba iniial. Neajunsul asociat acestor proceduri este reprezentat de posibila nclzire,
ceea ce prezint riscul de activare a DNazelor, enzime care vor degrada acizii nucleici.
Testarea OMG

66
Umectarea reduce gradul de nclzire i faciliteaz de asemenea procesul de extracie,
probabil datorit nmuierii particulelor. Acest aspect a fost subliniat de Corbisier et al.
(2005), n cazul probelor sub form de fin. Probele umede (iaurt, tofu, ngheat,
crem) nu necesit adugarea apei.
Omogenizarea minuioas este necesar i n cazul probelor lichide ca lapte, lapte
de soia, ulei sau bere.
n cazul probelor compozite, doar unele ingrediente conin OMG-uri, de aceea,
dac este posibil, componentele care nu sunt vizate n cadrul analizei i care constituie
poteniali contaminani (ex. condimente sau sosuri) trebuie separate de restul probei
pentru a mri eficiena extraciei. Uneori, ndeosebi n cazul probelor cu coninut ridicat
de amidon, acizi sau grsimi, este oportun utilizarea unor tratamente adiionale pentru
creterea eficienei lizei celulare i mbuntirea extraciei ADN-ului.
Se recomand de asemenea ca pregtirea probelor s se desfoare ntr-un spaiu
special dedicat acestei operaiuni datorit inerenei producerii prafului. Este absolut
necesar ca aceast ncpere s fie curat sistematic pentru a evita apariia
contaminrilor ncruciate (Querci et al., 2005).

2.5. EXTRACIA ADN-ULUI
2.5. DNA EXTRACTION

Dup cum s-a specificat ntr-unul dintre subcapitolele anterioare, reacia PCR,
clasic sau real-time, st la baza celor mai utilizate metode de testare OMG. n cadrul
analizelor ce au la baz aceast reacie, analitul este reprezentat de ADN, a crui izolare
i purificare constituie astfel prima etap a testrii OMG, specific biologiei moleculare.
Tehnica PCR este reproductibil, specific i sensibil, caracterizndu-se printr-o
mare capacitate de discriminare, procesare i costuri relativ reduse. Performanele
acesteia pot fi ns limitate de caracteristicile intrinseci ale probei i de performanele
metodei de extracie, aspecte ce se reflect n absena/prezena inhibitorilor PCR i n
calitatea i cantitatea ADN-ului din extracte (Di Pinto et al., 2007). Dac starea ADN-
ului este influenat n principal de procesarea industrial, eliminarea complet a
inhibitorilor PCR (ex. polizaharide, acizi humici sau lipide) depinde de procedura de
Testarea OMG

67
extracie (Deisingh i Badrie, 2005). Aceste substane pot persista n extractele finale,
determinnd, n general, reducerea sau inhibarea complet a procesului de amplificare.
De aceea, utilizarea metodelor moleculare pentru analiza probelor alimentare necesit
strategii de extracie i purificare care s asigure un grad ct mai mare de recuperare a
acizilor nucleici i de ndeprtare a substanelor inhibitoare, precum i a altor reziduuri
(Smith i Maxwell, 2007; Lipp et al., 2001, Zimmermann et al., 1998, Meyer i
Candrian, 1996, n Di Pinto et al., 2007; Meyer, 1999).
Cele mai importante caracteristici ale extractelor utilizate n analizele PCR sunt
cantitatea, calitatea i puritatea, care, dac sunt nesatisfctoare, reduc sensibilitatea
metodei sau fac imposibil testarea OMG (Engel i Moreano, 2003, n Smith i Maxwell,
2007; Deisingh i Badrie, 2005), mai ales n cazul n care materialul MG este prezent
doar ntr-un procent redus.
Existena unei largi varieti de metode destinate extraciei i purificrii acizilor
nucleici impune utilizarea urmtoarelor criterii pentru alegerea celei mai potrivite tehnici:
acidul nucleic int care trebuie izolat, tipul probei sau materialul iniial (ex. esut, frunz
sau material procesat), rezultatele ateptate (ex. cantitate, calitate sau timpul necesar
pentru purificare), aplicaiile ulterioare (ex. PCR, clonare, etichetare, blotting, real-time
PCR sau sintez de ADN complementar). Aceast alegere este foarte important, n
special pentru analiza cantitativ i reprezint de obicei un compromis ntre costuri,
concentraia extractului i puritatea acestuia. Esenial este ns capacitatea procedurii de
a permite obinerea unui extract cu concentraie mare de ADN i lipsit de substane care
pot afecta reacia de amplificare (Cankar et al., 2006).
Extracia ADN-ului din materialul biologic vegetal necesit liza celulelor,
inactivarea nucleazelor i separarea acestuia de substanele inhibitoare (ex. resturile
celulei, compui organici din mediul celular sau reactivi utilizai pentru izolare). De
obicei, procedura de liz reprezint o combinaie de principii diferite (ex. descompunerea
mecanic, tratament cu detergeni sau digestie enzimatic). Distrugerea membranei
celulare i inactivarea nucleazelor intracelulare pot fi combinate n cadrul aceleiai etape,
o singur soluie putnd conine detergent pentru solubilizarea membranei celulare i
sruri pentru denaturarea enzimelor. ndeprtarea resturilor celulare rezultate din aceast
operaiune este fcut prin filtrare, extracie sau precipitare. Aceste procedee pot fi
Testarea OMG

68
aplicate sauccesiv sau concomitent, fiecare presupunnd utilizarea unor metode sau
reactivi specifici. Ulterior extraciei se realizeaz splarea ndeprtarea reactivilor i
eventual a altor substane nedorite, nc prezente n soluie care presupune de fapt o
nou etap de filtrare sau precipitare. Analitul este apoi eluat sau resuspendat, obinndu-
se extractul (soluia) de ADN.
Dup cum s-a amintit i mai sus, o larg varietate de principii i protocoale de
extracie sunt disponibile i pot fi aplicate n acest domeniu. Cele mai utilizate vor fi
prezentate n subcapitolul 3.5.1.

2.6. EVALUAREA EXTRACTELOR DE ADN
2.6. EVALUATION OF DNA EXTRACTS

nainte de efectuarea analizei OMG propriu-zise, este necesar evaluarea
pretabilitii extractelor la analize bazate pe reacia PCR clasic, dar mai ales la cele
bazate pe reacia real-time PCR. Criteriile eseniale n acest context sunt cantitatea de
ADN recuperat i calitea extractului i a ADN-ului (Cankar et al., 2006; Moens et al.,
2005; Meyer, 1999).
Primul criteriu se refer la cantitatea de ADN prezent n extract, care trebuie s
fie suficient, adic peste limitele de detecie i cuantificare ale metodei utilizate (Kay et
al., 2001, i Hbner et al., 2001, n Cankar et al., 2006).
Al doilea criteriu vizeaz n principal posibilitatea de a regsi n extract substane
inhibitoatre pentru PCR, ca polizaharide, proteine, polifenoli (taninuri), lipide i ali
metabolii secundari (Holden et al., 2003, Peist et al., 2001, Wilson, 1997, i Rossen et
al., 1992, n Cankar et al., 2006; Meyer, 1999). Unele componente ale soluiilor utilizate
la extracie pot de asemenea afecta reacia PCR (Rossen et al., 1992, n Cankar et al.,
2006). Efectul substanelor contaminante n cadrul analizelor PCR este, n general,
reprezentat de reducerea eficienei de amplificare (Kubista et al., 2006). Substanele cu
efect antagonic inhibitorilor se numesc adjuvani (ex. polyvinylpyrrolidone/PVP sau
bovine serum albumine/BSA) i sunt de obicei incluse n mod constant ntr-unul dintre
reactivii uzuali (tamponul PCR) folosii pentru amplificare (Wilson, 1997, n Cankar et
al., 2006).
Testarea OMG

69
Prin calitatea ADN-ului extras se face referire la integritatea structural a
moleculelor. n acest conzext, Holst-Jensen i Berdal (2004) au introdus conceptul de
uniti PCR funcionale (PCR forming units), pentru a face diferena ntre copiile
intacte (amplificabile) de ADN int i cele puternic fragmentate (neaplificabile) (Cankar
et al., 2006).

2.6.1. Cuantificarea spectrofotometric
2.6.1. Spectrofotometric quantification

Caracterizarea calitativ i cantitativ a extractelor de ADN poate fi realizat n
mai multe moduri (Moens et al., 2005; Waiblinger et al., 2006):
- fluorimetric; cele mai utilizate din aceast categorie sunt migrarea n gel de
agaroz i marcarea cu o substan de intercalare (vezi subcapiltolul 2.6.2),
metoda Picogreen (Invitrogen, 2009) i utilizarea unui sistem real-time
PCR specific acestui gen de aplicaie;
- densitometric;
- spectrofotometric.
Datorit n principal avantajelor de ordin economic, ultima metod de cuantificare
a extractelor este des utilizat n practic, multe spectrofotometre fiind concepute special
pentru determinarea concentraiei i puritii moleculelor biologice. Trebuie ns avut n
vedere faptul c valorile obinute nu sunt exacte (sunt, de obicei, supraestimate), existnd
o serie de factori ce determin apariia unor erori semnificative (MATC, 2009)
Majoritatea moleculelor biologice (ex. ADN, ARN sau proteine) nu absorb lumina
din spectrul vizibil, dar o absorb pe cea ultraviolet. Proprietatea este folosit pentru
estimarea concentraiei i puritii moleculelor respective prezente n anumite soluii (ex.
extractele obinute din probele analizate) (MATC, 2009). Astfel ADN-ul, ARN-ul,
oligonucleotidele i chiar mononucleotidele pot fi msurate direct n soluii apoase
diluate sau nediluate, prin nregistrarea absorbiei la o anumit lungime de und, respectiv
n spectrul ultraviolet. Mrimea msurat este denumit absorban (A) sau densitate
optic (optical density/OD). Dac proba este pur (fr cantiti semnificative de
proteine, fenoli, agaroz etc.), msurarea cantitii de radiaie absorbit are un nalt grad
Testarea OMG

70
de precizie. n Tabelul 1 sunt prezentate lungimile de und din spectrul UV, relevante
pentru msurarea spectrofotometric a ADN-ului.


Tabelul 1.
Lungimi de und din spectrul UV relevante pentru msurarea ADN-ului
UV wavelenghts relevant to the measurement of DNA
Lungimea de und
Wavelenght
Importan
Importance
Observaii
Observations
215-230 nm
Absorbie minim a acizilor
nucleici. Absorbie maxim a
proteinelor, determinat de
legturile peptidice.
Nu se efectueaz msurtori deoarece
soluiile tampon i solvenii utilizai
frecvent n laborator absorb de asemeea
lumin n acest interval.
260 nm
Absorbie maxim a acizilor
nucleici.
Bazele azotate purinice prezint
absorbie maxim la o valoare puin mai
mic de 260 nm, iar bazele azotate
pirimidinice puin deasupra valorii de
260 nm. La aceast lungime de und
absorbia proteinelor este redus.
270 nm Absorbia puternic a fenolului
Fenolul poate reprezenta un contaminant
introdus n timpul efecturii extraciei.
280 nm
Nivel maxim de absorbie a
proteinelor, datorit aminoacizilor
aromatici.
Acizii nucleici prezint o absorbie
redus la acest nivel.
320 nm
Nici acizii nucleici, nici proteinele
nu absorb la acest nivel.
Nivel utilizat pentru corecii,
eliminndu-se semnalul aferent
turbiditii solventului.
Dup MATC (2009), modificat.


Esixt dou strategii de determinare a concentraiei ADN-ului pe baza absorbiei
luminii UV (MATC, 2009):
- se poate construi o curb de calibrare utiliznd probe standard;
- varianta simplificat a metodei anterioare, care are la baz utilizarea
constantelor de absorbie ale moleculelor de interes; potrivit legii Beer-
Lambert, ntre absorban i concentraie exist o relaie direct
proporional, astfel valorii A = 1 i corespund aporximativ 50 g/ml ADN
dublu-catenar (ADNdc), aproximativ 33 g/ml ADN monocatenar, 40
g/ml ARN sau aproximativ 30 g/ml nucleotide libere (MATC, 2009;
Somma 2004).
Testarea OMG

71
Prima metod se caracterizeaz printr-o precizie mai mare, n timp ce a doua este
mult mai simpl si rapid.
Spectrofotometria poate fi utilizat i pentru estimarea puritii unei soluii de
ADN. Dup cum s-a vzut anterior, soluiile de ADN prezint absorbie maxim pentru
lungimea de und de 260 nm, iar soluiile proteice pentru 280 nm. Deoarece soluiile de
ADN absorb parial lumina la 280 nm, iar cele proteice absorb parial lumina la 260 nm,
raportul dintre citirile la 260 nm i 280 nm (A
260
/A
280
) poate fi utilizat pentru estimarea
puritii extractului de ADN. Valoarea optim, corespunztoare unei soluii pure, este
cuprins ntre 1,7 i 1,9 (Qiagen, 2006). n cazul contaminrii cu proteine, raportul
A
260
/A
280
va fi semnificativ mai mic (pentru proteine pure raportul este de 0,6) (MATC,
2009), iar cuantificarea precis a cantitii de acid nucleic nu este posibil. Valori mai
mari de 2,0 sunt caracteristice souiilor pure de ARN.
Absorbia la 230 nm reflect gradul de contaminare al probei cu substane de tipul
carbohidrailor, peptidelor, polifenolilor sau compuilor aromatici. n cazul probelor pure
de ADN, raportul A
260
/A
230
trebuie s fie de aproximativ 2,2 (MATC, 2009).
Ca principiu de funcionare, spectrofotometrul utilizeaz transmisia luminii cu o
lungime de und specific printr-o soluie n care se afl dizolvat molecula de interes.
Diferena ntre cantitatea de lumin transmis nspre prob i cea recepionat la ieire
corespunde absorbanei moleculei care este direct proporional cu concentraia acesteia.
Acest tip de determinri pot fi utilizate i pentru stabilirea numrului absolut de
copii ale secvenei de interes. Pentru conversia masei de ADN n numr de copii ale
secvenei de interes se utilizeaz masa unui genom haploid, denumit echivalent
genomic haploid sau valoare 1C. Determinarea acestor valori, inclusiv pentru soia, a
fost fcut n cadrul a mai multor studii: Bennett i Leitch (2004) (Huang i Pan, 2005),
Bennett i Leitch (2003) (Rott et al., 2004), Bennett i Leitch (1997) (Cankar et al.,
2006), Arumuganathan i Earle (1995) (Reiting et al., 2007, i Taverniers et al., 2005);
Arumuganathan i Earle (1991) (Corbisier et al., 2005, i Petit et al., 2003). Subliniem c
aceste valori difer n funcie de autor (vezi valorile 1C citate i folosite de Reiting et al.,
2007, Burns et al., 2006, Cankar et al., 2006, Foti et al., 2006, SR EN ISO 21570:2006,
Waiblinger et al., 2006, Moens et al., 2005, Somma i Querci, 2004b, i Berdal i Holst-
Testarea OMG

72
Jensen, 2001). Putem totui conchide c valoarea medie a unui genom haploid de soia
reprezint echivalentul a aproximativ 1,15 pg de ADN genomic.
Practic, numerele absolute de copii ale fragmentelor int sunt determinate prin
raportarea cantitii de ADN la valoarea 1C corespunztoare taxonului analizat, nmulind
apoi cu un factor ce exprim zigoia evenimentului de transformare (Reiting et al., 2007).
Este foarte important s se in cont de stocastica distribuiei copiilor moleculei
int n soluia iniial de ADN (vezi Figura 16). Acest aspect are un impact deosebit n
special n cazul n care se lucreaz cu o cantitate mic de ADN, respectiv un numr redus
de copii, deoarece probabilitatea includerii a cel puin a unui fragment int n reacia
PCR poate fi nesatisfctoare (Berdal i Holst-Jensen, 2001).

2.6.2. Evaluarea strii de fragmentare a moleculelor de ADN
2.6.2. Assessment of DNA fragmentation

Dup cum s-a artat mai sus, integritatea structural a moleculelor de ADN
reprezint o caracteristic important pentru succesul reaciei PCR deoarece un grad
ridicat de fragmentare crete probabilitatea ca numrul copiilor amplificabile ale
secvenei int s fie insuficient, respectiv sub limita de detecie/cuantificare (Berdal i
Holst-Jensen, 2001). Acest fenomen este caracteristic n special matricilor procesate.
Valorile satisfctoare ale concentraiei i puritii extractelor determinate
spectrofotometric nu garanteaz prezena unui ADN nedegradat, cu mas molecular
mare. Pentru evaluarea acestei nsuiri se poate utiliza migrarea electroforetic n gel de
agaroz i marcarea cu o substan de intercalare (ex. Debode et al., 2007, CRL-GMFF,
2007, sau Corbisier et al., 2005) sau electroforeza capilar i detecia cu laser (Corbisier
et al., 2005). Cea de-a dou tehnic se caracterizeaz printr-o mai bun sensibilitate i
rezoluie (Garcia-Canas et al., 2004, n Engel et al., 2006), permind o mai bun
evaluare a degradrii ADN-ului (Corbisier et al., 2005). n schimb, electroforeza n gel de
agaroz este mult mai avantajoas din punct de vedere economic, fiind cel mai frecvent
utilizat pentru evaluarea strii de fragmentare.
Electroforeza n gel este o metod de separare a macromoleculelor (ex. ADN,
ARN sau proteine) n funcie de mrime, structur, ncrctur electric i alte proprieti
Testarea OMG

73
fizice (Somma i Querci, 2004a; Wikipedia, 2009f). n cadrul unui astfel de experiment,
moleculele sunt forate s strbat lungimea unui gel, micarea fiind determinat de
curentul electric aplicat electrozilor poziionai la ambele capete ale gelului (Somma i
Querci, 2004a) (Figura 17).




(a)



(b) (c)
Fig. 17. Electroforeza n gel de agaroz. (a) Cmpul electric determin deplasarea moleculelor de ADN de-a lungul
gelului de agaroz. (b) Modul n care moleculele de ADN strbat matricea poroas reprezentat de gel. (c)
Separarea moleculelor de ADN n funcie de mrime.
Fig. 17. Agarose gel electrophoresis. (a) The electric field which determines the movement of DNA molecules along
the agarose gel. (b) DNA molecules moving throgh the porous matrix of the gel. (c) Separation of DNA molecules
according to their size.
Surs: GSLC (2003).


Separarea se realizeaz deci ntr-o matrice poroas (gelul de agaroz), iar distana
strbtut n unitatea de timp i viteza de deplasare depind de caracteristicile:
- macromoleculelor separate, respectiv mobilitatea electroforetic, determinat
n principal de ncrctura electric i mrime (Wikipedia, 2009f);
- mediului de electroforez, respectiv tipul i concentraia gelului i a soluiei
tampon;
- curentului electric aplicat, respectiv intensitatea acestuia.
Testarea OMG

74
Procesul este similar trecerii particulelor printr-o sit (Wikipedia, 2009f), gelul
avnd rolul de a ncetini micarea moleculelor, datorit apariiei forelor de frecare.
ncetinirea micrii este cea care determin separarea moleculele de ADN (ISCID, 2005),
cele de dimensiuni mici strbtnd mai uor matricea comparativ cu cele de dimensiuni
mari.
O gam larg de molecule biologice (ex. aminoacizi, proteine, nucleotide sau acizi
nucleici) posed grupri ionizate care, la orice valoare a pH-ului, sunt prezente n soluii
sub form de cationi (+) sau anioni (-) (Somma i Querci, 2004a). n cazul ADN-ului,
sarcina electric, dat de moleculele de zahar i radicalii fosfai din cadrul nucleotidelor,
este negativ (Wikipedia, 2009f), iar acesta se va deplasa nspre anod (+).
Gelul utilizat pentru electroforez poate fi de mai multe tipuri, n funcie de tipul
aplicaiei i analitul cu care se lucreaz. Pentru experimentele specifice testrii OMG
calitative se utilizeaz geluri de agaroz. Concentraia gelului se exprim n procente de
mas raportate la volum (weight/volume, simbolizat w/v) i reprezint de asemenea un
factor ce influeneaz viteza de migrare i capacitatea de separare a moleculelor de
diferite dimensiuni. De obicei, aceasta variaz ntre 0,7-0,8% i 1,4-2% i influeneaz
invers proporional viteza de deplasare a moleculelor.
Soluia tampon de electroforez (electrophoresis buffer) are un anumit coninut n
sruri i are rolul de a menine constant valoarea pH-ului i de a pune la dispoziie ioni
care asigur conductivitatea electric (Wikipedia, 2009f; Somma i Querci, 2004a).
Concentraia tamponului de electroforez influeneaz direct proporional viteza de
migrare. Dac ns aceasta este prea mare, cldura generat de cmpul electric va crete
mult, putnd cauza topirea gelului sau alte inconveniente de natur tehnic.
ADN-ul nu poate fi vizualizat direct, ci doar dup marcare. Cea mai utilizat este
marcarea cu o substan de intercalare (ex. bromura de etidiu/EtBr, SYBR Green I sau
SYBR Safe). Moleculele unei astfel de substane au proprietatea de a se intercala ADN-
ului dublu-catenar. Dup intercalare emisia fluorescent a acestor molecule crete
semnificativ, iar n prezena unei surse de lumin UV ADN-ul dublu-catenar din gel
poate fi pus n eviden. Procedura clasic de marcare a ADN-ului implic utilizarea
EtBr, substan ce prezint ns o serie de neajunsuri (n special riscuri pentru sntate).
De aceea, n ultimii ani au fost introduse noi substane, mai puin periculoase i mai
Testarea OMG

75
performante din punct de vedere tehnic, ca SYBR Green I sau SYBR Safe. Procedura de
lucru este similar celei care utilizeaz EtBr, costurile fiind ns mai ridicate.
Mrimea fragmentelor separate este determinat apoi prin comparare cu probe
standard ce conin fragmente de ADN de mrimi cunoscute (Somma i Querci, 2004a).
Aceast etap este obligatorie doar la interpretarea rezultatelor obinute prin amlificare,
evaluarea extractelor putndu-se face i fr probe cunoscute.

2.6.3. Confirmarea absenei substanelor inhibitoare
2.6.3. Confirming the absence of PCR inhibitors

Dup cum s-a menionat i n subcapitolele anterioare, succesul extraciei n
cadrul analizelor OMG depinde de performanele metodei utilizate, respectiv de
capacitatea acesteia de a recupera o cantitate suficient de ADN amplificabil i de a
elimina inhibitorii PCR (Waiblinger et al., 2006). Prezena acestora din urm n extract i
influena pe care o au asupra reaciei PCR pot fi evideniate printr-un experiment real-
time PCR, amplificnd o secven endogen n diluii seriale ale extractului (CRL-
GMFF, 2007; Reiting et al., 2007; Foti et al., 2006; Lee et al., 2006; Waiblinger et al.,
2006; Cankar et al., 2006; SR EN ISO 21570:2006). Principiul i caracteristicile tehnicii
real-time PCR vor fi descrise n subcapitolul 2.9.2, iar modalitatea n care aceasta poate fi
utilizat pentru evaluarea inhibiiei n subcapitolele 2.6.3 i 3.5.2.4.
Acest tip de analiz reprezint o foarte bun modalitate de evaluare a metodelor de
extracie i a pretabilitii extractelor la amplificarea real-time PCR, constituind o parte
esenial a validrii efectuate n cadrul laboratorului (in-house validation), nainte de
verificarea printr-un studiu de comparare interlaboratoare (Waiblinger et al., 2006).

2.7. METODE ANALITICE UTILIZATE N CADRUL TESTRII OMG
2.7. ANALYTICAL METHODS EMPLOYED FOR GMO TESTING

Tipurile de metode utilizate n mod curent pentru testarea OMG sunt prezentate n
Figura 18, iar n Tabelul 2 sunt detaliate avantajele i dezavantajele celor mai utilizate
dintre acestea.
Testarea OMG

76
Tabelul 2.
Caracteristicile metodelor bazate pe analiza ADN-ului i proteinelor
Characteristics of DNA- and protein-based analytical methods
Caracteristic
Characteristic
Met. bazate pe analiza proteinelor
Protein-based methods
Met. bazate pe analiza ADN-ului
DNA-based methods
Uurin n
utilizare
1
Ease of use
- Medie pentru ELISA
- Testele rapide sunt extrem de expeditive
Metodele bazate pe PCR prezint o
dificultate mai mare pentru operator
Complexitate
tehnologic
1
Equipment
- Medie pentu ELISA
- Foarte simpl pentru testele rapide
nalt, mai ales pentru real-time
PCR i microarray
Durat
1

Duration
- 1-2 zile pentru ELISA; n cazul kiturilor
comerciale timpul de execuie este de
doar cteva ore
- Cteva minute pentru testele rapide
1-2 zile, n funcie de modul n care
este conceput protocolul integrat de
testare
Cost/prob
1
Cost/sample
Redus
Ridicat, n special pentru real-time
PCR i microarray
Versatilitate
Versatility
- Anticorpii specifici sunt dificil de
sintetizat
- n cazul ELISA se utilizeaz aporape
exclusiv kituri comerciale
- n cazul testelor rapide se utilizeaz
exclusiv kituri comerciale
- Primeri i sondele sunt foarte uor
de obinut
- Ponderea cea mai mare o au
probabil protocoalele concepute n
laborator
- Sunt disponibile kituri comerciale
ns protocolale de lucru pot fi
foarte uor modificate sau adaptate
Utilizare pentru
det. cantitative
Quantitative
results
- ELISA poate fi utilizat ca metod
cantitativ
- Testele rapide au fost considerate
metode calitaitve; recent a fost introdus
primul sistem cantitativ bazat pe
utilizarea stripurilor
2

Real-time PCR este cea mai
performant metod pentru testarea
cantitativ
Utilizare pe teren
Field testing
Posibil n cazul testelor rapide Nu este posibil
Aplicabilitate
Applicabilty
Poate fi analizat o gam larg de
proteine, dar metodele pot fi aplicate, n
general, n cazul produselor proaspete i
mai puin n cazul celor procesate
Poate fi aplicat chiar i produselor
intens procesate, moleculele de
ADN fiind mul mai stabile dect
proteinele
Specificitate
Specificity
Bun Mai mare dect la cealalt categorie
Sensibilitate
Sensitivity
Mai redus dect cea a tehnicilor bazate
pe analiza ADN-ului, n special n cazul
matricilor procesate
Cea mai mare sensibilitate o
prezint real-time PCR-ul
1
S-a inut cont i de etapa de izolare a analitului.
2
Sisemul QuickScan produs de EnviroLogix. Pentru mai multe detalii vezi EnviroLogix (2009).


O mare parte dintre probele care fac obiectul testrilor OMG este reprezentat de
matrici alimentare. Acestea se caracterizeaz de obicei printr-un intens grad de procesare,
n special sub influena temperaturilor ridicate (Endres, 2001). Datorit faptului c
Testarea OMG

77
termostabilitatea ADN-ului este mai bun dect a proteinelor (Anklam et al., 2002, n
Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999), reacia PCR este cea mai potivit tehnic
pentru detecia, identificarea i cuantificarea OMG-urilor (Anklam et al., 2002, n
Angonesi Brod et al., 2007; Taverniers et al., 2005; Berdal i Holst-Jensen, 2001).
Aceast tehnologie prezint deci o sensibilitate, specificitate i eficien mai mare dect
n cazul tehnicilor bazate pe analiza proteinelor (Holst-Jensen et al., 2003, n Smith i
Maxwell, 2007; Anklam et al., 2002, n Taverniers et al., 2005; Gachet et al., 1999).



Fig. 18. Metode disponibile pentru testrile OMG
Fig. 18. Available methods for GMO testing
Surse: Sisea et al. (2008); Tripathi (2005); Zafar et al. (2004); Ahmed (2002).


2.7.1. Detecia OMG-urilor cu ajutorul biotestelor
2.7.1. Bioassay-based detection of GMOs

Detecia OMG-urilor pe baza biotestelor este posibil doar n cazul diferitelor
tipuri de rezisten (ex. la erbicide, insecte sau antibiotice) (Zafar et al., 2004).
Testarea OMG

78
Testele de germinare presupun folosirea unor medii simple care conin erbicidul
sau antibioticul pentru care se testeaz rezistena. n cazul n care erbicidul nu se adaug
n mediu, acesta va fi aplicat prin pulverizare asupra plntuelor (Figura 19). n condiiile
descrise, indivizii rezisteni se vor dezvolta normal, fiind considerai pozitivi din punct de
vedere al prezenei transgenei.



Fig. 19. Biotest pentru detecia i identificarea plantelor rezistente la erbicid.
Fig. 19. Bioassay for the detection and identification of herbicide resistant plants.


n cazul testrii rezistenei la atacul insectelor, larvele speciilor int sunt lsate
libere pentru a se hrni cu plantele provenite din lotul de semine testate. Se poate
concluziona c plantele sunt transgenice n cazul n care larvele nu supravieuiesc
testului.
Aceste teste sunt uor de aplicat, nu necesit dotare special, sunt relativ ieftine,
dar necesit timp i se pot folosi doar n cazul loturilor de semine germinabile sau
plantelor care produc astfel de semine. Trebuie de asemenea s se aib n vedere c
proprietile germinative pot determina obinerea unor rezultate eronate, iar zigoia
caracterului transgenic nu poate fi stabilit.




Testarea OMG

79
2.7.2. Detecia OMG-urilor prin analiza proteinelor
2.7.2. Protein-based detection of GMOs

Dintre metodele bazate pe analiza proteinelor, doar cele imunologice sunt folosite
n practica testrii OMG. Acestea au la baz interaciunea anticorp-antigen, proteina
rezultat n urma expresiei transgenei n organismul gazd reprezentnd antigenul.
Teoretic, testele imunologice pot fi utilizate pentru o larg varietate de molecule
int. n practic ns, exist trei limite majore ale acestor metode:
- necesitatea prezenei n proba analizat a proteinelor cu structuri teriare i
cuaternare intacte; de obicei, n cazul matricilor procesate intervine
denaturarea proteinelor, condiia neputnd fi astfel satisfcut;
- disponibilitatea anticorpilor specifici; acetia sunt mult mai greu de
sintetizat comparativ cu primerii utilizai n cadrul metodelor bazate pe
analiza ADN-ului;
- posibilitatea ca ADN-ul transgenic prezent n prob s nu fie exprimat
uniform n timp i n toate organele plantei.
Datorit primului dezavantaj menionat, metodele de testare imunologice se pot
utiliza, n general, doar n cazul probelor proaspete sau cu grad redus de procesare (Zafar
et al., 2004), iar n analizele de rutin se utilizeaz exclusiv kituri comerciale.
Exist dou formate ale imunotestelor, ELISA i teste rapide de tipul stripurilor
(lateral flow strips), care difer n principal prin gradul de complexitate i performana
rezultatelor, cele dou caracteristici fiind invers proporionale.
Tehnica ELISA este utilizat, n general, pentru detecie calitativ sau stabilirea
nivelului de expresie proteic. Principiul ELISA cu cea mai larg aplicabilitate n testarea
OMG, sandwich ELISA (Figura 20), utilizeaz un anticorp de captur, imobilizat pe o
suprafa solid, i un anticorp de detecie marcat. Dac proteina de interes (antigenul)
este prezent n extractul testat, aceasta va fi legat de anticorpii care cptuesc pereii
godeului de analiz. Urmeaz apoi legarea la protein a celui de-al doilea set de anticorpi.
n urma unei reacii enzimatice de culoare, anticorpii marcai coloreaz mediul de reacie,
fiind astfel indicat i prezena proteinei transgenice. Dei ELISA poate fi utilizat pentru
cuantificare (Corbisier et al., 2005; Querci et al., 2005), n practic, aplicaiile n aceast
Testarea OMG

80
direcie sunt foarte restrnse. Corbisier et al. (2005), Querci et al. (2005) i Eyquem
(2004) au descris i demonstrat modul de utilizare a kitului GMO Food Ingredient
Testing (noua denumire GMOChek RUR Soya Test) produs de Strategic Diagnostics
(http://www.sdix.com) i validat de JRC pentru cuantificarea proteinei EPSPS n diferite
fraciuni alimentare de soia (Lipp et al., 2002, n Corbisier et al., 2005, i Strategic
Diagnostics, 2004) i alimente uor procesate, dar nerecomndat pentru detecia proteinei
de interes n stare denaturat. Acesta este probail i motivul pentru care rezultatele au fost
negative n cazul probelor tratate termic la temperaturi ridicate (Corbisier et al., 2005).
Stave (1999) afirm c detecia proteinelor denaturate este posibil utiliznd anticorpii
monoclonali, dar cuantificarea rmne n continuare foarte dificil n cazul alimentelor
procesate (Debode et al., 2007).


Sandwich ELISA

Fig. 20. Principiul metodei sandwich ELISA.
Fig. 20. The principle of sandwich ELISA.
Dup The Future of Things (2007), modificat.


Stripurile reprezint o form simplificat a testului ELISA, care nlocuiete
godeurile cu membrane nitrocelulozice (stripul propriu-zis) n care sunt ncorporai
anticorpi dubli, specifici proteinei analizate i marcai cu un reactiv colorat (Figura 21).
Testarea OMG

81

Fig. 21. Lateral flow strips - principiu de funcionare. (a) Vedere lateral ilustrnd
principiul testului imunologic i modul de dispunere a benzilor de control i testare pe
membrana nitrocelulozic. (b) Vedere frontal a testelor introduse n extract vegetal.
Rezultatul din stnga este negativ, iar cel din dreapta pozitiv.
Fig. 21. Lateral flow strip assay format. (a) Side view illustrating principles of the
immunological test, and relative location of control and test lines on a nitrocellulose
strip. (b) Vertical view of test strips dipped in an eppendorf containing genetically
modified material, and showing both negative and positive test results.
Surs: Layton n Ahmed (2002).


Testarea se face prin introducerea stripului ntr-un recipient ce conine extract din
planta analizat. Dac proteina de interes este prezent, aceasta va fi legat de anticorpii
specifici marcai (Figura 21a). Complexul migreaz apoi, prin capilaritate, de-a lungul
membranei nitrocelulozice poroase. Pe direcia de migrare sunt plasate dou zone de
captur, una pentru structurile anticorp-antigen, iar cealalt pentru anticorpii marcai
liberi. Prezena celei de a doua linii (controlul pozitiv) pe membran indic o prob
negativ, iar prezena ambelor linii indic un rezultat pozitiv (Figura 21b). Acest sistem
(Anexa III) ofer rezultate calitative n doar cteva minute, testele fiind considerate
ieftine, uor de efectuat i foarte potrivite pentru etapa de screening (Van Duijn et al.,
2002, n Van den Bulcke et al., 2005), domeniu n care i-au gsit o larg aplicabilitate,
spre deosebire de ELISA. Dup cum s-a menionat mai sus (vezi Tabelul 2), EnviroLogix
a introdus recent sistemul QuickScan care, n combinaie cu stripurile clasice, poate oferi
rezultate cantitative n cazul analizei loturilor de boabe/semine (Envirologix, 2009).
Principalii productori de kituri imunologice destinate testrii OMG sunt:
EviroLogix (http://envirologix.com/artman/publish/index.shtml), Strategic Diagnostics,
Romer Labs (http://www.romerlabs.com/romer.htm) i Agdia (http://www.agdia.com).

Testarea OMG

82
2.7.3. Testarea OMG bazat pe analiza ADN-ului
2.7.3. DNA-based testing of GMOs

Reacia PCR clasic i real-time

Reacia PCR permite amplificarea selectiv, ntr-un numr foarte mare de copii, a
unei secvene ADN prezent ntr-o proporie relativ redus n cadrul unui amestec
complex de fragmente ADN (Zafar et al., 2004). Analiza produilor rezultai prin
amplificare, n cadrul unei reacii PCR clasie, permite formularea unei concluzii calitative
(da sau nu) asupra prezenei OMG-urilor n proba testat. n practic, evaluarea
ampliconilor se face, n general, prin separare electroforetic n gel de agaroz, marcare
cu EtBr, vizualizare n prezea luminii UV i compararea cu probe standard. Pentru
obinerea informaiilor cantitative referitoare la coninutul de acizi nucleici este utilizat
tehnica real-time PCR. Caracteristicile acestor dou metode, precum i particularitile
care trebuie avute n vedere n contextul analizelor OMG, vor fi prezentate n
subcapitolele urmtoare.

Microarray

Numrul evenimentelor de transformare la plantele de cultur este n continu
cretere, diversificndu-se totodat i elementele genetice utilizate. Ca urmare,
metodologia de detecie i identificare folosit n prezent se va confrunta cu o serie de
probleme eseniale. Spre exemplu, screeningul nu va mai fi posibil utiliznd doar un
numr redus (1-3) de reacii PCR (Xu et al., 2006). n acest context, o metodologie care
s permit identificarea rapid a tuturor elementelor necesare este amplificarea PCR
multiplex. Un inconvenient care apare ns n acest caz este faptul c metoda
convenional de confirmare a produilor PCR (i.e. electroforeza) este mai dificil de
aplicat (Demekea et al., 2002, n Xu et al., 2006; Permingeat et al., 2002; Matsuoka et
al., 2002), alternativa fiind reprezentat de microarray. Astfel, amplificarea PCR
multiplex amplificarea concomitent a mai multor secvene int combinat cu
detecia microarray reprezint cel mai bun candidat pentru o strategie eficient, capabil
Testarea OMG

83
s acopere o gam ct mai larg de secvene int i care s permit identificarea uoar a
secvenelor amplificate.
Un sistem microarray include mai multe zone de reacie (spoturi) alctuite din
sonde (fragmente) oligonucleotidice specifice, fiind astfel posibil detecia simultan a
unui numr foarte mare de secvene de interes. Majoritatea aplicaiilor microarray sunt
destinate analizelor de expresie genic, identifcrii polimorfismelor i genotiprii.



Fig. 22. Chip microarray cu aproximativ 40.000 de spoturi.
Fig. 22. Microarray chip with aproximatelly 40.000 spots.
Surs: Molecular Station (2007a).


Tehnologia microarray, inclus n clasa microsistemelor analitice, deriv din
blottinguri i utilizeaz principiul clasic al hibridrii moleculare ntre dou fragmente
complementare. ADN-ul genomic este izolat din proba analizat i amplificat prin PCR,
iar ulterior ampliconii hibrideaz sonde oligonucleotidice (Xu et al., 2006) ataate pe
suporturile microscopice solide (cipuri) de sticl, material plastic sau silicon (Deisingh i
Badrie, 2005). n sistemul clasic, numrul sondelor este foarte mare, chiar de ordinul
zecilor de mii (Figura 22), determinarea se face n urma unor reacii fluorimetrice sau
colorimetrice, iar analiza datelor este foarte complex. Acest sistem permite realizarea
unor economii de timp, meninnd ns ridicate precizia, specificitatea i
reproductibilitatea (Deisingh i Badrie, 2005).


Testarea OMG

84


Extracia
ADN-ului

Amplificarea n
trei reacii PCR
multiplex utiliznd
primeri biotinilai
Hibridarea
produilor PCR pe
microarrayul
DualChip GMO

Detecia
colorimetric
Silverquant

(a) (b)
Fig. 23. Testarea OMG calitativ utiliznd kitul DualChip GMO V2.0 (Eppendorf). (a) Principiul funcional al
kitului. (b) Repartizarea seturilor de sondele specifice pentru detecia ampliconilor pe spoturile microarrayului.
Fig. 23. Qualitative GMO testing using DualChip GMO Kit V2.0 (Eppendorf). (a) Functional principle of the
kit. (b) Specific probe sets for amplicon detection spotted on the array.
Dup Eppendorf (2008).


Reaciile multiplex combinate cu detecia microarray permit determinarea
simultan a prezenei sau absenei unui set mare de secvene de interes (Xu et al., 2006;
Lauter, 2001, n Deisingh i Badrie 2005), oferind posibilitatea realizrii ntr-o singur
etap, a deteciei taxonilor, screeningului, precum i identificarea evenimentelor de
transformare. Cipurile ADN reprezint probabil i cea mai eficient modalitate de
identificare precis a evenimentelor de transformare care includ mai multe inserturi
(stacked events) datorit posibilitii de detecie concomitente a unui mare numr de
secvene genice.
Primul kit de detecie a OMG-urilor cu ajutorul cipurilor a fost creat de GeneScan
(http://www.genescan.de/en.aspx). Un alt exemplu din aceast categorie este DualChip
GMO Kit V2.0, produs de Eppendorf (http://www.eppendorf.com/
int/?l=1&action=start). Acest kit permite testarea calitativ simultan pentru mai multe
elemente genetice comune sau specifice diferitelor PMG-uri (Eppendorf, 2008). Aplicaia
Testarea OMG

85
presupune executarea a trei seturi de amplificri PCR multiplex (un set pentru
identificarea taxonilor, care include apte reacii; un set pentru screening OMG, care
include detecia a 12 elemente; un set pentru identificarea OMG-urilor, care include
detecia a 11 elemente) i o reacie de control a contaminrii cu CaMV, urmat de
hibridarea ampliconilor marcai (primerii utilizai pentru amplificare sunt biotinilai) pe
un singur cip ADN care conine sonde complementare acestora. Ampliconii sunt detectai
colorimetric utiliznd principiul Silverquant, patentat de Eppendorf. Etapele de lucru i
dispunerea spoturilor pe cip sunt prezentate n Figura 23.
Alte modele pentu detecia OMG-urilor utiliznd tehnica microarray au fost
descrise de Engel et al. (2006), Moens et al. (2005), Xu et al. (2006), Germini et al.
(2004) i Rudi et al. (2003).

PCR-ELISA

O alt metodologie cu capacitate mare de procesare i potenial pentru
automatizare este PCR-ELISA (Brunnert et al., 2001, n Deisingh i Badrie, 2005),
tehnic ce are la baz hibridarea specific cu o sond marcat cu digoxigenin (format
ELISA) a unui produs PCR biotinilat i imobilizat. Detecia are loc dup reacia
colorimetric n care este implicat digoxigenina.
Aplicaiile de acest fel sunt ns reduse ca numr, fiind potrivite doar pentru etapa
de screening din cadrul testrii OMG (ex. Vollenhofer et al., 1999, n Deisingh i Badrie,
2005, sau Petit et al., 2003). R-Biofarm (http://www.r-biopharm.com/index.php?) ofer
un astfel de kit comercial pentru detecia promotorului 35S i a terminatorului nos
(SureFood GMO 35S/NOS Screening) n diferite tipuri de probe (vezi R-Biofarm, 2009).

2.7.4. Alte principii de analiz a OMG-urilor
2.7.4. Other principles of GMO analysis

n cazul n care compoziia sau structura ingredientelor derivate din PMG-uri (ex.
acizi grai sau trigliceride) este modificat, metode bazate pe cromatografie pot fi
utilizate pentru detecia diferenelor din profilul compoziiei chimice (Anklam et al.,
Testarea OMG

86
2002, n Huang i Pan, 2005; Zafar et al., 2004). Aceast posibilitate a fost demonstrat
prin analiza uleiurilor obinute din rapia MG. Asfel, pentru investigarea amprentei
trigliceridelor a fost utilizat cromatografia lichid de nalt performan (high
performance liquid cromatography/HPLC) i ionizarea chimic la presiune atmosferic
combinat cu spectrometria de mas (atmospheric pressure chemical ionization mass
spectrometry/APCI-MS), iar cuantificarea s-a fcut cu un detector cu ionizare n flacr
(flame ionization detector/FID).
Utiliznd spectroscopia NIR (near infrared), se pot detecta anumite modificri
genetice care altereaz structura morfologic a plantelor, fr ns a modifica n mod
semnificativ coninutul de proteine i uleiuri (ex. soia RR) (Anklam et al., 2002, n
Huang i Pan, 2005; Zafar et al., 2004). Posibilitatea identificrii unui coninut redus de
OMG-uri este ns limitat, ca i n cazul metodelor cromatografice.
Alte metode de analiz OMG, majoritatea aflate n faz experimental sau
utilizate la scar foarte redus, sunt descrise de Obeid et al. (2004) i Garcia-Canas et al.
(2004) (electroforeza capilar cuplat cu fluorescen indus de laser), Jastrzebska et al.
(2003) (wavelength-dispersive X-ray fluorescence/WDXRF), Moens et al. (2005),
Mannelli et al. (2003a; 2003b) i Feriotto et al. (2003; 2002) (biosenzori/biocipuri)
(Deisingh i Badrie, 2005; Huang i Pan, 2005).

2.8. TESTAREA OMG CALITATIV BAZAT PE TEHNICA PCR
2.8. QUALITATIVE TESTING OF GMOs BASED ON CONVENTIONAL PCR

2.8.1. Utilizarea reaciei PCR n cadrul testrii OMG
2.8.1. Using the PCR reaction for GMO testing

Crearea reaciei n lan a polimerazei, de ctre Mullis i colaboratorii si, n 1983,
a revoluionat ramurile moleculare ale biologiei i medicinei (Saiki et al. 1988, n Somma
i Querci, 2004b), nainte de apariia acestei tehnici putnd fi obinute doar cantiti
infime dintr-un fragment int de ADN. Reacia PCR permite amplificarea enzimatic in
vitro a unei regiuni specifice de ADN, localizat ntre dou secvene ADN cunoscute,
fcnd astfel posibil multiplicarea unei singure copii a fragmentului de interes n peste
Testarea OMG

87
un milion de copii, n doar cteva ore. Tehnica PCR este esenial pentru multe procedee
de analiz molecular: clonarea unor fragmente specifice de ADN, detecia i
identificarea genelor n vederea diagnosticrii sau investigrii criminalistice, analiza
modelelor de expresie genic. n ultimii ani, reacia PCR a fcut posibil iniierea
cercetrilor n domenii noi ca: controlul autenticitii produselor alimentare,
monitorizarea OMG-urilor, evaluarea comtaminrii microbiologice.
Testele calitative ofer informaii referitoare la prezena/absena ADN-ului de
interes din proba analizat. Conform metodologiei descrise n subcapitolul 1.2.2, testarea
OMG calitativ const, de obicei, n parcurgerea mai multor etape analitice, fiecare
corespunznd unei amplificri PCR. Prima dintre acestea presupune detecia ADN-ului
specific taxonului din care deriv OMG-ul analizat, secvena int aparinnd n acest caz
unei gene caracteristice speciei (gen de referin) respective. Aceast analiz are rolul de
a elimina posibilitatea obinerii unor rezultate fals negative ce pot apare n cazul n care
extractul de ADN nu are parametri corespunztori pentru amplificare. Conceptual, etapa
trebuie inclus n metodologia de evaluare a caracteristicilor ADN-ului izolat (vezi
subcapitolul 2.6), alturi de alte analize specifice.
Urmeaz apoi screeningul, etap n care se realizeaz identificarea probelor ce
conin material MG. Se face astfel o triere a probelor, fiind eliminate din etapele
ulterioare ale procesului analitic cele fr coninut transgenic. Screeningul este necesar
mai ales n cazul probelor despre care nu exist informaii suficiente referitoare la
coninut (i.e. taxoni/ingrediente, evenimente de transformare). Chiar dac aceste
informaii sunt disponibile, efectuarea screeningului poate fi totui benefic, putnd oferi
indicii referitoare la prezena unor evenimente de transformare neateptate. intele pentru
amplificare corespund secvenelor celor mai frecvent utilizate elemente transgenice (ex.
promotorul 35S, ternimatorul nos sau gene marker pentru selecie).
n final, probele identificate pozitiv n cea de-a doua etap vor fi testate n vederea
determinrii precise a OMG-urilor pe care acestea le conin, amplificnd regiuni specifice
fiecrui eveniment de transformare.
n continuare vor fi prezentate caracteristicile metodolgiei PCR i va fi descris
modul n care aceasta este utilizat pentru testarea calitativ a coninutului MG.

Testarea OMG

88
2.8.2. Structura i modul de replicare a ADN-ului
2.8.2. DNA structure and replication

Pentru o mai bun nelegere a principiilor i aplicaiilor PCR, structura i modul
de replicare al acidului dezoxiribonucleic (ADN) sunt descrise n continuare, dup
Somma i Querci (2004b).
Molecula de ADN este constituit din dou catene complementare, rsucite i
antiparalele. Fiecare dintre cele dou catene este alctuit din uniti denumite
nucleotide, unite ntre ele prin legturi de hidrogen. Structura are un aspect helical cu
rsucire spre dreapta i este purttoarea informaiei genetice codificat n secvena
nucleotidelor. n celulele eucariote, nucleul conine cea mai mare parte a ADN-ului care
reprezint ADN-ul nuclear sau cromozomal. ADN-ul cromozomal este separat de restul
celulei (citoplasma) printr-o membran nuclear dubl. Pe lng acest tip de ADN, n
celulele eucariote se gsete i ADN extracromozomal, localizat la nivelul unora dintre
organitele celulare (ex. mitocondrii sau cloroplaste).
Nucleotidele, considerate elementele structurale eseniale ale ADN-ului, sunt
denumite i dezoxinucleozid trifosfai (deoxynucleosid thriphpsphates/dNTPs) i sunt
de patru feluri:
- dezoxiadenozin trifosfat (deoxyadenosin triphosphate/dATP) sau adenina;
- dezoxiguanozin trifosfat (deoxyguanosin triphosphate/dGTP) sau guanina;
- dezoxitimidin trifosfat (deoxytimidin triphosphate/dTTP) sau timina;
- dezoxicitidin trifosfat (deoxycitidin triphosphate/dCTP) sau citozina.
O nucleotid este alctuit din trei componente principale: o baz azotat purinic
(adenin/A sau guanin/G) sau pirimidinic (citozin/C sau timin/T), o molecul de
zahar (dezoxiriboz) i o grupare fosfat. Baza azotat este legat de atomul de carbon 1
al moleculei de zahar printr-o legtur glicozidic, iar gruparea fosfat este legat de
atomul de carbon 5 printr-o legtur diesteric (Figura 24a).
Nucleotidele formeaz o caten de ADN prin legarea gruprii fosfat a unei
nucleotide cu gruparea hidroxil a nucleotidei precedente. Aceasta nseamn c
nucleotidele noi sunt ataate ntotdeauna la captul 3 al lanului (Figura 24b).

Testarea OMG

89

(a) (b)
Fig. 24. Constituirea catenei de ADN prin adugarea nucleotidelor
libere. a) Elementele principale ale unei nucleotide. b) Formarea
catenei de ADN prin alipirea nucleotidelor libere la captul 3.
Fig. 24. Formation of the DNA strand by adition of single
nucleotides. a) Main components of a nucleotide. b) Formation of a
DNA strand by adding free nucleotides to its 3 end.
Surs: Andrews (2007).


Exceptnd unele virusuri, ADN-ul este dublu-catenar, iar cele dou catene sunt
perfect complementare, alipindu-se foarte precis una la cealalt. Fiecare baz din cadrul
unei catene este complementar unui singur tip de baz de pe catena opus, formnd
astfel o pereche de baze (pb): A este ntotdeauna complementar cu T, unindu-se prin
dou legturi de hidrogen; C este ntotdeaun legat de G prin intermediul a trei legturi
de hidrogen. Astfel, cele dou lanuri nucleotidice sunt complementare, fiecare putnd
servi ca matri pentru sinteza celuilalt. Bazele azotate formeaz un nucleu hidrofob n
interiorul dublului helix, zaharurile i gruprile fosfat (n form anionic) constituind
stratul extern, hidrofil, al moleculei.
Informaia genetic complet care definete structura i funcia unui organism este
codificat sub forma (macro)moleculei de ADN. Cele trei procese responsabile de
transmiterea informaiei genetice n descenden sunt:
- replicarea ADN-ul dublu-catenar este duplicat pentru obinerea a dou
molecule identice;
- transcripia un segment de ADN care constituie o gen este citit i
transcris ntr-o secven monocatenar de ARN, denumit ARN mesager
Testarea OMG

90
(ARNm); aceste molecule trec apoi din nucleu n citoplasm, suferind o
serie de transformri;
- translaia sintetizarea unei secvena de aminoacizi pe baza moleculei de
ARNm; secvena de aminoacizi astfel constituit reprezint este o protein.
Replicarea ADN-ului in vivo este procesul care st la baza amplificrii PCR. n
timpul replicrii, molecula de ADN se despiralizeaz, cele dou catene se separ i
fiecare dintre acestea devine o matri pentru sinteza unei catene complementare noi. La
finalul procesului de replicare, fiecare molecul dublu-catenar, compus dintr-o caten
de ADN nou i una veche, constituie o copie exact a moleculei dublu-catenare iniiale.
n cadrul acestui proces sunt implicate mai multe enzime, ca: topoizomeraza i helicaza,
(responsabile pentru despiralizarea ADN-ului), ADN polimeraza III (direct responsabil
de sinteza noii catene ADN), primaza (sintetizeaz o structur oligonucleotidic
primerul ARN pe catena matri), RNaza H (ndeprteaz primerul ARN), ADN
polimeraza I (completeaz poriunea rmas liber n urma primerului ARN). ADN
polimeraza III i desfoar activitatea de-a lungul catenei matri, alipind nucleotide
libere la nucleotidele deja existente, pe baz de complementaritate. Nucleotidele adugate
formeaz legturi covalente (fosfodiesterice) cu nucleotidele aceleiai catene, iar unirea
cu nucleotidele complementare ale celeilalte catene este asigurat prin intermediul unor
legturi de hidrogen.
ADN polimeraza are capacitatea de a aduga nucleotide libere doar la captul 3 al
unei catene ADN. De aceea, n mod convenional, ADN polimeraza acioneaz de la
captul 5 spre captul 3 al catenei matri. n funcie de direcia de replicare a moleculei
de ADN (i.e. direcia de despiralizare i denaturare a dublului helix), una dintre catene
(denumit leading) este sintetizat continuu, iar cealalt (denumit lagging) este
sintetizat n fragmente (denumite Okazaki). Ulterior sintezei noilor catene, ligazele
catalizez formarea unei legturi ntre eventualele grupri adiacente de nucleotide (ex.
fragmentele Okazaki, n cazul moleculei formate pe baza catenei lagging, sau secvenele
obinute dup eliminarea primerului ARN i umplerea golului rmas n urma acestuia, n
cazul moleculelor formate pe baza ambelor catene iniiale).


Testarea OMG

91
2.8.3. Principiul reaciei PCR
2.8.3. Principles of PCR reaction

Reacia PCR are la baz mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului i este
utilizat pentru amplificarea unei secvene int de ADN ntr-un numr mare de copii
(Kubista et al., 2006), fiind considerat un fotocopiator molecular (Dalgleish, 2007)
sau o metodologie de xeroxare a ADN-ului (NCHGR,1992).
Pentru ca amplificarea s aib loc, sunt necesare urmtoarele componente
principale: doi primeri oligonucleotidici care flancheaz secvena ADN int, nucleotide
libere, o polimeraz termostabil, ioni de magneziu, o soluie tampon ce are rol de mediu
de reacie. Reacia se desfoar n cadrul unui ciclu repetitiv de temperaturi (Figura 25).


30-40 cicluri compuse din trei etape:
Etapa 1:
denaturarea
Etapa 2:
alipirea
(hibridarea
molecular)
primerilor
Etapa 3:
extensia


Fig. 25. Etapele amplificrii PCR: denaturarea, alipirea i extensia.
Fig. 25. The three steps of a PCR reaction: denaturation, annealing and
extension.
Dup Vierstraete (1999) n Somma and Querci (2004b).


n prima etap a amplificrii PCR, temperatura nalt are rolul de a separa catenele
dublului helix de ADN. Temperatura este apoi cobort pentru a facilita alipirea
(hibridarea molecular) primerilor oligonucleotidici la secvena int. n ultima etap,
temperatura are o valoare optim pentru activitatea polimerazei care extinde primerii prin
alipirea unor noi nucleotide, n prezena ionilor de Mg. n contextul amplificrii PCR,
cele trei etape constituie un ciclu individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR (PCR
Testarea OMG

92
cycle/step). Dup fiecare ciclu, catenele de ADN nou sintetizate servesc ca matrie n
ciclul urmtor. Principalul produs al acestei reacii exponeniale este un segment dublu-
catenar de ADN a crui terminaii corespund capetelor 5 ale primerilor oligonucleotidici.
Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dat de distana dintre cei doi
primeri. Produii ciclului iniial de amplificare sunt ns reprezentai de molecule de
ADN de mrimi diferite, a cror lungimi pot depi pe cea determinat de siturile de
alipire a celor doi primeri. n ciclul doi, aceste molecule (produii primului ciclu de
amplificare) genereaz catene de ADN de lungime definit care se vor acumula
exponenial n continuare, formnd produii de reacie dominani.
Numrul final de copii (N) ale secvenei int, rezultat n urma amplificrii poate fi
exprimat prin urmtoarea relaie:


( )
0
2 2 N n N
n
- = (1)

unde n reprezint numrul de cicluri, 2n exprim produsul obinut dup primul ciclu i
produii cu lungime nedefinit obinui dup al doilea ciclu, care pot fi neglijai, iar N
0

numrul iniial de copii ale secvenei int (Somma i Querci, 2004b). Teoretic, dup 20
cicluri PCR vom avea o amplificare de 2
20
ori a ADN int, dac eficiena de amplificare
este de 100% n fiecare ciclu.
n practica ns, eficiena de amplificare variaz. Astfel, cantitatea teoretic de
produs obinut se poate exprima prin ecuaia:


( )
0
1 N E N
n
- + =
(2)

unde E reprezint eficiena de amplificare (Kubista et al., 2006).
n continuare sunt descrise cele trei etape ale reaciei PCR, dup Sambrook et al.
(1989) citai de Somma i Querci (2004b).
n prima etap, catena dubl este denaturat dnd natere ADN-ului monocatenar.
Procesul trebuie s fie complet deoarece catenele separate doar parial se vor realipi odat
cu scderea temperaturii, iar primerii nu vor putea aciona (Kubista et al., 2006).
Separarea catenelor complementare se face odat cu creterea temperaturii, prin ruperea
Testarea OMG

93
legturilor de hidrogen. Pragul de temperatur maxim este de 92-96 C, nivel la care se
consider c reacia este complet i ntreg ADN-ul dublu-catenar s-a denaturat. Nivelul
temperaturii la care jumtate din ADN-ul dublu-catenar se gsete sub form
monocatenar se numete temperatur de denaturare (melting temperature/T
m
) i este un
parametru utilizat la designul primerilor i al protocoalelor de amplificare. Tipul de
solvent, concentraia srurilor i pH-ul influeneaz procesul de denaturare. De exemplu,
n mediu de reacie cu coninut redus de sruri, pH ridicat i n prezena solvenilor
organici (ex. formaldehid), T
m
are valoare mai redus. Proporia C/G este un alt factor
important care influeneaz T
m
, aceast valoare fiind mai mare n cazul structurilor de
ADN cu coninut mai mare de C/G.
Temperatura ridicat corespunztoare etapei de denaturare asigur de asemenea
stoparea reaciilor enzimatice (ex. cele iniiate n ciclul anterior).
Alipirea (hibridarea) catenelor de ADN are loc odat cu scderea treptat a
nivelului de temperatur. Acest principiu st i la baza atarii primerilor la siturile
complementare care flancheaz secvena int. n aceast etap, ntre primerii prezeni n
mediul de reacie i ADN-ul matri monocatenar legturile se formeaz i se rup n mod
constant. Cu ct aceste legturi sunt mai stabile (ex. primerii care se potrivesc perfect pe
secvena matri de ADN), cu att vor rezista mai mult, permind ADN polimerazei s
i desfoare mai uor activitatea. Dup ataarea ctorva nucleotide, legturile devin
foarte puternice.
Temperatura necesar pentru alipirea primerilor depinde n principal de
caracteristicile acestora. Teoretic, aceasta este cu cteva grade mai mic dect T
m
, ceea ce
asigur formarea unor structuri stabile doar ntre primeri i fragmentele int ntre care
exist un grad mare de omologie (complementaritate) (Kubista et al., 2006).
Ultima etap presupune extinderea primerilor de-a lungul secvenei int prin
adugarea unor nucleotide libere de ctre ADN polimeraz (frecvent Taq ADN
polimeraza), n prezena Mg
2+
. Bazele complementare secvenei int sunt ataate n
continuarea primerului, la captul 3 al acestuia (reamintim c polimeraza adaug
nucleotide n direcia 5-3, citind secvena int de la 3 la 5). Temperatura optim de
funcionare a Taq ADN polimerazei este de aproximativ 72 C, acest nivel fiind utilizat
n majoritatea protocoalelor PCR (Kubista et al., 2006). De asemenea, pentru majoritatea
Testarea OMG

94
experimentelor PCR, durata de 30-45 secunde a acestei etape asigur extensia complet a
fragmentului de interes, fiind necesar un interval de timp mai lung n cazul n care
lungimea secvenei int depete 1000 pb.

2.8.4. Instrumentele i componentele necesare reaciilor PCR
2.8.4. Instruments and components of a PCR reaction

Dou mari inovaii au permis automatizarea procesului de amplificare PCR
(Somma i Querci, 2004b):



(a)

(b)
Fig. 26. Thermal cycler-ul. (a) Sistmul de bi marine utilizate pentru experimentele
PCR iniiale. (b) Thermal cycler modern (Veriti 384-Well Thermal Cycler, Applied
Biosystems) care permite desfurarea automatizat a amplificrii.
Fig. 26. The thermal cycler. (a) The temperature baths used for the initial PCR
experiments. (b) Modern thermal cycler (Veriti 384-Well Thermal Cycler, Applied
Biosystems) that allows automatization of the PCR process.
Surse: Molecular Station (2009b); Applied Biosystems (2009).


- introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt inactivate la
temperaturi ridicate; astfel, cantitatea de ADN polimeraz repartizat iniial
poate aciona de-a lungul mai multor cicluri PCR;
- crearea unor blocuri de temperatur a cror nivel termic poate fi crescut sau
cobort rapid, n mod automatizat; un astfel de instrument poart denumirea
de thermal cycler sau main PCR (Figura 26).
Testarea OMG

95
Parametri ciclurilor de temperatur i reactivii utilizai sunt factori critici pentru
succesul reaciei PCR, cele mai importante elemente care trebuie avute n vedere n acest
context fiind secvena int de ADN, primerii, polimeraza, soluia tampon, ionii de Mg,
nucleotidele libere i numrul ciclurilor de amplificare.

Secvena int

Teoretic, amplificarea PCR se poate desfura dac exist cel puin o copie intact
a secvenei int (Kubista et al., 2006), fiind ns necesar un numr mai mare de copii
pentru ca detecia produsului de amplificare s fie posibil. Mrimea acestei secvene
poate fi cuprins ntre 0,1 (sau chiar mai puin n cazul amplificrilor real-time PCR) i
pn la cteva kilobaze. Cantitatea total de ADN utilizat n mod obinuit pentru PCR
este de 0,05-10 g. Dei o prob nu trebuie s fie nalt purificat, cum se impune n cazul
altor aplicaii (ex. secveniere), eliminarea unor contaminani, ca polizaharide, polifenoli,
lipide, heparin, ageni de chelatizare ai Mg
2+
, formalin sau detergeni, este esenial
pentru buna desfurare a procesului de amplificare.

Primerii

O component foarte important a reaciei PCR este reprezentat de primeri.
Secvena acestora influeneaz poziia i lungimea produsului de amplificare, temperatura
de alipire i cantitatea de produs obinut (Innis i Gelfand, 1994, n Somma i Querci,
2004b). Proiectarea necorespunztoare a primerilor determin obinerea unor cantiti
reduse de produs de amplificare dorit sau chiar lipsa acestuia. Elementele importante
pentru construierea primerilor sunt: lungimea, temperatura de alipire, gradul de omologie
cu alte secvene dect cea pe care dorim s o amplificm, gradul de complementaritate
dintre secvenelor primerilor, coninutul G/C, secvenele polipirimidinice (T, C) sau
polipurinice (A, G), secvena de la captul 3 (Somma i Querci, 2004b).
Lungimea primerilor este cuprins de obicei ntre 16 i 30 nucleotide, iar cu ct
aceasta este mai mare, cu att alipirea (hibridarea) se realizeaz mai greu (temperatura de
alipire este mai ridicat), specificitatea reaciei crete (cu ct secvena este mai lung, cu
Testarea OMG

96
att probabilitatea existenei unor secvene similare scade), iar cantitatea de produs
acumulat se reduce.
Temperatura de alipire. O reacie PCR necesit utilizarea unor primeri cu
temperaturi de alipire (hibridare) similare. Dac cele dou temperaturi sunt foarte diferite,
amplificarea nu se va desfura corespunztor deoarece primerul cu temperatur de
hibridare mai ridicat se poate alipi nespecific dac nivelul de temperatur este optim
pentru cellalt primer, iar acesta din urm nu va rmne alipit la temperatura specific
primului primer, care este prea ridicat. n practic temperatura de alipire se determin
pornind de la temperatura de denaturare (T
m
) menionat anterior. Aceasta se poate
calcula utiliznd diferite formule, cea mai simpl fiind cea conceput de Wallace:

( ) ( ) C G T A T
m
+ + + = 4 2 (3)

unde: A, T, G, C reprezint numarul de baze ale primerului. Aceast formul ofer o
valoare aproximativ, dar destul de precis n cazul primerilor de 18-24 baze. Relaia
existent ntre temperatura de alipire i cea de denaturare reprezint una dintre aa-
numitele black boxes ale reaciei PCR. Regula general acceptat este utilizarea unei
temperaturi iniiale de alipire cu 5 C mai mic dect temperatura de denaturare. De cele
mai multe ori aceast valoare nu este ns optim, fiind necesar determinarea empiric a
temperaturii optime de alipire.
Secvena primerilor. Primerii trebuie astfel alei nct s aib o secven
complementar unic, cel puin pentru taxonul analizat, ceea ce confer specificitate
reaciei. Dup cum s-a menionat anterior, specificitatea primerilor este influenat i de
lungime, numrul siturilor de alipire fiind mult mai mic pentru un primer de 24 baze
comparativ cu unul de 15 baze.
Fiecare primer trebuie astfel proiectat nct s nu conin secvee omoloage mai
lungi de trei baze, aceastea putnd cauza apariia unor structuri dublu-catenare de tip ac-
de-pr ce mpiedic alipirea corect. O alt eroare de proiectare este prezena regiunilor
omoloage n cadrul primerilor utilizai n aceeai reacie, rezultatul fiind sporirea primer-
dimerilor.
Testarea OMG

97
Alipirea captului 3 al primerilor este esenial deoarece aceasta este partea n
care polimeraza va aduga nucleotide libere pentru sinteza noii catene. Este recomandat
includerea ct mai multor baze G i C n aceast regiune, prezena lor favoriznd o
hibridare mai stabil.
Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar regiunile
poli-T sau poli-A sunt instabile din punct de vedere al legturilor complexului primer-
secven int. Cu toate acestea, trebuie evitat nlnuirea mai multor baze de acelai fel.
Ideal, succesiunea nucleotidelor n cadul secvenei primerilor trebuie s fie ntmpltoare,
G/C s reprezinte 50%, iar totalul bazelor s fie de aproximativ 20. n aceast situaie, T
m

va fi cuprins ntre 56 i 62 C.
Designul primerilor se realizeaz cu software-uri speciale, ca Primer Express,
distribuit de Applied Biosystems, sau Primer3 care poate fi accesat liber
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Acestea sunt astfel concepute nct s ia n considerare
toate principiile amintite anterior, referitoare la caracteristicile intrinseci ale primerului.
Specificitatea poate fi apoi evaluat teoretic prin determinarea omologiei secvenelor
primerilor cu secvene genomice din diverse baze de date (ex. GenBank,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), utiliznd software-uri de tip BLAST
(basic local alignment search tool) (ex. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).
Concentraia primerilor. Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei n
concentraii de 1 M, suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezena unor
concentraii mai mari poate cauza amplificarea unor secvene nedorite. Dac ns
concentraia primerilor n mediul de reacie este redus, eficiena reaciei PCR va scdea.

ADN polimeraza

Metoda conceput de Mullis utiliza o ADN polimeraz termosensibil, fiind
necesar adugarea enzimei n mediul de reacie naintea fiecrei etape de extensie.
Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a uurat mult metodologia
de lucru, adugarea enzimei dup fiecare etap de denaturare nemaifiind necesar. Prima
ADN polimeraz termostabil utilizat a fost Taq ADN polimeraza, provenit de la
bacteria Thermus aquaticus care triete n izvoarele termale din Yellowstone National
Testarea OMG

98
Park, SUA, la temperaturi de aproximativ 85 C (Saiki et al., 1988, n Somma i Querci,
2004b).
Datorit mediului din care provine, Taq ADN polimeraza funcioneaz optim la o
temperatur de 70-80 C i este, probabil, cea mai utilizat polimeraz n aplicaiile PCR.
Exist i alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN polimeraza, provenit de la Pyrococcus
furiosus) i de asemenea diverse companii productoare pun la dispoziie o multitudine
de versiuni ale aceleiai enzime, modificate i optimizate pentru diferite aplicaii (ex. n
cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNA Polymerase i HotStar Taq DNA Polymerase de
la Qiagen, Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase de la Fermentas, TaqDNA
Polymerase nativ i recombinant, Platinum TaqDNA Polymerase de la Invitrogen,
AmpliTaq DNA Polymerase i AmpliTaq Gold DNA Polymerase de la Applied
Biosystems, GoTaq Flexi DNA Polymerase de la Promega).

Nucleotidele libere

Nucleotidele libere reprezint elementele de baz pentru sinteza ADN-ului.
Concentraia acestora trebuie s fie cuprins ntre 20 i 200 M pentru fiecare din cele
patru tipuri, n proporii echivalente, pentru a reduce erorile de ncorporare n moleculele
nou sintetizate (Innis et al., 1988, n Somma i Querci, 2004b). Nucleotide nalt purificate
sunt furnizate i utilizate ca stocuri, de obicei n amestec.

Soluia tampon i ionii de Mg

Dei nu particip direct la desfurarea reaciei de polimerizare, prezena unei
soluii tampon n mediul de amplificare este indispensabil, aceasta avnd rolul de a
asigura un mediu optim, din punct de vedere chimic, pentru activitatea i stabilitatea
ADN polimerazei. Compoziia soluiei tampon este optimizat pentru enzima creia i
este destinat, cei doi reactivi fiind comercializai sub form de pachet. Cele mai utilizate
soluii tampon conin 10 mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5-2,5 mM MgCl
2
. Acestor
componente li se mai pot aduga i alte substane, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvani ce
au rolul de a mbunti modul n care decurge amplificarea.
Testarea OMG

99
Prezena cationilor divaleni de Mg este de asemenea esenial pentru desfuarea
amplificrii, concentraia optim determinndu-se empiric pentru fiecare protocol n
parte. Acetia se regsesc sub form de sruri (de obicei MgCl
2
) concentraia final fiind
cuprins, n general, ntre 0,5 i 5,0 mM. Ionii de Mg ndeplinesc urmtoarele roluri:
- formeaz un complex solubil cu nucleotidele, esenial pentru ncorporarea
acestora n catena de ADN;
- stimuleaz activitatea polimerazei;
- ridic temperatura de denaturare a complexului primer-secven int,
conferindu-i stabilitate.
n general, o concentraie redus de Mg
2+
are ca rezultat acumularea n cantiti
reduse a produsului de reacie, n timp ce concentraia ridicat de Mg
2+
favorizeaz
acumularea produilor nespecifici. Pentru ca ionii de Mg s fie activi n timpul reaciei,
trebuie evitat prezena n soluia ADN a unor cantiti ridicate de ageni de chelatizare
(ex. EDTA) sau gupri ionice ncrcate negativ (ex. fosfai).

Numrul ciclurilor de amplificare

Numrul ciclurilor necesare pentru producerea unei cantiti detectabile de
amplicon depinde n principal de concentraia iniial a secvenei de ADN int. Pentru
amplificarea a 50 copii, Innis i Gelfand (1990) recomand 40-45 cicluri PCR, n timp ce
doar 25-30 cicluri sunt suficiente pentru amplificarea a 3x10
5
molecule (Somma i
Querci, 2004b). Aceast disproporionalitate se datoreaz efectului de plafonare (platou),
care implic modificarea ratei de acumulare a produsului PCR n ultimele cicluri ale
amplificrii. Plafonarea este cauzat de degradarea reactivilor (ex. enzime sau
nucleotide), consumarea acestora (ex. primeri n cazul produilor scuri sau nucleotide n
cazul produilor lungi) sau de concurena produilor nespecifici pentru reactivi. Datorit
acestui fenomen, mrirea numrului de cicluri peste anumie valori nu reprezint o soluie.
De aceea, n cazul n care produsul de interes nu este obinut dup 30-40 cicluri PCR se
recomand efectuarea unei reamplificri, utiliznd o parte (i.e. aproximativ 1 l) din
produsul de amplificare i un nou amestec de reacie.

Testarea OMG

100
2.8.5. Reacii PCR specializate
2.8.5. Specialized PCR reactoins

Pe lng reacia PCR tipic, descris anterior, au fost create variante destinate unor
aplicaii specifice: nested PCR, touch-down PCR, real-time PCR (rt-PCR), reverse
transcription PCR (RT-PCR), consensus PCR, PCR multiplex, colony PCR, hot-start
PCR, inverse PCR, PCR RAPD, PCR AFLP etc. Unele metodologii de testare OMG
calitativ sunt bazate pe protocoale nested PCR, n timp ce real-time PCR este tehnica
cea mai utilizat pentru cuantificarea acizilor nucleici. Reaciile multiplex pot fi utilizate
att n etapa de analiz calitativ, ct i n cea de cuantificare.
n continuare sunt descrise principiile metodei nested PCR i a reaciilor
multiplex.

Nested PCR

Un experiment de tip nested PCR presupune utilizarea unui set de primeri
localizat ntre ali doi primeri pereche, de-a lungul aceluiai fragment de ADN (Figura
27). ntr-o prim reacie se realizeaz amplificarea cu primerii externi, urmat de
amplificarea cu ceilali doi primeri (Somma i Querci, 2004b). Deoarece fragmentul mai
lung, amplificat n prima etap, este utilizat ca matri n cadrul celei de-a doua reacii,
metoda se caracterizeaz printr-o mare sensibilitate i specificitate (Zimmermann et al.,
1998, n Angonesi Brod et al., 2007; Somma i Querci, 2004b). Sensibilitatea crete
datorit reamplificrii regiunii de interes, iar sporirea specificitii se bazeaz pe
probabilitatea extrem de redus ca eventualele fragmente amplificate nespecific n prima
etap s fie amplificate nespecific i n cea de-a doua reacie. A doua reacie poate fi
considerat o strategie de confirmare a identitii produsului PCR. Sensibilitatea mrit a
acestei tehnici este ns susceptibil potenialelor contaminri care pot apare n timpul
executrii protoculului. Trebuie deci acordat o atenie deosebit acestui aspect, mai ales
n cazul laboratoarelor de testare.
Aceast tehnic a fost foarte apreciat pentru avantajele pe care le prezint,
majoritatea primerilor concepui la sfritul anilor 1990 pentru detecia OMG-urilor fiind
Testarea OMG

101
inclui n astfel de protocoale. O mare parte dintre acetia sunt utilizai i astzi n
practica testrii OMG. Singurul neajuns al acestei abordri este reprezentat de necesitatea
executrii a dou reacii de amplificare, ceea ce nseamn un consum suplimentar de timp
i materiale.



Fig. 27. Detecia genei lectinei de la soia utiliznd un protocol nested PCR. Amplificarea
fragmentului int se desfoar n dou faze utiliznd primerii externi i apoi primerii interni.
Fig. 27. Detection of soybean lectin gene by nested PCR. The amplification of the target
sequens is achieved using the outer primer set and then the inner primer set.
Dup Meyer (1999), modificat.


PCR multiplex

PCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri n cadrul unei
reacii, avnd ca rezultat obinerea unui singur amplicon specific. n cadrul unei reacii
PCR multiplex sunt utilizate mai multe perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai
multe secvee int. Acest tip de aplicaie s-a dezvoltat n ultimii ani, mai ales dup
introducerea unor noi tipuri de polimeraze (Germini et al., 2004). Prezena mai multor
perechi de primeri n acelai mediu de reacie determin sporirea probabilitii de apariie
a hibridrilor nespecifice i a construciilor primer-dimer, amplificarea preferenial a
fragmentelor de ADN mai scurte (Atlas i Bey, 1994, n Somma i Querci, 2004b),
precum i reducerea limitelor de detecie (Germini et al., 2004), fcnd destul de dificil
optimizarea protocoalelor de acest tip. Cu toate aceastea, metoda genereaz mult mai
mult informaie, ntr-un timp mai scurt i cu costuri mai reduse dect amplificrile PCR
clasice (singleplex) (Germini et al., 2004).
Testarea OMG

102
Perechile de primeri trebuie s aib temperaturi de alipire ct mai apropiate. Este
de asemenea necesar ca lungimea fragmentelor amplificate s fie similar, cele mai scurte
fiind amplificate preferenial. n ceea ce privete validarea teoretic a secvenelor
primerilor, aceast poate fi fcut cu ajutorul unor software-uri ca Oligos
(http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm), iar efectele eficienelor
diferite de amplificare pot fi compensate prin ajustarea empiric a concentraiilor
primerilor. Utilizarea soluiilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele
generate de prezena unui numr mai mare de primeri.
Alte surse reprezentative pentru aceast tem sunt Zhang et al. (2007), Engel et
al., (2006), Foti et al. (2006), Xu et al. (2006), Forte et al. (2005), Onishi et al. (2005),
Hernndez et al. (2004a, 2004b, 2003) i Matsuoka et al. (2002).

2.8.6. Identificarea contaminrii, validarea i interpretarea rezultatelor
2.8.6. Contamination identification, result validation and interpretation

Reacia PCR are o larg aplicabilitate n practica tiinific, fiind utilizat ca
tehnic analitic sau pregtitoare. Datorit sensibilitii metodei, contaminarea cu ADN,
chiar i n cantiti foarte reduse, poate duce la obinerea unor rezultate incorecte. Acest
aspect trebuie s constituie ngrijorarea principal n cadrul laboratoarelor de testare
(Querci et al., 2005). Este de aceea necesar ca setarea reaciei s se desfoare ntr-un
mediu lipsit de ampliconi provenii din alte reacii PCR, ADN rezultat din pregtirea
probelor anterioare sau substane rezultate n urma proceselor de decontaminare (Somma
i Querci, 2004b). Primele dou tipuri de ageni produc contaminare de tip carry-over,
determinnd apariia rezultatelor fals pozitive, iar a treia categorie constituie substane
inhibitoare ce favorizeaz obinerea rezultatelor fals negative. Un alt tip de erori care
trebuie evitat este contaminarea ntre probe analizate n paralel (contaminare
ncruciat/cross-over contamination), care determin de asemenea apariia unor rezultate
fals pozitive.
Existena spaiilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat, reduce
riscul contaminrii, iar respectarea strict a normelor de decontaminare este o condiie
esenial pentru reducerea ratei de apariie a rezultatelor fals pozitive. Roth et al. (1997),
Testarea OMG

103
citai de Somma i Querci (2004b), recomand de asemenea ndeplinirea anumitor cerine
de rutin referitoare la organizarea i desfurarea activitilor, menite s asigure
meninerea unui mediu adecvat de lucru pentru orice sistem de analiz care are la baz
reacia PCR, indiferent de numrul probelor procesate.
Sursele poteniale de contaminare pot fi uor ntlnite n laborator (ex. probele
analizate, personalul, instalaia de aer condiionat, echipamentele sau reactivii), motiv
pentru care este necesar utilizarea probelor de control, pozitive i negative. Acestea sunt
necesare pentru a evidenia prezena contaminanilor, dac acetia exist i pentru a
evalua (valida) corectitudinea rezultatelor obinute. Probele de control pentru analize
OMG, specifice nc din etapa de pregtirea a probelor i pn la cea de cuantificare, sunt
prezentate n continuare conform SR EN ISO 24276:2006:
- prob de control pentru mediul de lucru (environmental control/E); utilizarea
acestui tip de control este recomandat ncepnd cu etapa de pregtire
(omogenizare) a probei i are rolul de a identifica prezena contaminanilor n
mediul de lucru (ex. aerul din labortor); proba const dintr-un tub coninnd
ap liber de acizi nucleici, care este lsat deschis n mediul de lucru pe tot
parcusul procesului de analiz;
- prob neutr de control a extraciei (extraction blank/B); controlul are
caracter obligatoriu, ncepnd cu etapa de extracie a ADN-ului; n acest tip
de prob, materialul biologic este nlocuit cu ap liber de acizi nucleici,
urmrindu-se evaluarea prezenei/absenei contaminrii ncruciate n timpul
etapei de extracie; n fiecare serie de extracii trebuie inclus cel puin o
astfel de prob de control;
- prob pozitiv de control a extraciei (positive extraction control/P) este de
asemenea obligatorie ncepnd cu etapa de extracie; indic dac reactivii
utilizai pentru extracie funcioneaz corespunztor i dac extracia a fost
executat n mod corect; n acest scop se utilizeaz o prob care conine n
mod sigur fragmentul de interes; aceast prob trebuie utilizat periodic,
precum i la schimbarea stocului de soluii de lucru;
- prob pozitiv de control pentru ADN-ul int (positive DNA target
control/C+); controlul este obligatoriu, ncepnd cu etapa PCR, pentru a
Testarea OMG

104
verifica eficiena procedurii de amplificare a secvenei int; proba de control
este constituit din ADN extras dintr-un MRC pentru secvena de interes sau
dintr-o prob cunoscut pozitiv; acest tip de prob poate fi nlocuit sau
poate nlocui proba pozitiv de control a extraciei (P);
- prob negativ de control pentru ADN-ul int (negative DNA target
control/C-); acest tip de control are caracter obligatoriu ncepnd cu etapa de
amplificare a ADN-ului; demonstreaz capacitatea procedurii de a nu
produce rezultate fals pozitive n lipsa secvenei int, utilizarea fiind ns
justificat doar n etapa de validare a metodei; proba se obine dintr-un MRC
care nu conine secvena de interes sau dintr-o prob cunoscut negativ;
- prob de control a reactivilor (amplification reagent control/NTC); utilizarea
acestei probe de control este necesar din etapa PCR; are rolul de a verifica
contaminarea cu acizi nucleici a reactivilor utilizai pentru PCR; poate fi
nlocuit de proba neutr de control a extraciei; proba de control include toi
reactivii necesari, mai puin extractul de ADN care este nlocuit de un volum
corespunztor de ap liber de acizi nucleici;
- prob de control a inhibiiei reaciei PCR (PCR inhibition control/I); se
utilizeaz ncepnd cu etapa de amplificare, avnd rolul de a confirma
absena/prezena inhibitorilor ce pot afecta eficiena amplificrii; controlul
inhibiiei poate fi fcut prin analiza real-time PCR a unei diluii seriale a
extractului; o alt strategie o reprezint utilizarea unui control extern,
ntnlnit n literatura de specialitate sub denumirea spike; n aceast
situaie, extractul analizat este amestecat cu o soluie pozitiv pentru secvena
de interes, care reprezint practic controlul pozitiv extern; uneori, controlul
pozitiv extern poate fi adugat naninte de extracie, caz n care este
reprezentat de o matrice (ex. fin).
Interpretarea rezultatelor testrii OMG calitative se face pe baza profilului obinut
prin separarea electroforetic a produilor PCR. Mrimea ampliconilor separai este
estimat cu ajutorul unei soluii de ADN standard (DNA marker, DNA ladder) care
conine fragmente de mrimi cunoscute (Figura 28). n cazul n care profilul
electroforetic al probei prezint o band a crei mrime este aproximativ cea ateptat, se
Testarea OMG

105
poate concluziona c banda este cea cutat, iar proba este pozitiv. Validarea
rezultatelor presupune ndeplinirea urmtoarelor condiii:
- proba de control pentru mediul de lucru (E), proba neutr de control a
extraciei (B), proba negativ de control pentru ADN-ul int (C-) i proba de
control a reactivilor (NTC) nu trebuie s prezinte banda specific
corespunztoare ampliconului pe care dorim s-l detectm; pot fi prezente
benzi scurte corespunztoare structurilor primeri-dimer;
- proba pozitiv de control a extraciei (P), proba pozitiv de control pentru
ADN-ul int (C+) i proba de control a inhibiiei reaciei PCR (I) trebuie s
prezinte banda corespunztoare secvenei int pe care dorim s o detectm;
- repetiiile corespunztoare aceleiai probe trebuie s prezinte rezultate
identice.



(a) (b) (c) (d)
Fig. 28. Standarde ADN utilizate pentru estimarea mrimii produilor
PCR. (a) Benchtop 100bp DNA Ladder (Promega). (b) 100bp DNA Step
Ladder (Promega). (c) Benchtop PCR Markers (Promega). (d)
OGeneRuler 100 bp (Fermentas).
Fig. 28. DNA weight markers used to estimate the size of PCR amplicons.
(a) Benchtop 100bp DNA Ladder, (b) 100bp DNA Step Ladder, (c)
Benchtop PCR Markers. (d) OGeneRuler 100 bp (Fermentas).
Surse: Promega (2009) i Fermentas (2009).


n cazul n care exist neconcordane ntre probele de control, analiza trebuie
considerat neconcludent (SR EN ISO 24276:2006).
Un aspect important, care reiese i din cele prezentate anterior, este faptul c o
parte din probele de control, n special cele pozitive, pot fi reprezentate de materiale de
Testarea OMG

106
referin (certificate). Utilizarea materialelor de referin constituie o parte esenial a
procedurilor de control al calitii, aspecte care vor fi abordate ntr-unul dintre
subcapitolele urmtoare. Trebuie reinut c n scopul validrii rezultatelor nregistrate,
utilizarea probelor de control i a materialelor de referin este indispensabil (el et al.,
2006; Querci et al., 2005).
n cazul n care specificul experimentelor impune o confirmare foarte precis a
rezultatelor obinute prin electroforez, se pot aplica diferite metode, ca: analiza de
restricie a produilor PCR, Southern blotting-ul, secvenierea produilor PCR cea mai
sigur cale de confirmare a autenticitii acestora.

2.9. TESTAREA OMG CANTITATIV BAZAT PE TEHNICA REAL-TIME
PCR
2.9. QUANTITATIVE TESTING OF GMOs BASED ON REAL-TIME PCR

2.9.1. Introducerea analizei real-time PCR
2.9.1. Introduction of real-time PCR analysis

Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea
stabilirii unei corelaii directe ntre cantitatea produsului de amplificare acumulat i
numrul iniial de copii ale moleculei int (Weighardt, 2004). Particularitile reaciei
PCR convenionale nu permit realizarea unei astfel de corelaii, principala cauz fiind
eficiena defectuoas a amplificrii, care nu este constant ntre diferitele reacii, dar mai
ales ntre ciclurile aceleiai reacii (Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004). Aceast limit
a fost depit n 1992, de ctre Higuchi i colaboratorii si, care au iniiat analiza
cineticii reaciei de amplificare prin crearea metodei real-time PCR, capabil s detecteze
produii de amplificare odat cu formarea i acumularea acestora (Kubista et al., 2006;
Weighardt, 2004). Sistemul de analiz n timp real folosea EtBr pentru detecia ADN-ului
i un thermal cycler adaptat s iradieze mediul de reacie cu lumin UV i s nregistreze
fluorescena emis de fluorocrom. Excitaia moleculelor de EtBr i nregistrarea
fluorescenei se realizau la sfritul fiecrui ciclu de amplificare, dup etapa de extensie.
Valoarea intensitii fluorescente nregistrate i numrul ciclurilor PCR au fost introduse
Testarea OMG

107
ntr-un grafic care a oferit o imagine a procesului de amplificare, prezentnd acumularea
produsului de amplificare n funcie de timp.
Metodologia real-time PCR utilizat astzi este o mbuntire a tehnicii iniiale
create de Higuchi et al. i reprezint cea mai performant strategie de cuantificare a
acizilor nucleici (Cankar et al., 2006; Miraglia et al., 2004, i Anklam et al., 2002, n
Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004; Alary et al., 2002). Pe lng
precizia cuantificrii, a crescut i capacitatea de analiz, iar incidena erorilor i a
rezultatelor fals pozitive este mult redus (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002).
Deoarece amplificarea i detecia sunt combinate ntr-o singur analiz (sistem nchis),
riscul de contaminare este de asemenea redus. Tehnica este utilizat n special pentru
detecia patogenilor, analiza expresiei genice, analiza polimorfismului determinat de o
singur nucleotid (single nucleotide polymorphism/SNP), analiza aberaiilor
cromozomiale etc. Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizat i mai precis
metod de cuantificare a coninutului MG al diferitelor materii prime sau procesate de
origine vegetal destinate consumului alimentar al oamenilor sau animalelor (Cankar et
al., 2006; SR EN SO 21570:2006, Kubista at al., 2006; Deisingh i Badrie, 2005).

2.9.2. Principiul real-time PCR
2.9.2. Real-time PCR principles

Tehnica real-time PCR utilizeaz primeri specifici pentru amplificarea secvenei
int, iar n tandem cu acetia, construcii oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de
molecule incluse n mediul de reacie indic acumularea produsului PCR (Burns et al.,
2004). Astfel, de-a lungul mai multor cicluri de amplificare, construciile
oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secvenei int, vor determina
modificarea semnificativ a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004). Detaliile
referitoare la aceste molecule vor fi prezentate n subcapitolul 2.9.9.
Teoretic, n cadrul amplificrii, acumularea produilor PCR se desfoar
exponenial. n practic ns, reacia nu atinge niciodat eficien maxim. Mai mult,
dup 30-40 cicluri de amplificare intervine fenomenul de plafonare (Ahmed, 2002) care
afecteaz reaciile n mod independent i diferit (Figura 29).
Testarea OMG

108

Fig. 29. Cinetica reaciilor de amplificare. n cazul amplificrii
paralele a mai multor repetiii ale aceleiai probe, curbele de
rspuns sunt foarte asemntoare n faza exponenial (portocaliu).
Spre sfritul reaciei profilurile sunt ns extrem de diferite (rou).
Fig. 29. Kinetics of amplification reactions. Response curves of
replicates are very similar during the exponential phase (orange),
while at the end of the reaction they differ considerably (red).


n cadrul reaciei PCR convenionale, determinarea este fcut ntr-un singur
punct la sfaritul amplificrii (determinare end-point). De aceea proporionalitatea ntre
cantitatea final de ampliconi i cea iniial de copii ale secvenei int este redus,
nefiind posibil cuantificarea (Figura 30a i b). S-a demonstrat totui empiric, c aceast
proporionalitate exist n timpul fazei exponeniale a amplificrii, nainte s intervin
plafonarea. Astfel, dac se cunoate numrul de cicluri necesare pentru atingerea unei
anumite concentraii a moleculei int, numrul iniial de copii ale acesteia poate fi
determinat cu precizie (Figura 30c i d). Pentru calcularea concentraiei moleculei de
interes ntr-o prob necunoscut este necesar utilizarea unei curbe de calibrare
(denumit i curb standard) (Burns et al., 2004) obinut prin analiza unui set de
calibratori (probe standard) (Taverniers et al., 2005) reprezentat de probe al cror numr
iniial de copii ale secvenei int este cunoscut (Figura 30a i c).
Att n cazul probelor standard, ct i al celor necunoscute, monitorizarea
acumulrii produilor de reacie odat cu desfurarea amplificrii se face prin
nregistrarea emisiei fluorescente a unor substane speciale aflate n mediul de reacie.
Este evident c ntre semnalul fluorescent i cantitatea de ampliconi formai exist
o relaie de proporionalitate direct, ambele crescnd odat cu numrul de cicluri de
amplificare (Kubista et al., 2006; Grove, 1999, n Burns et al., 2004). Concentraiile
Testarea OMG

109
iniiale ale moleculei int i numerele ciclurilor PCR sunt apoi utilizate pentru
construirea curbei standard care reprezint de fapt o regresie liniar (concentraia
moleculei int reprezint varibila independent, iar valoarea numrul ciclurilor PCR este
variabila dependent). Trebuie remarcat c n ciclurile iniiale semnalul generat este slab
i nu poate fi deosebit de semnalul de fond (background signal/fluorescence). Odat cu
acumularea unei cantitai mai mari de produs semnalul crete semnificativ, ridicndu-se
deasupra celui de fond (Figura 31). Din acest moment acumularea produsului de
amplificare este evident, putndu-se face colectarea datelor pentru analiza cantitativ.



Fig. 30. Diferenele dintre analiza PCR convenional (a, b) i analiza real-time PCR (c, d). Graficele (b, d)
reprezint concentraia produilor PCR (axa OY) n funcie de coninutul OMG procentual al probei iniiale (axa
OX), n punctul A. (a) Punctul A n care sunt colectate datele pentru analiz reprezint un anumit numr de cicluri
de amplificare. (b) Se observ c probele B i C, n cazul crora a intervenit fenomenul de plafonare, conin
cantiti de ampliconi similare, cu toate c numerele iniiale de copii int difer de zece ori. Situaia este
asemntoare n cazul probelor C i D. Este astfel ilustrat lipsa proporionalitii dintre concentraia ADN-ului i
porduii PCR. (c) Punctul A n care sunt colectate datele pentru analiz reprezint o anumit valoare a concentraiei
ampliconilor. (d) Se observ existena unei relaii de liniaritate direct ntre produii PCR i concentraia ADN-ului
n faza exponenial a amplificrii, corelarea celor dou valori fiind posibil.
Fig. 30. Differences between traditional PCR (a, b) and real-time PCR (c, d). The concentration of amplicons
present at point A (OY axis) are plotted (b, d) as a function of percent GMO present in the initial sample (OX axis).
(a) Point A represents a certain number of amplification cycles. (b) Samples B and C have similar amplicon
concentrations despite the fact that there is a ten fold difference between their initial target quantities. The same
applies to samples C and D. This demonstrates that proportionality between DNA concentration and amplicons is
limited for cassic PCR. (c) Point A represents a certain value of amplicon concentration. (d) By contrast, there is a
linear relationship between amplicons and DNA concentration during the exponential phase of real-time PCR.
Dup Fagan n Ahmed (2002) modificat.
Coninut
iniial
Numrul de cicluri PCR Coninutul iniial
Numrul de cicluri PCR Coninutul iniial
Coninut
iniial
P
r
o
d
u

i

P
C
R

P
r
o
d
u

i

P
C
R

P
r
o
d
u

i

P
C
R

C
i
c
l
u
r
i

P
C
R

Testarea OMG

110

Fig. 31. Graficul unei amplificri real-time PCR construit pe o scar (semi)logaritmic. Sunt evideniate cele trei
faze tipice tuturor reaciilor de amplificare: faza iniial, n care semnalul generat de acumularea ampliconilor nu
poate fi deosebit de semnalul de fond; faza exponenial, n care semnalul generat de acumularea ampliconilor
depete semnalul de fond; faza n care intervine plafonarea, eficiena amplificrii reducndu-se semnificativ.
Fig. 31. Real-time PCR amplification plot constructed on a (semi-)logarithmic scale. The typical phases of a real-
time PCR are highlighted: the initial lag stage, when the signal produced by amplicon accumulation is weak and
it can not be distinguished from the background signal; a second exponential phase, when the amplicon signal
passes the background; a third stage, when amplification efficiencies drop considerably and the plots tend to reach
a plateau.
Dup Weighardt (2004), modificat.


2.9.3. Eficiena amplificrii n analizele real-time PCR
2.9.3. Amplification eficiency in real-time PCR analyses

Eficiena reaciei PCR este exprimat ca rat de amplificare a crei valoare
teoretic este 2, ceea ce nseamn c numrul de copii ale unui amplicon este dublat n
fiecare ciclu PCR (Moens et al., 2005). n cazul unei eficiene de 100%, raportul dintre
numrul iniial al copiilor secvenei int n dou probe diferite este dat de formula:


( )
TA TB
C C
B
A
N
N

= 2
0
0

(4)

unde N
0A
i N
0B
reprezint numerele iniiale de molecule int din probele A, respectiv B,
iar C
TA
i C
TB
sunt valorile C
T
(cycle threshold) corespunztoare acestora. Deocamdat,
valoarea C
T
trebuie neleas ca un interval de timp ce reprezint un numr de cicluri de
amplificare. Dup cum s-a menionat n subcapitolele anterioare, semnalul fluorescent al
unei probe este determinat de produsul de amplificare, fiind direct proporional cu
Numr de cicluri
Pragul limit
Semnal de fond
Faza
liniar
Etapa de plafonare
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n


Curbe de
amplificare
Testarea OMG

111
cantitatea acestuia. Astfel, presupunnd c proba A atinge acelai nivel al fluorescenei,
respectiv pragul limit (threshold value) (Figura 31), cu patru cicluri mai trziu dect
proba B, adic are nevoie de patru cicluri de amplificare adiionale, putem conchide c
proba A coninea iniial de 16 ori (2x2x2x2) mai puine molecule int dect proba B.
Trebuie subliniat faptul c semnalul probei cu mai puine molecule va atinge mai trziu
valoarea pragului, dup parcurgerea mai multor cicluri de amplificare.
n practic ns, reacia PCR nu este perfect, fiind necesar introducerea n
ecuaia 4 a eficienei de amplificare (E):


( )
( )
TA TB
C C
B
A
E
N
N

+ = 1
0
0

(5)

Presupunnd c reacia PCR are o eficien de 90%, valoare tipic pentru probele
biologice, diferena de patru cicluri ntre dou curbe de amplificare reflect un raport de
(1 + 0,9)
4
= 13 ntre valorile iniiale numrului de copii ale secvenei int din probele A
i B.
n cazul unei singure probe, ecuaia 5 devine:


( )
n
n
E
N
N
+ = 1
0

(6)

unde N
0
i N
n
reprezint numrul iniial de molecule int, respectiv numrul de molecule
int dup n cicluri de amplificare.
Pentru estimarea eficienei amplificrii este utilizat tot curba standard, amintit n
subcapitolul anterior. Aceasta este construit ntr-un grafic n care sunt reprezentate
valorile C
T
(obinute prin amplificare) aferente probelor standard n funcie de logaritmul
concentraiei numrului iniial de copii ale secvenei int sau logaritmul factorului de
diluie (Applied Biosystems, 2001). Pentru fiecare curb standard este calculat i ecuaia
de regresie asociat care descrie relaia dintre variabilele x (i.e. logaritumul concentraiei
secvenei int) i y (i.e. C
T
):

B x M y + - = (7)

Testarea OMG

112
unde M este panta curbei standard (dreapta de regresie), iar B reprezint intersecia
dreptei de regresie cu axa OY. Din ecuaia de regresie reiese urmtoarea egalitate:


B N M C
T
+ - = ) log(
0

(8)

n cazul unei probe cu o singur copie a moleculei int ecuaia (8) devine:


B M C
T
+ - = ) 1 log( (9)

Logaritmul din 1 este 0 indiferent de baz, deci C
T
este egal cu B.
Panta unei reacii poate fi utilizat pentru a determina eficiena reaciei i
exponentul/factorul amplificrii (F):


M
F
1
10

=
(10)

1 10
1
=

M
E
(11)

2.9.4. Cuantificarea OMG-urilor
2.9.4. GMO quantification

Prin testarea OMG cantitativ materialul transgenic dintr-o prob nu poate fi
exprimat dect procentual, sub forma raportului dintre cantitatea de ADN MG i cea de
ADN total corespunztor taxonului analizat (Vatilingom et al., 1999). Pentru fiecare
prob este astfel necesar cuantificarea ADN-ului MG n paralel cu cea a ADN-ului
specific taxonului (Burns et al., 2004; Hernndez et al., 2004b), al doilea tip avnd rol de
referin. Strategia asigur normalizarea intern (normalizarea la nivelul probei), precum
i normalizarea intra- i interdeterminri, deoarece ia n calcul posibila degradare a ADN-
ului sau prezena inhibitorilor, factori care, teoretic, afecteaz n egal msur cele dou
sisteme PCR. Totui, acest ipotez nu a fost demonstrat.
Secvena de referin corespunde unei gene (denumit endogen) care trebuie s
ndeplineasc urmtoarele condiii:
- s fie specific taxonului;
Testarea OMG

113
- s fie prezent print-o singur copie la nivelul genomului haploid;
- s fie reprezentat stabil n diferite linii ale aceleiai specii;
- s aib aceiai parametri de amplificare ca secvena transgenic, cerin
care depinde ns foarte mult i de modul n care este conceput
experimentul.
Exist cteva aspecte referitoare la modul de exprimare a coninutului procentual
de OMG-uri, care trebuie menionate. n primul rnd, prin Regulamentele 1829/2003 i
1830/2003 a fost stabilit pragul coninutului procentual de OMG-uri ce trebuie avut n
vedere pentru aplicarea etichetrii, respectiv 0,9%, la nivel de ingredient. Iniial, nu a fost
ns indicat nicio unitate de msur pentru acest prag, implementarea prevederilor
legislative referitoare la etichetare fiind astfel problematic (Moens et al., 2005). Ieirea
din acest impas s-a fcut odat cu introducerea Recomandrii 2004/787/EC. Aceasta
definete procentul de ADN MG ca fiind raportul dintre numrul copiilor de ADN MG
i numrul copiilor de ADN specific taxonului int, calculat la nivel de genom haploid.
Se face de asemenea precizarea c procentul de ADN MG amintit anterior s fie utilizat
pentru exprimarea rezultatelor analizelor cantitative. n acest context, inconvenientul este
determinat de natura calibratorilor i a materialelor de referin utilizate pentru
cuantificare, elemente care intervin n asigurarea trasabilitii i validarea metodelor. Mai
multe considerente referitoare la toate aceste aspecte vor fi prezentate ntr-unul dintre
subcapitolele urmtoare (2.9.7).

2.9.5. Analiza grafic a datelor experimentale
2.9.5. Graphical analysis of experimental data

Odat cu desfurarea amplificrii n cadrul unui sistem real-time PCR, semnalul
fluorescent din mediul de reacie este msurat, iar pe baza acestor date se va realiza o
reprezentare grafic a acumulrii produilor PCR n funcie de numrul ciclurilor de
amplificare (Figura 32). Scala pentru fluorescen poate fi normal sau logaritmic, cea
de-a doua facilitnd distingerea celor trei faze ale amplificrii, menionate i n Figura 31:
- faza iniial, n care intensitatea fluorescenei variz foarte puin,
corespunznd semnalului de fond;
Testarea OMG

114
- faza liniar, n care reacia se desfoar exponenial iar acumularea
ampliconilor este evident;
- stadiul de platou (plafonare), n care rata amplificrii se reduce considerabil.



(a)


(b)


(c)

Fig. 32. Analiza grafic a datelor experimentale. (a) Poziionarea pragului limit pe o scal norml. Curba
de amplificare are o alur sinuoas. (b) Pe scal logaritmic, n faza exponenial, curba de rspuns apare
sub forma unei drepte. (c) Curba standard (de calibrare) este construit ntr-un grafic n care axa OY
corespunde valorilor C
T
iar axa OX logaritmului numrului iniial de copii ale fragmentului int.
Fig. 32. Graphical analysis of experimental data. (a) The cycle threshold on a linear scale. The response
curve appears as a sinusoid. (b) On a logarithmic scale and within the exponential stage the response
curve appears a straight line. (c) The standard (calibration) curve is constructed by plotting C
T
values
(OY axis) against the log of of the initial number of template copies in the standard samples (OX axis).


V
a
l
o
r
i

C
T

Log(conc. iniial)
Puncte de calibrare
Numr de cicluri
Pragul limit
Semnal de fond
CT
Faza
liniar
Etapa de plafonare
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n


Pragul limit
Numr de cicluri
Curbe de amplificare
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n


Curba standard
Testarea OMG

115
Pragul limit reprezint punctul de echivalen pentru toate reaciile incluse ntr-o
analiz. Dup Vatilingom et al. (1999), pragul limit (definit de software) este punctul n
care semnalul fluorescent depete de zece ori deviaia standard a mediei intensitii
msurate ntre al treilea i al 15-lea ciclu. n acest moment, ntre valoarea C
T
i logaritmul
concentraiei moleculei int exist o relaie liniar (Burns et al., 2004).
n practic, alegerea pragului limit este fcut de ctre operator, reprezentnd
unul dintre elementele subiective al analizei real-time PCR. Punctul n care acesta este
plasat trebuie ales foarte atent (Figura 32b). n primul rnd trebuie s fie situat n cadrul
fazei exponeniale i deasupra semnalului de fond. Pe scal logaritmic, faza de cretere
exponenial apare sub forma unei drepte, n timp ce pe o scal normal corelaia ntre
rata de acumulare a ampliconilor i alura curbei este mai greu de fcut. De asemenea,
nivelul de poziionare al pragului trebuie ales astfel nct, n acel punct, graficele probelor
s fie liniare i paralele, iar cele ale repetiiilor s coincid ct mai mult.
Dup poziionarea pragului limit, software-ul calculeaz automat valorile C
T
.
Ciclul pragului limit (C
T
) reprezint ciclul PCR n care semnalul fluorescent generat prin
amplificarea moleculei int atinge pragul limit definit de software sau de ctre operator
(Burns et al., 2004; Rott et al. 2004). Practic, C
T
reprezint o valoare zecimal, ce
exprim numrul de cicluri PCR la care curba de amplificare generat de modificarea
intensitii semnalului fluorescent intersecteaz pragul limit (Corbett Research, 2004;
Vatilingom et al., 1999). Corelaia dintre numrul iniial de copii ale secvenei int i
valoarea C
T
este urmtoarea: cu ct cantitatea iniial de ADN int este mai mare, cu att
produsul PCR se acumuleaz i este detectat mai repede, iar valoarea C
T
este mai mic.
n continuare este generat curba standard, n funcie de datele atribuite probelor
cunoscute (standarde/calibratori) incluse n experiment i de valorile C
T
determinate
experimental (Figura 32c). Limitele curbei trebuie s corespund unui interval ct mai
larg. Una dintre condiiile de validare a rezultatelor este ca valorile C
T
corespunztoare
probelor necunoscute s se ncadreze n intervalul dat de valorile C
T
ale probelor
standard.
Dup construirea curbei standard sunt calculai anumii parametri ai acesteia (ex.
valoarea R
2
, panta curbei standard sau eficiena amplificrii) care ofer informaii despre
experiment i permit validarea rezultatelor obinute. n cazul n care parametri curbei
Testarea OMG

116
standard sau celelalte elemente de validare nu se ncadreaz n limitele optime, rezultatele
analizei nu trebuie valorificate.
Valoarea R
2
(sau R^2), numit coeficient de corelaie, exprim procentual msura
n care rezultatele corespund ipotezei statistice (Corbett Research, 2004). n contextul
analizei cantitative, R
2
indic proporia n care datele obinute corespund ipotezei
conform creia valorile cunoscute introduse n experiment formeaz o linie de regresie
(curba standard/trend line). Cu ct valoarea R
2
este mai mare, cu att standardele se vor
ncadra mai bine pe aceeai dreapt. Cu alte cuvinte, coeficientul exprim corectitudinea
rezultatelor obinute, n sensul corespondenei valorilor teoretice ale numrului iniial de
copii int din probele standard, cu cele determinate experimental. n practica analizelor
real-time PCR, o valoare mai mare de 0,98 este considerat satisfctoare (ENGL, 2008;
Rasmussen, 2001, n Taverniers et al., 2005). Trebuie reinut faptul c se pot obine
valori R
2
bune chiar i n cazul unor curbe standard necorespunztoare, dac nu a fost
analizat un numr suficient de puncte de calibrare. Cu alte cuvinte valoarea R
2
va crete
cu ct numrul punctelor ce formeaz curba standard este mai mic.
Valorile ideale pentru panta curbei standard, M, exponentul amplificri, F, i
eficiena reaciei, E, sunt -3,322, 2, respectiv 1. Acestea corespund dublrii numrului de
produi de amplificare n fiecare ciclu, adic unei eficiene de amplificare de 100%. De
asemenea intercepia, B, trebuie s fie ct mai apropiat de 40, valoare ce corespunde
numrului teoretic de cicluri necesare pentru amplificarea unei singure copii a secvenei
int (Rasmussen, 2001, n Taverniers et al., 2005).
Ecuaiile:


( ) B C M
T
conc
+ -
= 10 (12)

( ) B conc M C
T
+ - = log (13)

reprezint dou moduri de evideniere a legturii dintre valorile C
T
i concentraiile
iniiale ale moleculelor int (Corbett Research, 2004). Acestea sunt utilizate pentru
determinarea concentraiei iniiale a secvenei int dintr-o prob necunoscut pe baza
valorii C
T
determinate pentru respectiva prob.
Testarea OMG

117
Trebuie menionat c n cazul probelor analizate n mai multe repetiii (cel puin
dou-trei fiind recomandate), pentru calcularea concentraiilor finale anumite software-
uri utilizeaz media geometric, nu pe cea aritmetic (Corbett Research, 2004), datorit
naturii exponeniale a reaciei real-time PCR.
Datele brute sunt exportate ntr-un fiier Excel, iar apoi, pentru determinarea
procentului OMG, se aplic formulele de calcul specifice metodei alese (metoda curbei
standard sau metoda C
T
).
Figura 33 ilustreaz modul de prezentare a datelor analitice n cazul sistemelor
real-time PCR utilizate n experimentele descrise n aceast lucrare.




(a) (b)
Fig. 33. Mod de prezentare a datelor obinute n urma unui experiment real-time PCR. (a) Ferestre de analiz a
software-ului Rotor-Gene 6.1 (Corbett Research). (b) Fereastra principal a software-ului LightCycler 480 1.2
(Roche).
Fig. 33. Display of real-time PCR experimental data. (a) Rotor-Gene 6.1 software (Corbett Research) analysis
screen. (b) LightCycler 480 1.2 software (Roche) main analysis window.


2.9.6. Metode de calcul
2.9.6. Calculus

Cuantificarea relativ a coninutului MG este bazat ntotdeauna pe analiza a dou
secvene int, una corespunztoare transgenei, iar cealalt specific unei gene de
referin. Amplificarea celor dou secvene int trebuie fcut n paralel, fie n reacii
diferite (reacii simplex) fie n acelai mediu de reacie (reacie duplex).

Testarea OMG

118

F
i
g
.

3
4
.

U
t
i
l
i
z
a
r
e
a

c
u
r
b
e
i

s
t
a
n
d
a
r
d

p
e
n
t
r
u

d
e
t
e
r
m
i
n
a
r
e
a

c
o
n
c
e
n
t
r
a

i
e
i

p
r
o
b
e
l
o
r

n
e
c
u
n
o
s
c
u
t
e

n

c
a
d
r
u
l

u
n
e
i

a
n
a
l
i
z
e

d
e

c
u
a
n
t
i
f
i
c
a
r
e

a
b
s
o
l
u
t

.


F
i
g
.

3
4
.

U
s
i
n
g

t
h
e

s
t
a
n
d
a
r
d

c
u
r
v
e

t
o

d
e
t
e
r
m
i
n
e

t
h
e

c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

o
f

u
n
k
n
o
w
n

s
a
m
p
l
e
s

a
s

p
a
r
t

o
f

a
n

a
b
s
o
l
u
t
e

q
u
a
n
t
i
f
i
c
a
t
i
o
n

a
n
a
l
y
s
i
s
.

T
h
e

s
t
a
n
d
a
r
d


D
u
p


R
o
c
h
e

(
2
0
0
6
a
)
,

m
o
d
i
f
i
c
a
t
.

Testarea OMG

119
Ca i n cazul altor metode de msurare a concentraiei analitului dintr-o prob, n
cadrul testrilor OMG este necesar utilizarea unor materiale cu proprieti cunoscute,
denumite standarde, materiale de referin sau calibratori, n vederea construirii
curbelor standard (de calibrare) cu ajutorul crora va fi apoi determinat coninutul
probelor necunoscute (Figura 34) (Aberasturi et al., 2002, Liu, 2002, Rao et al., 2002, i
Prichard, 2001, n Burns et al., 2004). Curbele standard sunt construite ntr-un sistem de
dou axe ortogonale, axa 0Y corespunznd numrului ciclurilor de amplificare, iar axa
0X variaiei coninutului iniial de molecule int. Practic, pe axa OX vor fi reprezentate
valorile C
T
/C
T
obinute n urma analizei, iar pe cealalt logaritmul concentraiei iniiale
a moleculei int sau logaritmul factorului de diluie. Probele standard sunt analizate n
paralel cu probele necunoscute i cu cele de control, pentru fiecare fiind determinate
valori C
T
sau C
T
, n funcie de metoda de calcul utilizat. Determinarea coninutului
iniial al probelor necunoscute este fcut prin extrapolare utiliznd ecuaia de regresie
asociat curbei standard (Burns et al., 2004). Majoritatea modelelor de calcul utilizeaz
metoda celor mai mici ptrate pentru definirea relaiei dintre variabila dependent i cea
independent (Wikipedia, 2009n; Burns et al., 2004).
Amplificarea probelor necunoscute i a calibratorilor trebuie s se desfoare n
paralel, n cadrul aceluiai experiment. n acest context este important evaluarea
eficienei de amplificare a fiecrei probe necunoscute, comparativ cu cea a standardelor,
aspect care este adesea ignorat sau considerat neglijabil (Rott et al., 2004). Cankar et al.
(2006) afirm c pentru o precizie ct mai mare diferenele dintre cele dou tipuri de
eficiene trebuie s fie ct mai reduse. Datele obinute de aceti autori au demonstrat c
cele dou eficiene sunt de cele mai multe ori diferite, iar influena asupra rezultatului
cuantificrii poate fi semnificativ. Orice strategie aplicat cu scopul de a reduce aceste
neajunsuri va determina n schimb creterea costurilor (Cankar et al., 2006), de aceea
efectul eficienelor de amplificare diferite este, n general, trecut cu vederea.
n ceea ce privete cuantificarea acizilor nucleici n general, modele matematice
utlizate pentru prelucrarea datelor sunt numeroase i variate, n cazul testrii OMG fiind
aplicate ns doar dou metode de calcul (Cankar et al., 2006; Deisingh i Badrie, 2005;
Applied Biosystems, 2001):
Testarea OMG

120
- metoda C
T
(C
T
method/approach), bazat pe compararea valorilor C
T

n vederea detrminrii coninutului OMG (%);
- metoda curbei standard (standard curve method/approach), care
presupune msurarea cantitilor absolute ale moleculelor int, la nivel
de echivaleni genomici haploizi.

Metoda C
T


n cazul metodei C
T
(Figura 35), pentru fiecare prob inclus n analiz
(standard, necunoscut, control) se calculeaz o valoare C
T
care reprezint diferena
ntre valoarea C
T
corespunztoare transgenei i valoarea C
T
corespunztoare genei



(a)

(b)




(c)

Fig. 35. Metoda C
T
. (a) Pentru fiecare punct al curbei standard este utilizat cte o prob standard diferit, iar
amplificarea se celor dou secvene de interes se face n sistem duplex. (b) Designul experimental al unei analize.
(c) Determinarea valorilor C
T
, construirea curbei standard i determinarea concentraiei n OMG-uri.
Fig. 35. C
T
method. (a) A different standard corresponds to each calibration point of the standard curve and the
amplification of the two targets is performed in the same well, as a duplex. (b) Plate layout. (c) Calculation of C
T

values, construction of standard curve and calculation of GMO content.
Surs: Querci et al. (2005).

Testarea OMG

121
de referin (C
T
= C
Treferin
- C
Ttransgen
), ambele determinate n urma amplificrii. Pentru
construirea curbei de calibrare datele probelor standard sunt introduse ntr-un grafic care
exprim valorile C
T
n funcie de logaritmul concentraiei iniiale a numrului de copii
al secvenei int (Applied Biosystem, 2001). Coninutul OMG (%) al probei necunoscute
este apoi calculat cu ajutorul valorii C
T
, utiliznd ecuaia de regresie asociat curbei
standard. Trebuie remarcat c fiecrui punct de calibrare i corespunde o prob standard
separat, cu o anumit concentraie OMG. Metoda este descris n detaliu de ctre Foti et
al. (2006).
Aceast strategie de calcul implic desfurarea reaciilor de amplificare n sistem
duplex. Presupunerea inerent acestei strategii este c eficienele celor dou sisteme de
amplificare (de referin, respectiv transgenic) sunt aceleai, att n cazul unei probe date,
ct i ntre diferitele tipuri de probe (ex. MRC-uri i matrici compozite sau intens
porcesate). Deoarece exist diferene cel puin ntre tipurile de probe analizate, aceast
supoziie este considerat nepotrivit n majoritatea situaiilor (Cankar et al., 2006).
Totui, o astfel de strategie este mai eficient din punct de vedere economic i de
asemenea nu este influenat de erorile de pipetare (Alary et al., 2002).
n Figura 35c este reprezentat unul dintre modele de prelucrare a datelor care
utilizeaz valoarea C
T
, panta M i intersecia B (Burns et al., 2004).

Metoda curbelor standard

Aceast metod (Figura 36) presupune exprimarea coninutului procentual de
material MG cu ajutorul unor valori absolute obinute n cadrul unui experiment real-time
PCR. Cele dou molecule de interes vor fi amplificate n sisteme simplex (Querci et al.,
2005) (Figura 36b), fiecare prob fiind deci prezent n dou reacii separate, una
specific (primeri i sond) transgenei, iar cealalt genei de referin (Rott et al. 2004).
Este astfel necesar construirea a dou curbe standard, cte una pentru fiecare secven
int.



Testarea OMG

122

(a)

(b)

(c)

(d)
Fig. 36. Metoda curbei standard. (a) Modul de utilizare a probei standard n vederea construirii celor dou curbe de
calibrare. (b) Design experimental al celor dou reacii simplex. Toate probele, standard (S) sau necunoscute (A, B i
C), trebuie analizate n trei (sau patru) repetiii. Sunt necesare cel puin patru puncte pentru construirea unei curbe
standard (S1, S2, S3, S4). Este recomandat analiza probelor necunoscute att nediluate, ct i diluate, pentru a testa
efectul ihibitorilor. Se vor include ntotdeauna probe de control adecvate. Aceleai probe necunoscute, probe standard
i probe de control sunt incluse att pentru sistemul de cuantificare al genei MG (sus), ct i pentru sistemul de
cuantificare al genei endogene (jos). (c) Construirea curbelor standard i determinarea cantitativ a celor dou
molecule de interes. (d) Formula de calcul a coninutului OMG relativ.
Fig. 36. Standard curve method. (a) Construction of the two standard curves using serial dilutions of one standard.
(b) Plate layout of the two simplex reactions. All samples are analyzed as replicates. A minimum of four calibration
points are required to construct a standard curve. Unknown samples should be analyzed both undiluted and diluted in
order to assess the influence of inhibitors. The same types of samples are used for both quantification systems. (c)
Construction of the standard curves and quantitative determination of the two molecules of interest. (d) Calculation of
the GMO relative content.
Surs: Querci et al. (2005).


Spre deosebire de strategia (metoda) anterioar, n acest caz se utilizeaz un singur
calibrator (soluie cu concentraie cunoscut a moleculei de interes), punctele curbei
standard reprezentnd diluii seriale ale acestuia (Cankar et al., 2006). n acest fel,
diferena dintre eficienele celor dou reacii (sistemul transgenic, respectiv cel de
referin) este luat n considerare nu se mai face presupunerea c acestea sunt egale.
Sunt considerate egale doar eficienele de amplificare ale standardului i probelor
necunoscute amplificate n paralel. Aceast presupunere poate duce de asemenea la
Testarea OMG

123
supra- sau subestimarea coninutului MG deoarece, n majoritatea cazurilor, ntre cele
dou tipuri de matrici (i.e. standarde/calibratori i probe necunoscute) exist diferene
(Cankar et al., 2006). n cele mai multe dintre protocoalele studiate, standardul utilizat a
fost reprezentat de un MRC cu 2% sau 5% material transgenic.
Cele dou curbe de calibrare care redau relaia dintre valorile C
T
i logaritmul
numrului de copii al moleculei int, sunt construite pe baza rezultatelor amplificrii
seriei de diluii obinute din proba standard. Curbele standard sunt utilizate apoi pentru
determinarea numrului iniial de copii ale genei de interes din proba necunoscut, prin
extrapolare, introducnd valorile C
T
obinute n ecuaiile asociate regresiei liniare a
acestora (Tani et al., 2005; Corbett Research, 2004; Rott et al. 2004; Weighardt, 2004)
(Figura 36c). Valorile probelor analizate trebuie s se ncadreze ntre limitele curbei
standard, cele care ies n afara acestor valori fiind eliminate datorit erorilor care le pot fi
asociate (Roche, 2006a; Weighardt, 2004).
Procentul de material MG este determinat prin raportarea numrului de copii ale
transgenei la numrul de copii ale endogenei (Rott et al. 2004). Aceast raportare permite
normalizarea datelor, depindu-se eventulale neajunsuri determinate de calitatea diferit
a extractelor. Valoarea obinut este relativ i reprezint coninutul OMG al probei
necuoscute exprimat ca numr al copiilor de ADN MG raportat la numrul copiilor de
ADN specific taxonului int, la nivelul genomului haploid (Figura 36d).
Pentru determinarea final a coninutului MG (%) au fost propuse i alte formule
de calcul (ex. Tani et al., 2005).
Un alt element menionat n literatura de specialitate (ex. Lee et al., 2006, sau
Huang i Pan, 2005) ca fiind necesar pentru calcularea coninutului de ADN MG, este
factorul de corecie. Acesta exprim raportul dintre numrul copiilor secvenei
transgenice i cel al endogenei, la nivelul genomului haploid al liniei transgenice
analizate. n cazul evenimentului de transformare GTS 40-3-2, factorul de corecie are
valoarea 1.




Testarea OMG

124
2.9.7. Materialele de referin certificate
2.9.7. Certified reference materials

Materialele de referin certificate (MRC) reprezint o categorie de probe foarte
importante n cadrul testrii OMG, fiind utilizate pentru controlul calitii sau validarea
metodelor (IRMM, 2008a; Trapmann et al., 2007; Querci et al., 2005). n ceea ce
privete testrile cantitative, MRC-urile joac un rol crucial, cel de calibratori ADN
(Querci et al., 2005; Taverniers et al., 2005; Burns et al., 2004) necesari construirii
curbelor standard. n aceast situaie, variabila independent necesar construirii acestor
curbe cu ajutorul regresiei liniare, este reprezentat de valoarea pentru care MRC-urile
sunt certificate.
Conform SR EN ISO 24276:2006 i Regulamentului 641/2004, MR-ul este un
material sau o substan ale crei proprieti sunt suficient de omogene i stabile pentru a
fi folosite la calibrarea unui aparat, evaluarea unei metode sau atribuirea de valori altui
material. MRC-urile reprezint o clas aparte de MR-uri: MRC-ul este un MR nsoit de
un certificat oficial care i atest proprietile. n contextul testrii OMG, se certific o
valoare ce reprezint coninutul de material derivat dintr-un anumit eveniment de
transformare. Deoarece prin procedura de certificare se stabilete trasabilitatea
materialului la o unitate din Sistemul Internaional, certificatul include i incertitudinea
valorii msurate, cu un anumit nivel de ncredere care este de asemenea menionat (SR
EN ISO 24276:2006; Regulamentul 641/2004).
Utilizarea acestor materiale n cadrul analizelor reprezint deci un element cheie
pentru asigurarea calitii i validarea rezultatelor (Ahmed, 2002).
Soluiile de calibrare utilizate conin fie ADN genomic (ADNg) fie secvene de
ADN plasmidial (ADNp), ambele tipuri prezentnd avantaje i limite. Un al treilea tip de
calibratori este bazat pe ampliconi hibrizi, ce includ ambele secven int. Utilizarea
acestora n cadrul testrilor OMG a fost descris de Pardigol et al. (2003) (Debode et al.,
2007; Engel et al., 2005).
Calibratorii utilizai n mod tradiional n practica testrii OMG sunt cei pe baz de
ADNg, toate MRC-urile disponibile pn nu demult ncadrndu-se n aceast categorie.
n ultima perioad ns, o serie de studii au promovat utilizarea soluiilor pe baz de
Testarea OMG

125
ADNp (ex. Burns et al., 2006, Kunert et al., 2006, Kuribara et al., 2002, n Burns et al.,
2006, Holst-Jensen i Berdal, 2006, Lee et al., 2006, Lin et al., 2006, Toyota et al., 2006,
Huang i Pan, 2005, Moens et al., 2005, Taverniers et al., 2005, Hernndez et al., 2004b,
sau Taverniers et al., 2001), iar la sfritul anului 2007 a fost introdus primul astfel de
MRC. Principala diferen ntre cele dou categorii este modul de exprimare a
coninutului relativ de material transgenic, n primul caz acesta reprezentnd un raport de
mase, iar n cel de-al doilea un raport ntre numere de copii ale unor fragmente de ADN.
Reticena fa de utilizarea moleculelor plasmidiale ca materiale de referin a
avut ca principal argument lipsa comutabilitii (commutability). Aceast proprietate se
refer la concordana dintre rezultatele obinute pentru acelai msurand n condiii
diferite (i.e. secvena int n MRC-uri bazate pe ADNg, MRC-uri bazate pe ADNp,
respectiv probe obinuite) (vezi ISO 17511, n Taverniers et al., 2004). Cu alte cuvinte s-
a luat n calcul posibilitatea existenei unor diferene de amplificare ntre calibratorii pe
baz de ADNg i cei pe baz de ADNp, pe de o parte, precum i ntre calibratori i
probele obinuite (necunoscute), pe de alt parte. Recent, mai muli autori (ex. Charels et
al., 2007 i Mattarucchi et al., 2005, n el et al., 2008, Terry et al., 2002, n Burns i
Valdivia, 2007, Lin et al., 2006, Moens et al., 2005, Taverniers et al., 2005, sau
Taverniers et al., 2001) au demonstrat c ntre cele dou tipuri de calibratori nu exist
diferene semnificative, n unele cazuri rezultatele obinute utiliznd MRC-urile pe baz
de ADNp fiind chiar superioare (ex. Burns et al., 2006). Lucrrile enumerate anterior
prezint de asemenea o serie de informaii referitoare la alte caracteristici i avantaje ale
calibratorilor plasmidiali.
Singurele MRC-uri disponibile n prezent pentru analizele OMG sunt cele produse
de IRMM, existnd mai multe tipuri (Figura 37). Acestea sunt prezentate n continuare
conform IRMM (2009):
- MRC-uri al cror coninut procentual OMG este exprimat ca fracie de mas;
acestea sunt obinute prin amestecul materialului MG cu material
nemodificat, n proporii corespunztoare; n acest context prin material se
nelege fin; astfel de MRC-uri sunt disponibile pentru evenimente de
transformare la soia (Roundup Ready), porumb (Bt176, Bt11, MON810,
GA21 etc.) i sfecl de zahr (H7-1);
Testarea OMG

126



(a)




(b)







(c)
Fig. 37. Tipuri de MRC-uri produse i comercializate de IRMM. (a) MRC-uri pe baz de ADNg. (b) MRC pe baz
de ADNp. (c) Exemple de certificate pentru diferite materiale de referin. Este indicat tipul MRC-ului i valoarea
certificat (rou), precum i incertitudinea asociat valorii certificate (portocaliu).
Fig. 37. Types of CRMs produced and commercialized by the IRMM. (a) gDNA-based CRMs (matrix CRMs).(b)
pDNA-based CRM. (c) Examples of certificates for different reference materials. The type of CRM, the certified
value (red) and the uncertainty of the certified value (orange) are indicated.
Surs: IRMM (2009).


- MRC-uri al cror coninut procentual OMG este exprimat ca fracie din
numrul de observaii; astfel de MRC-uri sunt disponibile pentru evenimente
de transformare la cartof (EH92-527-1), bumbac (281-24-236 x 3006-210-
23) i soia (356043); n primul caz termenul observaii se refer la
tuberculi, iar pentru celelalte dou termenul observaii fce referire la
semine; MRC-urile din aceast categorie sunt obinute ca amestecuri de
material OMG cu material nemodificat, n proporii corespunztoare; prin
material se nelege pudr obinut n urma mcinrii tuberculilor,
respectiv seminelor;
Testarea OMG

127
- MRC-uri ce includ un calibrator independent pentru cuantificarea prin real-
time PCR (coninutul OMG procentual este exprimat ca fracie din numrul
de copii ADNg), precum i o matrice separat, pentru controlul calitii
procedurii de msurare a aceluiai OMG (coninutul este exprimat ca fracie
de mas) (IRMM, 2008a); deocamdat, exist un singur MRC de acest fel
ERM-BF413d pentru evenimentul MON810;
- MRC-uri al cror coninut OMG (%) este exprimat ca fracie din numrul de
copii ADNp; exist un singur astfel de MRC ERM-AD413 pentru
evenimentul MON810.
n continuare sunt abordate cteva probleme eseniale n ceea ce privete
disponibilitatea MRC-urilor pentru testarea OMG. n primul rnd, existena acestui tip de
matrici pentru fiecare eveniment de transformare autorizat n UE, precum i pentru cele
neautorizate, este considerat de ENGL ca factor esenial pentru procesul de testare. Dei
comparativ cu celelalte probleme acest deziderat este mult mai uor de realizat, MRC-
urile nu sunt nc disponibile dect pentru un numr redus de evenimente de transformare
(vezi IRMM, 2009).
Cel de-al doilea aspect se refer disponibilitatea MRC-urilor adecvate din punct de
vedere al caracteristicilor matricei analizate (i.e. modul i gradul de procesare, coninut)
(Burns i Valdivia, 2007; Trapman i Emons, 2005). Pentru corectitudinea cuantificrii
prin real-time PCR este necesar ca probele analizate i standardele (calibratorii) s
prezinte proprieti intrinseci asemntoare, ceea ce faciliteaz comportarea similar n
timpul procesului PCR, din punct de vedere al ratelor de amplificare. Majoritatea
experimentelor cantitative consider aceast ipotez adevrat, fr ns a o testa (Cankar
et al., 2006; Rott et al., 2004). O serie de autori au evideniat diferene semnificative sub
aspectul eficienelor de amplificare, ntre matricile neprocesate i cele intens procesate
(Moreano et al., 2005, n Burns i Valdivia, 2007; Corbisier et al., 2005; Hols-Jemsen i
Berdal, 2004), care au influenat negativ exactitatea determinrilor (Cankar et al., 2006).
Cu toate acestea, n contextul testrii OMG, definirea caracteristicilor unei matrici
alimentare reprezint un exerciiu dificil deoarece acelai produs poate fi obinut prin
procedee diferite, existnd astfel deosebiri n privina substanelor coninute i deci a
pretabilitii la analize (Cankar et al., 2006).
Testarea OMG

128

Fig. 38. Ilustrarea relaiei dintre ploidia i originea (zigoia) diferitelor esuturi ale seminei, pe de o parte i
proporia ADN-ului transgenic, de cealalt parte. Contribuia fiecrui tip de esut este influenat i de cultivar,
momentul recoltrii etc. Sus: diferenele n ceea ce privete originea i ploidia principalelor tipuri de esuturi ale
seminelor. Mijloc: n cazul speciilor nealbuminoase (ex. soia) influena genotipului genitorilor asupra proporiei de
ADN transgenic este redus, n timp ce la speciile albuminoase (ex. porumb) genotipul genitorilor poate influena
semnificativ proporia de ADN transgenic. Trebuie menionat c proporiile corespunztoare diferitelor tipuri de
esuturi pot diferi n funcie de surs. Jos: inconsecvena dintre cantitatea de semine transgenice i cantitatea de
ADN transgenic.
Fig. 38. Illustrating the relation between ploidy and origin (zygosity) of diffrent seed tissues, on one hand, and the
proportion of transgenic DNA, on the other hand. The contribution of each type of tissue differs with the cultivar,
harvesting time etc. Upper part: differences between the main parts of seed with respect to origin and ploidy.
Middle: in exalbuminous plant species(e.g. soybean) the genotype of the two parents has little influence on the
proportion of transgenic DNA, while in albuminous plant species (e.g. maize) the genotype of the two parents can
significantly affect the proportion of transgenic DNA. It has to be mentioned that tissue fractions can be different
between sources. Lower part: inconsistency between transgenic seed quantity and transgenic DNA quantity.
Dup Papazova et al. (2005) n Block et al. (2008), Allnut et al. (2006), Holst-Jensen et al. (2006), Moens et al.
(2005) i Yoshimura et al. (2005a), modificat.


O alt problem referitoare la utilizarea MRC-urilor este reprezentat de
exprimarea coninutului OMG (Allnutt et al., 2006). Dup cum s-a vzut mai sus,
conform Recomandrii 2004/787/EC exprimarea rezultatelor cantitative se face sub
forma procentelor de ADN MG. Coninutul MRC-urilor este ns exprimat, n majoritatea
Testarea OMG

129
cazurilor, ca fracie de mas sau numr de observaii. n prima situaie, posibilitatea
sporirii incertitudinii de msurare apare datorit ploidiei i zigoiei diferite a esuturilor
seminelor cuare sunt utilizate la obinerea MRC-urilor (Figura 38). n cazul numrului
de observaii (semine sau tuberculi) apare i posibilitatea diferenelor de mas dintre
acestea. Datorit acestor considerente, noul tip de calibratori (ADNp) este mai potrivit
pentru exprimarea concentraiilor OMG sub forma echivalenilor genomici haploizi (el
et al., 2008; Burns et al., 2006).
De asemenea, cel puin n cazul MRC-urilor reprezentate printr-un amestec de
finuri obinute din boabe uscate mcinate, utilizatorul este atenionat ctre productor
(vezi IRMM, 2008b) c:
- cele dou finuri folosite pentru producerea CRM-ului difer semnificativ
n privina coninutului de ADN; acest diferen semnificativ poate afecta
determinrile;
- n funcie de compoziia matricei care constituie proba necunoscut, pot
exista diferene de msurare (cantitativ) ntre aceasta i MRC; diferenele
se pot datora deosebirilor dintre fina MG i cea nemodificat, utilizate la
producerea MRC-ului, precum i metodei de extracie.
Problematica referitoare la disponibilitatea unor MRC-uri adecvate este
recunoscut de comunitatea tiinific implicat n testarea OMG. Este ns clar i
imposibilitatea crerii unei game de MRC-uri care s acopere toate necesitile, n special
n ceea ce privete a doua problem evideniat mai sus (Cankar et al., 2006).

2.9.8. Instrumentele real-time PCR
2.9.8. Real-time PCR instruments

Un instrument real-time PCR are urmtoarele pri componente de baz: blocul
termic ce asigur desfurarea ciclurilor de amplificare, dispozitivul pentru excitarea
fluorocromilor, sistemul optic destinat detectrii i nregistrrii semnalului fluorescent.
Funcionarea acestui instrument este controlat prin intermediul unui software specific
instalat pe un PC conectat la instrument.

Testarea OMG

130

(a)



(b)
Fig. 39. Rotor-Gene 3000 (Corbett Research). (a) Thermal cycler-ul Rotor-Gene 3000. (b) Camera de
nclzire/rcire i sistemul optic. Sursa de excitare luminoas este plasat n partea lateral a camerei n care sunt
aezate probele, iar fotomultiplicatorul care detecteaz emisia fluorescent este aezat sub aceast camer.
Instrumentul are patru canale de detecie care pot fi utilizate simultan n analizele multiplex: FAM (470/510
excitare/detecie), JOE (530/555 excitare/detecie), ROX (585/610 excitare/detecie) i Cy5 (625/665
excitare/detecie). Rotorul pe care se aeaz tuburile cu probe este interschimbabil permind amplifiarea simultan
a 36 sau 72 probe.
Fig. 39. Rotor-Gene 3000 (Corbett Research). (a) The Rotor-Gene 3000 thermal cycler. (b) The heating/cooling
chamber and the optic system. The excitation source is positioned on the side of the chamber, while the
photomultiplier detecting the fluorescent emission is positioned underneath the chamber. The instrument has four
preset detection channels that are used in multiplex runs: FAM (470/510 excitare/detecie), JOE (530/555
excitare/detecie), ROX (585/610 excitare/detecie) i Cy5 (625/665 excitare/detecie). Two different rotor systems
can be used, one accomodating 36 wells, and the other 72 wells.
Surs: Corbett Research (2004).


n momentul de fa este disponibil un numr considerabil de aparate destinate
analizelor real-time PCR. Principalele diferene de ordin tehnic dintre acestea sunt date
de numrul canalelor pe care se poate realiza detecia, viteza de analiz, numrul de
reacii care se pot desfura n paralel i opiunile de analiz ale software-ului. Cele mai
utilizate instrumente real-time PCR sunt (Center for Medical Genetics, 2007; Kubista et
al., 2006; Querci et al., 2005):
- 7900HT (pn la 384 probe), 7700, 7500, 7500 i StepOnePlus, sisteme
produse de Applied Biosystems;
- LightCycler 480 (pn la 384 probe), LightCycler 2.0 i LightCycler 1.5
produse de Roche;

Testarea OMG

131

(a)

(b)

(c)

(d)
Fig. 40. Instrumentul real-time PCR LightCycler 480 (Roche). (a) Sistemul de cuantificare
LightCycler 480 i staia de lucru. (b) Modul special de aranjare a componentelor sistemului
optic. (c) Vedere interioar a instrumentului i a prilor sale componente. (d) Blocul termic
i modul de integrare al elementului Therma-Base.
Fig. 40. LightCycler 480 real-time PCR instrument (Roche). (a) The quantification sytem
LightCycler 480 Instrument with workstation. (b) The special arrangement of the optical
components. (c) Inner view of the instrument with its building blocks. (d) LightCycler 480
thermal block and cross-section showing the integration of the Therma-Base.
Surs: Roche (2009a).


- Rotor-Gene 6000 (6 canale de detecie) i Rotor-Gene 3000 (4 canale de
detecie) produse de Corbett Research; ambele utilizeaz o platform
rotativ pentru asigurarea uniformitii temperaturii;
- Chromo4, DNAEngine Opticon, iCycler, iQ, MyiQ i iQ5 produse de
BioRad;
- Mastercycler i RealPlex (Eppendorf);
Testarea OMG

132
- Mx3000p, Mx3005p i Mx4000 (Startagene);
- SmartrCycler i GeneXpert (Cepheid);
- InSyte (Biogene) care are apte canale de detecie i este foarte rapid;
- SuperConvector (AlphaHelix), realizeaz amplificri foarte rapide;
- DT-322 (DNA Technology), se remarc prin dimensiuni foarte reduse;
- Exicycler (Bioneer);
- OpenArray NT Cycler (BioTrove);
- Quantica (Techne).
Pe lng software-urile de control specifice instrumentelor, exist i pachete
software create pentru analiza datelor real-time PCR (ex. DANA, BestKeeper,
Normfinder, Q-Gene, GenEx, qBasePlus sau RDML), majoritatea neavnd ns o mare
aplicabilitate n domeniul testrilor OMG (Bellocchi et al., 2008; Center for Medical
Genetics, 2007).
Experienele descrise n aceast lucrare s-au desfurat pe dou platforme real-
time PCR: Rotor-Gene 3000 i LightCycler 480. Cteva din caracteristicile acestora sunt
prezentate n Figurile 39 i 40.

2.9.9. Sisteme de detecie
2.9.9. Detection systems

Exist dou categorii de sisteme ce pot fi utilizate pentru monitorizarea
amplificrii:
- care utilizeaz substane de intercalare (ex. EtBr, SYBR Green I, LC Green sau
BOXTO)
- care utilizeaz sonde/primeri marcai cu fluorocromi (ex. TaqMan, FRET,
Molecular Beacons, Scorpions sau TaqMan MGB).
n cazul optimizrii corespunztoare a reaciei de amplificare, sistemul de detecie
utilizat nu este important dect sub aspect economic, substanele de intercalare fiind mult
mai ieftine. De cealalt parte, sondele/primerii marcai asigur optimizarea uoar a
protocolului de amplificare, din perspectiva specificitii, aceste sisteme fiind
recomandate ndeosebi n cazul reaciilor multiplex.
Testarea OMG

133
Substane de intercalare

Prima aplicaie a tehnicii real-time PCR s-a desprins direct din experimentele lui
Higuchi et al., EtBr fiind ns nlocuit cu SYBR Green I, substan fluorescent de
intercalare caracterizat printr-o toxicitate mult mai redus i o specificitate mult mai
mare (Haugland, 2002). SYBR Green I se intercaleaz ADN-ului dublu-catenar, dar nu se
poate lega i la ADN-ul monocatenar.
O consecin a intercalrii este intensificarea fluorescenei, de 800-1000 ori,
substana fiind practic nefluorescent cnd se gsete liber n soluie. Apariia emisiei
fluorescente se datoreaz unor modificri ale structurii interne dup intercalarea ntre
catenele moleculei de ADN (Kubista et al., 2006). Excitarea este produs de lumina
albastr (
max
= 488 nm), iar energia acumulat este disipat sub form de lumin verde
(
max
= 422 nm) (Wikipedia, 2009q).
Principiul deteciei i cuantificrii este urmtorul: odat cu nceperea reaciei PCR,
cantitatea n cretere de ADN nou sintetizat leag o cantitate tot mai mare de SYBR
Green I, rezultatul fiind intensificarea semnalului fluorescent (Figura 41).



(a) (b) (c)
Fig. 41. Etapele de baz ale deteciei ADN-ului n real-time PCR, utiliznd substane de intercalare (ex. SYBR
Green I). (a) n stare liber moleculele de SYBR Green I au o emisie fluorescent redus. Odat cu alipirea
primerilor se formeaz mici regiuni dublu-catenare la care se intercaleaz SYBR Green I, iar semnalul fluorescent al
acestora se intensific. (b) n faza de elongaie, din ce n ce mai mult ADN dublu-catenar este disponibil pentru
intercalarea moleculelor fluorescente. (c) La sfritul elongaiei cantitatea de ADN dublu-catenar este maxim,
moment n care se msoar intensitata fluorescenei.
Fig. 41. Basic steps of real-time PCR DNA detection using intercalating dyes (e.g. SYBR Green I). (a) Free SYBR
Green I molecules have low fluorescent emission. During annealing, PCR primers hybridize to the target DNA
strand and form small regions of dsDNA where SYBR Green I intercalates. As a consequence the fluorescent signal
slightly increases. (b) In the elongation phase, more and more dsDNA is formed and more SYBR Green I dye can
intercalate. The fluorescent signal is again increased. (c) At the end of the elongation phase, all DNA has become
double-stranded and the maximum amount of SYBR Green I is intercalated. This is the moment when the
fluorescence is measured.
Surs: Roche, (2006a).

Testarea OMG

134
O limit a acestei strategii este reprezentat de recunoaterea nespecificic a
ADN-ului dublu-catenar. Toate moleculele de acest tip prezente n mediul de reacie,
inclusiv produii PCR nedorii i primer-dimerii, sunt intercalate de SYBR Green I i
particip la formarea semnalului total. Pentru depirea acestei probleme, dup ncheierea
amplificrii, se face analiza curbei de denaturare (melting analysis) a produilor de
reacie (Figura 42). n cadrul acestei analize produii rezultai (i.e. ADN dublu-catenar
int, ADN dublu-catenar nespecific, primer-dimeri) sunt denaturai treptat prin creterea
gradual a temperaturii, n paralel fiind nregistrat modificarea semnalului fluorescent.
Aceast modificare este redat n funcie de variaia temperaturii, sub forma unei curbe,
ntr-un grafic cu dou axe (Figura 42, drepta). Fluorescena se reduce treptat datorit
efectelor pe care creterea temperaturii le are asupra proprietilor interne ale
fluorocromilor legai la ADN-ul dublu-catenar (Nygren et al., 1998, n Kubista et al.,
2006). n momentul n care temperatura de denaturare a ADN-ului dublu-catenar este
atins, moleculele sunt puse n libertate i fluorescena scade brusc. Acest nivel de
temperatur este apoi calculat ca maxim al primei derivate negative a curbei de
denaturare. Deoarece fiecare tip de molecul dublu-catenar are o temperatur specific
de denaturare este posibil discriminarea diferiilor produi PCR (specifici sau
nespecifici).
Analiza curbei de denaturare reprezint de asemenea o alternativ simpl, ieftin,
rapid i sigur pentru metodele de identificare a OMG-urilor bazate pe PCR-ul
convenional (Taverniers et al., 2005). Identificarea i discriminarea ampliconilor se face
pe baza temperaturilor de denaturare, determinate de coninutul GC, lungimea i secvena
acestora, precum i de concentraia substanei de intercalare, a srurilor i a produsului
int din mediul de reacie (Li et al., 2003, Shepherd et al., 1998, i Ririe et al., 1997, n
Taverniers et al., 2005). Este astfel posibil efectuarea n bune condiii a reaciilor
multiplex (Hernndez et al., 2004a, 2004b i 2003), diferii autori raportnd
discriminarea unor ampliconi a cror temperaturi de denaturare difereau doar prin 1,5-2
C (Taverniers et al., 2005). Ca i n cazul tehnologiei microarray, tehnica ofer un
deosebit potenial pentru rezolvarea problemelor determinate de creterea numrului de
evenimente de transformare comercializate (Hernndez et al., 2004a, 2004b i 2003).

Testarea OMG

135

Fig. 42. Analiza curbei de denaturare. Intensitatea semnalului fluorescet se reduce brusc odat cu denaturarea unei
cantiti mai mari de ADN dublu-catenar. Punctul de denaturare corespunde punctului de inflexiune al curbei de
denaturare care se determin ca maxim al primei derivate negative a curbei de denaturare. Ampliconul generat prin
amplificarea secvenei int este mai lung dect primer-dimerii i astfel necesit pentru denaturare o temperatur mai
mare.
Fig. 42. Melting curve analysis. Dye fluorescence drops rapidly when the DNA melts. The melting point is defined as
the inflection point of the melting curve, which is easiest determined as the maximum in the negative 1st derivative of
the melting curve. The amplicon produced from the targeted product is typically longer and melts at higher
temperature than the primer-dimers.
Surs: Kubista et al. (2006).


Un incovenient al substanei SYBR Green I este faptul c inhib activitatea Taq
ADN polimerazei, motiv pentru care trebuie utilizat n concentraii reduse, ceea ce
diminueaz semnificativ capacitatea de a indica schimbri mici n gradul de hibridare al
macromoleculei de ADN. Pentru rezolvarea acestei probleme se pot utiliza ali ageni de
intercalare (ex. LC Green sau EvaGreen). LC Green de exemplu, nu inhib activitatea
polimerazei i poate fi utilizat n concentraii suficient de mari astfel nct s poat
satura siturile dublu-catenare de intercalare care apar odat cu acumularea produilor
PCR (Figura 43) (Idaho Technology, 2009). n acest caz, saturarea siturilor de intercalare
elimin posibilitatea ca o molecul de fluorocrom s fie redistribuit din regiuni care au
devenit monocatenare n cele care sunt nc dublu-catenare, problem ntlnit la
sistemele care utilizeaz SYBR Green I. Utilizat n combinaie cu instrumentul HR-1
(High Resolution Melter) (Idaho Technology), LC Green faciliteaz detecia precis a
unor variaii reduse ale semnalului fluorescent, care indic stadiul de hibridare al
produslui PCR. Sistemul a fost creat pentru identificarea mutaiilor, dar prezint un mare
potenial i pentru testele de cuatificare prin real-time PCR.


Testarea OMG

136

Fig. 43. Diferene ntre modul de intercalare al
moleculelor de SYBR Green I (sus) i LC Green (jos).
Fig. 43. Diferences between LC Green and SYBR
Green I intercalation to dsDNA.
Surs: Idaho Technology (2009).


Sonde i primeri specifici marcai

Specifictatea deteciei este o caracteristic esenial pentru analizele cantitative.
Pentru sporirea acesteia se pot utiliza diferite construcii oligonucleotidice marcate
fluorescent, care au capacitatea de a detecta doar secvena int, fr a influena negativ
procesul PCR. Aceste construcii oligonucleotidice sunt mprite n dou mari grupe,
sonde, respectiv primeri marcai. Diferena esenial dintre acestea este dat de rolul pe
care l joac n cadrul experimentului. Astfel, sondele au doar rol de detecie, pentru
amplificarea fragmentului de interes fiind necesar utilizarea a doi primeri convenionali.
n schimb, primerii marcai funcioneaz i ca amorse pentru reacia de polimerizare a
uneia dintre catenele moleculei int, de aceea n aceste experimente se utilizeaz doar un
primer obinuit. Urmtoarea clasificare a construciilor oligonucleotidice utilizate pentru
detecie i cuantificare pe baza nregistrrii emisiei fluorescente, este preluat de la
Kubista et al. (2006). Grupa sondelor include:
- sondele hidrolizabile (hydrolysis probes), denumite i sonde TaqMan,
descrise de Holland et al. (1991);
- balizele moleculare (molecular beacons), descrise de Tyagi i Kramer
(1996) i Tyagi et al. (1998);
- sondele de hibridare (hybridization probes), descrise de Caplin et al.
(1999);
- sondele Lion, produse de Biotools.
Testarea OMG

137
Aceste construcii sunt marcate cu doi fluorocromi ce formeaz o pereche donor-
acceptor, n care primul, n stare excitat, i transfer energia celui de-al doilea, aflat n
proximitate. Acesta din urm suprim astfel activitatea fluorescent a donorului, motiv
pentru care este denumit i represor (quencher). Molecula represoare poate fi
fluorescent (fluorescent quencer), disipnd cea mai mare parte din energia primit sub
form de lumin, sau nefluorescent (dark quencher), caz n care energia primit este
eliberat sub form de cldur.
Primerii modificai sunt clasificai dup cum urmeaz (Kubista et al., 2006):
- primerii de tip Scorpion, descrii de Whithcombe et al. (1999);
- primerii LUX, descrii de Nazarenko et al. (2002);
- primerii Ampliflour, descrii de Uchara et al. (1999);
- sistemul Qzyme (Clonetech).
Fiecare dintre principiile de mai sus prezint avantaje i limite, cele mai utilizate
n practic fiind ns sondele, iar dintre acestea cele hidrolizabile. Avantajul principiului
TaqMan este dat de uurina de proiectare comparativ cu celelalte tipuri de sonde.
Construciile oligonucleotidice marcate pot fi constituite din nucleotidice normale
sau molecule sintetice similare acestora (ex. peptide nucleic acid/PNA sau locked nucleic
acid/LNA), iar al doilea element major care intr n alctuirea sunt sunt substanele
fluorescente (reporter dyes), denumite i fluorocromi sau cromofori.
FRET (fluorescence/Frster resonance energy transfer) reprezint mecanismul
de transfer al energiei ntre doi fluorocromi (Wikipedia, 2009h; Haugland, 2002) i st la
baza principiului de funcionare al sondelor marcate (Figura 44). n continuare este
descris acest principiu conform Roche (2006a).
Sursa de lumin a instrumentului excit molecula donoare prin intermediul unui
filtru cu lungime de und corespunztoare absorbiei maxime a acesteia. n aceast stare,
anumii electroni din molecula donoare sunt excitai, ajungnd de la nivelul de baz la un
nivel energetic superior. n mod normal, energia acumulat de donor este disipat sub
form de emisie fluorescent cu lungime de und diferit, mai mare dect cea de excitaie
(Figura 44a). Pentru ca transferul de energie s aib loc (Figura 44b) este necesar
ndeplinirea urmtoarelor condiii: cele dou molecule (donor i acceptor) trebuie s fie

Testarea OMG

138

(a) (b)
Fig. 44. Principiul FRET. (a) FRET nu are loc datorit distanei dintre donor i acceptor. (b) n
cazul n care cele dou molecule sunt apropiate n spaiu, FRET apare, sub forma transferului de
energie de la donor la acceptor.
Fig. 44. FRET principle. (a) FRET doesnt occur because of the dsitance between the donor and
acceptor molecules. (b) When the two molecules are adjacent to each other, the energy transfer
takes place.
Dup Wikipedia (2009h), modificat.


apropiate n spaiu (de obicei 10-100 ); suprapunerea spectrului de emisie a donorului
cu spectrul de excitare a acceptorului. n aceste condiii o mare parte din energia
donorului este transferat acceptorului. n urma transferului energetic, electronii
donorului revin la nivelul de baz (emisia fluorescent a donorului este suprimat), n
timp ce o parte din electronii acceptorului trec ntr-o stare de excitaie. Dup cum s-a
menionat anterior, energia nmagazinat va fi disipat sub form de radiaie luminoas
sau sub form de cldur, n funcie de tipul moleculei acceptoare (i.e. represorul).
Exist mai multe strategii de utilizare a acestui mecanism n vederea deteciei
specifice a ampliconilor. Astfel, sondele hidrolizabile sunt bazate pe utilizarea unui
acceptor de tipul dark quencher, n timp ce sondele de hibridare utilizeaz molecule
acceptoare cu emisie fluorescent.
Programele de amplificare pentru sondele TaqMan sunt constituite, n general, din
cicluri de amplificare cu dou trepte de temperatur (se folosete un singur nivel pentru
hibridare i extensie). Acest sistem poate influena negativ eficiena polimerazei, de aceea
este necesar ca secvenele int s fie de lungimi reduse (Kubista 2006). n cazul
cuantificrii OMG-urilor condiia referitoare la lungimea ampliconilor este ns necesar
i datorit faptului c ADN-ul poate fi puternic degradat.
Sondele de hibridare. Pentru monitorizarea formrii produilor PCR cu ajutorul
acestui sistem, pe lng primerii PCR, trebuie utilizate dou sonde oligonucleotidice
specifice, marcate cu fluorocromii corespunztori i denumite sonde de hibridare.
Testarea OMG

139
Sondele de hibridare sunt proiectate sub form de pereche, una fiind marcat la captul
3, cu fluorocromul donor (ex. Fluoresceine), iar cealalt la captul 5, cu fluorocromul
acceptor (ex. Red 640 sau Red 705) (Figura 45). Deoarece FRET scade odat cu mrirea
distanei dintre cei doi fluorocromi, sondele trebuie concepute astfel nct s hibrideze
regiuni adiacente ale moleculei de ADN int (de obicei sunt desparite de 1-5
nucleotide).
Datorit celor dou sonde, aceste sisteme de cuantificare sunt caracterizate printr-
un nalt nivel al specificitii deteciei. De asemnea, sondele nu sunt degradate n timpul
amplificrii, fiind astfel posibil efectuarea analizei curbei de denaturare n vederea
confirmrii specificitii reaciei PCR.
Sondele de degradare (sondele hidrolizabile/TaqMan sau principiul TaqMan)
se bazeaz pe activitatea exonucleatic 5-3 a Taq ADN polimerazei, respectiv
capacitatea de a dezintegra (hidroliza), n timpul extensiei, orice segment oligonucleotidic
alipit moleculei matri (Lie i Petropoulos, 1998, n Weighardt, 2004). n general, sonda
TaqMan/hidrolizabil are o lungime de 20-30 baze, iar temperatura de alipire este cu
aproximativ 10 C mai mare dect a primerilor. Nucleotida de la captul 5 are ataat un
fluorocrom reporter (de obicei FAM), iar cea de la captul 3 unul represor (TAMRA)
(Figura 46). De asemenea, captul 3 este blocat, fiind mpiedicat extensia sondei
asemntor primerilor.
Ct timp sonda este intact, apropierea reporterului fa de represor face posibil
trasferul de energie ntre cele dou molecule, determinnd suprimarea emisiei
fluorescente. n timpul reaciei PCR, n prezena unei molecule int, sonda se alipete
specific ntre siturile complementare primerilor. Apoi, n etapa de extensie a primerilor,
Taq ADN polimeraza se deplaseaz de-a lungul moleculei int sintetiznd noua caten,
proces n care hidrolizeaz sonda TaqMan. Degradarea ntrerupe transferul de energie de
la reporter ctre represor, semnalul fluorescent propagndu-se n mediul de reacie i
fiind nregistrat. n acest mod este indicat acumularea produsului PCR. Degradarea unor
noi sonde n ciclurile succesive va determina sporirea numrului de fluorocromi liberi i
implicit creterea semnalului fluorescent. Creterea intensitii semnalului fluorescent, ca
rezultat al degradrii sondelor odat cu acumularea produsului de amplificare, are loc n
fiecare ciclu PCR i nu influeneaz desfurarea reaciei.
Testarea OMG

140


(a) (b) (c)
Fig. 45. Detecia cu sonde FRET. (a) Sonda donoare este marcat cu fluorocrom donor (verde) la captul 3, iar
cealalt sond este marcat cu un fluorocrom acceptor la captul 5 (rou). Sonda acceptoare este de asemenea
fosforilat la captul 3 pentru a mpiedica polimerizarea. Fluorocromii pot fi plasai i invers pe cele dou sonde. n
faza de denaturare nu are loc extensia. Datorit distanei dintre dintre cei doi flourocromi transferul de energie
(FRET) nu apare n aceast etap, fluorocromul acceptor nefiind astfel excitat. (b) n timpul etapei de longaie cele
dou sonde hibrideaz situri adiacente ale segmentului de ADN int. Fluorocromul donor este excitat de sursa de
lumin a instrumentului. Energia acestuia nu este disipat sub form de lumin fluorescent, ci este transmis
acceptorului, excitndu-l. Fluorescena emis de acceptor este msurat la sfritul etapei de alipire, cnd aceasta
este maxim. (c) Dup alipire, temperatura este ridicat iar sondele se desprind n timpul etapei de elongaie. La
sfritul acestei etape sondele sunt din nou deprtate una fa de cealalt, iar astfel transferul de energie nu are loc.
Fig. 45. Real-time PCR detection using FRET probes. (a) The donor probe is labeled with a donor dye (green) at the
3-end, while the HybProbe acceptor probe is labeled at the 5-end with an acceptor dye (the acceptor probe is also
3-phosphorylated to prevent extension). Note that this set-up might also be reversed: acceptor probe labeled at the
3-end and donor probe labeled at the 5-end. Hybridization does not occur during the denaturation phase of PCR.
Since the distance between the unbound probes prevents energy transfer between the two dye labels, no fluorescence
will be detected from the acceptor dye during this phase. (b) During the annealing phase, the two probes hybridize to
the amplified DNA fragment in a close head-to-tail arrangement. The donor dye is excited by the light source of the
instrument, which causes it to emit energy. Instead of being emitted as fluorescent light, the emitted energy excites
the acceptor dye. The fluorescence emitted by the acceptor dye is measured at the end of each annealing step, when
the fluorescence intensity is highest. (c) After annealing, the temperature is raised and the HybProbe probes are
displaced during elongation. At the end of this step, the PCR product is double-stranded and the displaced HybProbe
probes are again too far apart to allow FRET to occur.
Surs: Roche (2006a).




(a) (b) (c) (d)
Fig. 46. Principiul TaqMan. (a) O sond hidrolizabil este marcat cu doi fluorocromi adiaceni, astfel nct
molecula represoare mpiedic activitatea fluorescent a reporterului. (b) n etapa de alipire, primerii i sondele se
alipesc specific secvenei int. (c) n timpul elongaiei, polimeraza ntlnete sonda i datorit proprietilor sale
exonucleatice are capacitatea de a o degrada. (d) n acest moment cei doi fluorocromi nu mai sunt adiaceni, astfel
nct energia intern a reporterului este disipat sub form de lumin fluorescent care este msurat de instrument.
n acest mod creterea intensitii fluorescente a fluorocromului reporter este corelat cu acumularea produsului int
care determin degradarea sondelor. Semnalul fluoescent este msurat la sfritul etapei de elongaie.
Fig. 46. TaqMan principle. (a) A hydrolysis probe carries two fluorescent dyes in close proximity, with the quencher
dye suppressing the reporter fluorescence signal. The 3-end of the probe is phosphorylated, so it cannot be
extended during PCR. (b) In the annealing phase of PCR, primers and probes specifically anneal to the target
sequence. (c) As the DNA polymerase extends the primer, it encounters the probe and cleaves it (the 5-nuclease
activity). Probe fragments are displaced from the target sequence, while the polymerase continues the elongation.
(d) In the cleaved probe, the reporter dye is no longer quenched and therefore can emit fluorescent light that can be
measured by the instrument. Thus, the increase in fluorescence from the reporter dye directly correlates to the
accumulation of released reporter dye molecules and indirectly to the amount of PCR products. As with SYBR
Green I, the fluorescent signal of the reporter dye is measured at the end of the elongation phase.
Surs: Roche (2006a).
Testarea OMG

141
Deoarece semnalul reporterului apare doar dac primerii PCR i sonda TaqMan se
alipesc secvenei int, specificitatea acestui sistem este semnificativ mai mare dect a
sistemelor PCR clasice sau a sistemelor real-time PCR care utilizaez SYBR Green I.
Hagen i Beneke (2002) citai de Ahmed (2002) precizeaz c 179 de produse
alimentare pe baz de soia (inclusiv produse pentru nou-nscui, produse de slbit,
buturi, fulgi, tofu, tiei, uleiuri i condimente) au fost analizate utiliznd sistemul
TaqMan, acesta fiind destul de sensibil nct s permit detecia moleculelor int. ADN-
ul de soia nu a putut fi ns detectat n matricile intens procesate ca uleiuri i condimente.

2.10. INTERPRETAREA I RAPORTAREA REZULTATELOR OBINUTE N
URMA TESTRII OMG
2.10. INTERPRETATION AND REPORT OF GMO TESTING RESULTS

Trebuie n primul rnd avut n vedere c laboratorul recepioneaz direct proba de
laborator, obinut sau nu printr-un proces de eantionare, iar rezultatele produse n urma
analizelor se vor referi strict la acest eantion. Modul de utilizare a rezultatelor (i.e.
extrapolarea la ntregul lot din care provine proba analizat) rmne la latitudinea
beneficiarului.
Conform SR EN ISO 24276:2006, buletinul de analiz trebuie s menioneze clar
cantitatea secvenei transgenice raportat la cea a taxonului, sub forma procentelor de
ADN MG (vezi subcapitolul 2.9.4). Rezultatele testrii vor fi exprimate ca n Tabelul 3.
Trebuie de asemenea s se specifice valoarea incertitudinii de msurare, precum i
limitele de detecie i cuantificare absolute i practice.
Trapmann et al. (2007) recomand urmtorul mod de raportare a rezultatelor
testrii OMG cantitative:
- dac c > LOQ se raporteaz Concentraia = (c U); c reprezin rezultatul
msurtorii; incertitudinea raportat n acest caz este cea extins, calculat
cu ajutorul incertitudinii standard i utiliznd un factor de acoperire k = 2
(nivelul de ncredere de aproximativ 95%);
- n cazul n care LC < c < LOQ se raporteaz Concentraia = (c U), dac
nu este posibil estimarea concentraiilor sub LOQ; dac estimarea este
Testarea OMG

142
posibil sub LOQ, se raporteaz Concentraia (LOQ + U
LOQ
), U
LOQ

reprezentnd incertitudinea extins a valorii LOQ;
- dac c < LC se raporteaz Concentraia < LC. AND-ul MG nu a fost
detectat n aceast prob.
Parametri menionai anterior sunt prezentai ntr-unul dintre subcapitolele
urmtoare.


Tabelul 3.
Modul de raportare a rezultatelor obinute n urma testrii
Reporting of test results
Rezultatele testrii
Testing results
Raportarea rezultatelor
Reporting of results
Secvena int specific taxonului nu a
fost detectat
Pentru proba analizat nu s-a detectat ADN.
Secvena int specific taxonului a fost
detectat; secvena int specific
OMG-ului nu a fost detectat
Pentru proba analizat nu s-a detectat ADN
specific evenimentului de transformare X.
Ambele secvene int au fost detectate,
dar n cel puin unul dintre cazuri
secvena int este sub LOQ
S-a detectat ADN specific evenimentului de
transformare X.
Ambele secvene int au fost detectate,
iar n ambele cazuri cantitile sunt
peste LOQ
Coninutul de ADN specific evenimentului de
transformare X este Y. Incertitudinea de
msurare a metodei este Z.
Dup SR EN ISO 24276:2006, modificat.


2.11. EVALUAREA I VALIDAREA METODELOR ANALITICE
2.11. ANALYTICAL METHOD EVALUATION AND VALIDATION

2.11.1. Importana metodelor analitice validate
2.11.1. The importance of validated analytical methods

Furnizarea unor rezultate analitice corecte, care ndeplinesc anumite cerine de
calitate, reprezint elementul esenial n cadrul activitii de testare a produselor
Testarea OMG

143
alimentare. De aceea, laboratorul trebuie s fie capabil s i desfoare activitatea n
conformitate cu toate standardele naionale sau internaionale n domeniu (SR EN
ISO/CEI 17025:2005), cel mai important aspect tehnic fiind reprezentat de utilizarea unor
metode analitice adecvate. Prin aceasta se nelege necesitatea ca laboratorul s
foloseasc metode validate oficial, dac acestea sunt disponibile, sau cel puin metode n
cazul crora s-a demonstrat capacitatea obinerii unor rezultate sigure i repetabile
(Querci et al., 2005). Ambele categorii sunt indispensabile n toate domeniile de analiz
(Thompson et al., 2002).
Alte activiti pe care laboratorul trebuie s le implementeze n vederea obinerii
unor rezultate de calitate sunt:
- asigurarea trasabilitii; n acest scop echipamentele vor fi verificate
metrologic (i.e. etalonate/calibrate n funcie de specificul fiecruia) sau n
cadrul controlului intern de calitate; tot n acest context, este necesar
asigurarea i monitorizarea condiiilor de mediu pentru a exista certitudinea
c parametri mediului ambiant n care se efectueaz analizele nu afecteaz
stabilitatea reactivilor, a materialelor de control, a probelor biologice i
buna funcionare a echipamentelor;
- efectuarea controlului intern al calitii (internal quality control/IQC sau in-
house quality assurance); IQC reprezint un set de proceduri aplicate
continuu n cadul laboratorului n vederea evalurii activitilor desfurate
i a rezultatelor furnizate; se demonstreaz, practic, c metoda funcioneaz
n limitele prestabilite, iar rezultatele sunt destul de sigure pentru a fi
oferite beneficiarilor; n cadrul acestui proces se utilizeaz MR-uri, n
situaia ideal acestea fiind i certificate; materialele de control vor
parcurge ntregul proces analitic la care sunt supuse probele necunoscute,
sau doar o parte a acestuia; rezultatele obinute n cadrul acestei activiti
pot fi utilizate i pentru procesul de validare i estimare a incertitudinii de
msurare;
- participarea la comparri/studii de comparare interlaboratoare
(interlaboratory studies sau collaborative/ring trials), denumite i
experimente de evaluare prin cooperare (SR ISO 5725-1:1997); acest tip
Testarea OMG

144
de activitate constituie un control extern al calitii sau un mod de evaluare
a competenei laboratorului (proficiency testing/PT);
- acreditarea conform unui standard adecvat (ENGL, 2008); n cazul
laboratoarelor de testare OMG, acreditarea se face n conformitate cu
standardul ISO/CEI 17025, recunoscut la nivel internaional ca document
esenial pentru ndeplinirea condiiilor de asigurare a calitii activitilor
de testare (el et al., 2008).
Utilizarea unor metode precise i exacte i implementarea msurilor de asigurare a
calitii vor permite laboratoarelor s furnizeze rezultate corecte, de ncredere i
comparabile la nivel internaional, acestea constituind premisele pentru desfurarea
controlului oficial al OMG-urilor comercializate (Morisset et al., 2009; el et al., 2008;
Thompson et al., 2002).

2.11.2. Validarea i acreditarea metodelor analitice
2.11.2. The importance of validated analytical methods

2.11.2.1. Validarea
2.11.2.1. Validation

Toate msurile enumerate n subcapitolul anterior sunt interconenctate cu
validarea care reprezint astfel componenta esenial a strategiei utilizate de ctre
laborator pentru asigurarea calitii, precum i pentru evaluarea performanelor tehnice n
vederea obinerii unor rezultate precise i exacte (ENGL, 2008; el et al., 2008).
Validarea reprezint confirmarea prin examinare i furnizarea unor dovezi
obiective care demonstreaz ndeplinirea cerinelor specifice unui anumit mod de
utilizare intenionat (SR EN ISO/CEI 17025:2005). A valida o metod nseamn a
investiga dac scopul acesteia, reprezentat de obinerea unor rezultate analitice cu un
nivel acceptabil de incertitudine, este atins (Thompson et al., 2002).
n contextul testrii OMG, validarea metodelor este legat de:
- procedura de autorizare de ctre Comisia European a comercializrii
evenimentelor de transformare;
Testarea OMG

145
- acreditarea de ctre laboratoarele de testare a metodelor utilizatze.
n primul caz, conform legislaiei europene privitoare la autorizarea OMG-urilor
(ex. Regulamentele 1981/2006, 641/2004 sau 1829/2003), notificatorul este obligat s
includ n dosarul pentru autorizare o metodologie de testare a evenimentului de
transformare, care cuprinde proceduri de eantionare, identificare i detecie (CRL-
GMFF, 2009a; Mazzara et al., 2008). CRL-GMFF, prin intermediul laboratoarelor din
cadrul ENGL, va evalua i valida metodele analitice transmise de ctre notificator
(Mazzara et al., 2008; Regulamentele 1981/2006 i 1829/2003), iar concluziile vor fi
prezentate Comisiei Europene pentru a fi utilizate n procesul decizional (GMO
Compass, 2006a). n acest context, procesul de evaluare de ctre CRL-GMFF a
performanei metodelor propuse de notificatori se desfoar n dou faze (ENGL, 2008;
Mazzara et al., 2008):
- prima faz presupune evaluarea datelor i materialelor incluse de notificator
n dosarul oficial; prin materiale se nelege matrici derivate din OMG-
uri ce conin evenimentul de transformare pentru care se solicit
autorizarea;
- faza a doua corespunde procesului de validare deplin a metodei printr-un
studiu de comparare interlaboratoare; probele testate n cadrul studiului
sunt reprezentate de materialele menionate anterior.
Iniial, notificatorul realizeaz o validare in-house a metodei pe care o propune.
Ca n cazul oricrui proces de validare, este necesar n primul rnd specificarea
criteriilor de performan a metodei sau a criteriilor de acceptabilitate pe care aceasta
trebuie s le ndeplineasc pentru a putea fi inclus ntr-un proces de validare deplin
(full validation) (faza a doua). Definirea criteriilor de performan trebuie fcut n
conformitate cu recomandrile ENGL (vezi ENGL, 2008) (Regulamentul 641/2004).
Datele validrii efectuate n cadrul laboratorului sunt incluse n dosarul de autorizare i
vor fi examinate de CRL-GMFF ( Mazzara et al., 2008). Practic, notificatorul trebuie s
demonstreze c metoda ndeplinete condiiile generale enunate n Regulamentul
641/2004 i criteriile de acceptabilitate indicate de ENGL. nainte de compararea
interlaboratoare se va realiza i o testare experimental a metodei utiliznd materialele
(probele) trimise de ctre notificator.
Testarea OMG

146
n cea de-a doua faz, transferabilitatea i performanele metodei sunt evaluate n
cadrul unui studiu de comparare interlaboratoare desfurat n conformitate cu principiile
descrise de Uniunea Internaional de Chimie Pur i Aplicat (International Union of
Pure and Applied Chemistry/IUPAC) i ISO (ex. ISO 5725). Studiul va include cel puin
12 laboratoare naionale de referin din cadrul UE (vezi Anexa II a Regulamentului
1981/2006), iar evaluarea rezultatelor se va face conform criteriilor ENGL (vezi ENGL,
2008).
La sfritul procesului de validare metodele sunt publicate pe site-ul CRL-GMFF
(vezi CRL-GMFF, 2009b), fiind disponibile pentru alte laboratoare de testare (el et al.,
2008).
Mai multe informaii referitoare la procedura de validare utilizat de CRL-GMFF
sunt prezentate de ENGL (2008) i el et al. (2008), iar rezultate ale unor astfel de
comparri au fost publicate i de ISO (vezi SR EN ISO 21570:2006, SR EN ISO
21571:2006 i SR EN ISO 21569:2006).
n cea de-a doua situaie (i.e. acreditarea laboratorului), necesitatea acreditrii este
impus de prevederile legislative din domeniul controlului oficial al alimentelor, iar
pentru parcurgerea acestui proces este n primul rnd necesar utilizarea unor metode
performante, capabile s furnizeze rezultate precise i sigure. SR EN ISO/CEI
17025:2005 menioneaz c laboratoarele de testare care doresc s parcurg procesul de
acreditare trebuie s utilizeze cu precdere metodele analitice publicate n standardele
internaionale, regionale sau naionale. Aceast cerin a fost introdus deoarece metodele
standardizate au fost n prealabil deplin validate, ceea ce nseamn c performanele lor
au fost investigate prin studii de comparare interlaboratoare. Exemple n acest sens sunt
metodele incluse n standardele SR EN ISO 21570:2006, SR EN ISO 21571:2006 i SR
EN ISO 21569:2006 care servesc ca documente verticale de referin pentru testarea
OMG. n cazul implementrii acestor metode, laboratorul trebuie doar s demonstreze c
este capabil s ating performanele obinute n urma studiului interlaboratoare
(Thompson et al., 2002). Aceasta se face printr-o validare n cadrul laboratorului, nefiind
necesar testarea tuturor parametrilor de performan (el et al., 2008).
Testarea OMG

147
Cerina referitoare la implementarea cu precdere a metodelor analitice validate a
fost enunat i de legislaia UE n domeniul testrii OMG (vezi Recomandarea
2004/787/EC).
n cazul n care metodele deplin validate i standardizate nu sunt disponibile sau
nu pot fi implementate, se va opta pentru alte tipuri de metode: metode standardizate
folosite n afara domeniului lor de aplicare, metode standardizate extinse sau modificate,
metode nestandardizate, metode proiectate/dezvoltate de laborator (SR EN ISO/CEI
17025:2005). n aceste situaii este necesar s se demonstreze c metodele sunt adecvate
pentru utilizarea intenionat (SR EN ISO/CEI 17025:2005), iar aceasta va fi fcut
printr-o validare in-house efectuat n conformitate cu criteriile acceptate la nivel
internaional (ex. ISO 5725) (Recomandarea 2004/787/EC), testarea tuturor parametrilor
de performan fiind necesar cel puin n cazul metodelor dezvoltate de laborator (el et
al., 2008).
Ca i n cazul validrii depline, vor fi specificate cerinele i apoi se va efectua
determinarea performanelor. n acest context, cerinele de performan sunt definite n
SR EN ISO 24276:2006 care servete ca document orizontal pentru testarea OMG.
Pe baza celor discutate anterior conchidem c o metod de testare poate parcurge
urmtoarele etape: crearea (proiectarea i testarea), validarea n cadul unui laborator sau a
unui numr mic de laboratoare, validarea deplin printr-o comparare interlaboratoare,
adoptarea de ctre un organism de standardizare (recunoscut la nivel internaional). n
cele din urm, nainte de implementarea metodei n cadrul unui laborator, este necesar
parcurgerea unei proceduri de confirmare a faptului c vor fi ndeplinite caracteristicile
de performan atribuite metodei (el et al., 2008).
Cerinele minime de performan pentru metodele analitice de testare OMG, att
n contextul validrii depline, ct i al validrii in-house, vor fi discutate n subcapitolul
2.11.3.
Procedurile analitice pentru testarea OMG sunt alctuite din etape succesive ce pot
fi tratate ca un ntreg sau ca module separate (Holst-Jensen i Berdal, 2004, n Holst-
Jensen, 2007). Aceast modalitate de organizare este recunoscut i de legislaia
european, Regulamentul 641/2004 descriind metode pentru eantionarea, detecia i
identificarea evenimentelor de transformare. n acest context, validarea ntregului
Testarea OMG

148
protocol integrat de testare este privit ca o abordare clasic, fiind denumit abordare
global (Figura 47, stnga). O alt strategie a fost propus de Holst-Jensen i Berdal
(2004), aceasta presupunnd validarea separat, sub form de module (Figura 47,
dreapta), a fiecrei etape din cadrul procedurii analitice (el et al., 2008; Burns i
Valdivia, 2007; Holst-Jensen, 2007; Reiting et al., 2007; Cankar et al. 2006). Se
realizeaz practic validarea individual a metodei de extracie a ADN-ului, a celei de
detecie, respectiv a celei de cuantificare. Comparativ cu abordarea clasic, cea modular
permite simplificarea estimrii IM i reducerea costurilor, oferind n acelai timp o mare
flexibilitate n adaptarea protocoalelor de lucru n funcie de specificul fiecrei situaii,
determinat n principal de caracteristicile probei analizate (Reiting et al., 2007; Cankar et
al. 2006).
Att metodele publicate n standardele ISO, ct i cele de pe site-ul CRL-GMFF,
corespund abordrii modulare, ceea ce nseamn c etapele analitice (i.e. extracia,
cuantificarea) au fost validate individual i pot fi combinate n funcie de necesiti. Din
punct de vedere al procesului de validare, va fi necesar n primul rnd calcularea IM
asociate utilizrii protocolului integrat n cazul unei matrici date.


Abordarea global Abordarea modular

Fig. 47. Principiul strategiilor de validare a protocoalelor integrate de testare OMG.
Fig. 47. Principle of different approaches used for the validation of integrated
GMO testing protocols.
Surs: Holst-Jensen i Berdal (2004) n Holst-Jensen (2007).
Testarea OMG

149
Elemente ca gena de referin, procedura de extracie, reactivii i platforma real-
time PCR sunt clar definite n cazul fiecrei metode validate. Este ns neclar dac
schimbarea unuia dintre aceste elemente (de obicei reactivii sau instrumentul PCR difer
ntre laboratoare) poate fi considerat o modificare a metodei. Aceast situaie constituie
o provocare n plus pentru laboratorul care dorete implementarea unei metode deja
validate (standardizate). n acest context, modificarea unor caracteristici neeseniale va
necesita probabil doar verificarea parametrilor critici (ex. limitele de detecie i
cuantificare sau repetabilitatea), n cadrul laboratorului, iar n cazul unor modificri
substaniale va fi necesar o nou evaluare a tuturor parametrilor de performan.
Un caz similar este reprezentat de utilizarea metodei pentru o matrice nou, iar n
contextul n care laboratorul dorete testarea unui numr mare de evenimente de
trasnformare, implementarea unor metode ce necesit reactivi, platforme sau protocoale
de extracie diferite va fi costisitoare i ineficient (el et al., 2008). Toate acestea
reprezint exemple n care abordarea modular permite o eficientizare substanial a
activitilor.

2.11.2.2. Acreditarea
2.11.2.2. Accreditation

Dintre instrumentele de asigurare a calitii n cadrul laboratoarelor de testare,
acreditarea este considerat ca fiind cea mai detaliat i important (Querci et al., 2005).
ISO definete acreditarea ca fiind procesul prin care o instituie abilitat recunoate
formal faptul c laboratorul opereaz conform unui sistem de calitate i este competent i
capabil, din punct de vedere tehnic, s furnizeze rezultate valide. Aceasta nu garanteaz
ns corectitudinea rezultatului obinut, dar asigur ndeplinirea anumitor cerine eseniale
de calitate precum i un cadru care s permit identificarea neconformitilor (Querci et
al., 2005). Acreditarea laboratoarelor de testare se desfoar n conformitate cu SR EN
ISO/CEI 17025:2005, recunoscut la nivel internaional ca stadard esenial n definirea
cerinelor generale pentru competena tehnic a laboratoarelor de testare i calibrare (el
et al., 2008). Aceste cerine includ:
- demonstrarea competenei tehnice a operatorilor;
Testarea OMG

150
- utilizarea unor metodologii de testare bine definite;
- utilizarea MRC-urilor;
- testarea competenei prin intermediul unor comparri interlaboratoare;
- intreinerea, verificarea, calibrarea i etalonarea aparatelor;
- controlul documentelor;
- controlul nregistrrilor;
- furnizarea unor rapoarte adecvate; elementele cheie ale acestora sunt
rezultatele obinute prin testare i IM estimat n cadrul activitii de
validare.
Domeniul de acreditare reprezint enunarea oficial i precis a activitilor
pentru care laboratorul este acreditat (ILAC, 2002). Majoritatea proceselor de acreditare
au la baz un domeniu fix, ceea ce nseamn c laboratorul este acreditat pentru anumite
materiale/produse testate, metode utilizate i teste efectuate (el et al., 2008). n cazul
domeniului de acreditare fix, modificarea listei metodelor acreditate nu poate fi fcut
dect odat cu evaluarea de ctre organismul de acreditare (Leclercq, 2002, i EA-
Eurloab-Eurachem Permanent Liaison Group, 2001, n el et al., 2008). n acest caz,
domeniul acreditrii reflect situaia n momentul efecturii ultimei evaluri. Acreditarea
unui domeniu fix este potrivit laboratoarelor care desfoar o activitate de rutin,
utiliznd metode standard (el et al., 2008).
n ultimii ani s-a fcut tot mai des simit oportunitatea domeniilor de acreditare
flexibile (Holmgren 2006, i Leclercq, 2002, n el et al., 2008). Un astfel de domeniu ar
permite laboratorului ce a demonstrat c posed o competen tehnic corespunztoare s
introduc metode noi sau s le modifice pe cele deja acreditate fr a parcurge o nou
etap de evaluare (Steffen, 2002, i EA- Eurloab-Eurachem Permanent Liaison Group,
2001, n el et al., 2008).
Necesitatea introducerii i validrii ct mai rapide a unor metode noi de testare
este determinat de numrul n cretere al evenimentelor de transformare autorizate
precum i de ptrunderea tot mai frecvent a celor neautorizate. Va fi astfel posibil
reacia prompt la schimbrile n acest domeniu, fr ntreruperea schimburilor
comerciale (el et al., 2008). Acreditarea unui domeniu flexibil prezint o serie de
Testarea OMG

151
avantaje i confer laboratoarelor o flexibilitate sporit, dar include i cerine adiionale
referitoare la capabilitile tehnice i cele ale sistemului de management.

2.11.3. Prametri validrii
2.11.3. Validation parameters

Parametri de performan ai metodelor de testare OMG, care stau la baza
procesului de validare sunt (ENGL, 2008; el et al., 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN
ISO 24276:2006; el et al., 2006; Germini et al., 2004; SR ISO 5725-1:1997):
- aplicabilitatea (applicability/fitness for purpose);
- practicabilitatea (practicability);
- specificitatea/selectivitatea (specificity/selectivity);
- sensibilitatea (sensibility);
- robusteea (robustness);
- limita de detecie (limit of detection/LOD);
- limita de cuantificare (limit of quantification/LOQ);
- nivelul critic (critical level/LC);
- exactitatea (accuracy);
- justeea (trueness);
- raza dinamic (dymic range);
- repetabilitatea (repetability), sau precizia intradeterminare (ntre probe
diferite analizate n paralel);
- reproductibilitatea (reproducibility), sau precizia interdeterminri;
- incertitudinea de msurare (measurement uncertainty/MU).
Aplicabilitatea se refer la scopul n care este utilizat metoda i presupune
identificarea matricei, analitului, concentraiilor i a tipului de studiu efectuat (ENGL,
2008; Trapmann et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006).
Practicabilitatea reprezint uurina efecturii operaiilor, din punct de vedere al
numrului de probe analizate n unitatea de timp i a costurilor, astfel nct s fie atinse
Testarea OMG

152
criteriile de performan solicitate i s fie ndeplinit scopul specificat (ENGL, 2008; SR
EN ISO 24276:2006).
Specificitatea este proprietatea unei metode de a rspunde n exclusivitate la
caracteristicile analitului investigat (ENGL, 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN ISO
24276:2006).
Sensibilitatea reprezint modificarea rspunsului unei metode analitice, raportat
la modificarea corespunztoare a concentraiei unui standard (calibrator). Proprietatea se
refer la curbele de calibrare, concretizndu-se prin modificarea pantei acestora (SR EN
ISO 24276:2006).
Robusteea reprezint msura capacitii metodei de a nu fi afectat semnificativ
de modificri reduse, deliberate, ale condiiilor experimentale descrise n procedur.
Modificrile variaz n funcie de metod (ENGL, 2008; EMEA, 1995, n Trapmann et
al., 2007). De exemplu, pentru real-time PCR trebuie luai n considerare urmtorii
factori: diferite modele ale thermal cyclerului, concentraiile reactivilor, profilul de timp
i temperatur (ENGL, 2008).
LOD este cantitatea sau concentraia (de obicei exprimat ca numr de copii ale
secvenei int) minim a analitului, care poate fi detectat cu certitudine ntr-o prob
analizat, dar nu neaprat i cuantificat. Aceast proprietate trebuie determinat n
cadrul unui studiu interlaboratoare sau prin alte metode corespunztoare de validare (ex.
validare in-house) (ENGL, 2008; Reiting et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006). La acest
nivel metoda trebuie s permit detectarea analitului n cel puin 95% din cazuri, rata de
apariie a rezultatelor fals negative fiind deci 5% (Trapmann et al., 2007).
LOQ reprezint cea mai redus cantitate sau concentraie (de obicei exprimat ca
numr de copii ale secvenei int) a analitului dintr-o prob test care poate fi determinat
cantitativ, cu un nivel acceptabil de precizie i acuratee (ENGL, 2008; Foti et al., 2006;
SR EN ISO 24276:2006). Acest parametru trebuie determinat n cadrul unui studiu
interlaboratoare sau prin alte metode corespunztoare de validare (ex. validare in-house).
Berdal i Holst-Jensen (2001) fac distincia ntre trei tipuri de limite de detecie i
cuantificare:
- absolute, definite anterior; se determin cu ajutorul diluiilor seriale;
Testarea OMG

153
- relative, i.e. cele mai mici procente de material MG care pot fi detectate,
respectiv cuantificate; limitele relative se determin ca raport ntre limitele
absolute de copii ale secvenei MG int i numrul maxim de copii int
pentru gena de referin, care corespunde cantitii totale de ADN; astfel,
dac avem o limit absolut de 50 copii, ce corespunde unei cantiti de
aproximativ 0,06 ng ADN, limita relativ va fi de 0,03% ntr-o cantitate de
200 ng ADN total; limita de cuantificare poate fi determinat i ca multiplu
al limitei absolute (i.e. rLOQ = 3 rLOD) (Foti et al., 2006);
- practice, i.e., limitele funcionale pentru proba analizat; limitele practice se
bazeaz pe coninutul msurat (estimat) al taxonului i limitele absolute;
sunt calculate prin extrapolare lund n considerare probabilitile
distribuiilor unor cantiti mici de copii ale secvenei; modele de
determinare a limitelor practice sunt prezentate de Waiblinger et al. (2006)
i Berdal i Holst-Jensen (2001).
Trebuie subliniat faptul c limitele absolute depind de metoda de amplificare, n
timp ce limitele relative sunt influneate i de ADN-ul izolat i utilizat ca matri. De
aceea Berdal i Holst-Jensen (2001) sunt de prere c limitele absolute nu prezint nicio
aplicabilitate real, accentul trebuind pus pe cele practice.
LC este cea mai redus valoare msurat care demonstreaz, cu un grad suficient
de ncredere, c analitul este prezent (i.e. concentraia > 0) (Trapmann et al., 2007).
Exactitatea reprezint gradul de concordan ntre un rezultat obinut prin testare i
valoarea de referin acceptat (teoretic) (ISO, 2006, n Trapmann et al., 2007; SR EN
ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Justeea, denumit i exactitate a mediei (ENGL, 2008; ISO/FDIS, 2006, n
Trapmann et al., 2007; SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997), reprezint gradul
de concordan ntre valoarea medie a unei serii de rezultate obinute prin testare i
valoarea de referin acceptat (teoretic). Msura justeei este exprimat de eroarea de
justee, denumit i bias (ENGL, 2008; Trapmann et al., 2007; SR EN ISO
24276:2006), parametru care reprezint diferena ntre media rezultatelor i valoarea de
referin acceptat (NMKL, 1997, n Trapmann et al., 2007; SR ISO 5725-1:1997) i se
determin cu formula:
Testarea OMG

154

Raza dinamic reprezint intervalul de concentraii de-a lungul cruia rezultatele
sunt liniare i cu un nivel acceptabil de exactitate i precizie (ENGL, 2008; Trapmann et
al., 2007).
Precizia (fidelitatea) reprezint gradul de concordan ntre rezultate independente
obinute n condiii date. Acest parametru este calculat de obicei ca abatere standard a
rezultatelor testrii. O precizie mai sczut este reflectat printr-o abatere standard mai
mare (SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Repetabilitatea reprezint precizia n condiii de repetabilitate. Condiiile de
repetabilitate presupun obinerea unor rezultate independente n urma analizei unor probe
test identice, utiliznd aceeai metod, n acelai laborator, cu acelai echipament, de
ctre acelai operator i ntr-un interval scurt de timp (SR EN ISO 24276:2006; SR ISO
5725-1:1997). Germini et al. (2004) au determinat acest paramentru ca raport ntre
numrul de rezultate corecte obinute i numrul total de analize efectuate n condiii de
repetabilitate.
Abaterea standard a repetabilitii (repeatability standard deviation/RSD
r
)
reprezint abaterea standard a rezultatelor obinute n condiii de repetabilitate. Aceasta
este o msur a dispersiei distribuiei rezultatelor n condiii de repetabilitate. Tot n acest
scop pot fi utilizai termenii varian a repetabilitii i coeficient de variaie a
repetabilitii (ENGL, 2008; ISO/FDIS, 2006, n Trapmann et al., 2007; SR EN ISO
24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Limita de repetabilitate (r) este valoarea sub care este situat, cu o probabilitate de
95%, diferena absolut dintre dou rezultate obinute n condiii de repetabilitate (SR
ISO 5725-1:1997).
Reproductibilitatea reprezint precizia n condiii de reproductibilitate. Condiiile
de reproductibilitate presupun obinerea rezultatelor n urma analizei unor probe test
identice, utiliznd aceeai metod n laboratoare diferite, cu echipamente diferite sau de
ctre operatori diferii (SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997). Germini et al.

100
.
. .
-

=
teoretic val
calculat medie val teoretic val
biasul (14)
Testarea OMG

155
(2004) au determinat reproductibilitatea ca raport ntre numrul de rezultate corecte
obinute i numrul total de analize efectuate n condiii de reproductibilitate.
Abaterea standard a reproductibilitii (reproducibility standard deviaition/RSD
R
)
reprezint abaterea standard a rezultatelor obinute n condiii de reproductibilitate.
Aceasta este o msur a dispersiei distribuiei rezultatelor n condiii de reproductibilitate.
Tot n acest scop pot fi utilizai termenii varian a reproductibilitii i coeficient de
variaie a reproductibilitii (ENGL, 2008; ISO/FDIS 3534-1, 2006, n Trapmann et al.,
2007; SR EN ISO 24276:2006; SR ISO 5725-1:1997).
Limita de reproductibilitate (R) este valoarea sub care este situat, cu o
probabilitate de 95%, diferena absolut dintre dou rezultate obinute n condiii de
reproductibilitate (SR ISO 5725-1:1997).
Incertitudinea de msurare este un parametru asociat rezultatului unei msurtori,
care caracterizeaz dispersia valorilor atribuite analitului (SR EN ISO 24276:2006).



Fig. 48. Precizia i exactitatea msurtorilor.
Fig. 48. Precision and accuracy of measurements.


Dintre elementele menionate anterior, precizia i exactitatea (justeea, n cazul n
care avem de-a face cu serii de msurtori) sunt cele mai importante pentru descrierea
performanelor unei metode. n vorbirea curent cei doi termeni sunt utilizai, n general,
ca sinonime, nefiind fcut nicio distincie ntre ei (Wikipedia, 2009a). Din punct de
vedere tiinific ns, precizia i exactitatea reprezint dou concepte diferite, un sistem
Testarea OMG

156
de msurare (i.e. metoda cantitativ) putnd fi exact dar imprecis, precis dar inexact,
inexact i imprecis, sau exact i precis (Figura 48). Doar n ultimul caz sistemul este
considerat valid (Wikipedia, 2009a).
De asemnea, menionm c exactitatea implic combinarea componentelor
aleatorii ale erorii, reprezentate de precizie, cu cele sistematice, reprezentate de justee
(ISO, 1993, n Burns et al., 2006; Huang i Pan, 2005; SR ISO 5725-1:1997). Cu alte
cuvinte, precizia depinde doar de distribuia erorilor aleatorii (Burns et al., 2006), n timp
ce eroarea de justee (biasul) corespunde erorilor sistematice (SR ISO 5725-1:1997). n
relaie cu cele menionate anterior se subliniaz i necesitatea de a face distincie ntre
incertitudinea de msurare i erori (ISO, 1995, n Trapmann et al., 2007).
ENGL a definit anumite criterii de acceptare pentru parametri de validare a
metodelor (ENGL, 2008; Mazzara et al., 2008):
- aplicabilitatea enunul trebuie s cuprind informaii despre scopul
metodei i date despre ceilali indici de performan, precum i avertizri
asupra limitelor metodei;
- practicabilitatea n general, metoda trebuie s fie uor de utilizat i
similar altor metode ca i grad de dificultate, fr a necesita tipuri noi de
aparate i resurse;
- specificitatea metoda trebuie s rspund exclusiv la caracteristicile
analitului/msurandului (i.e. secvena int) pentru care a fost creat;
specificitatea teoretic a primerilor este testat prin comparri cu diverse
baze de date (ex GenBank); trebuie de asemenea prezentate rezultate
obinute n urma testrilor unor probe care nu conin secvena int;
- LOD trebuie s fie sub 1/20 din concentraia int; aceast concentraie int
este reprezentat de pragul relevant pentru cerinele legislative, adic 0,9%,
caz n care LOD-ul trebuie s fie < 0,045%; n cel puin 95% din cazuri;
metodele cantitative trebuie s detecteze prezena analitului la nivelul LOD,
asigurnd 5% rezultate fals negative; considerente referitoare la acest
parametru sunt incluse i n SR EN ISO 24276:2006;
- LOQ trebuie s fie sub 1/10 din valoarea concentraei int; aceast
concentraie int este reprezentat de pragul relevant pentru cerinele
Testarea OMG

157
legislative, adic 0,9%, caz n care LOD-ul trebuie s fie < 0,09%;
considerente referitoare la acest parametru sunt incluse i n SR EN ISO
24276:2006;
- robusteea modificarea rezultatului determinat de micile schimbri
intenionate nu trebuie s depeasc 30%;
- exactitatea nu trebuie s depeasc 25% din valoarea de referin;
- justeea valoarea biasului nu trebuie s depeasc 25% de-a lungul
ntregii raze dinamice;
- raza dinamic trebuie s includ concetraii de zece ori mai mici, respectiv
cel puin de cinci ori mai mari dect concentraia int; aceasta este
reprezentat de pragul relevant pentru cerinele legislative, adic 0,9%, raza
dinamic trebuind s corespund n acest caz intervalului 0,09-4,5%;
- RSD
r
calculat trebuie s fie 25% de-a lungul ntregii raze dinamice; n
cazul datelor incluse n dosarul de autorizare trimis de aplicant, estimarea
repetabilitii tebuie s se bazeze pe un numr suficient de rezultate, cel
puin 15, conform SR ISO 5725-3:1997; acelai numr de msurtori este
considerat necesar i pentru procesele de validare;
- RSD
R
calculat trebuie s fie < 35% de-a lungul ntregii raze dinamice; n
cazul concentraiilor < 0,2% valoarea poate fi ns < 50%.
Dup cum s-a menionat ntr-unul dintre subcapitolele anterioare, amploarea
procedurii de validare depinde de entitatea care o efectueaz i de tipul metodei (vezi el
et al., 2008).

2.11.4. Incertitudinea de msurare
2.11.4. Measurement uncertainty

2.11.4.1. Considente generale
2.11.4.1. General considerations

Incertitudinea de msurare (IM) este parametrul cel mai util pentru descrierea
calitii unei msurtori (Trapmann et al., 2007) deoarece furnizeaz dovezi referitoare la
Testarea OMG

158
aplicabilitatea metodei, iar procedura de estimare a acesteia permite identificarea
factorilor care contribuie la variaia rezultatelor (Burns i Valdivia, 2007). IM este
definit ca parametrul asociat rezultatului unei msurtori, care caracterizeaz dispersia
valorilor ce pot fi rezonabil atribuite msurandului (i.e. concentraia materialului MG)
(ISO, 1993, n Trapmann et al., 2007). Parametrul este reprezentat de obicei de o abatere
standard (sau un multiplu al acesteia), sau de un interval de ncredere cruia i este
asociat o anumit probabilitate (Trapmann et al., 2007).
Trebuie reinut c IM este ntotdeauna asociat procesului analitic, indiferent dac
este sau nu inclus n raportul de analiz. Mai mult, doar n cazul n care valoarea
incertitudinii extinse a fost estimat i este specificat, rezultatul raportat poate fi utilizat
n practic fr nicio ndoial (Trapmann et al., 2007). Astfel, n cazul testrii OMG
cantitative, IM trebuie sczut din rezultatul msurtorii, iar valoarea rezultat va fi cea
folosit pentru evaluarea conformitii cu legislaia n vigoare.
Oportunitatea i obligativitatea efecturii testrilor OMG de ctre laboratoare
acreditate au fost discutate ntr-unul dintre subcapitolele precedente. S-a menionat de
asemnea c procesul de acreditare a laboratoarelor de testare se desfoar de obicei n
conformitate cu ISO/CEI 17025, iar una dintre prevederile acestui document o constituie
implementarea unei proceduri de estimare a IM. n cazul n care metodologia de testare
nu permite un calcul riguros al IM laboratorul trebuie cel puin s ncerce s identifice
toate componentele de incertitudine i s fac o estimare rezonabil (SR EN ISO/CEI
17025:2005). Astfel, laboratoarele de testare care i desfoar activitatea n contextul
legislaiei europene privitoare la OMG-uri, vor raporta IM mpreun cu rezultatul
analizei, ceea ce vine n ntmpinarea necesitilor prezentate n paragraful de mai sus.
Cu toate c importana estimrii incertitudinii asociate testrii OMG este evident,
dup cum reiese i din cele prezentate anterior, cercetrile i aplicaiile n domeniu nu
sunt pe deplin formate: nu exist o strategie clar pentru analiza IM, care s satisfac
toate necesitile, fiind, n general, necesar o abordare de la caz la caz; nu exist de
asemenea criterii universal acceptate pentru designul protocoalelor tiinifice. Lipsa
exemplelor concrete din literatura de specialitate referitoare la estimarea IM asociate
procedurilor analitice de testare OMG subliniaz i mai mult problemele cu care se
confrunt acest domeniu (Burns i Valdivia, 2007). Totui, progrese semnificative au fost
Testarea OMG

159
realizate n ultimii ani n direcia estimrii incertitudinii n acest domeniu, o serie de
documente sau publicaii cu caracter ndrumtor fiind acum disponibile:
- Bellocchi et al. (2008b), ENGL (2008), Leimanis et al. (2008), el et al.
(2008), Acutis et al. (2007), Burns i Valdivia (2007), Hamels et al. (2007),
Trapmann et al. (2007), el et al. (2006), precum i sursele citate n aceste
lucrri;
- SR ISO 5725:1997; SR EN ISO 24276:2006, conine o serie de definiii
relevante pentru acest domeniu; SR EN ISO 21570:2006, conine
numeroase detalii referitoare la diferite studii de colaborare pentru
validarea performanelor;
- Ghidul de exprimare a incertitudinii de msurare, menionat de Trapmann
et al. (2007) i SR EN ISO/CEI 17025:2005;
- site-ul CRL-GMFF care conine o serie de rapoarte ale procedurilor de
validare a unor metode de testare OMG n contextul autorizrii plasrii pe
piaa UE a unor evenimente de transformare.
n contextul testrii OMG, estimarea IM este aplicabil determinrii cantitative a
concentraiei materialului genetic derivat din evenimentele de transformare autorizate. Se
dorete implementarea acestui concept i n cazul determinrilor calitative care confirm
prezena/absena evenimentelor de transformare autorizate sau neautorizate, cercetrile n
aceast direcie fiind ns ntr-o faz de nceput (IUPAC, 2005, n Trapmann et al., 2007).

2.11.4.2. Factorii care contribuie la incertitudinea de msurare
2.11.4.2. Factors contributing to the measurement uncertainty

IM apare datorit unor factori a cror inciden nu poate fi (ntotdeauna) evitat.
Utilizarea procedurilor de lucru validate corespunztor i implementarea msurilor de
asigurare a calitii vor permite ns obinerea unor rezultate cu un nalt grad de
repetabilitate, iar bugetul de incertitudine va fi redus. Un design experimental adecvat
contribuie de asemenea la reducerea IM i faciliteaz estimarea corect a acesteia (Burns
i Valdivia, 2007).
Testarea OMG

160
Burns i Valdivia (2007) au analizat elementele care contribuie la IM n cazul
testrii OMG, procedura analitic integrat fiind mprit n urmtoarele etape:
eantionarea, extracia ADN-ului, cuantificarea i (eventual) ajustarea diluiei extractului,
setarea reaciei de amplificare, desfurarea experimentului de amplificare, analiza
datelor realizat de software i operator, interpretarea rezultatelor. n continuare sunt
prezentate cteva considerente referitoare la aceste elemente, influena lor asupra
procesului analitic fiind ns abordat i n alte subcapitole ale prezentei lucrri.

Eantionarea

Etapa de eantionare are rolul de a asigura reprezentativitatea probei de laborator
pentru lotul iniial i datorit specificului su poate constitui o important surs de
incertitudine (Holst-Jensen i Berdal, 2004, n Cankar et al., 2006). De aceea, obinerea
probei de laborator reprezint o problem cheie (Wiseman, 2002, n Burns i Valdivia,
2007; Trapmann i Emons, 2005), iar n cazul n care nu se poate demonstra
reprezentativitatea eantionului este just s considerm adevrat ipoteza anterioar
(Trapmann et al., 2007). Trebuie ns menionat c efectul eantionrii intervine doar n
momentul extrapolrii rezultatelor obinute la nivelul ntregului lot. De asemenea, acest
element nu este luat n considerare la estimarea IM n cadrul procesului de validare.

Extractul de ADN

Procedura de izolare a ADN-ului poate influena substanial cuantificarea prin:
capacitatea de a nltura inhibitorii, rata de recuperare a ADN-ului, nivelul de degradare
al acestuia (Cankar et al., 2006; Corbisier et al., 2005; Peano et al., 2004, n Corbisier et
al., 2005). De aceeea, strategia ideal ar fi adaptarea metodei de extracie pentru fiecare
matrice testat. Definirea unei matrici alimentare reprezint ns un exerciiu extrem de
dificil, n principal datorit variabilitii ce apare n cadrul fiecrei categorii de matrici.
Seminele, cea mai simpl categorie, pot diferi sub aspectul umiditii, coninutului de
amidon etc. n cazul matricilor alimentare procesate situaia este mult mai complex
datorit faptului c acelai produs (ex. lapte soia sau texturate proteice) poate varia
Testarea OMG

161
semnificativ n funcie de productor. Este astfel imposibil optimizarea procedurilor
pentru fiecare matrice n parte (Cankar et al., 2006; Corbisier et al., 2005).
n acest context, factorii de interes sunt cantitatea de ADN amplificabil i
inhibitorii PCR, n continuare fiind discutat modul n care acetia pot afecta eficienele de
amplificare.
Contribuia metodei de extracie la sporirea IM a fost demonstrat de mai multe
studii (ex. Corbisier et al., 2005, Yoshimura et al., 2005b, sau Berdal i Holst-Jensen,
2001), concentraia ADN-ului MG fiind de obicei supraestimat. Valorile cele mai mari
ale erorii de justee au fost nregistrate n cazul matricilor intens procesate, ceea ce
sugereaz c proprietile matricei joac de asemenea un rol important la formarea IM,
prin influena pe care o au asupra caracteristicilor analitului. Astfel, metoda de extracie
poate influena semnificativ cantitatea total de ADN recuperat. Teoretic, acest parametru
are doar un aport redus la bugetul de incertitudine deoarece estimarea concentraiei OMG
se bazeaz pe o cuantificare relativ (Smith i Maxwell, 2005, n Burns i Valdivia,
2007). Pe de alt parte, tocmai aceast abordare poate determina apariia unor diferene
de performan (i.e. eficiena de amplificare) ntre cele dou sisteme de cuantificare, care
vor determina abaterea de la raportul real. Altfel spus, cu ct ratele de amplificare ale
celor dou sisteme sunt mai asemntoare, cu att precizia determinrii crete. De
asemenea, eficienele trebuie s fie asemntoare i ntre probele diferite din cadrul unui
sistem de amplificare (i.e. probele necunoscute i calibratori). Contribuia eficienei de
amplificare la IM depinde i de designul experimental i metoda de calcul. Considerente
referitoare la aceast problem sunt prezentate i alte n subcapitole ale prezentei lucrrii
(ex. 2.9.6 sau 2.9.7).
Modificarea raportului real dintre cele dou secvene de interes s-ar putea datora
apariiei unor deosebiri cu caracter aleator n ceea ce privete degradarea i
extractibilitatea acestora (Japanese Agricultural Standard, 2001, n Moriuchi et al., 2007;
Corbisier et al., 2005). Incidena celor dou fenomene nu poate fi ignorat, dar evaluarea
lor este foarte dificil, sau chiar imposibil.
Prezena inhibitorilor afecteaz cu siguran eficiena reaciei PCR, dar n acest
caz nu vor exista diferene ntre cele dou sisteme de amplificare. Astfel, IM aferent
Testarea OMG

162
acestui factor va fi influenat doar de compoziia matricei iniiale i de capacitatea
metodei de extracie de a elimina compuii nedorii.
Mrimea ampliconilor este un alt parametru ce poate constitui o cauz pentru
estimarea eronat a coninutului MG, existnd posibilitatea apariiei unor diferene ntre
ratele de amplificare ale celor dou secvene de interes (Corbisier et al., 2005). Tinnd
ns cont de indicaiile din literatura de specialitate, impactul va fi neglijabil.
n principiu, cantitatea de ADN recuperat nu reprezint un factor limitativ dect
din perspectiva limitelor de detecie i cuantificare. Totui, s-a demonstrat c n cazul
concentraiilor reduse de ADN int, variaia ntre repetiii este mai mare dect n cazul
concentraiilor ridicate (Cankar et al., 2006; Rnning et al.,2003, i Shindo et al., 2002,
n Huang i Pan, 2005). Prin urmare este just s considerm c i IM crete n cazul unui
numr redus de copii ale moleculei int (Peccoud i Jacob, 1996, n Berdal i Holst-
Jensen, 2001). Aceste neajunsuri sunt datorate probabil efectelor stocastice ce intervin n
operaiunile de pipetare (diluare, setarea reaciilor) a soluiilor de ADN (Cankar et al.
2006).
Engel et al. (2006) au concluzionat c prezena n prob a particulelor cu
granulaie diferit reprezint de asemenea o surs de eroare pentru rezultatul determinrii
cantitative, mai ales n cazul n care materialul transgenic este prezent doar ntr-una dintre
fraciuni.
Surse adiionale de incertitudine n cadrul extraciei pot fi constituite i de unele
echipamente utilizate (ex. pipete sau balane), de aceea este recomadat
calibrarea/etalonarea regulat.
Etapa de cuantificare a extractului reprezint de asemenea o surs de incertitudine,
ns contribuie relativ puin la bugetul total deoarece metodologia de analiz i prelucrare
a datelor include o normalizare intern. Cu toate acestea, omogenizarea probei nainte de
cuantificare, curarea corespunztoare i calibrarea spectrofotometrului i a pipetelor,
precum i utilizarea unor vrfuri de pipet corespunztoare (i.e. prevzute cu barier de
protecie mpotriva aerosolilor) contribuie la sporirea ncrederii n corectitudinea
operaiilor efectuate. Trebuie avut n vedere c repetarea msurtorilor mrete precizia
rezultatelor finale.

Testarea OMG

163
Reacia de amplificare

Setarea reaciei se face ntr-o hot dotat cu lumin UV pentru decontaminare. Ca
i n etapele precedente, folosirea vrfurilor de pipet speciale este binevenit.
Exist numeroase surse de incertitudine asociate etapei analitice propriu-zise, cum
ar fi de exemplu secvenele int utilizate (Hbner et al., 2001, n Burns i Valdivia,
2007). ntr-un articol publicat recent (vezi Morisset et al., 2009) se atrage atenia asupra
acestei noi provocri ce poate afecta eficacitatea metodelor de testare OMG. Studiul a
avut ca scop compararea a dou metode real-time PCR bazate pe principiul TaqMan, care
utilizeaz ca int regiuni diferite ale promotorului 35S. n cazul unui MRC pentru
evenimentul de transformare TC1507 (porumb) aceaste metode s-au deosebit
semnificativ n ceea ce privete sensibilitatea. Investigaiile ulterioare au artat c
performana diferit a celor dou metode se datoreaz prezenei unui SNP (accesiunea
FJ605509, Genbank) n regiunea utilizat ca int de metoda cu sensibilitate mai redus.
SNP-ul nu a fost ntlnit n nicio alt secven disponibil pentru porumbul TC1705 (ex.
patente sau dosarul pentru obinerea autorizaiei de comercializare) sau pentru alte
evenimente de transformare care conin promotorul P-35S. Este evident c ntr-o astfel de
situaie eficiena deteciei unor niveluri reduse de material transgenic este afectat
considerabil. O posibil explicaie a discrepanei dintre datele oficiale, incluse de ctre
aplicant n dosarul de autorizare i secvena identificat de Morisset et al. (2009) este
urmtoarea: mutaia a survenit la ncruciarea elitei transgenice TC1705 cu liniile
nemodificate genetic, iar verificarea insertului a fost fcut doar naintea procesului de
obinetre a hibrizilor comerciali. Alte dou situaii similare au fost raportate n cazul unor
varieti comerciale de porumb MON810 (Aguilera et al., 2009, i Aguilera et al., 2008,
n Morisset et al., 2009).
Sistemul de amplificare i platforma real-time PCR constituie de asemenea surse
de incertitudine, putnd avea un aport mai mare dect refacerea experimentului n
condiii de reproductibilitate (ex. zile diferite) (Donald et al., 2005, n Burns i Valdivia,
2007). Aceste aspecte sunt importante mai ales n cazul studiilor de comparare
interlaboratoare. Totui, urmarea strict a instruciunilor de utilizare, a protocoalelor
validate sau a procedurilor operaionale va asigura reducerea IM.
Testarea OMG

164
Prelucrarea datelor

Valoarile C
T
determinate sunt influenate semnificativ de software-ul utilizat i
constituie unul dintre aspectele asupra cruia laboratorul nu are niciun control. Software-
ul utilizat depinde de platforma pe care se desfoar experimentele. n aceast situaie
trebuie de asemenea avut n vedere c un nivel ridicat de replicare a rezultatelor (prin
intermediul probelor, zilelor, analizelor etc.) contribuie la sporirea gradului de ncredere
n reprezentativitatea valorii medii calculate.
Operatorul poate contribui de asemenea la IM, n momentul n care realizeaz
anumite setri ale software-ului, precum i n etapa de prelucrare a datelor. Atenia i
verificarea operaiilor efectuate pot ns elimina aceast surs de erori.
Modelele matematice utilizate pentru prelucrarea datelor au fcut obiectul multor
studii, neexistnd ns pn n prezent un consens n ceea ce privete aplicarea acestora.
De exemplu, Burns et al. (2004) au comparat dou tipuri de regresie (liniar, respectiv
pondearat) i dou tipuri de medii (aritmetic, respectiv geometric). S-a concluzionat
c diferenele ntre cele dou tipuri de regresie pot fi semnificative, depinznd ns foarte
mult de distribuia valorilor prelucrate. De asemenea, utilizarea mediei geometrice este
mai potrivit datorit naturii experimentelor real-time PCR, precum i faptului c are, n
general, un grad mai mare de reprezentativitate pentru majoritarea rezultatelor deoarece
reducere efectul extremelor. Aceast caracteristic a fost inclus, de exemplu, n
algoritmul de calcul al software-ului Rotor-Gene 6.1.
Componetele ecuaiei de regresie, respectiv panta, M, i intersecia, B, depind de
calitatea curbei de calibrare care este influenat la rndul ei de precizia i justeea
calibratorilor. De aceea, MRC-urile caracterizate corespunztor i care ndeplinesc toate
condiiile calitative referitoare la exactitate i IM, reprezint standardele cele mai
potrivite pentru a fi utilizate pe post de calibratori (Trapmann et al., 2002, n Burns i
Valdivia, 2007). n ceea ce privete MRC-urile, se poate conchide c valoarea teoretic
utilizat de obicei pentru calibrare (cazul MRC-urilor pe baz de ADNg) se bazez pe un
raport de mase i nu pe unul de echivaleni genomici (Berdal i Holst-Jensen, 2001), iar
dac se utilizeaz o valoare ce exprim un raport de copii ale secvenelor int (cazul
Testarea OMG

165
MRC-urilor pe baz de ADNp), similitudinea (din punct de vedere al proprietilor
maricei) dintre calibrator i proba necunoscut este mai redus.

2.11.4.3. Estimarea incertitudinii de msurare
2.11.4.3. Estimation of measurement uncertainty

Este preferabil ca estimarea IM s se fac pe baza datelor furnizate de studiile de
comparare interlaboratoare i doar n cazul n care acestea nu sunt disponibile s se
foloseasc rezultate obinute n cadrul unui singur laborator, ca parte a procesului de
validare sau a celui de control intern al calitii (Trapmann et al., 2007). n cazul validrii
interne, laboratorul care implementeaz metoda trebuie doar s demonstreze c poate
obine performanele atribuite acesteia, datele obinute fiind ulterior coroborate cu cele
deja existente.
Odat estimat, IM poate fi aplicat oricror msurtori obinute cu aceeai
metod, n cadrul aceluiai laborator i n aceleai condiii (Trapmann et al., 2007).
Metodologia de estimare depinde foarte mult de caracteristicile analizei. Liniile
directoare generale au fost stabilite de organizaii sau instituii internaionale ca ISO,
Eurachem, JRC sau Codex Alimentarius (vezi Trapmann et al., 2007). n ceea ce privete
domeniul de aplicare al acestei lucrri, chiar dac conceptul de cuantificare a coninutului
de material MG este destul de bine conturat, existena unui numr mare de platforme,
sisteme de cuantificare i evenimente de transformare, precum i lipsa MRC-urilor
adecvate i a standardizrii modului de analiz, prelucrare i utilizare a datelor
ngreuneaz estimarea IM (Burns et al., 2005, n Burns i Valdivia, 2007). n acest
context, raportul publicat de Trapmann et al. (2007) ncearc s pun bazele unei
abordri unice a acestor problematici, idee susinut i de ali autori (ex. Morisset et al.,
2008, sau el et al., 2008).
Metodologia de estimare a IM pesupune calcularea mai multor parametri:
incertitudinea standard (standard uncertainty/u sau u
i
) care poate fi absolut (u
0
) i
relativ (RSU), incertitudinea standard compus (combined standard uncertainty/u
c
),
incertitudinea de msurare extins (expanded measurement uncertainty/U). O serie de
Testarea OMG

166
considerente teoretice referitoare la aceste elemente sunt prezentate de Trapmann et al.
(2007) i NIST (2000).
Dup cum s-a artat n subcapitolul anterior, incertitudinea de msurare (aferent
unui rezultat obinut prin msurare) se datoreaz unor factori ce intervin n procesul
analitic, fiecruia dintre acetia fiindu-i atribuit o parte din bugetul de incertitudine,
denumit component de incertitudine (Trapmann et al., 2007). Este de aceea oportun
mprirea/divizarea procedurii de lucru n procese ct mai simple i calcularea IM
separat pentru fiecare dintre acestea, urmnd apoi combinarea componentelor sub forma
incertitudinii combinate (ISO, 1995, n Trapmann et al., 2007). Indiferent de modul de
estimare, fiecare dintre componente este reprezentat de o abatere standard i este
denumit incertitudine standard, iar folosirea i combinarea acestor componente ale
varianei se face n conformitate cu anumite reguli bine stabilite (Burns i Valdivia, 2007;
ISO, 1995, n Trapmann et al., 2007; NIST, 2000). O parte din componentele de
incertitudine pot fi evaluate pe baza distribuiei statistice a rezultatelor unei serii de
msurtori (evaluarea de tip A), fiind exprimate sub forma abaterilor standard
experimentale. Evaluarea celorlalte componente care pot fi de asemenea exprimate ca
abateri standard (sau aproximri ale abaterilor standard corespunztoare) este bazat pe
diverse tipuri de informaii apriorice (evaluarea de tip B) (Trapmann et al., 2007; NIST,
2000).
De exemplu, n cazul cuantificrii coninutului de material MG, incertitudinea
asociat metodei de cuantificare (u
met
) este consecina contribuiei incertitudinii
materialului de referin i a modului de lucru. Astfel, se vor lua n considerare
urmtoarele componente: incertitudinea asociat materialului de referin (u
ref
) i
incertitudinea asociat protocolului de lucru (u
prot
). Incertitudinea asociat MR-ului se
obine din certificatul acestuia, mprind incertitudinea extins (U
ref
) menionat, la
factorul de acoperire k (de obicei 2, corespunznd unei probabiliti de 95%). Aceasta
este o estimare de tip B. La estimarea incertitudinii asociate protocolului de lucru se
poate lua n considerare doar componenta aferent reproductibilitii. Evaluarea aplicat
n aceast situaie este de tip A, determinarea incertitudinii asociate reproductibilitii
protocolului (u
prot
) fiind fcut pe baza a x
i
(i = 1n) valori obinute n n msurri
efectuate. Se consider c pentru n 10 incertitudinea asociat erorilor de
Testarea OMG

167
reproductibilitate are la baz o distribuie normal, fiind calculat cu ajutorul urmtoarei
ecuaii (Gherasimov, 2009; Trapmann et al., 2007):

=
|
|
.
|

\
|

-
-
=
n
i
i
prot
x
x x
n n
u
1
2
) 1 (
1
(15)

Incertitudinea standard asociat rezultatelor testrii se va calcula apoi conform
ecuaiei (Gherasimov, 2009; Trapmann et al., 2007):

2 2
prot ref met
u u u + = (16)

n final, incertitudinea relativ extins se determin astfel (Gherasimov, 2009;
Trapmann et al., 2007):

k u U
met met
- =
(17)

Procedura general de estimare a IM implic deci identificarea surselor de
variabilitate i verificarea i combinarea celor majore. Alternativa este reprezentat de
folosirea datelor/informaiilor furnizate de studiul interlaboratoare i/sau validarea in-
house i/sau controlul intern de calitate pentru estimarea relaiei dintre concentraia
probei (c) i incertitudinea standard (u) i calcularea nivelului critic (LC) i a limitelor de
detecie (LOD) i cuantificare (LOQ) utiliznd u (Trapmann et al., 2007). n cea de-a
doua situaie se poate utiliza reproductibilitatea determinat n cadrul laboratorului, dac
se demonstreaz c nu exist bias. n cazul n care acesta exist, va trebui eliminat. Se
garanteaz astfel c rezultatul i incertitudinea acestuia includ valoarea adevrat a
concentraiei materialului MG dintr-o prob. Reproductibilitatea se determin prin
repetarea analizei unor probe reale, iar controlul biasului se face cu ajutorul MRC-urilor
(Magnusson et al., 2004, i NMKL, 1997, n Trapmann et al., 2007). n cazul metodelor
noi, pentru care nu exist date rezultate n urma efecturii controlului intern al calitii, se
va folosi doar validarea in-house (Magnusson et al., 2004, n Trapmann et al., 2007).
Testarea OMG

168
Este important ca estimarea IM s acopere toate etapele procedurii analitice, de
aceea determinarea reproductibilitii n cadrul laboratorului presupune repetarea
independent a analizei probelor n condiii care s reprezinte variaia pe termen lung a
componentelor sistemului analitic. Setul de probe analizate n experiment trebuie s
includ tipurile de matrici i concentraiile n cazul crora va fi aplicat valoarea
incertitudinii de msurare. Trebuie incluse n mod obligatoriu i probe al cror coninut
OMG este apropiat de pragurile limit pentru care se fac determinrile, i.e. pragul de
0,9%, prevzut de legislaia european.
Un exemplu detaliat de calculare a IM utiliznd datele obinute n cadul
controlului intern al calitii este prezentat de Trapmann et al. (2007).

2.11.5. Strategii de evaluare in-house a performanelor unei metode analitice
2.11.5. Strategiile for in-house evaluation of analytical method performance

Argumentele referitoare la necesitatea validrii metodelor n cadrul laboratorului
i amploarea acestui porces (i.e. parametri de performan ce trebuie testai) au fost deja
prezentate. n continuare vor fi prezentate cteva metodologii concrete de validare n
scopul acreditrii sau doar n vederea evalurii rezultatelor obinute n cadrul activitii de
cercetare.

2.11.5.1. Strategia utilizat de CRL-GMFF
2.11.5.1. The CRL-GMFF strategy

Indiferent de strategia utilizat, primul pas corespunde redactrii unei variante
iniiale a procedurii operaionale standard (standard operational procedure/SOP).
Urmeaz apoi redactarea planului de validare care include parametri ce vor fi verificai,
personalul executant i orice alte informaii necesare. Un astfel de exemplu este prezentat
de el et al. (2008).
Disponibilitatea unor MRC-uri corespunztoare este o condiie indispensabil
pentru efectuarea validrii.
Testarea OMG

169
Procedura recomandat de CRL-GMFF pentru verificarea performanelor
metodelor ce au fost deja validate printr-un studiu interlaboratoare este prezentat n
continuare, dup el et al. (2008).
Avnd n vedere considerentele referitoare la caracteristicile extractului, unul
dintre parametri care trebuie evaluai este robusteea. Se vor testa master mixuri cu
diferite concentraii ale ADN-ului int, primerilor i sondelor, trebuind demonstrat faptul
c performana metodei nu variaz semnificativ.
Limitele de cuantificare i detecie, precum i raza de cuantificare se determin cu
ajutorul unor diluii seriale ale soluiei de ADN, de la un numr mare de copii ale
secvenei int pn la unul foarte redus (< 1).
Este ideal ca justeea (sau exactitatea) s fie determinat prin participarea la
programe specifice de testare a competenelor. Dac acestea nu sunt disponibile, justeea
va fi evaluat cu ajutorul MRC-urilor.
O importan deosebit trebuie acordat de asemenea preciziei de msurare a unor
probe standard (cu concentraii cunoscute) cu niveluri diferite care s acopere ntreaga
raz dinamic. n cazul validrii in-house precizia este exprimat de abaterea standard a
unei serii de rezultate experimentale obinute n condiii de repetabilitate (RSD
r
).
Repetabilitatea este evaluat de ctre un operator ntr-un interval de cel puin dou zile.
Deoarece studiile anterioare de validare au demonstrat c variabilitatea ntre operatori
experimentai este neglijabil comparativ cu variabilitatea repetiiilor aceluiai operator
n zile diferite, se consider c datele obinute de un singur operator pot fi suficiente
pentru evaluarea repetabilitii. Pentru estimarea rezonabil a repetabilitii sunt necesare
minim 15 rezultate pentru un nivel de concentraie OMG (SR ISO 5725-3:1997).
Designul experimental corespunztor tuturor principiilor enunate anterior este prezentat
n Figura 49.
Cele opt analize nu vor putea fi ns efectuate ntr-o singur zi, o soluie practic
fiind repartizarea acestora de-a lungul unei perioade de patru zile. n aceast situaie ne
putem ntreba dac analizele sunt efectuate conform cerinelor ISO (SR EN ISO
24276:2006; SR ISO 5725-1:1997), adic ntr-un interval scurt de timp. Astfel, se
impune o analiz mai detaliat a rezultatelor. Cu alte cuvinte, trebuie s ne asigurm c
nu intervine modificarea condiiilor de mediu i a modului de funcionare a aparatului
Testarea OMG

170
(calibrarea) de-a lungul perioadei n care se desfoar analizele. Condiiile de mediu (ex.
temperatur sau umiditate) trebuie controlate strict n cadrul laboratorului. Pentru a
determina ns dac factorul timp afecteaz determinrile trebuie s efectum o
estimare a preciziei prin analiza varianei (i.e. calculul preciziei intermediare gradul de
concordan ntre rezultate individuale obinute cu aceeai metod, n cazul aceluiai
material i n cadrul aceluiai laborator, schimbnd ns operatorii i/sau echipamentul
i/sau momentul determinrii). Factorul numr de zile este testat pentru a verifica
urmtoarea ipotez de lucru: variabilitatea ntre zile nu este semnificativ. n cazul n care
aceast variabilitate este nesemnificativ, precizia intermediar este nul, iar precizia
metodei corespunde abaterii standard a repetabilitii (RSD
r
). n caz contrar, RSD
r
trebuie
corectat, eliminnd precizia intermediar i lund astfel n considerare doar
variabilitatea asociat metodei de cuantificare. n final, valoarea obinut n urma
validrii in-house este comparat cu cea determinat n cadrul studiului de comparare
interlaboratoare.



Fig. 49. Design experimental utilizat pentru estimarea reproductibilitii unei metode analitice.
Fig. 49. Experimental design used to assess the reproducibility of an analytical method.
Dup el et al. (2008).

Testarea OMG

171
Dac metoda ndeplinete caracteristicile de performan ce i-au fost atribuite
anterior, se poate scrie versiunea final a procedurii operaionale standard, iar metoda
poate fi inclus n domeniul de acreditare.
Un alt element pe care CRL-GMFF pune accentul este reprezentat de evaluarea
prezenei inhibitorilor n extractul ADN. Pentru aceasta se utilizeaz procedura descris
n subcapitolul 2.6.3.
Un model asemntor de validare a metodei n cadrul laboratorului a fost
prezentat de Foti et al. (2006). n acest caz au fost estimate reproductibilitatea
intermediar a valorii C
T
i repetabilitatea metodei, utiliznd MRC-uri produse de
IRMM. Pentru ambii parametri s-au calculat: mediile, medianele, abaterile standard,
abaterile standard relative (preciziile), intervalele de ncredere, coeficienii de variaie
(exprimai procentual). Analizele au fost efectuate ntr-un singur laborator, dar n zile
diferite i de ctre operatori diferii (Figura 50a), ceea ce a fcut necesar evaluarea
preciziei intermediare asociate valorii C
T
, urmnd liniile directoare ale standardului ISO
5725-3:1994(E). Factorii de variaie luai n calcul au fost timpul i operatorul.




(a) (b)
Fig. 50. Design experimental utilizat pentru validarea in-house. (a) Evaluarea reproductibilitii intermediare.
(b) Estimarea repetabilitaii.
Fig. 50. Experimental design used for in-house validation. (a) Assessment of intermediate reproducibility. (b)
Estimation of repetability.
Dup Foti et al. (2006).

Testarea OMG

172
Pentru evaluarea repretabilitii a fost utilizat designul experimental din Figura
50b. Limitele aboslute i relative de detecie i cuantificare au fost determinte utiliznd
diluii seriale ale extractului obinut dintr-un MRC. Metoda a fost utilizat pentru testarea
competenelor i a fost adoptat de JRC (vezi Querci et al., 2004).

2.11.5.2. Alte modele
2.11.5.2. Other approaches

Reiting et al. (2007) au determinat limita de detecie (LOD) i au verificat
repetabilitatea, calculnd abaterea standard relativ a repetabilitii (RSD
r
). A fost
utilizat o serie de diluii ale unui extract obinut dintr-un MRC, care a reprezentat
cantiti diferite de copii ale moleculei int. Pentru fiecare nivel amplificarea a fost
efectuat n ase repetiii.
n cadrul experimentelor desfurate, Cankar et al. (2006) au estimat variabilitatea
intra- i interdeterminri a metodei utilizate pentru determinarea concentraiei ADN-ului
MG. Pentru aceasta s-a analizat o serie de diluii reprezentnd concentraii diferite ale
moleculei int. Autorii au calculat abaterea standard (SD) i coeficientul de variaie (C
V
)
al valorilor C
T
obinute pentru fiecare diluie. Pentru evaluarea variabilitii
intradeterminare diluiile au fost amplificate n triplicat, iar n vederea evaluarii
variabilitii interderminri analiza a fost repetat de zece ori.
Lee et al. (2006) au evaluat exactitatea i precizia sistemului de cuantificare
folosit, determinnd biasul, respectiv abaterea standard relativ (RSD
r
). Validarea in-
house s-a bazat pe analiza a ase amestecuri cu niveluri diferite OMG.
Validarea in-house efectuat de Corbisier et al. (2005) s-a bazat pe determinarea
repetabilitii i a preciziei intermediare, fiind calculat i valoarea IM.
Huang i Pan (2005) au investigat exactitatea metodei de cuantificare utilizate,
estimnd justeea i precizia. Au fost calculate eroarea de justee (biasul) i coeficientul
de variaie (C
V
). Au fost cuantificate cinci niveluri diferite OMG, msurtorile fiind
repetate de cel puin trei ori.
Tani et al. (2005) au comparat dou protocoale de cuantificare prin real-time PCR,
investignd exactitatea (justeea) i precizia acestora. Pentru estimarea exactitii s-a
Testarea OMG

173
determinat eroarea de justee (biasul), iar precizia a fost evaluat pe baza abaterii standard
relative a repetabilitii (RSD
r
). Datele utilizate pentru calcule au fost obinute prin
analiza a cinci MRC-uri cu niveluri diferite de coninut MG, msurtorile fiind efectuate
de trei ori cu fiecare dintre cele dou metode.
Modul de determinare a limitelor de detecie i cuantificare utiliznd diluiile
seriale, este prezentat n detaliu de Berdal i Holst-Jensen (2001).

Testarea OMG

174

CAPITOLUL III. TESTAREA OMG APLICAII PRACTICE
CHAPTER III. GMO TESTING PRACTICAL APPLICATIONS


3.1. ETAPELE ANALITICE ALE METODOLOGIEI DE TESTARE OMG
3.1. ANALYTICAL STEPS OF THE GMO TESTING METHODOLOGY

Specificul activitilor de testare a produselor alimentare impune acreditarea
procedurilor utilizate de ctre laborator, proces care necesit, la rndul su, ndeplinirea
unor cerine speciale. innd cont de exigenele menionate (vezi capitolul anterior), de



Fig. 51. Variante ale metodologiei integrate de testare OMG.
Fig. 51. Flow chart of two integrated GMO tesing procedure variants.
Testarea OMG

175
dotrile avute la dispoziie, precum i de indicaiile din literatura de specialitate,
recomandm utilizarea uneia dintre variantele metodologice prezentate n Figura 51, care
includ toate etapele specifice acestei activiti: eantionarea, pregtirea probelor, extracia
ADN-ului, evealuarea extractelor, analiza calitativ, analiza cantitativ. Aceste etape au
fost implementate i n cazul laboratorului CERT-OMG din cadrul USAMV Cluj-
Napoca. Cele dou variante difer n principal din perspectiva metodologiei utilizate
pentru evaluarea caracteristicilor extractelor de ADN. n continuare vor fi detaliate
fiecare dintre etapele analitice prezentate n Figura 51, cu exemplificare pentru
evenimentul de transformare GTS 40-3-2 (soia Roundup Ready).

3.2. MATERIALUL BIOLOGIC
3.2. BIOLOGICAL MATERIAL

3.2.1. Soia Roundup Ready (evenimentul de transformare GTS 40-3-2)
3.2.1. Roundup Ready soybean (GTS 40-3-2 transformation event)

Alegerea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 pentru exemplificarea
metodelor descrise, s-a fcut pe baza considerentelor prezentate n continuare.
S-a inut cont n primul rnd de faptul c soia transgenic prezint o mare
importan pentru agricultur (vezi subcapitolul 1.1.5). De exemplu, la nivelul anului
2009, soia tolerant la glifosat a fost cultivat pe mai mult de 69 milioane ha, ceea ce
reprezint aproximativ 77% din suprafaa global aferent aceastei specii (James, 2009b).
Un aspect mai important este reprezentat de statutul soiei Roundup Ready la
nivelul UE. Dei cultivarea acesteia n cadrul UE nu a fost niciodat autorizat, importul
i utilizarea n alimentaia oamenilor i a animalelor a fost posibil nc din 1996. n acest
context, soia a fost i este prezent constant pe piaa european. n prezent, autorizaia
pentru comercializare a soiei Roundup Ready este n curs de nnoire i exist o aplicaie
i pentru autorizarea pentru cultivare. De asemenea, i alte evenimente de transformare la
soia (i.e. MON89788, A2704-12) au primit n ultimii ani autorizaie pentru plasare pe
piaa comunitar, niciunul neputnd fi ns i cultivat (GMO Compass, 2009 i 2008a).
Testarea OMG

176
n ceea ce privete ara noastr, timp de peste zece ani, nainte de aderarea la UE,
soia transgenic (i.e. Roundup Ready) a fost a autorizat pentru cultivare i implicit
pentru comercializare. n acest context, dorim s subliniem i posibilitatea existenei
culturilor ilegale, mai ales c prezena acestora a fost semnalat chiar i n perioada n
care cultivarea era legal (Dinu, 2006).
Pe lng cele menionate deja, s-a avut n vedere i faptul c soia Roundup Ready
a constituit obiectul a numeroase studii tiinifice cu aceeai tem a prezentei lucrri.
Evenimentul de transformare la soia (Glycine max) GTS 40-3-2 (identificator unic
MON-432-6), comercializat sub denumirea Roundup Ready (RR), a fost creat de
Monsanto (www.monsanto.com) n scopul utilizrii erbicidelor totale pe baz de glifosat
pentru controlul buruienilor n culturi comerciale. Simplitatea acestui sistem a reprezentat
unul dintre motivele succesului rapid pe care la avut n rndul cultivatorilor (AGBIOS,
2009b). Soia Roundup Ready este cultivat pentru boabe destinate alimentaiei umane (n
special sub form de ulei, fraciuni proteice i fibre) i a animalelor (n special sub form
de rot) (Querci i Mazzara, 2004b).
Glifosatul este o substan cu aciune sistemic i constituie ingredientul activ al
erbicidului RoundUp produs de Monsanto. Acesta se aplic post-emergent, fiind utilizat
n ntreaga lume ca agent neselectiv de control al buruienilor (Querci i Mazzara, 2004b),
n special la culturile de soia i porumb (EPA, 2002, n Deisingh i Badrie, 2005).
Glifosatul inhib 5-enolpiruvishikimat-3-fosfat sintaza (EPSPS) (Lin et al., 2000;
Deisingh i Badrie 2005), enzim larg rspndit n plante, ciuperci i microorganisme.
EPSPS este esenial cii biochimice a shikimatului, substan implicat n producerea
aminoacizilor aromatici fenilalanin, tirozin i triptofan. Inhibarea enzimei EPSPS are
ca rezultat suprimarea creterii i n cele din urm moartea plantei.
GTS 40-3-2 a fost obinut prin introducerea n varietatea comercial A5403
(Asgrow Seed Company) a genei EPSPS, izolat din linia CP4 a speciei Agrobacterium
tumefaciens (Lin et al., 2000). Gena introdus codific o protein EPSPS insensibil, n
general, la aciunea glifosatului, care poate astfel metaboliza aminoacizii aromatici
necesari plantei, chiar i n cazul aplicrii erbicidului Roundup (Deisingh i Badrie, 2005;
Querci i Mazzara, 2004b).
Testarea OMG

177
n GTS 40-3-2, acivitatea genei EPSPS este regulat de promotorul constitutiv
optimizat 35S (P-E35S) provenit de la Cauliflower Mosaic Virus i de terminatorul
sintazei de nopalin (nos) provenit de la Agrobacterium tumefaciens (Lin et al., 2000)
(Figura 52). Secvena CTP4, provenit de la Petunia hybrida, codific o peptid de
tranzit n cloroplaste i a fost clonat la captul 5 al genei de rezisten la glifosat.
Aceast peptid semnal faciliteaz transferul enzimelor sintetizate n cloroplaste, locul
unde are loc biosinteza shikimatului i unde acioneaz glifosatul (Querci i Mazzara,
2004b). Dup transfer, peptida de tranzit este ndeprtat i degradat rapid de o proteaz
specific.



Fig. 52. Reprezentarea schematic a casetei genice introduse n soia Roundup Ready.
Fig. 52. Schematic representation of the Roundup Ready soybean gene cassette.
Dup Padgette et al. (1995) n Querci i Mazzara (2004).


Gena EPSPS este ominprezent n natur i de aceea nu este considerat toxic sau
alergenic. Mai mult, enzima a fost supus analizei comparative cu bazele de date ale
secvenelor de aminoacizi ale polipeptidelor toxice i alergenice, nefiind ns identificat
omologie semnificativ cu niciuna dintre acestea (Querci i Mazzara, 2004b).
Varietatea comercial de soia A5403 a fost transformat prin bombardament cu
particule de aur cptuite cu vectorul plasmidial PV-GMGT04 derivat din E. coli, n care
au fost introduse mai multe construcii genice ce includeau gena EPSPS, pentru rezisten
la glifosat, gena gus, pentru producerea markerului de selecie -glucuronidaza, respectiv
gena nptII, pentru rezisten la kanamicin (Querci i Mazzara, 2004b). Transformantul
iniial a prezentat dou situri de integrare, unul cu markerul de selecie gus iar cellalt cu
gena de toleran la glifosat. Aceste dou situri au segregat independent n generaiile
urmtoare, linia GTS 40-3-2 coninnd n cele din urm un singur insert, n care este
integrat gena de toleran la glifosat (Padgette et al., 1996 i 1995, n Querci i Mazzara,
2004b). Ulterior, s-a demonstrtat c pe lng insertul raportat iniial, evenimentul de
Testarea OMG

178
transformare GTS 40-3-2 conine dou segmente nefuncionale de ADN, cu lungimea de
250 pb, respectiv 72 pb (Windels et al., 2001, n Querci i Mazzara, 2004b; Monsanto,
2000).
Analizele moleculare efectuare de-a lungul a ase generaii, au reafirmat faptul c
inseria este stabil.
Dup introducerea n SUA, n 1994, aprobarea de import n UE a fost dat prin
Decizia Comisiei 98/281/CE din 3 aprilie 1996, n conformitare cu prevederile Directivei
90/220. Aceast decizie permitea importul sub form de semine destinate procesrii n
vederea utilizrii n alimente sau furaje (AGBIOS, 2009b; Querci i Mazzara, 2004b). n
2007 autorizaia pentru comercializare n cadrul UE a expirat, fiind naintat ns o nou
aplicaie pentru autorizare n conformitate cu legislaia intrat n vigoare n 2004. n
prezent, n statele membre UE, inclusiv n ara noastr, comercializarea i utilizarea n
alimentaie a soiei Roundup Ready este legal (Comisia European, 2009; GMO
Compass, 2009), cultivarea fiind ns interzis. Evenimentul GTS 40-3-2 a primit
aprobri pentru cultivare i/sau utilizare n alimentaie i n alte ri ca: Argentina,
Australia, Noua Zeeland, Brazilia, Canada, UE, Japonia, Korea, Mexic, Polonia, Rusia,
Africa de Sud, Elveia, Tailanda, Uruguay i SUA (AGBIOS, 2009b).

3.2.2. Tipuri de probe analizate
3.2.2. Types of samples used for the analyses

Literatura de specialitate (ex. Wikipedia, 2009d, Wikipedia, 2009e, Wikipedia,
2009m, Wikipedia, 2009o, Wikipedia, 2009p, Wikipedia, 2009r, Moriuchi et al., 2007,
Ujheyi et al., 2007, Zhang et al., 2007, Cardarelli et al., 2005, Querci et al., 2005, Van
den Bulcke et al., 2005, Yoshimura et al., 2005b, Querci i Foti, 2004, Rott et al., 2004,
Endres, 2001, Gachet et al., 1999, Vatilingom et al., 1999, sau Berk, 1992) menioneaz
o palet larg de produse alimentare ce conin soia i care ar putea constitui obiectul
testrilor OMG:
- produse cu specific asiatic obinute din soia (ex. tofu, miso, yuba, kinako,
nama-age, natoo sau sos de soia); aceste produse sunt rspndite n principal
n Japonia, iar unele se gsesc frecvent i pe piaa european (ex. tofu);
Testarea OMG

179
- produse pe baz de soia (ex. texturate proteice, tofu, laptele de soia lichid
sau liofilizat, boabe de soia acidifiate, boabe de soia fierte, ulei sau sos
fermentat); soia este ingredientul principal; aceste produse sunt obinute din
boabe ntregi de soia sau reprezint fraciuni obinute prin rafinare;
- produse ce conin soia sau fraciuni din soia ca ingrediente (ex. crem
vegetal de brnz, pate vegetal, salam vegetal, cremwurti vegetali, burger
vegetal, past vegetal, snackuri, biscuii, mncare pentru nou-nscui, fin
buturi rcoritoare, iaurt, produse de patiserie i panificaie, suplimente
nutritive, maionez vegetal sau batoane energizante); pe etichet se
menioneaz c produsul conine soia boabe, protein (vegetal) din soia sau
concentrat de soia; n general, aceste produse sunt pasteurizate/sterilizate,
meniune fcut de asemenea pe etichet;
- produse ce conin fraciuni din soia (ex. lecitin, izolat proteic sau fibre) ca
ingrediente cu rol de aditivi n supe la conserv sau deshidratate, paste,
produse pe baz de carne, ciocolat, sosuri, siropuri etc.
Dup cum reiese din paragraful anterior, soia se regsete ntr-o gam foarte
variat de produse alimentare destinate consumului uman, gradul de procesare fiind de
obicei ridicat i afectnd semnificativ pretabilitatea la testare, datorit degradrii
moleculelor de interes (ADN sau proteine). Pe piaa din ara nostr, produsele de larg
consum ce conin soia sunt mult mai puine. Din punctul de vedere al consumatorului
acestea pot fi clasificate dup cum urmeaz:
- texturate proteice cele mai rspndite produse alimentare din soia, motiv
pentru care au repezenatat principala categorie de probe necunoscute testate
pn n prezent n cadrul laboratorului nostru;
- produse n care extractul proteic din soia nlocuiete ingredientele de origine
animal (ex. crem vegetal de brz, pate vegetal, salam vegetal,
cremwurti vegetali, burger vegetal sau past vegetal); aceste produse sunt
de asemenea numeroase, majoritatea fiind ns comercializate doar periodic,
ca produse de post;
- lapte de soia, iaurturi i buturi rcoritoare;
- tofu; reprezint cel mai rspndit produs dintre cele cu specific asiatic;
Testarea OMG

180
- batoane energizante;
- orice sortiment de ciocolat (conine lecitin ca aditiv);
- unele sortimente de mncare pentru nou-nscui;
- suplimente proteice;
- produse ce conin ulei vegetal obinut din soia.
n Anexa IV sunt prezentate o serie de produse ce conin soia i sunt
comercializate n ara noastr.
Probele descrise anterior intr n categoria aa-numitelor probe necunoscute i
constituie, de fapt, obiectul analizelor. O alt categorie este reprezentat de proble (cu
caracteristici) cunoscute. Acestea au rol de probe de control (pozitive sau negative), fiind
utilizate pentru validarea corectitudinii rezultatelor analitice, sau pot avea rol de
calibratori. De obicei, aceste probe sunt reprezentate de materiale de referin. n situaia
ideal aceste matriale sunt nsoite i de certificate care le atest anumite proprieti (vezi
subcapitolul 2.9.7).
Tabelul 4 conine o serie din probele selectate i testate n cadrul laboratorului
CERT-OMG.


Tabelul 4.
Tipuri de probe pe baz de soia testate n cadrul laboratorului CERT-OMG
Types of samples containg soybean tested by CERT-OMG
Tipul matricei
Type of matrix
Provenien
Source
Nr. probe
No. of samples
Codul probei
Sample code
Tipul probei
Sample type
Grad de procesare
1

Degree of processing
TPS
2
, granule, felii/
niele sau cuburi
Comer 8 T Necunoscut Mediu-nalt
Semine soia Prod. privat 6 S Necunoscut Neprocesat
Lapte de soia Comer 1 LS Necunoscut nalt
CVB
3
Comer 1 CS Necunoscut nalt
Baton energizant Comer 1 BE Necunoscut nalt
Pate vegetal Comer 2 PS Necunoscut nalt
Tofu

Comer

2 TF Necunoscut Mediu
Biscuii Comer

1 BS Necunoscut nalt
ERM-BF410
4
IRMM 6 R MRC
5
Redus
1
Aceast clasificare este bazat pe informaiile ntlnite n litereatura de specialitate.
2
Texturat proteic de soia.
3
Crem vegetal de branz ce conine soia.
4
Material de referin certificat (MRC) pentru soia Roundup Ready. Exist ase tipuri de MRC-uri, fiecruia
corespunzndu-i o anumit concentraie de material MG (<0,003%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, respectiv 5%).
5
Utilizat pentru trasabilitate i controlul calitii.

Testarea OMG

181
3.3. EANTIONAREA
3.3. SAMPLING

n ceea ce privete eantionarea, trebuie avute n vedere considerentele prezentate
n capitolul anterior. Probele testate de ctre noi au fost alese la ntmplare, fr a aplica o
procedur de eantionare la nivelul ntregului lot. De aceea, rezultatele obinute reflect
doar proprietile acestor probe individuale, extrapolarea la nivelul ntregului lot din care
acestea au provenit nefiind corect din punct de vedere statistic (Rott et al., 2004). n
cazul probelor necunoscute ambalate, au fost achiziionate cte dou pachete/cutii,
exceptnd-o pe cea sub form de biscuii, iar probele sub form de semine au fost
reprezentate de cantiti de aproximativ 100 g. MRC-urile au fost achiziionate de la
IRMM n flacoane cu coninutul net de 1 g. Pentru fiecare tip de prob necunoscut
cantitatea total a fost omogenizat i pregtit corespunztor. Aceste aspecte vor fi
discutate n subcapitolul urmtor.

3.4. PREGTIREA PROBELOR TEST
3.4. TEST SAMPLE PREPARATION

n cadrul activitilor pe care le-am desfurat, seminele/boabele au fost pregtite
iniial prin mojarare n azot lichid, iar ulterior s-a trecut la utilizarea unei mori cu cuite
rotative Grindomix GM 200 (Retsch) (Figura 53). n cel de-al doilea caz, mrunirea i
omogenizarea se poate face la o turaie de 6000 rpm, n reprize de 15 secunde, numrul
de repetri variind n funcie de consistena probei. n intervalul dintre dou repetri
amestecul a fost agitat uor pentru a favoriza procesul de omogenizare i mrunire. Dup
mcinarea unei probe, vasul de mcinare trebuie curat corespunztor pentru a evita
apariia contaminrii ncruciate. Curarea trebuie fcut prin splare cu detergent,
tergere cu etanol i apoi cltire cu ddH
2
O. Vasul este apoi uscat cu ajutorul fluxului
laminar de aer al unei hote, i n prezena luminii UV. n vederea acreditrii metodologiei
de testare, va fi necesar i autoclavarea vasului de mcinare dup fiecare folosire.
Deoarece dotarea standard a apararatului Grindomix include un singur vas de mcinare se
Testarea OMG

182
recomand achiziionarea unor vase suplimentare, care ar permite scurtarea timpului total
de pregtire al probelor n cazul n care numrul acestora este mai mare.



Fig. 53. Moara cu cuite Grindomix GM 200 (Retsch).
Fig. 53. The Grindomix GM 200 (Retsch) mixer.
Surs: Retsch (2009).


n urma experimentelor efectuate s-a constatat c mrunirea mecanic a probelor
uscate, utiliznd moara cu cuite rotative, este mai expeditiv i necesit mai puin efort
din partea operatorului comparativ cu mojararea manual n azot lichid. Teoretic, a doua
metod asigur condiii mai bune pentru extracie, temperatura sczut inhibnd
activitatea nucleazelor i reducnd stresul termic exercitat asupra moleculelor de ADN.
Dei nu a fost fcut nicio corelaie statistic ntre metoda de mrunire i calitatea
extractelor, pe baza experienei practice, considerm c mrunirea mecanic nu afecteaz
rezultatele obinute. De asemenea, acest aparat este utilizat i n cadrul altor studii din
acest domeniu (ex. Schulze, 2008, sau Querci et al., 2005).
n cazul probelor sub form de texturate proteice de soia coninutul fiecrui pachet
a fost mcinat individual, iar ulterior s-a realizat omogenizarea celor dou pachete.
Texturatele proteice sub form de niele au necesitat o mrunire prealabil, nainte de
mcinare. n cazul batoanelor energizante adugarea apei a fost esenial pentru procesul
de mrunire i omogenizare. Omogenizarea probelor sub form de fin, mlai, pate sau
Testarea OMG

183
crem a fost de asemenea realizat cu aparatul Grindomix GM 200. Laptele de soia a fost
omogenizat prin agitarea energic a cutiei.
Un aspect important pentru obinerea unor concentraii satisfctoare de ADN este
reprezentat de gradul de mrunire al particulelor ce intr n alctuirea probei test.
Conform Asociaiei Franceze de Normalizare (Association Franaise de Normalisation),
mrimea optim a acestora este de sub 500 m (Moens et al., 2005). Att mojararea cu
azot lichid, ct i utilizarea morii rotative, asigur obinerea unor particule de dimensiuni
diferite, de aceea se recomand utilizarea unei site pentru separarea fraciunii cu
granulaie corespunztoare, din care s fie apoi constituit proba test. Aceast msur va
fi implementat i n cadrul laboratorului nostru.
Corbisier et al. (2005) au concluzionat c umectarea probei nainte de extracie
favorizeaz acest proces, att prin nmuierea particulelor, ct i prin reducerea stresului
termic. Trebuie ns avut n vedere c umectarea i separarea n fraciuni cu granulaie
diferit nu pot fi aplicate concomitent.
n aceast etap, formarea prafului reprezint un factor de risc important, datorit
creterii probabilitii de apariie a contaminrilor ncruciate, n special n cazul
mrunirii cu moara cu cuite. Este deci necesar luarea tuturor msurilor menite s
previn prezena prafului n mediul de lucru.

3.5. EXTRACIA ADN-ULUI
3.5. DNA EXTRACTION

3.5.1. Metode de extracie a ADN-ului utilizate n testarea OMG
3.5.1. DNA extraction methods used in GMO testing

Metodele de extracie cel mai frecvent ntlnite n literatura de specialite din acest
domeniu sunt prezentate n Tabelul 5. Dintre aceste metode, ase sunt descrise n
subcapitolele urmtoare, fiind testate i n cadrul laboratorului nostru (i.e. protocolul pe
baz de CTAB, kiturile QIAamp DNA Stool Mini, DNeasy Plant i High Pure GMO
Sample Preparation i metodele bazate pe utilizarea platformelor automatizate MagNA
Pure LC i Maxwell 16).
Testarea OMG

184
Tabelul 5.
Metodele de extracie a ADN-ului utilizate n cadrul testrii OMG
Extraction methods used to isolate and purify genomic DNA for GMO testing
Nr.
crt.
No.
Metoda de extracie
Extraction method
Surse bibliografice
References
Observaii

Comments
1.
Extracie pe baz de CTAB
1

Metod manual bazat pe
protocolul descris de Murray i
Thompson (1980)
Precipitare cu CTAB, extracie
organic i purificare cu alcool
Somma (2004)

Kunert et al. (2006)
Lin et al. (2000)

Lin et al. (2006)
Huang i Pan (2005)

Corbisier et al. (2005)

Cankar et al. (2006)

Cankar et al. (2006)
Moriuchi et al. (2007)


Alary et al. (2002)

Fernandez et al. (2005)

Cardarelli et al. (2005)

Hernndez et al. (2003)
Hernndez et al. (2004a)
Hernndez et al. (2004b)

Angonesi Brod et al.
(2007)
Smith i Maxwell (2007)

Ujhelyi et al. (2007)
Foti et al. (2006)


Berdal i Holst-Jensen
(2001)
Jasbeer et al. (2008)
Utilizat la soia i purumbul; recomand i
mrirea cantitii iniiale de prob
Utilizat la porumb; dup Wurz et al. (1999)
Utilizat la soia i porumbul; extracie cu
cloroform; dup Lipp et al. (1999)
Utilizat la soia; dup Lipp et al. (1999)
Utilizat la soia; extracie cu cloroform i alcool
izoamilic
Utilizat la soia; dup Murray i Thompson
(1980)
Utilizat la soia i porumb; fr tratamente cu
proteinaz K i RNaz A; dup Somma (2004)
Utilizat la soia i porumb; dup Somma (2004)
Utilizat la soia; extracie cu cloroform i alcool
izoamilic; dup Japanese Agricultural
Standard (2001)
Utilizat la porumb; dup Rogers i Bendich
(1985)
Utilizat la porumb; dup Rogers i Bendich
(1985)
Utilizat la soia i porumb; extracie cu cloroform;
dup Tinker et al. (1993)
Dup Meyer i Jaccaud (1997)
Dup Meyer i Jaccaud (1997)
Utilizat la porumb; dup Rogers i Bendich
(1985)
Utilizat la RR; extracie cu cloroform; dup Lipp
et al. (1999)
Utilizat la porumb; extracie cu cloroform; dup
Lipp et al. (1999)
Utilizat la soia; dup Somma (2004)
Utilizat la soia; dup Murray i Thompson
(1980); purificare suplimentar (Qiaquick)
dup Hhne et al. (2002)
Utilizat la soia; dup Van den Eede (2000)

Dup Somma (2004) i dup Tinker et al. (1993)
2.
Metoda Wizard (Promega)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu particule magnetice
Germini et al. (2004)
Rott et al. (2004)
Corbisier et al. (2005)
Di Pinto et al. (2007)
Cankar et al. (2006)
Smith i Maxwell (2007)
Xu et al. (2006)
Zhang et al. (2007)
Ujhelyi et al. (2007)
Burns i Valdivia (2007)
Jasbeer et al. (2008)
Utilizat la porumb i soia; dup SLMB
3

Utilizat la soia
Utilizat la soia
Utilizat la Bt176
Utilizat la porumb i soia; dup Spoth i Strauss
Utilizat la porumb; dup Spoth i Strauss
Utilizat la porumb i soia
Utilizat la soia
Utilizat la soia
Utilizat la soia
Utilizat la soia
3.
QIAamp Stool DNA Mini Kit
1

(Qiagen)

Kit comercial, procesare manual
2

Purificare cu coloane
Tengel et al. (2001)
Rott et al. (2004)
Qiagen (2007)
Utilizat la porumb i soia
Utilizat la soia; modificat
Specificaiile tehnice ale productorului
Testarea OMG

185

continuare Tabelul 5.
Nr.
crt.
No.
Metoda de extracie
Extraction method
Surse bibliografice
References
Observaii
Comments
4.
DNeasy Plant Kit
1
(Qiagen)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu coloane
Onishi et al. (2005)
Taverniers et al. (2005)
Matsuoka et al. (2002)
Yoshimura et al. (2005a)

Yoshimura et al. (2005b)

Tengel et al. (2001)
Thion et al. (2002)
Tani et al. (2005)
Corbisier et al. (2005)
Di Pinto et al. (2007)
Cankar et al. (2006)
Rudi et al. (2003)

Forte et al. (2005)
Abdullah et al. (2006)
Smith i Maxwell (2007)
Berdal i Holst-Jensen
(2001)
Jasbeer et al. (2008)
Lee et al. (2006)
Qiagen (2006)
Utilizat la porumb
Utilizat la porumb; proba test 20 mg
Utilizat la porumb
Utilizat la porumb i soia; cantitate mai mare a
probei test i timp mai lung de incubare
Utilizat la porumb i soia; cantitate mai mare a
probei test i timp mai lung de incubare
Utilizat la porumb i soia
Utilizat la soia
Utilizat la soia
Utilizat la soia
Utilizat la Bt176
Utilizat la porumb i soia
Utilizat la porumb; cantitate mai mare a probei
test i timp mai lung de incubare
Utilizat la porumb i soia
Utilizat la soia
Utilizat la porumb
Utilizat la soia

-
Utilizat la porumb; modificat
Specificaiile tehnice ale productorului
5.
High Pure GMO Sample
Preparation Kit
1
(Roche)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu coloane
Zule et al. (2009)
Leau et al. (2008)
Jasbeer et al. (2008)
Roche (2004)
Debode et al. (2007)

Utilizat la soia i porumb
Utilizat la soia
-
Instruciunile productorului
Utilizeaz un kit asemntor High Pure PCR
Template (Roche)
6.
MagNA Pure LC DNA Isolation
Kit I
1
i II (Roche)
Kit comercial, procesare
automatizat
Purificare cu particule magnetice
Sakai et al. (2002)
Hahnen et al. (2002)
Schultze, 2008
Jasbeer et al. (2008)
Roche (2009b)
Roche (2005)
Utilizat la soia
Utilizat la porumb
Utilizat la soia i porumb
-
Instruciunile de utilizare a kitului
Manualul instrumentului
7.
Maxwell 16 Tissue DNA
Purification Kit
1
(Promega)
Kit comercial, procesare
automatizat
Purificare cu particule magnetice
Promega (2006)
Koller i Storts (2006)
Specificaiile tehnice ale productorului
Aplicaie propus de porductor pentru soia
8.
QIAGEN Genomic-tip 20/G
(Qiagen)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu coloane
Yoshimura et al. (2005b)
Toyota et al. (2006)
Utilizat la porumb i soia; modificat
Utilizat la soia
9.
Extracie pe baz de SDS-Na-
acetat
Met. original a fost propus de
Dellaporta et al. (1983)
Corbisier et al. (2005)
Cazzola i Petruccelli
(2006)
Hernndez et al. (2004a)
Utilizat la soia
Utilizat la porumb i soia

Utilizat la porumb i soia
10.
KingFisher Magnetic Particle
Processor (Thermo Fisher
Scientific)
Kit comercial, procesare
automatizat
Purificare cu particule magnetice
Smith i Maxwell (2007) Utilizat la porumb

Testarea OMG

186

continuare Tabelul 5.
Nr.
crt.
No.
Metoda de extracie
Extraction method
Surse bibliografice
References
Observaii
Comments
11.
Extracie pe baz de TNE
Metod manual
Studer et al. (1998)
Vatilingom et al. (1999)
Utilizat la soia i porumb; dup SLMB
Utilizat la soia i porumb; dup Kppel et al.
(1997); purificare adiional (Qiaquick)
12.
GENESpin (GeneScan)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu coloane
Cankar et al. (2006) Utilizat la soia i porumb
13.
NucleoSpin Food Kit (Machery-
Nagel)
Kit comercial, procesare manual
Purificare cu coloane
Smith i Maxwell (2007)
Reiting et al. 2007
Jasbeer et al., 2008
Agodi et al., 2006
Utilizat la porumb
Utilizat la porumb
-
Utilizat la soia i porumb
1
Testat n cadrul laboratorului CERT-OMG.
2
Procedura poate fi automatizat dac se utilizeaz instrumentul QIAcube (Qiagen).
3
SLMB - Schweizerisches Lebensmittelbuch (Swiss Food Manual).


3.5.1.1. Metoda de extracie pe baz de CTAB
3.5.1.1. CTAB-based DNA extraction method

Protocolul de extracie i purificare a ADN-ului utiliznd bromura de
cetiltrimetilamoniu (cetyltrimethyl ammonium bromide/CTAB) a fost conceput de
Murray i Thompson n 1980. Metoda poate fi uilizat pentru extracia i purificarea
ADN-ului dintr-o gam foarte variat de probe, de la esuturi vegetale proaspete pn la
matrici alimentare, fiind extrem de util n eliminarea polizaharidelor i compuilor
fenolici care afecteaz puritatea i calitatea extractelor (Somma, 2004). Variante mai mult
sau mai puin asemntoare ale procedurii pe baz de CTAB sunt des utilizate n cadrul
testrilor OMG (vezi Tabelul 5).
Protocolul folosit n cadrul acestei lucrri (Figura 54) a fost conceput pe baza a
dou variante asemntoare, una propus de Somma (2004), iar cea de-a doua fiind
publicat n standardul SR EN ISO 21571:2006. Cele cinci etape care compun protocolul
au fost descrise i de Gachet et al. (1999).
Lizarea membranei celulare i a celei nucleare reprezint prima etap, proba
omogenizat fiind tratat cu o soluie tampon de extracie ce conine NaCl, EDTA Tris-
HCl i CTAB. Toate membranele celulare au o structur general reprezentat de un strat
dublu de lipide n care sunt intercalate moleculele proteice, legturile dintre aceste

Testarea OMG

187

F
i
g
.

5
4
.

I
z
o
l
a
r
e
a

i

p
u
r
i
f
i
c
a
r
e
a

A
D
N
-
u
l
u
i

u
t
i
l
i
z

n
d

m
e
t
o
d
a

p
e

b
a
z


d
e

C
T
A
B
.

F
i
g
.

5
4
.

I
s
o
l
a
t
i
o
n

a
n
d

p
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
n

o
f

D
N
A

u
s
i
n
g

t
h
e

C
T
A
B
-
b
a
s
e
d

m
e
t
h
o
d
.

Testarea OMG

188
componente fiind de tip necovalent. Liza celular este produs de detergentul CTAB care
are o structur bipolar asemntoare lipidelor, cu un pol hidrofil i cellalt hidrofob.
CTAB-ul prezent n soluia de extracie are deci rolul de a ngloba lipidele care intr n
alctuirea membranei celulare i a celei nucleare, reinnd totodat moleculele proteice.
AND-ul genomic este pus astfel n libertate. Acest principiu de liz celular cu ajutorul
unui detergent este valabil n cazul tuturor metodelor de extracie.
n prezena unei concentraii specifice de sruri (i.e. NaCl) i a proteinazei K,
proteinele i ADN-ul disociaz, favoriznd formarea unui complex insolubil acizii
nucleici-detergent. NaCl are i efect inhibitor asupra unor clase de enzime. Substana
chelatizant EDTA este utilizat pentru legarea ionilor metalici, cofactori activatori
pentru DNaze, ceea ce determin reducerea activitii acestor enzime. Tris-HCl are rol de
tampon n soluia de extracie, protejnd ADN-ul de valorile extreme ale pH-ului.
Deoarece ADN-ul se poate degrada n aceast etap, timpul dintre omogenizarea probei
i adugarea soluiei tampon CTAB trebuie s fie ct mai scurt. La sfritul acestei etape
resturile celuare grosiere sunt ndeprtate prin centrifugare.
A doua etap a protocolului extracia presupune separarea complexului CTAB-
acizi nucleici de polizaharide, compui fenolici, proteine i alte substane rezultate n
urma lizei celulare. n prezena unei concetraii reduse de sruri (< 0,5 m NaCl),
substanele contaminante nu precipit i pot fi ndeprtate prin extracie cu cloroform.
Cloroformul denatureaz proteinele i faciliteaz separarea fazei apoase (supernatantul)
de cea organic (faza inferioar, cu densitate mai mare). Extracia cu cloroform se poate
repeta de una sau dou ori pentru ndeprtarea complet a impuritilor din stratul apos.
Pentru a recupera o parte ct mai mare din acizii nucleici, se poate efectua o extracie
suplimentar din faza organic, obinnd o soluie apoas care este apoi adugat
extractului iniial.
n urmtoarea etap, soluia apoas este tratat cu un amestec de precipitare ce
conine CTAB i NaCl Dup sedimentarea ADN-ului precipitat prin centrifugare,
supernatantul este ndeprtat. Precipitatul este apoi resuspendat cu ajutorul unei soluii de
NaCl dup care urmeaz o nou etap de extracie cu clorofom, pentru ndeprtarea
compuilor organici.
Testarea OMG

189
n continuare se realizeaz purificarea acizilor nucleici, ndeprtndu-se
detergentul i srurile. n aceast etap au loc precipitri i splri ale ADN-ului extras,
utiliznd izopropanol i soluie de etanol.
Procedura de baz este conceput pentru extracia dintr-o prob test de 100 mg. n
cazul matricilor alimentare intens procesate se poate iniia procedura de extracie la o
scar de zece ori mai mare (Querci et al., 2005), utilizndu-se o prob test de 1 g, precum
i cantiti mai mari de reactivi n primele etape ale protocolului. Strategia are rolul de a
mri cantitatea de ADN recuperat, sporind astfel ansele de detecie a unor proporii
reduse de material transgenic.
n Anexa V este redat succesiunea detaliat a etapelor de lucru, compoziia
soluiilor stoc i materialele necesare pentru aceast metod de extracie.

3.5.1.2. Extracia ADN-ului cu DNeasy Plant Mini Kit
3.5.1.2. DNA extraction using the DNeasy Plant Mini Kit

Caracteristicile tehnice prezentate n continuare au fost preluate din cartea tehnic
a kitului DNeasy Plant Handbook (vezi Qiagen, 2006). Acesta a fost optimizat pentru
purificarea ADN-ului vegetal din esuturi proaspete (n special frunze), ngheate sau
liofilizate, n vederea efecturii analizelor PCR sau Southern blotting. Cantitatea maxim
de material iniial recomandat pentru utilizare este de 100 mg n cazul esutului proaspt
(umed), respectiv 20 mg pentru esut uscat, categorie n care am considerat c se
ncadreaz majoritatea probelor pe care le-am testat. Kitul asigur purificarea a 3-30 g
ADN, iar timpul de lucru estimat este de o or.
Metodologia DNeasy (Figura 55) combin proprietile de legare ale membranelor
de silicon i separarea prin microcentrifugare. Dup mrunirea mecanic a materialului,
se realizeaz liza celular i digestia ARN-ului prin incubare n prezena unui tampon
specific i a RNazei A. Dup liz, proteinele i polizaharidele sunt precipitate cu ajutorul
srurilor, resturile celulare i compuii precipitai fiind apoi ndeprtai din lizat cu
ajutorul coloanelor de filtrare QIAshredder. Filtratul obinut este amestecat cu tampon de
legare i etanol, iar amestecul este ncrcat n coloanele DNeasy. n aceste condiii, ADN-
ul este reinut prin adsorbie la suprafaa membranei, iar compuii nedorii sunt eliminai
Testarea OMG

190
prin dou splri succesive. La final, ADN-ul este eluat ntr-un tampon cu concentraie de
sruri redus sau n ap.



Fig. 55. Procedura de extracie cu ajutorul kitului DNeasy Plant Mini.
Fig. 55. DNeasy Plant Mini kit extraction procedure.
Dup Qiagen (2006).


Numeroase surse din literatura de specialitate (ex. Cankar et al., 2006, Yoshimura
et al., 2005a i 2005b, Rudi et al., 2003, sau Tengel et al., 2001) indic modificarea
protocolului de baz n vederea optimizrii performaelor extraciei. Astfel, se recomand
mrirea cantitii de prob utilizat pentru extracie, de la 20 mg la 1 g. n aceast situaie
va fi necesar i modificarea volumelor de soluii utilizate n primele faze ale
protocolului. Se mai poate mri timpul de incubare a probei n tamponul de liz sau
temperatura la care face incubarea. Aceste modificri ale protocolului de baz au fost de
asemenea testate.
Testarea OMG

191
Modul de utilizare a kitului pentru extracia ADN-ului n vederea testrilor OMG,
este prezentat n Anexa V. O descriere detaliat a protocolului de lucru i a pricipiilor de
funcionare a acestuia a fost publicat i de Thion et al. (2002).

3.5.1.3. Extracia ADN-ului cu QIAamp DNA Stool Mini Kit
3.5.1.3. DNA extraction using the QIAamp DNA Stool Mini Kit

Caracteristicile tehnice prezentate n continuare au fost preluate din cartea tehnic
a kitului QIAamp DNA Stool Handbook (vezi Qiagen, 2007). Kitul QIAamp DNA
Stool Mini (Qiagen) permite izolarea ADN-ului uman sau al microorganismelor din
probe de materii fecale proaspete sau congelate. Acest tip de specimene conin foarte
muli inhibitori ai reaciei PCR, anumite elemente ale kitului (tabletele InhibitEX i
tamponul ASL) fiind special concepute pentru a asigura o purificare corespunztoare.
Concentraia ADN-ului obinut este de 75-300 ng/l.
Se recomand utilizarea unei probe de 180-220 mg. Liza celular se realizeaz n
tamponul ASL, prin incubare la temperatura de 70 C. Substanele care pot degrada
ADN-ul i inhibitorii PCR sunt apoi adsorbii de matricea InhibitEX i eliminai prin
centrifugare. Ulterior se realizeaz purificarea ADN-ului, care include:
- denaturarea proteinelor prin incubare la 70 C n prezena proteinazei K;
- n anumite condiii de pH i concentraie a srurilor ADN-ul este legat la
suprafaa membranei de silicon a coloanelor QIAamp, iar impuritile sunt
eliminate prin centrifugare;
- ADN-ul este splat n dou etape, iar apoi este eluat ntr-un tampon cu
concentraie sczut de sruri.
Procedura este prezentat grafic n Figura 56, iar protocolul de lucru detaliat este
redat n Anexa V.
Ca i n cazul kitului DNeasy Plant, surse din literatura de specialitate indic
modificarea protocolului de baz n vederea optimizrii performaelor extraciei. Cea mai
important sugestie este reprezentat de mrirea cantitii de prob utilizat pentru
extracie, de la 20 mg la 1 g (Rott et al., 2004). Va fi evident necesar i modificarea
volumelor de soluii, n etapa iniial.
Testarea OMG

192

Fig. 56. Procedura de extracie cu ajutorul kitului QIAamp DNA Sool.
Fig. 56. QIAamp DNA Stool kit extraction procedure.
Dup Qiagen (2007).


3.5.1.4. Extracia ADN-ului utiliznd kitul High Pure GMO Sample Preparation
3.5.1.4. DNA extraction using High Pure GMO Sample Preparation Kit

Caracteristicile tehnice prezentate n continuare au fost preluate din manualul de
instruciuni al kitului (vezi Roche, 2004). Kitul High Pure GMO Sample Preparation
(Roche) a fost otpimizat pentru izolarea ADN-ului din matrici alimentare (materii prime
sau procesate) de origine vegetal n vederea efecturii testelor OMG. Calitatea ADN-
ului este corespunztoare aplicaiilor PCR, putndu-se obine 0,1-10 g acizi nucleici din
200 mg prob (cantitatea recomandat pentru utilizare), n funcie de gradul de procesare
al matricii alimentare. Pentru matricile nalt procesate, ADN-ul recuperat poate fi prezent
n fragmente de sub 1000 pb. De accea, n aplicaiile PCR ulterioare, este recomandat
utilizarea unor ampliconi mai scuri de 200 pb.
Procedura de lucru este redat n Figura 57. Dup omogenizarea probei, ADN-ul
este extras prin incubare la temperatur nalt, n prezena unui tampon de extracie. Se
aplic un tratament cu proteinaz K, iar lizatul este apoi separat prin centrifugare. n
vederea purificrii, ADN-ul este legat selectiv la membrana din fibre de sticl a tubului
Testarea OMG

193
de filtrare, dup care purificarea se realizeaz prin dou etape de splare-centrifugare. n
final, un tampon cu concentraie redus n sruri elibereaz ADN-ul de la suprafaa
fibrelor de sticl.
Modul de utilizare a kitului pentru extracia ADN-ului n vederea testrilor OMG,
este prezentat n Anexa V.



Fig. 57. Procedura de extracie utiliznd kitul High Pure GMO Sample Preparation.
Fig. 57. High Pure GMO Sample Preparation kit extraction procedure.
Dup Roche (2004).


3.5.1.5. Extracia ADN-ului pe platforma MagNA Pure LC
3.5.1.5. DNA extraction on the MagNA Pure LC platform

Platforma MagNA Pure LC (Roche) (Figura 58) utilizeaz kituri de extracie
special concepute pentru separarea i purificarea automatizat a ADN-ului cu ajutorul
particulelor magnetice (magnetic beads). Aceste particule au dimensiuni microscopice i
miezul magnetic, iar n anumite condiii de temperatur i pH partea lor exterioar
prezint afinitate pentru moleculele de ADN.

Testarea OMG

194

Fig. 58. Meniul principal al software-ului MagNA Pure LC (Roche).
Fig. 58. Main menu of the MagNA Pure LC software (Roche).
Surs: Roche (2005).


Proba
mrunit


n condiii de
temperatur
ridicat i la
un anumit
pH, acizii
nucleici sunt
eluai de pe
particlulele
magnetice

Liza celular
i digestia
proteinelor n
prezena
tamponului
de liz i a
proteinazei K
Acizii
nucleici
sunt
reinui la
suprafaa
particulelor
magnetice
Complexul
acizi
nucleici-
particule este
separat cu
ajutorul unui
cmp magn.
Resturile
celulare
sunt
ndeprtate
prin mai
multe etape
de splare
Complexul
acizi
nucleici-
particule este
separat cu
ajutorul unui
cmp magn.

Fig. 59. Etaple principale ale protocolului de extracie automatizat care utilizeaz principiul
particulelor magnetice.
Fig. 59. Main steps of the automated extraction protocol based on magnetic beads principle.
Dup Roche (2005).


Platforma poate procesa 1-32 de probe ntr-un interval de timp care variaz ntre
30 i 90 minute, n funcie de kit, protocol i numr de probe. Operatorul programeaz
aparatul n funcie de protocolul ales prin intermediul unui sofware specific (MagNA
Pure LC V3.0.11, Roche) i ncarc soluiile de lucru i materialele consumabile.
Testarea OMG

195
Extracia propriu-zis este execuatat apoi automatizat. Succesiunea etapelor de extracie
este prezentat n Figura 59.
Niciunul dinre kiturile concepute de Roche pentru MagNA Pure LC nu este
destinat izolrii acizilor nucleici n vederea efecturii analizelor OMG. Cu toate acestea,
unele protocoale pot fi adaptate prin includerea unei etape de pregtire n cadrul creia s
se realizeze mrunirea esutului utilizat pentru izolarea ADN-ului. Au fost identificate i
testate trei exemple de acest fel:
- primul, pentru obinerea ADN-ului din porumb n vederea deteciei real-time
PCR a genelor endogene, presupune omogenizarea probei cu soluia de liz
inclus n MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue), iar apoi
supernatantul este utilizat pentru extracie conform protocolului de baz;
aplicaia a fosr publicat de Hahnen et al. (2002);
- a doua variant, pentru extracie din semine de soia, presupune o etap
premergtoare de tratare a probelor iniiale cu soluii de dodecil sulfat de
sodiu (sodium dodecyl sulfate/SDS) i tiocianat de guanidin (guanidinium
thiocyanate/GTC), extracia fiind apoi efectuat cu MagNA Pure LC DNA
Isolation Kit I (Blood) (Sakai et al., 2002);
- a treia variant, pentru izolarea ADN-ului din soia, porumb sau rapi;
utilizeaz n etapa premergtoare o soluie tampon pe baz de CTAB, iar
extracia se desfoar apoi cu MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II
(Tissue), conform protocolului de baz (Schulze, 2008).
Metodologia de lucru, echipamentele i reactivii necesari sunt prezentai n Anexa
V.

3.5.1.6. Extracia ADN-ului pe platforma Maxwell 16
3.5.1.6. DNA extraction on the Maxwell 16 platform

Kitul Maxwell 16 Tissue DNA Purification (Promega) este utilizat mpreun cu
instrumentul Maxwell 16 (Promega) (Figura 60a) n cadrul unei metode simple i
automatizate pentru extracia efcient a ADN-ului genomic din esuturi (Promega, 2006).
Procedurile de purificare sunt preprogramate n software-ul aparatului, iar reactivii
Testarea OMG

196
necesari sunt inclui ntr-un cartu care se utilizeaz direct (Figura 60b i c). Setarea se
face foarte rapid i uor, iar timpul de lucru este de 30-50 minute, n funcie de procedura
aleas.





(b) (c)
(a)
Fig. 60. Instrumentul Maxwell 16 (Promega). (a) Vedere de ansamblu a platformei de extracie Maxwell 16. (b)
Vedere lateral a cartuului de extracie. (c) Repartizarea reactivilor n cartuul de extracie.
Fig. 60. The Maxwell 16 instrument (Promega). (a) General view of the Maxwell 16 extraction platform. (b)
Lateral view of the extraction cartridge. (c) The distribution of the reagents inside the extraction cartridge.
Surs: Kephart et al. (2006).


Kitul nu a fost optimizat pentru extracia ADN-ului din semine sau alte matrici
alimentare de origine vegetal, fiind astfel necesar adaptarea protocolului de baz.
Avnd de-a face cu un sistem nchis, ca i n cazul platformei MagNA Pure LC, singura
modificare care poate fi adus protocolului de baz este includerea unei etape de
pretratament. Modificarea fcut a corespuns recomandrilor productorului (vezi Koller
i Storts, 2006), fiind concretizat prin incubarea probei test n prezena enzimei
CelluACE (Promega) i a unui tampon specific.
Modul de lucru este prezentat n Anexa V.



Testarea OMG

197
3.5.2. Testarea metodelor de extracie a ADN-ului
3.5.2. Testing of DNA extracion methods

Pentru succesul analizelor ce urmeaz a fi efectuate, alegerea unei metode de
extracie adecvate matricei analizate este indispensabil. Trebuie ns avut n vedere
faptul c este imposibil optimizarea portocolului de extracie pentru fiecare tip de
matrice n parte (Cankar et al., 2006). Cea mai practic soluie este probabil reprezentat
de selectarea i utilizarea unui protocol pentru o anumit categorie de probe, n funcie de
anumite proprieti ale categoriei respective (ex. taxon, gradul de procesare sau
compoziie).
Testarea n paralel a mai multor metode de extracie este destul de comun n
studiile din acest domeniu, rareori ns numrul acestora ajungnd sau depind patru (ex.
Jasbeer et al., 2008, Smith i Maxwell, 2007, Moens et al., 2005, sau Yoshimura et al.,
2005b).
Dup cum s-a menionat anterior (subcapitolul 3.5.1.), n cadrul laboratorului
nostru au fost testate ase metode de baz (n unele cazuri fiind incluse mai multe
variante ale aceleiai metode de baz) dintre cele prezentate n Tabelul 5. Acestea sunt:
protocolul pe baz de CTAB; kiturile QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen), DNeasy Plant
Mini (Qiagen) i High Pure GMO Sample Preparation (Roche); metodele automatizate
bazate pe utilizarea platformelor MagNA Pure LC (Roche) i Maxwell 16 (Promega).
Metodele manuale au fost selectate pentru testare deoarece sunt citate frecvent n
publicaiile din domeniul de interes. Metodele automatizate nu sunt utilizate la scar
larg, fiind ns luate n studiu deoarece dotarea existent a laboratorului unde s-au
desfurat experienele, includea platformele de lucru specifice. S-a dorit astfel evaluarea
posibilitii utilizrii acestora n activitatea de testare OMG.
Evaluarea performanelor metodelor a fost fcut avnd n vedere urmtoarele
caracteristici: calitatea extractului (concentraia i puritatea determinate
spectrofotometric, gradul de fragmentare, prezenta substanelor inhbitoare),
repetabilitatea, timpul necesar pentru procesarea unui lot de probe, costul unei probe,
dotrile necesare, gradul de complexitate al operaiunilor.

Testarea OMG

198
3.5.2.1. Design experimental
3.5.2.1. Experimental design

n vederea testrii metodelor de extracie, din proba de laborator mcinat sub
form de pudr fin, se preleveaz o cantitate suficient pentru a asigura obinerea tuturor
probelor test necesare. Pentru fiecare metod se vor extrage n paralel ase probe test, iar
extracia va fi efectuat de trei ori, n condiii de repetabilitate (Figura 61). n final, se
obine un grup de 18 (6x3) extracte pentru fiecare metod testat. Extractele vor fi apoi
analizate pentru a stabili performanele metodei. Analiza const din:
- determinri spectrofotometrice ale concentraiei i puritii fiecrui extract
de ADN; se fac cte trei citiri spectrofotometrice consecutive, valorile finale
reprezentnd media aritmetic a acestora; se pot determina valorile medii
globale ale concentraiei ADN-ului, eficienei de extracie i puritii,
precum i deviaia standard relativ a repetabilitii;
- elecroforeza n gel de agaroz i marcarea cu o substan de intercalare n
vederea determinrii gradului de fragmentare al ADN-ului;
- demonstrarea absenei inhbitorilor PCR din extractele ADN printr-o
amplificare real-time PCR.
Aceast metodologie are la baz procedura propus de CRL-GMFF pentru
validarea in-house a metodelor de extracie, ca parte a procesului de autorizare de ctre
Comisia European a introducerii pe piaa UE a evenimentelor de transformare.
Iniial, pentru testarea metodelor de extracie am utilizat probe comerciale sub
form de texturate proteice. Alegerea acestui tip de prob ca model pentru testarea OMG
a fost ntlnit i n alte studii (ex. Moens et al., 2005), reprezentnd n primul rnd o
strategie de reducere a costurilor. De asemenea, proba aleas face parte din cea mai
rspndit categorie de produse alimentare pe baz soia din ara noastr i este
caracterizat printr-o procesare medie, situndu-se din acest punct de vedere ntre
materiile prime (semine) i alimentele cu cel mai nal grad de procesare (ex. pate sau
ulei). Ulterior, metodele au fost testate i pe alte matrici, n principal sub form de
semine i MRC-uri, fr ca aceste experimente s aib amploarea celor iniiale.

Testarea OMG

199

F
i
g
.

6
1
.

D
e
s
i
g
n
u
l

e
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

u
t
i
l
i
z
a
t

p
e
n
t
r
u

c
o
m
p
a
r
a
r
e
a

m
e
t
o
d
e
l
o
r

d
e

e
x
t
r
a
c

i
e
.

B

-

p
r
o
b
a

n
e
u
t
r


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

e
x
t
r
a
c

i
e
i
.

F
i
g
.

6
1
.

E
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

d
e
s
i
g
n

u
s
e
d

f
o
r

t
h
e

e
v
a
l
u
a
t
i
o
n

o
f

D
N
A

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n

m
e
t
h
o
d
s
.

E
B

-

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n

b
l
a
n
k
.

Testarea OMG

200
3.5.2.2. Analiza spectrofotometric
3.5.2.2. Spectrofotometric analysis

n acest context, recomandm utilizarea sistemului NanoDrop Nd-1000 UV/Vis
1l Spectrophotometer (Labtech International) (Figura 62) care reprezint probabil cea
mai expeditiv i mai simpl metod pentru efectuarea acestui tip de determinri. Pentru
determinri este necesar doar un volum de 1-2 l din soluia analizat. n prima faz se
msoar proba oarb (blank) reprezentat de soluia tampon utilizat la
resuspendarea/eluarea ADN-ului, respectiv ap steril dublu distilat (ddH
2
O) sau
tampon de eluie, n funcie de metoda de extracie. Urmeaz apoi msurarea probelor
necunoscute conform strategiei indicate n subcapitolul 2.6.1.



Fig. 62. Spectrofotometrul NanoDrop Nd-1000 (Labtech International).
Fig. 62. NanoDrop Nd-1000 UV/Vis 1l Spectrophotometer (Labtech International).
Surs: IGBMC (2008).


n Tabelul 6 este exemplificat modul de prelucrare a datelor obinute prin
determinri spectrofotometrice, n cazul evalurii unei metode de extracie a ADN-ului
(i.e. kitul QIAamp DNA Stool Mini). Fiecare concentraie reprezint media a trei citiri
succesive.
Conform criteriilor minime de acceptabilitate enunate de ENGL (vezi ENGL,
2008), extractul utilizat pentru amplificare trebuie s aib o concentraie mai mare dect
Testarea OMG

201
concentraia de lucru specificat n protocolul metodei de detecie/cuantificare. n cazul
rezultatelor prezentate, aceast condiie este ndeplinit.


Tabelul 6.
Concentraia ADN-ului n extractele obinute cu kitul QIAamp DNA Stool Mini
DNA concentration of extracts obtained with QIAamp DNA Stool Mini Kit
Proba
Sample
Concentraia (ng/l)
Concentration (ng/l)
Parametri calculai
Determined parameters
1 71,1 Concentraia ADN-ului
2 83,5
3 229,2
4 269,9
5 241,5
6 281,2
1 242,2
2 280,4
Media tuturor probelor
Abaterea standard
Coeficientul de variaie


219,57 ng/l
60,74 ng/l
27,66%


3 233,6
4 229,4
5 139,5
Cantitatea de ADN recuperat
(volumul total al soluiei
de ADN a fost de 200 l)
6 239,4
1 243,4
2 276,0
3 215,3
4 229,5
5 219,4
6 227,7
Media tuturor probelor
Abaterea standard
Coeficientul de variaie


43,91 g
12,15 g
27,66%




Rezultatelor prezentate anterior le sunt asociate i determinri referitoarea la
puritatea soluiilor (extractelor), respectiv citirile A
260
/A
280
. Majoritatea dintre acestea s-au
ncadrat n intervalul 1,85-2,15. Dup cum am mai menionat, valoarea ideal este 1,8, iar
intervalul 1,7-1,9 este considerat optim. Un raport mai mic de 1,7 indic prezena
proteinelor n extract, iar un raport mai mare de 1,9 corespunde unei cantiti ridicate de
ARN. n cel de-al doilea caz se poate aplica un tratament cu RNaz (acest tratament este
uneori inclus n protocolul de baz). Dup incubarea cu RNaz, se va observa o scdere a
valorii raportului A
260
/A
280
i o cretere a concentraiei ADN-ului. Considerm ns c
aceast etap nu este necesar, iar modificarea concentraiei soluiei de ADN dup
Testarea OMG

202
aplicarea RNazei, poate fi interpretat ca o indicaie a preciziei reduse ce caracterizeaz
determinarea spectrofotometric.
Metodele de extracie au fost testate pe mai multe tipuri de matrici, putndu-se
formula urmtoarele concluzii genrale:
- n cazul texturatelor i seminelor, cantitatea de ADN recuperat crete odat
cu gradul de mrunire al particulelor;
- extractele obinute din semine sau MRC-uri prezint aproximativ aceleai
concentraii de ADN ca i n cazul texturatelor proteice, puritatea fiind ns
mai bun;
- probele intens procesate produc rezultate mult mai slabe comparativ cu
texturatele sau seminele; valori substanial mai mari ale concentraiei se
obin cu metoda High Pure GMO Sample Preparation, precum i cu
ajutorul extraciilor la scar mrit (utilizate n cazul protocolului pe baz
de CTAB i a kitului QIAamp DNA Stool Mini).
Alte considerente importante pentru aceast etap au fost prezentate de Moens et
al. (2005). Este binecunoscut faptul c valorile obinute reprezint, n general,
supraestimri ale concentraniilor reale, aceasta putnd fi deseori observat n urma
migrrii electroforetice a extractelor. Supraestimarea este determinat de diferii factori
fizici (ex. turbiditatea soluiei), iar unele proceduri de laborator (ex. centrifugarea sau
scderea valorii msurate la 320 nm din cea obinut la 260 nm) pot diminua acest
fenomen, reducnd implicit eroarea de justee. Denaturarea prealabil a ADN-ului (ex.
tratament cu NaOH 2M), o procedur des recomandat n cazul determinrilor
spectrofotometrice, s-ar putea s nu prezinte o utilitate prea nsemnat.
Chiar i n cazul unei determinri destul de precise, trebuie avut n vedere c
metoda ia n considerare att moleculele de ADN cu greutate molecular mare, ct i pe
cele degradate i chiar nucleotidele. De aceea, cantitatea de ADN amplificatil este
probabil mai redus.
Un alt principiu utilizat frecvent pentru determinarea concentraiei ADN-ului este
cel fluorimetric (ex. metoda Picogreen). Corbisier et al. (2005) i Moens et al. (2005) au
concluzionat ns c i n acest caz pot apare erori, valorile reale fiind de obicei
Testarea OMG

203
subestimate. Celelalte metode (ex. dot densitometry sau real-time PCR) care se pot folosi
n acest scop prezint la rndul lor diferite neajunsuri.
Se poate concluziona c determinarea concentraiei ADN-ului ntr-o soluie este
corect doar dac respectiva soluie este pur (ex. ADN plasmidial purificat prin HPLC),
iar obinerea unor extracte corespunztoare n cazul probelor alimentare este un obiectiv
greu de realizat. Evaluarea spectrofotometric a extractelor este deci problematic,
neexistnd nc o metod foarte precis i sigur. Principalul impediment al acestei
determinri rmne deci puritatea extractului, ca i n cazul cuantificrii prin real-time
PCR.

3.5.2.3. Starea de fragmentare
3.5.2.3. Fragmentaion state of DNA

Pentru aceast analiz se recomand migrarea extractelor ntr-un gel de agaroz de
concentraie redus (ex. 1%, w/v), cu grosimea mai mic de 1 cm. Intensitatea curentului
electric trebuie s fie de aproximativ 10 V/cm. Dup migrare, n vederea marcrii ADN-
ului, gelul este incubat ntr-o soluie ce conine un agent fluorescent de intercalare (ex.
EtBr sau SYBR Safe), la temperatura camerei i sub agitare uoar. Soluia de marcare
este obinut prin diluarea substanei de intercalare n tamponul utilizat pentru separarea
electroforetic (TAE 1X sau TBE 0,5X). Datorit riscurilor pe care EtBr le prezint
pentru mediu i sntate, recomandm utilizarea substanelor de tip SYBR.
n cadrul laboratorului nostru, transiluminarea gelurilor n vederea vizualizrii
ADN-ului marcat, se face cu ajutorul sitemului BioSpectrum AC Imaging System (Ultra-
Violet Products/UVP) (Figura 63).
Echipamentele, materialele i procedura de lucru sunt prezentate n Anexa VI.
n Figura 64 sunt prezentate cteva exemple de profile electroforetice obinute
dup migrarea n gel de agaroz a extractelor. Dup cum se poate observa, extractele
obinute din probe neprocesate prezint, n general, o band evident (partea de sus a
imaginilor), ce corespunde ADN-ului cu mas molecular mare, n timp ce soluiile
extrase din matrici alimentare compozite sau nalt procesate conin multe fragmente, de

Testarea OMG

204

Fig. 63. BioSpectrum AC Imaging System (UVP).
Fig. 63. BioSpectrum AC Imaging System (UVP).
Surs: UVP (2009).







(a) (b)



(c) (d)
Fig. 64. Electroforez n gel de agaroz a extractelor de ADN obinute cu ajutorul mai multor metode, din
diferite tipuri de probe ce conin soia. Probele: M, marker; S, semine de soia; R, MRC; T, texturat proteic;
PS, pate vegetal; LS, lapte de soia. (a) Protocolul pe baz de CTAB. (b) Kitul QIAamp DNA Stool Mini. (c)
Kitul High Pure GMO Sample Preparation. (d) Sistemul MagNA Pure LC.
Fig. 64. Gel electrophoresis of DNA extracts obtained with different methods, from several types of matrices
containg soybean. Samples: S, soybeans; R, CRM; T, textured soy protein; PS, vegetarian pt containg
soybean; LS, soymilk; (a) The CTAB-based protocol. (b) The QIAamp DNA Stool Mini Kit. (c) The High
Pure GMO Sample Preparation Kit. (d) The MagNA Pure LC system.

R20 R50 S1 S4 T2 T3 T4 T7 R20 S1 T4 PS M
M S1 R20 M T4 PS
PS LS R20 T4 M
Testarea OMG

205
mrimi reduse, ce indic degradarea ADN-ului. Aceste fragmente apar sub form de pete
sau dre (smear). Uneori dra nsoete benzile sau petele. Dac n subcapitolul anterior
s-a subliniat faptul c extractele obinute din boabe sau fin/MRC-uri au concentraii
similare cu cele obinute din texturate, acum se pot observa clar diferenele dintre cele
dou tipuri de matrici, concretizate i prin gradul de fragmentare.
Conform criteriilor minime de acceptabilitate enunate de ENGL (vezi ENGL,
2008), extractul utilizat pentru testare trebuie s conin fragmente de ADN mai mari
dect ampliconii corespunztori celor dou sisteme de cuantificare. Exist ns situaii
(i.e. n general, n cazul probelor intens procesate, profilele electroforetice indic lipsa
ADN-ului nefragmentat) n care acest parametru nu poate fi verificat prin separare
electroforetic. De aceea, recomandam ca ntotdeauna, indiferent de rezultatele migrrii
n gel i cele ale determinrilor spectrofotometrice, amplificabilitatea extractului s fie
testet printr-o reacie (real-time) PCR specific taxonului.

3.5.2.4. Confirmarea absenei inhibitorilor PCR
3.5.2.4. Confirming the absence of PCR inhibitors

3.5.2.4.1. Design experimental
3.5.2.4.1. Experimental design

Pentru evaluarea efectului substanelor inhibitoare se recomand efectuarea unor
determinri real-time PCR, utiliznd diluii seriale ale extractului analizat. inta
amplificrilor este reprezent de o secven endogen (specific taxonului). n acest scop,
concentraiile extractelor analizate sunt ajustate la valoarea ce trebuie utilizat n cadrul
protocolului de cuantificare, iar din aceste soluii (denumite 1:1) sunt preparate diluii
seriale de factor patru (1:4, 1:16, 1:64, 1:256). Reaciile pot fi efectuate fr repetiii
(CRL-GMFF, 2007) sau n duplicat (Foti et al., 2006).
Dup efectuarea experimentelor, valorile C
T
ale soluiilor diluate sunt introduse
ntr-un grafic, n funcie de logaritmul factorului de diluiei. Utiliznd regresia liniar, se
construiete dreapta de regresie (trend line), iar apoi se determin parametri de interes ai
reaciei de amplificare.
Testarea OMG

206
n urmtoarea etap, valoarea C
T
a probei nediluate este determinat prin
extrapolare cu ajutorul ecuaiei de regresie liniar, iar apoi este comparat cu valoarea C
T

msurat pentru acest prob. Diferena (C
T
) mai mic de 0,5 ntre cele dou valori
indic o influen redus, sau chiar absena inhibitorilor.
Un exemplu de concepere (designul experimental) a unui astfel de experiment este
prezentat n Figura 65.


(a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
1
WD
1
WD
1
1:4
1
1:4
1
1:16
1
1:16
1
1:64
1
1:64
1
1:256
1
1:256
2
WD
2
WD
B
2
1:4
2
1:4
2
1:16
2
1:16
2
1:64
2
1:64
2
1:256
2
1:256
3
WD
3
WD
3
1:4
3
1:4
C
3
1:16
3
1:16
3
1:64
3
1:64
3
1:256
3
1:256
4
WD
4
WD
4
1:4
4
1:4
4
1:16
4
1:16
D
4
1:64
4
1:64
4
1:256
4
1:256
5
WD
5
WD
5
1:4
5
1:4
5
1:16
5
1:16
5
1:64
5
1:64
E
5
1:256
5
1:256
6
WD
6
WD
6
1:4
6
1:4
6
1:16
6
1:16
6
1:64
6
1:64
6
1:256
6
1:256
F
7
WD
7
WD
7
1:4
7
1:4
7
1:16
7 1:16
7
1:64
7
1:64
7
1:256
7
1:256
8
WD
8
WD
G
8
1:4
8
1:4
8
1:16
8
1:16
8
1:64
8
1:64
8
1:256
8
1:256
9
WD
9
WD
9
1:4
9
1:4
H
9
1:16
9
1:16
9
1:64
9
1:64
9
1:256
9
1:256
PC PC NTC NTC

y = -3.4048x + 21.3932
R
2
= 0.9978
18
20
22
24
26
28
30
32
34
-4 -3 -2 -1 0
log(1/dilution factor)
C
t
y = -3.2847x + 20.9080
R
2
= 0.9990
18
20
22
24
26
28
30
32
34
-4 -3 -2 -1 0
log(1/dilution factor)
C
t
Measured
Ct Ct Mean ACt
Expected
ACt Logarithm
1:4 22.97 -0.6021
22.83 22.90 1.88 2 -0.6021
1:16 24.77 -1.2041
24.90 24.83 1.93 2 -1.2041
1:64 26.93 -1.8062
26.81 26.87 2.04 2 -1.8062
1:256 28.74 -2.4082
28.88 28.81 1.94 2 -2.4082
Measured
Ct Ct Mean
Extrapol.
Ct
21.064
20.963 21.01 20.91 0.11
Measured
Ct Ct Mean ACt
Expected
ACt Logarithm
1:4 23.37 -0.6021
23.59 23.48 1.81 2 -0.6021
1:16 25.49 -1.2041
25.42 25.45 1.98 2 -1.2041
1:64 27.60 -1.8062
27.45 27.52 2.07 2 -1.8062
1:256 29.46 -2.4082
29.77 29.62 2.09 2 -2.4082
Measured
Ct Ct Mean
Extrapol.
Ct
21.71
21.62 21.66 21.39 0.27
1 A
Working dilution
Working dilution
Extrapol. - Mean Ct
Sample code :
Dilution factor
Dilution factor
Sample code :
Ok
1 B
Ok
Extrapol. - Mean Ct

y = - 2.3920x + 24.5082
R
2
= 0.9374
18
20
22
24
26
28
30
32
34
-4 -3 -2 -1 0
log(1/dilution fact or)
C
t
y = - 2.7592x + 23.8056
R
2
= 0.9604
18
20
22
24
26
28
30
32
34
-4 -3 -2 -1 0
log(1/dilution fact or)
C
t
Measured
Ct Ct Mean ACt
Expected
ACt Logar ithm
1:4 26.44 -0.6021
26.35 26.40 3.36 2 -0.6021
1:16 26.88 -1.2041
26.69 26.78 0.39 2 -1.2041
1:64 28.75 -1.8062
28.62 28.68 1.90 2 -1.8062
1:256 30.55 -2.4082
30.58 30.57 1.88 2 -2.4082
Measured
Ct Ct Mean
Extrapol.
Ct
23.13
22.94 23.04 24.51 1.47
Measured
Ct Ct Mean ACt
Expected
ACt Logar ithm
1:4 25.72 -0.6021
25.99 25.85 2.94 2 -0.6021
1:16 26.71 -1.2041
26.69 26.70 0.85 2 -1.2041
1:64 28.52 -1.8062
28.45 28.48 1.78 2 -1.8062
1:256 30.75 -2.4082
30.84 30.80 2.31 2 -2.4082
Measured
Ct Ct Mean
Extrapol.
Ct
22.87
22.97 22.92 23.81 0.89
Working dil ution
Extr apol . - Mean Ct
Extr apol . - Mean Ct
Sample code :
Di lution factor
Sample code : 2B
Di lution factor
Out of
A.C.
2A
Working dil ution
Out of
A.C.

(b) (c)
Fig. 65. Evaluarea efectului inhibitorilor PCR. (a) Exemplu de setare a unui experiment de evaluare a efectului
substanelor inhibitoare. Sunt analizate nou extracte de ADN (1-9), fiecare nediluat (WD) i n patru diluii seriale
(1:4, 1:16, 1:64, 1:256). Toate probele sunt analizate n duplicat. O prob de control pozitiv (PC) i una de control a
reactivilor (NTC) sunt de asemenea incluse n experiment. Trebuie avut n vedere c valoarea C
T
ateptat n cazul
diluiilor 1:4 este 2 (C
T
= log
2
4 = 2), iar valoarea ateptat pentru panta unei reacii PCR cu eficiena de 100% este
-3,32. Criteriile de acceptrabilitate sunt: C
T
< 0,5; -3,6 < valoarea pantei < -3,1; R
2
> 0,98. (b) Experimente n care
nu exist efect de inhibiie. (c) Experimente n care exist efecte de inhibiie.
Fig. 65. Assessment of PCR inhibitors. (a) Example of plate set-up for assessing the effect of inhibitors. nine
different DNA samples are anlized (1-9), each undiluted (WD) and in four serial dilutions (1:4, 1:16, 1:64, 1:256).
All samples are run in duplicate. A positive control (PC) and a reagent control (NTC) are also included in the
analysis.The expected C
T
value for fourfold dillutions is 2 (C
T
= log
2
4 = 2) and the expecte dslope for a PCR with
100% efficiency is -3.32. The acceptability criteria are as follows: C
T
< 0,5; -3,6 < slope < -3,1; R
2
> 0,98. (b)
Runs with no inhibition effect. (c) Runs in which inhibition of PCR is present.


Testarea OMG

207
3.5.2.4.2. Metoda de lucru
3.5.2.4.2. Working method

Analiza a fost efectuat pe platforma LightCycler 480 utiliznd kitul LightCycler
480 Probes Master (Roche). Kitul conine un master mix universal pentru reacii real-
time PCR n sistem TaqMan, iar primerii i sondele se adaug separat, n funcie de
secvena int.
Protocoalele real-time PCR folosite au la baz metodele descrise n SR EN ISO
21570:2006, Anexele B.1 i C.1. Cele dou sisteme au fost create pentru detecia ADN-
ului specific taxonului (i.e. soia), fiind utilizate i n cadrul unor protocoale de
cuantificare a evenimentului de transformare GTS 40-3-2.
Oligonucleotidele utilizate n cadrul acestei metode sunt prezentate n Tabelul 7,
lungimea ampliconului fiind de 81 pb. Compoziia master mixului i condiiile de
amplificare sunt prezentate n continuare, n Tabelul 8, respectiv Tabelul 9.


Tabelul 7.
Primeri i sonde utilizate n combinaie cu kitul LightCycler 480 Probes Master
Primers and probes used in combination with the LightCycler 480 Probes Master Kit
Denumitre
Name
int
Target
Secven 5-3
5- 3 sequence
Surse
References
Lectin-F
Lectin-R
Lectin-TMP*
Gena Le1
de la soia
TCC ACC CCC ATC CAC ATT T
GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA
FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA
Debode et al. (2007); Brodmann et al. (2002), n
Cankar et al. (2006); Foti et al. (2006); SLMB**
(2000), n SR EN ISO 21570:2006; Taverniers et al.
(2001).
* Sond TaqMan.
** SLMB - Schweizerisches Lebensmittelbuch (Swiss Food Manual).


Amestecurile de reacie i programele de amplificare prezentate anterior au fost
ntocmite pe baza informaiilor din standardul SR EN ISO 21570:2006 i a instruciunilor
kitului LightCycler 480 Probes Master (Roche, 2006b). n Anexa VII este prezentat
modul de setare a reaciilor aferente acestei metode.


Testarea OMG

208
Tabelul 8.
Master mix ul utilizat pentru evaluarea efectului inhibitorilor PCR
PCR reaction master mix used to assess the effect of the PCR inhibitors
Concentraie final
Final concentration
Volum pentru o reacie (l)
Volume for one reaction (l) Reactiv
Reagent Soia
Soybean
Porumb
Maize
Soia
Soybean
Porumb
Maize
H
2
O pentru PCR* - - 4,2 6,48
Primer F, 10 M 0,9 M 0,3 M 1,8 0,6
Primer R, 10 M 0,9 M 0,3 M 1,8 0,6
Sond TaqMan, 10 M 0,1 M 0,16 M 0,2 0,32
Master (2x)* 1x 1x 10 10
Volum total master mix 18 l
ADN** 2 l
* Reactiv inclus n kitul LightCycler 480 Probes Master.
** Maxim 40 ng/l conform protocoalelor originale. Concentraia utilizat n cadrul experimentelor a fost de
aproximativ 50 ng/l.


Tabelul 9.
Program de amplificare pentru sistemul LightCycler 480
Amplification program for the LightCycler 480 system
Etap
Step
Parametri temperatur/timp
Temperature/time parameters
Cicluri
Cycles
Mod de analiz
Analisys mode
Incubare 95 C, 10 min 1 -
Denaturare 95 C, 15 sec
Alipire 60 C, 25 sec Amplificare
Extensie 72 C, 10 sec
45
Cuantificare, achiziie
semnal n etapa de
extensie (mod Single)
Rcire 40 C, 10 sec 1 -


n Figura 66 sunt prezentate datele i rezultatele obinute n cadrul a dou astfel de
analize. n primul caz (Figura 66a), curba de regresie ndeplinete condiiile de
acceptabilitate (i.e. R
2
> 0,98, panta cuprins ntre -3,6 i -3,1), iar valoarea C
T
teoretic
corespunztoare diluiei 1:1, extrapolat cu ajutorul ecuaiei de regresie, este de 24,94.
Dat fiind faptul c valoarea C
T
msurat este 24,67 i deci C
T
< 0,5, se poate
concluziona c n acest exemplu nu apare efectul de inhibiie.
n schimb, curba de regresie construit cu datele obinute n cel de-al doilea
experiment indic o amplificare defectuoas (Figura 66b). Condiiile de acceptabilitate nu
Testarea OMG

209
sunt satisfcute n ntregime (ex. panta > -3,1), iar diferena (C
T
) dintre cele dou valori
(teoretic i calculat) corespunztoare diluiei 1:1, este mai mare de 0,5.





Diluia


Valoarea CT (media a
dou determinri
paralele)
1:1 24,67
1:4 26,88
1:16 28,78
1:64 30,72
n
u
m

r

c
i
c
l
u
r
i

d
e

a
m
p
l
i
f
i
c
a
r
e


log(factorul de diluie)

1:256 32,36
(a)




Diluia



Valoarea CT (media a
dou determinri
paralele)
1:1 24,48
1:4 26,7
1:16 28,73
1:64 30,58
c
l
u
r
i

d
e

a
m
p
l
i
f
i
c
a
r
e

log(factorul de diluie)

1:256 31,7
(b)
Fig. 66. Evaluarea efectului inhibitorilor PCR n cazul a dou extracte ADN. 1:1 reprezint un
extract brut a crui concentraie de ADN a fost ajustat la 50 ng/l. (a) Datele obinute indic lipsa
inhibiiei. (b) Datele obinute indic prezena inhibiiei.
Fig. 66. Assessment of PCR inhibition for two DNA extracts. 1:1 represents a DNA extract with its
DNA concentration adjusted to 50 ng/l. (a) Data are indicating absence of PCR inhibition. (b) PCR
inhibition is present, as suggested by experimental data.


Acest model analitic, recomandat i utilizat de CRL-GMFF pentru evaluarea
efectului inhibitorilor, a fost preluat de alte studii (ex. Cankar et al., 2006, Waiblinger et
al., 2006, sau SR EN ISO 21570:2006) care au subliniat necesitatea ca ntotdeauna
nainte de cuantificarea propriu-zis s fie efectuat analiza inhibiiei prin amplificarea
real-time PCR a unei secvene de referin n cadrul unei serii de diluii a probei
Testarea OMG

210
analizate. De asemenea, determinarea concentraiei relative a unei secvene endogene
poate fi utilizat i pentru compararea mai multor metode de extracie sub aspectul
cantitii totale de ADN amplificabil recuperat dintr-o prob (Smith i Maxwell, 2007).
Efectul substanelor inhibitoare asupra cineticii amplificrii poate fi de mai multe
feluri. Acestea au fost exemplificate de Moens et al. (2005) prin analiza real-time PCR a
unei serii de diluii n care au fost amplificate n paralel o secven specific taxonului
sau organismelor vegetale (control intern) i o secven de ADN plasmidial (control
extern/spike). n Figura 67 sunt prezentate dou modele de evoluie a curbei de
amplificare (unul pentru inta endogen, cellalt pentru inta extern) n cazul extractului
fr efect de inhibiie.



(a)

(b)
Fig. 67. Amplificri real-time PCR ale unor extracte n care nu este prezent efectul de inhibiie. (a)
Detecia unei gene endogene ntr-o serie de diluii de factor opt ale aceluiai extract. Curbele de
amplificare sunt paralele i la o diferen de trei cicluri (C
T
= 3) ntre dou diluii succesive. Aceast
diferen corespunde factorului de diluie 8. (b) Detecia unei secvene int externe (plasmid) adugat
(spiked) n cantiti egale n cele trei diluii seriale. Curbele de amplificare sunt aceleai.
Fig. 67. Real-time PCR runs for DNA extracts with no inhibitory effect. (a) Detection of an endogenous
target on an eight-fold dilution series of the same DNA extract. Amplification curves are parallel and with
a difference of three cycles (C
T
= 3) between two consecutive dilutions. The difference corresponds to
eight-fold dilutions. (b) Detection of an external target (plasmid) added (spiked) in equal concentrations
in the three sample of the dilution series. The amplification plots are the same (superposed).
Surs: Moens et al. (2005).


Cea mai important concluzie a studiului citat anterior, se refer la existena a
dou tipuri principale de efecte de inhibiie:
- primul se caracterizeaz prin reducerea eficienei de amplificare de-a lungul
ntregii reacii (Figura 68); apariia semnalului aferent valorii C
T
este de
obicei ntrziat;
X plasmid
Testarea OMG

211
- n al doilea caz, eficiena este redus doar n primele cicluri (Figura 69);
semnalul fluorescent este generat cu intrziere i deci valoarea C
T
este mai
mare; alura curbei de amplificare este ns normal.



(a)

(b)
Fig. 68. Amplificri real-time PCR ale unor extracte n care apare primul tip de inhibiie. (a) Detecia unei
gene endogene ntr-o serie de diluii de factor opt ale aceluiai extract. Inhibiia reaciei de amplificare este
evident n cazul probei nediluate (1). (b) Detecia unei secvene int externe (plasmid) adugat (spiked)
n cantiti egale n cele trei diluii seriale, precum i ntr-o prob separat. Inhibiia reaciei de amplificare
este evident n cazul probei nediluate (1) i n cazul celei diluate de opt ori (8X).
Fig. 68. Real-time PCR runs for DNA extracts with no inhibitory effect. (a) Detection of an endogenous
target on an eight-fold dilution series of the same DNA extract. The inhibition is visible in the case of the
undiluted sample (1). (b) Detection of an external target (plasmid) added (spiked) in equal concentrations
in the three sample of the dilution series, and in an independent reaction. The undilauted sample (1) and
the eight-fold dilution (8X) are affected by inhibition.
Surs: Moens et al. (2005).



(a)

(b)
Fig. 69. Amplificri real-time PCR ale unor extracte n care este prezent al doilea tip de inhibiie. (a)
Detecia unei gene endogene ntr-o serie de diluii de factor opt ale aceluiai extract. Inhibiia reaciei de
amplificare este evident n cazul probei nediluate (1). (b) Detecia unei secvene int externe (plasmid)
adugat (spiked) n cantiti egale n cele trei diluii seriale, princum i ntr-o prob separat. Inhibiia
reaciei de amplificare este evident n cazul probei nediluate (1) i n cazul celei diluate de opt ori (8X).
Fig. 69. Real-time PCR runs for DNA extracts with no inhibitory effect. (a) Detection of an endogenous
target on an eight-fold dilution series of the same DNA extract. The inhibition is visible in the case of the
undiluted sample (1). (b) Detection of an external target (plasmid) added (spiked) in equal concentrations in
the three sample of the dilution series, and in an independent reaction. The undilauted sample (1) and the
eight-fold dilution (8X) are affected by inhibition.
Surs: Moens et al. (2005).


X
X
plasmid
X
plasmid
Testarea OMG

212
Datele sugereaz c n cel de-al doilea caz inhibiia apare doar n ciclurile iniiale,
cnd rezultatul amplificrii nu este nc vizibil. Spre deosebire, primul tip de inhibiie
este permanent, de-a lungu ntregii reacii de amplificare. Ipoteza care ncearc s explice
aceste efecte se bazeaz pe existena unor molecule cu mecanisme diferite de aciune. n
cazul n care proba nu este analizat n mai multe repeteii sau n diluii seriale, exist
posibilitatea ca inhibiia (mai ales din cea de-a doua categorie) s rmn nedetectat.
Efectul de inhibiie va constitui astfel o surs de eroare (bias) pentru analiz.

3.5.2.5. Compararea metodelor de extracie pe baza criteriilor economice
3.5.2.5. Comparizon of extraction methods based on economical criteria

Compararea metodelor de extracie sub aspect economic se va face avnd n
considerare urmtorii parametri: timpul necesar pentru procesarea unui lot de probe,
costul unei probe, dotrile necesare. n continuare sunt sintetizate cteva concluzii
desprinse din activitatea pe care am desfurat-o.
Cea mai ieftin extracie se realizez utiliznd protocolul CTAB. Costul unei
probe a fost ns mai greu de aproximat n acest caz, motiv pentru care s-a ales ca
referin metoda DNeasy, celelalte costuri fiind redate ca multipli ai acesteia (Tabelul
10). Datele referitoare la costuri pot varia semnificativ n funcie de cursul valutar i
preurile oferite de distribuitori, iar modificarea costurilor aferente unei metode va fi
independent de celelalte metode.
Creterea numrului de probe procesate n paralel va permite eficientizarea
utilizrii diferitelor resurse (ex. timp sau resurse materiale). De exemplu, n cazul
sistemului MagNA Pure LC, dublarea numrului de probe (de la 16 la 32) nu atrage dup
sine dublarea timpului de lucru, dar eficiena maxim din punct de vedere al consumului
de reactivi se realizeaz doar dac sunt procesate loturi echivalente cu capacitatea
maxim de lucru a aparatului (i.e. 32 probe).
n ceea ce privete dotrile de care laboratorul trebuie s dispun, acestea sunt
asemntoare n cazul tuturor metodelor, cu excepia celor automatizate care necesit n
plus prezena sistemului robotizat de efectuare a extraciilor.

Testarea OMG

213
Tabelul 10.
Evaluarea metodelor de extracie din punct de vedere economic
Economical assessment of extraction method performance
Metod
Method
Timp necesar
1
(min)
Assay time(min)
Cost/prob
2

Cost/sample
CTAB 300 0,3
DNeasy Plant Mini Kit 70 1
QIAamp DNA Stool Kit 70 1,6
High Pure GMO Sample Preparation Kit 70 3,6
Maxwell 16 Tissue DNA Purification Kit 50
3
1,8
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I 110
4
1,5
1
Nu s-a inut cont nici de timpul necesar pentru cntrirea probelor i pregtirea soluiilor de lucru.
2
Nu au fost incluse costurile materialelor de uz general (ex. vrfuri de pipete, tuburi de reacie, mnui sterile).
3
Nu include etapa de pretratament a probelor (~120 min).

4
Nu include etapa de pretratament a probelor (~60 min).


3.5.2.6. Considerente generale refertioare la testarea metodelor de extracie
3.5.2.5. General considerations on the testing of DNA extraction methods

n cazul kitului DNeasy Plant Mini i al extraciei automatizate cu sistemul
Maxwell 16, rezultatele obinute n final au fost total nesatisfctoare.
Sistemul Maxwell 16 a fost utilizat conform indicaiilor productorului (Koller i
Storts, 2006; Promega, 2006). Koller i Storts (2006) constituie singura surs identificat
n literatura de specialitate, care descrie utilizarea sistemului Maxwell 16 pentru izolarea
i purificarea ADN-ului din boabe de soia, extractele obinute corespunznd parametrilor
analizelor real-time PCR. n experienele desfurate n cadrul laboratorului nostru,
extractele obinute, att din texturate proteice, ct i din boabe de soia, nu au fost ns
corespunztoare pentru amplificare. S-au nregistrat concentraii foarte reduse de ADN,
ceea ce sugereaz o slab capacitate de recuperare, iar amplificarea secvenelor de interes
nu a fost posibil, fie datorit prezenei unei cantiti reduse de ADN amplificabil, fie
datorit eliminrii insuficiente a inhibitorilor PCR.
n contrast, DNeasy este unul dintre cele mai utilizate protocoale de extracie n
cadrul analizelor OMG. n vederea sporirii eficienei, diferii autori au recomandat
modificri ale protocolului de baz (ex. mrirea cantitii probei test sau creterea
perioadei i temperaturii de incubare n etapa de liz celular). Cu toate c s-a inut cont
Testarea OMG

214
i de aceste sugestii, rezultatele obinute au fost slabe. Trebuie menionat c cel puin n
cazul boabelor i a finii, majoritatea surselor bibliografice au indicat obinerea unor
extracte foarte bune. Cauzele care au determinat obinerea performanelor slabe n cadrul
laboratorului nostru nu au fost identificate. Rezultate slabe sunt ns de ateptat n cazul
utilizrii kitului DNeasy pentru izolarea ADN-ului din matrici procesate (Cankar et al.,
2006; Terry et al., 2002, n Corbisier et al., 2005), motiv pentru care Rott et al. (2004) i
Tengel et al. (2001) au preferat folosirea metodei QIAamp.
n ceea ce privete metoda pe baz de CTAB, sunt disponibile o multitudine de
variante (vezi Tabelul 5), mai mult sau mai puin asemntoare. Aceasta rmne probabil
cea mai versatil metod i cu siguran cea mai ieftin, fiind preferat de multe grupuri
de cercetare (ex. Zhou et al., 2007, Kunert et al., 2006, Moens et al., 2005, Querci et al.,
2005, sau Somma, 2004).
Rezultatele testrii comparative a celor ase metode de extracie sunt sintetizate n
Figura 70.



Fig. 70. Compararea principalelor caracteristici de performan ale metodelor de extracie testate.
Fig. 70. Comparison of main performance characteristics of tested extraction methods.


Gradul de complexitate/dificultate se refer n primul rnd la implicarea
operatorului n fluxul de lucru i uurina n utilizare. n acest context, protocolul pe baz
de CTAB este cel mai laborios, iar metodele automatizate necesit cel mai redus efort din
partea operatorului.
n urma acestui experiment considerm c patru dintre metodele testate (i.e.
protocolul pe baz de CTAB i kiturile QIAamp DNA Stool Mini, HighPure GMO
Sample Preparation i MagNA Pure LC DNA Isolation) sunt potrivite pentru includerea
Testarea OMG

215
n cadrul analizelor de rutin. Este ns dificil gsirea uneia care s satisfac toate
necesitile i s ofere ntotdeauna rezultate optime. De aceea, n funcie de nevoile i
resursele laboratorului de testare, metoda pentru care se opteaz poate fi diferit.

3.5.3. Extracia ADN-ului n cadrul testrii OMG
3.5.3. DNA extraction for GMO testing

3.5.3.1. Design experimental
3.5.3.1. Experimental design

Izolarea ADN-ului n vederea testrii OMG se poate face conform schemei din
Figura 71. n experiment sunt incluse probele de control adecvate (subcapitolul 2.8.5), n
conformitate cu cerinele standardului SR EN ISO 24276:2006, iar pentru fiecare



Fig. 71. Designul experimental pentru extracia ADN-ului din probele necunoscute. P -
prob pozitiv de control a extraciei, B - proba neutr de control a extraciei, E - prob de
control pentru mediul de lucru.
Fig. 71. Experimental design used for extracting DNA from unknown samples. PE -
positive extraction control, E - environmental control.
Testarea OMG

216
prob necunoscut se efectueaz dou extracii paralele (SR EN ISO 21571:2006; Querci
et al., 2005; Germini et al., 2004). Foti et al. (2006) recomand efectuarea extraciilor n
triplicat. i n cazul acestor extracte se va determina concentraia ADN-ului, puritatea i
starea de fragmentare.

3.5.3.2. Rezultate i considerente generale
3.5.3.2. Results and general considerations

Datele prezentate n continuare au fost obinute utiliznd kitul QIAamp DNA
Stool Mini n cazul probelor pe baz de soia.
Din perspectiva laboratorului nostru, rezultatele determinrilor spectrofotometrice
pot fi sintetizate dup cum urmeaz:
- concentraiile extractelor obinute din texturate proteice din soia (granule,
felii/niele, cuburi) au fost relativ bune, situndu-se, n general, n
intervalul 180-300 ng/l i cu o medie de aproximativ 250 ng/l; n ceea ce
privete raporturile A
260
/A
280
i A
260
/A
230
, valorile s-au ncadrat, n general,
ntre 1,85 i 2,15, respectiv 2 i 2,15;
- concentraia medie a fost mai redus n cazul seminelor de soia
aproximativ 220 ng/l cu valori cuprinse ntre 180 i 270 ng/l;
raporturilor de puritate au avut aproximativ aceleai valori ca i n situaia
anterioar;
- n cazul probelor dificile (i.e. lapte de soia, crem vegetal de brnz, baton
energizant, pate) s-au nregistrat concentraii destul de reduse, sub 15 ng/l,
raporturile de puritate fiind de asemenea slabe;
- n cazul probelor sub form de tofu s-au obinut rezultate relativ bune,
concentraia ADN-ului depind 80 ng/l, iar valorile raporturilor de
puritate fiind de aproximativ 2,2;
- concentraia medie a extractelor din MRC-urile pentru soia MG a fost de
aproximativ 260 ng/l, variind ntre 160 ng/l i 400 ng/l; raporturile de
puritate au fost asemntoare cu ale primelor dou categorii de probe.
Testarea OMG

217
Starea de fragmentare a extractelor a fost evaluat prin migrare n gel de agaroz
i marcare cu EtBr, conform metodologiei descrise n subcapitolul 2.6.2, iar o parte din
rezultate sunt prezentate n Figura 72.


Fig. 72. Electroforez n gel de agaroz a extractelor de ADN obinute cu ajutorul kitului QIAamp DNA Stool Mini,
din probe ce conin soia. Probele: M, marker; S, semine soia; R, MRC; T, texturat proteic;CS, crem vegetal de
brnz; BE, baton energizant; B, proba neutr de control a extraciei.
Fig. 72. Gel electrophoresis of DNA extracts obtained with the QIAamp DNA Stool Mini Kit from samples
containing soybean. Samples: S, soybeans; R, CRM; T, textured soy protein; CS, soybean-based cheese analogue;
BE, candy bar; B, extraction blank.


Extracia la scar mrit (10X) este justificat mai ales n cazul probelor
procesate, obinndu-se concentraii de ADN de 2-4 ori mai mari dect n condiiile de
baz.
n cazul matricilor procesate sau compozite trebuie luai n considerare anumii
factori determinai de modul de obinere al acestora, care fac analizele moleculare dificile
sau chiar imposibile:
- operaiunile de procesare pot determina degradarea ADN-ului;
- matricile nalt rafinate (ex. amidon, lecitin, ulei sau izolate proteice),
folosite ca atare sau ca ingrediente, au un coninut redus de acizi nucleici
deoarece procedura de obinere urmrete, n general, separarea oricrui alt
material dect cel de interes (Weigel et al., 2001, n Smith i Maxwell,
2007);
- materialul MG poate fi prezent doar la nivelul unui ingredient care deine o
proporie redus ntreaga prob;
T7 T8 S1 S2 BE B M R20 T1 T2 T4 T5 CS T6 M
Testarea OMG

218
- matricile alimentare reprezint de obicei amestecuri complexe, putnd
astfel conine o serie de substane (ex. polizaharide, polifenoli sau lipide)
care afecteaz extracia sau amplificarea PCR (Holden et al., 2003, i
Porebski et al., 1997, n Ujhelyi et al., 2007; Cazzola i Petruccelli, 2006).
Att apa, ct i activitatea mecanic, valorile extreme ale pH-ului, temperatura i
activitatea enzimatic, sunt factori care pot cauza degradarea ADN-ului (Jonas et al.,
2001; Klein et al., 1998, n Engel et al., 2006; Corbisier et al., 2005; Wurz et al., 1999).
Acetia pot fi prezeni n cadrul fazei de procesare industrial, precum i n etapa de
extracie, iar influena lor poate fi considerabil (Engel et al., 2006), depinznd ns
foarte mult de modul n care interacioneaz ntre ei (sinergic sau antagonic).
Temperatura ridicat are impact negativ, att n cadrul procesrii industriale, ct i
n cel al procesrii analitice. Moleculele de ADN sunt fie fragmentate (Meyer et al.,
1994, i Ebbehoj i Thomsen, 1991, n Corbisier et al., 2005), fie denaturate (Corbisier et
al., 2005), ambele modificri afectnd n primul rnd etapa de evaluare a extractelor.
Chiar dac aceasta nu este critic, ulterior, amplificarea unui ADN puternic fragmentat va
rezulta ntr-un eec.
n timpul procesrii alimentare, apa va afecta n mod cert calitatea materialului
genetic din prob, datorit influenei sinergice pe care o are mpreun cu ceilali factori
enumerai anterior, precum i datorit faptului c favorizeaz intensificarea activitii
DNazelor (Rckold et al., 2001, n Corbisier et al., 2005). Pe de alt parte, n cadrul
procedurii de extracie, apa poate contribui pozitiv la recuperarea unei cantiti mai mari
de ADN. Astfel, Corbisier et al. (2005) au concluzionat c extractibilitatea ADN-ului a
fost mbuntit prin simpla expunere a finii la ap, fenomen remarcat i de ali autori i
care se datoreaz probabil faptului c pereii celulari sunt degradai prin umectare,
datorit condiiilor hipotonice. Efectul diferit al apei n cea de-a doua situaie se datoreaz
faptului c ceilali factori (ex. temperatur sau pH) sunt controlai. De aceea, temperatura
ct mai redus, dar pozitiv, parcurgerea ct mai rapid a protocolului de lucru i
utilizarea soluiilor de lucru tamponate vor favoriza obinerea unor extracte cu nsuiri
mai bune.
Pe lng degradare, un alt fenomen cu impact negativ asupra integritii
moleculeor de ADN este denaturarea. Aceasta este caracteristic n special matricilor
Testarea OMG

219
procesate, fiind cauzat de aciunea unor factori de stres externi (ex. temperatura, valorile
extreme ale pH-ului, srurile caotropice sau solvenii anorganici) ce intervin n cadrul
procesului tehnologic de obinere/prelucrare (Wikipedia, 2009g).
S-a remarcat de asemenea c exist o corelaie pozitiv ntre gradul de mrunire
al probei i extractibilitatea ADN-ului (Moreano et al., 2005a, n Engel et al., 2006).
Trebuie ns acordat o atenie deosebit creterii temperaturii n timpul mrunirii
probei, aceasta putnd determina reducerea considerabil a cantitii extrase de ADNdc
(Corbisier et al., 2005). Adugarea apei reduce influena termic negativ.
n ceea ce privete pH-ul, valorile reduse ale acestuia contribuie la fragmentarea
ADN-ului. Toate soluiile utilizate n cadrul procedurii de extracie au ns pH-ul
stabilizat la o valoare care nu afecteaz moleculele de interes.
Una dintre problemele majore ntlnite n cadrul testrii OMG, care deriv din
faza de extracie, este reprezentat de variaia considerabil a caracteristicilor soluiei de
ADN, idee subliniat de mai multe studii (Moens et al., 2005; Cankar et al., 2006).
Astfel, degradarea moleculelor de interes, precum i diferite substane inhibitoare sau
cantiti insuficiente de ADN pot mpiedica parial sau total reacia de amplificare.
Influena acestori factori reprezint o important surs de variabilitate, n special n cazul
analizelor real-time PCR. Dintre toi parametri de evaluare a extractelor, considerm
absena inhibitorilor ca fiind esenial, prere mprtit i de ali autori (ex. Cankar et
al., 2006, sau Rott et al., 2004).
Recuperarea unei cantiti ct mai mari de ADN este de asemenea foarte
important deoarece:
- trebuie avut n vedere faptul c aceasta un corespunde n totalitate ADN-
ului amplificabil;
- capacitatea de a efectua (corect) determinarea cantitativ se reduce n cazul
n care materialul MG se regsete ntr-o concentraie redus.
n cazul n care concentraia ADN-ului este prea sczut, se poate realiza
concentrarea acesteia cu ajutorul unor dispozitive speciale (i.e. Amicon Ultra-4
Centrifugal Filter Units, produse de Millipore) (Ujhelyi et al., 2007).
Trebuie avut n vedere c diluarea extractului n scopul obinerii concentraiei
optime de ADN va determina i reducerea efectului inhibitorilor copurificai (Smith i
Testarea OMG

220
Maxwell, 2007). n cazul n care ADN-ul este ns degradat, diluarea va putea determina
reducerea cantitii de ADN amplificabil sub limita de detecie/cuantificare.
Pentru a rezolva problema inhibitorilor se poate realiza o purificare suplimentar a
extractelor utiliznd, de exemplu, coloane cromatografice schimbtoare de ioni (anion
exchange chromatography colums/AECs) (Moens et al., 2005). Datorit complexitii i
timpului pe care l reclam, este ns dificil includerea unei astfel de proceduri n cadul
analizelor de rutin.
O alt posibil soluie n cazul inhibitorilor este reprezentat de agenii de
intensificare (enhancing agents) sau facilitare (facilitators) a reaciei PCR. Acetia au
efect antagonic inhibitorilor, avnd capacitatea de a reduce sau chiar de a nltura efectul
acestora (Moens et al., 2005). O serie dintre aceste substane (ex. BSA) sunt n
permanen utilizate ca ingrediente ale soluiei tampon pentru PCR.

3.6. TESTAREA OMG CALITATIV
3.6. QUALITATIVE GMO TESTING

3.6.1. Design experimental
3.6.1. Experimental design

n cadrul acestei etape se recomand efectuarea amplificrilor PCR n duplicat
(Querci et al., 2005; Germini et al., 2004) sau triplicat (Foti et al., 2006; Moens et al.,
2005) pentru fiecare extract (deci patru sau ase amplificri pentru fiecare prob
recepionat de laborator), precum i utilizarea probelor de control corespunztoare.
Structura unui experiment este prezentat grafic n Figura 73.
Pentru testarea soiei MG se poate utiliza ca prob pozitiv de control pentru ADN-
ul int (C+), MRC-ul ERM-BF410e (R20), cu un coninut de soia MG de 2%, iar ca
prob negativ de control pentru ADN-ul int (C-), MRC-ul ERM-BF411e (B20), cu un
coninut de 2% porumb Bt176.
Literatura de specialitate conine o multitudine de primeri destinai aplicaiilor din
acest domeniu, n cadrul activitilor pe care le-am desfurat fiind utilizai cei prezentai
n Tabelul 11.
Testarea OMG

221


F
i
g
.

7
3
.

D
e
s
i
g
n
u
l

e
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

p
e
n
t
r
u

t
e
s
t
a
r
e
a

O
M
G

c
a
l
i
t
a
t
i
v

.

E

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

p
e
n
t
r
u

m
e
d
i
u
l

d
e

l
u
c
r
u
;

B

-

p
r
o
b


n
e
u
t
r


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

e
x
t
r
a
c

i
e
i
;

P

-

p
r
o
b


p
o
z
i
t
i
v


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

e
x
t
r
a
c

i
e
i
;

C
+

-

p
r
o
b


p
o
z
i
t
i
v


d
e

c
o
n
t
r
o
l

p
e
n
t
r
u

A
D
N
-
u
l

i
n
t

;

C
-

-

p
r
o
b


n
e
g
a
t
i
v


d
e

c
o
n
t
r
o
l

p
e
n
t
r
u

A
D
N
-
u
l

i
n
t

;

N
T
C

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

r
e
a
c
t
i
v
i
l
o
r
;

I

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

i
n
h
i
b
i

i
e
i

r
e
a
c

i
e
i

P
C
R
.

F
i
g
.

7
3
.

E
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

d
e
s
i
g
n

f
o
r

q
u
a
l
i
t
a
t
i
v
e

G
M
O

t
e
s
t
i
n
g
.

E

-

e
n
v
i
r
o
n
m
e
n
t
a
l

c
o
n
t
r
o
l
;

B

-

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n

b
l
a
n
k
;

P

-

p
o
s
i
t
i
v
e

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n
;

C
+

-

p
o
s
i
t
i
v
e

D
N
A

t
a
r
g
e
t

c
o
n
t
r
o
l
;

C
-

-

n
e
g
a
t
i
v
e

D
N
A

t
a
r
g
e
t

c
o
n
t
r
o
l
;

N
T
C

-

a
m
p
l
i
f
i
c
a
t
i
o
n

r
e
a
g
e
n
t

c
o
n
t
r
o
l
;

I

-

P
C
R

i
n
h
i
b
i
t
i
o
n

c
o
n
t
r
o
l
.

Testarea OMG

222
Tabelul 11.
Primerii utilizai pentru detecia secvenelor int
Primers used to detect target sequences
Primeri
Primers
inta
Target
Secvena 5- 3
5- 3 sequence
Amplicon (pb)
Amplicon (bp)
Surs bibliografic
Reference
CP3
CP4
Secvena
trnL*
GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC
CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG
> 500 Thion et al. (2002)
GM03
GM04
Gena Le1
GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C
GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG
118
Ujhelyi et al. (2007)
Cardarelli et al. (2005)
Querci et al. (2004b)
Meyer i Jaccaud (1997)**
Meyer et al. (1996)**
Rott et al. (2004)
Thion et al. (2002)
Gachet et al. (1999)
Lektin1
Lektin6
Gena Le1
GAC GCT ATT GTG ACC TCC TC
GAA AGT GTC AAG CTT AAC AGC GAC G
318
Abdullah et al. (2006)
Tengel et al. (2001)
p35S-cf3
p35S-cr4
Promotorul
35S
CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG
TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C
123
Cardarelli et al. (2005)
Querci et al. (2004b)
Lipp et al. (2001)**
CaMV1
CaMV2
Promotorul
35S
GAA GGT GGC TCC TAC AAA TGC C
GTG GGA TTG TGC GTC ATC CC
199
Thion et al. (2002)
Wolf et al. (2000)
HA-nos 118f
HA-nos 118r
Terminatorul
nos
GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG
GAC ACC GCG CGC GAT AAT TTA TCC
118
Ujhelyi et al. (2007)
Abdullah et al. (2006)
Cardarelli et al. (2005)
SR EN ISO 21569:2006)
Querci et al. (2004b)
Lipp et al. (2001)**
RR01
RR04
Ev. de transf.
GTS 40-3-2
TGG CGC CCA AAG CTT GCA TGG C
CCC CAA GTT CCT AAA TCT TCA AGT
356
Abdullah et al. (2006)
Tengel et al. (2001)
Kppel et al. (1997), n Studer
et al. (1998)
GM05
GM09
Ev. de transf.
GTS 40-3-2
CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG
CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT
447
Angonesi Brod et al. (2007)
Cardarelli et al. (2005)
Querci et al. (2004b)
Gachet et al. (1999)
Studer et al. (1998)
Mayer i Jaccaud (1997)**
GM07
GM08
Ev. de transf.
GTS 40-3-2
ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA
TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA
169
Angonesi Brod et al. (2007)
Cazzola i Petruccelli (2006)
Querci et al. (2004b)
Gachet et al. (1999)
Studer et al. (1998)
Meyer i Jaccaud (1997)**
* Specific genomului cloroplastelor.
** Citai de Querci i Mazzara (2004b).


Primerii sunt livrai, n general, sub form liofilizat, iar n vederea obinerii
soluiilor stoc (100 M), resuspendarea se face n ddH
2
O, conform indicaiilor din fiele
tehnice ale primerilor.
Cteva exemple de accesiuni din baza de date GenBank, care pot fi utilizate pentru
designul primerilor destinai testrii OMG la soia Roundup Ready (evenimentul de
transformare GTS 40-3-2), sunt:
Testarea OMG

223
- AB209952 i K00821 pentru gena lectinei de la soia;
- V00141 i A18053 pentru CaMV;
- V00087 pentru gena nos de la A. tumefaciens;
- AR342204 i AY592954 pentru evenimentul de transformare propriu-zis.
n continuare este prezentat un master mix care a fost testat i poate fi utilizat n
cazul fiecrei perechi de primeri menionate n Tabelul 11. Volumul final al reaciei este
de 25 l, reactivii i cantitile necesare pentru pregtirea master mixului fiind prezentate
n Tabelul 12. Toate pipetrile trebuie efectuate ntr-o hot cu flux laminar de aer steril i
meninnd tuburile cu reactivi la temperatura de aproximativ 4 C. Este recomandat
omogenizarea tuburilor cu reactivi nainte i dup realizarea amestecurilor de reacie.


Tabelul 12.
Master mix utilizat pentru reaciile PCR
PCR reaction master mix
Reactiv
Reagent
Concentraie final
Final concentration
Volum pentru o prob (l)
Volume for one sample (l)
ddH
2
O - 13,85
Tampon PCR 5X, 7,5 mM MgCl
2
1X, 1,5 mM 5
Soluie MgCl
2
,

25 mM 1 mM 1
Soluie dNTPs, 10 mM 0,2 mM 0,5
Primer F, 10 M 0,5 M 1,25
Primer R, 10 M 0,5 M 1,25
ADN polimeraz, 5 U/l 0,03 U/l 0,15
Volum total 23 l
ADN 2


n cazul programului de amplificare (Tabelul 13) doar temperatura de alipire a
primerilor va diferi, de la caz la caz, celelalte etape fiind identice. Modelul de thermal
cycler utilizat pentru efectuarea amplificrilor n cadrul laboratorului nostru este
prezentat n Figura 74.
Modul de setare a reaciilor PCR este prezentat n Anexa VIII.


Testarea OMG

224
Tabelul 13.
Programul de amplificare utilizat pentru testarea calitativ a OMG-urilor
PCR amplification program for GMO qualitative testing
Etap
Step
Temperatur (C)
Temperature (C)
Timp (secunde)
Duration (seconds)
Nr. repetiii
No. of repeats
Denaturare iniial 95 180 1
Denaturare 95 30
Alipirea primerilor 60*, 62** sau 63*** 30
Extensie 72 30
40
Extensie final 72 180 1
* Pentru seturile de primeri Lektin1/Lektin6, ZEIN3/ZEIN4, RR01/RR04, GM05/GM09, GM07/GM08,
CRYIA1/CRYIA2 i CRYIA3/CRYIA4.
** Pentru seturile de primeri p35S-cf3/p35S-cr4 i HA-nos 118f/HA-nos 118r.
*** Pentru seturile de primeri CP3/CP4, GM03/GM04 i CaMV1/CaMV2.



Fig. 74. Aparatul PalmCycler (Corbett Research) utilizat pentru amplificrile PCR.
Fig. 74. PalmCycler (Corbett Research) instrument used for PCR amplification.


3.6.2. Detecia ADN-ului specific taxonului
3.6.2. Taxon-specific DNA detecion

Analiza are rolul de a confirma prezena ADN-ului amplificabil n proba extras.
Cu alte cuvinte, se testeaz pretabilitatea extractului la PCR, eliminndu-se astfel
posibilitatea nregistrrii unor rezultate fals negative n etapele ulterioare (Hhne et al.,
2002, n Reiting et al. 2007; Abdullah et al., 2006; Forte et al., 2004; Querci et al.,
2004b; Rott et al. 2004). Acestea ar putea fi generate n cazul n care parametri
Testarea OMG

225
extractului (i.e. cantitate, puritate, integritate) nu sunt corespunztori pentru
experimentele PCR.
n aceast etap se urmrete amplificarea i detecia unui fragment dintr-o gen
(denumit gen endogen sau gen de referin) specific taxonului din care deriv
evenimentul de transformare. Aceste gene sunt cele utilizate i n cadrul cuantificrii
relative a coninutului de OMG-uri prin real-time PCR (Querci i Mazzara, 2004b). n
cazul soiei, ca gen de referin este utilizat n exclusivitate gena lectinei.
Conceptual, aceast etap nu face parte din categoria analizelor OMG propriu-
zise, ci constituie o metod de evaluare a extractelor de ADN i poate fi substituit n
dou moduri:
- amplificarea unei secvene de interes (de obicei aferent transgenei) ntr-un
amestec format din proba necunoscut i o prob pozitiv de control
(denumit control extern/spike) (Bickley i Hopkins, 1999, n Smith i
Maxwell, 2007; Tengel et al., 2001); acest tip de prob permite, practic,
evaluarea fenomenului de inhibiie (total);
- detecia i cuantificarea unei secvee de referin n cadrul unui experiment
real-time PCR; n acest caz se va analiza o serie de diluii ale extractului
obinut din proba de interes (vezi subcapitolul 2.6.3); aceast analiz va
indica clar prezena inhibitorilor i msura n care acetia acioneaz; n
celelalte dou cazuri se va observa doar inhibiia total, pentru a identifica
inhibiia parial fiind necesar i cuantificarea probei n cel puin dou
diluii (de obicei 1:1 i 1:10), n cadrul etapei de analiz cantitativ.
Primerii GMO3/GMO4 (Tabelul 11) au fost creai de Meyer et al., n 1996, pentru
detecia genei lectinei de la soia (Le1), iar apoi au fost utilizai de Meyer i Jaccaud, n
1997, n a doua faz a unui protocol de tip nested PCR (Figura 27) destinat amplificrii
ADN-ului extras din alimente procesate (Querci i Mazzara, 2004b). Fragmentul
amplificat are lungimea de 118 pb.
Pentru detecia genei Le1 a fost utilizat i perechea de primeri Lektin1/Lektin6
(Tengel et al., 2001) (Tabelul 11).
O alt strategie de evideniere a prezenei ADN-ului vegetal presupune
amplificarea unui segment din informaia genetic de la nivelul cloroplastelor. Protocolul
Testarea OMG

226
a fost publicat de Thion et al. (2002) i are ca elemente principale primerii CP3/CP4 ce
amplific un segment de 500-600 pb situat la nivelul secvenei trnL (Tabelul 11).
Evident, aceast metod nu permite discriminarea taxonilor.
Rezultatele utilizrii primerilor specifici taxonului soia, sunt prezentate n Figurile
75 i 76. Se poate remarca diferena de lungime ntre cei doi ampliconi, aspect ce poate fi
esenial n cazul testrii unor extracte obinute din matrici intens procesate. De asemenea,





Fig. 75. Testare PCR (detecia taxonului) a probelor ce conin soia, utiliznd primerii GM03/GM04. Probe: T,
texturat proteic de soia; S, semine de soia; LS, lapte de soia; CS, crem vegetal de brnz; BE, baton energizant;
PS, pate vegetal; E, prob de control pentru mediul de lucru; B, proba neutr de control a extraciei; C+, prob
pozitiv de control pentru ADN-ul int; C-, prob negativ de control pentru ADN-ul int; NTC, prob de control a
reactivilor; M, marker ADN.
Fig. 75. PCR testing (taxon detection) of soybean samples using GM03/GM04 primers. Samples: T, textured soy
protein; S, soybeans; PS, vegetarian pt containg soybean; CS, soybean-based cream cheese analogue; BE, candy
bar; LS, soymilk; E, environmental control; B, extraction blank; C+, positive DNA target control; C-, negative DNA
target control; NTC, amplification reagent control; M, DNA ladder.
E B C+ C- NTC
118 pb
BE PS
M
150 pb
118 pb
S4 S5 LS CS
118 pb
E B C+ C- NTC
118 pb
T7 T8
M
150 pb
Testarea OMG

227

Fig. 76. Testare PCR (detecia taxonului) a probelor ce conin soia, utiliznd Lektin1/Lektin6. Probe: S, semine de
soia; E, prob de control pentru mediul de lucru; B, proba neutr de control a extraciei; C+, prob pozitiv de
control pentru ADN-ul int; C-, prob negativ de control pentru ADN-ul int; NTC, prob de control a reactivilor;
M, marker ADN.
Fig. 76. PCR testing (taxon detection) of soybean samples using Lektin1/Lektin6 primers. Samples: S, soybeans; E,
environmental control; B, extraction blank; C+, positive DNA target control; C-, negative DNA target control;
NTC, amplification reagent control; M, DNA ladder.



Fig. 77. Testare PCR (detecia ADN-ului vegetal) a probelor ce conin soia/porumb, utiliznd primerii CP3/CP4.
Probe: M, marker ADN; S, semine de soia; BP, boabe de porumb la conserv; R20, MRC soia RR; B20, MRC
porumb Bt176; CS, crem vegetal de brnz; N, mlai; T, texturat proteic de soia; F, fulgi de porumb; PS, pate
vegetal cu soia; NTC, prob de control a reactivilor.
Fig.77. PCR testing of maize samples using CP3/CP4 primers, specific for maize zein gene. Samples: M, DNA
ladder; S, soybeans; BP, canned maize kernels; R20, RRS CRM; B20, BT176 maize CRM; CS, soybean-based
cheese analogue; N, maize flour; T, textured soy protein; PS, vegetarian pt containg soybean; F, cornflakes;
NTC, amplification reagent control.


odat cu creterea gradului de procesare al probei s-a remarcat reducerea intensitii
benzilor. Acest rezultat era de ateptat n cazul analizei produselor alimentare procesate,
fiind datorat reducerii cantitii iniiale de ADN int i/sau prezenei inhibitorilor.
n Figura 77 sunt prezentate rezultate ale amplificrilor cu primerii CP3/CP4.
Apariia benzilor multiple (pistele CS i PS) este probabil datorat prezenei mai multor
500 pb

S1 BP CS N1 T1 T7 PS

600 pb

400 pb
S1 S2
M E B C+ C- NTC
318 pb
M R20 B20 F2 NTC

Testarea OMG

228
taxoni, regiunea amplificat nefiind perfect conservat la nivel interspecific. Autorii care
au utilizat aceti primeri au raportat obinerea unor ampliconi de 500-600 pb.
Dup cum se poate observa n imaginile anterioare (intensitatea benzilor),
amplificarea cu primerii CP3/CP4 se caracterizeaz printr-o sensibilitate mult mai mare
comparativ cu celelalte perechi de primeri deoarece, la nivelul celulei, informaia
genetic aferent cloroplastelor se regsete ntr-un numr mult mai mare de copii dect
cea nuclear. Dezavantajul metodei este reprezentat de imposibilitatea identificrii unui
anumit taxon.
Toate rezultatele prezentate n acest subcapitol au fost obinute n condiiile
descrise n subcapitolul 3.6.1.

3.6.3. Detecia rapid (screeningul) a OMG-urilor
3.6.3. GMO screening

Etapa de screening este necesar n cazul testrii unor probe despre care nu exist
informaii precise referitoare la coninut. Se are astfel n vedere posibilitatea prezenei n
probele analizate a mai multor taxoni i evenimente de transformare, identificndu-se
cele care nu conin material MG, n vederea eliminrii lor din etapele analitice ulterioare.
Practic, aceast strategie are ca scop reducerea volumului de munc i a consumului de
materiale.
Protocolul PCR trebuie astfel conceput nct s permit detecia unor elemente
genetice prezente n ct mai multe evenimente de transformare genetic. Cea mai
evident limit a acestei strategii este imposibilitatea deteciei tuturor OMG-urilor printr-
un numr redus de reacii (1-2), aspect discutat i n subcapitolul 2.7.3.

3.6.3.1. Detecia promotorului P-E35S
3.6.3.1. Detection of the P-E35S promoter

Promotorul 35S provenit de la CaMV reguleaz expresia genic a unui numr
mare de transgene, fiind prezent n numeroase evenimente de transformare. Pentru
detecia specific a acestui element regulator au fost utilizate seturile de primeri p35S-
Testarea OMG

229
cf3/p35S-cr4 i CaMV1/CaMV2 (Tabelul 11). Prima pereche a fost conceput de Lipp et
al. (2001) i amplific un fragment de 123 pb (Querci i Mazzara, 2004b). A doua
pereche, conceput de Wolf et al. (2000), permite obinerea unui amplicon de 199 pb.
Un exemplu de profil electroforetic obinut n urma amplificrii cu primeri
specifici promotorului P-E35S, este prezentat n Figura 78. Amplificrile au fost efectuate
n condiiile descrise n subcapitolul 3.6.1.



Fig. 78. Screening OMG utiliznd primeri specifici promotorului P-E35S (p35S-cf3/p35S-cr4). Probele:
S2, semine de soia; R20, MRC soia RR; E, prob de control pentru mediul de lucru; B, proba neutr de
control a extraciei; C+, prob pozitiv de control pentru ADN-ul int; C-, prob negativ de control
pentru ADN-ul int; NTC, prob de control a reactivilor; M, marker ADN.
Fig. 78. GMO screening using primers specific to the P-E35S promoter (p35S-cf3/p35S-cr4). Samples:
S1, soybeans; R20, RRS CRM; E, environmental control; B, extraction blank; C+, positive DNA target
control; C-, negative DNA target control; NTC, amplification reagent control; M, DNA ladder.


3.6.3.2. Detecia terminatorului T-nos
3.6.3.2. Detection of the T-nos terminator

Pentru detecia terminatorului nos s-au utilizat primerii HA-nos118f i HA-
nos118r (Tabelul 11) creai de Lipp et al. (2001) (Querci i Mazzara, 2004b). Reacia are
ca rezultat amplificarea unui fragment de 118 pb al secvenei netranslatate de la captul
3 (Reiting et al., 2007).
Profilul electroforetic obinut dup amplificarea cu primeri specifici
terminatorului nos este prezentat n Figura 79. Amplificrile au fost efectuate n condiiile
descrise n subcapitolul 3.6.1.


100 pb
S2 R20
M E B C- NTC
123 pb
Testarea OMG

230

Fig. 79. Screening OMG utiliznd primeri specifici terminatorului T-nos (HA-nos r/HA-nos f). Probele: S, semine
de soia; C+, prob pozitiv de control pentru ADN-ul int; C-, prob negativ de control pentru ADN-ul int;
NTC, prob de control a reactivilor; M, marker ADN.
Fig. 79. GMO screening using primers specific for the T-nos terminator (HA-nos r/HA-nos f). Samples: S, soybeans;
C+, positive DNA target control; C-, negative DNA target control; NTC, amplification reagent control; M, DNA
ladder.


3.6.3.3. Screeningul OMG utiliznd kitul Biogenics Standard
3.6.3.3. GMO screening using the Biogenics Standard Kit

Pentru screening se poate utiliza i kitul Biogenics Standard produs de Biotools
(http://www.biotools.eu). Acesta permite identificarea promotorului 35S i a
terminatorului nos i include de asemenea reacii de detecie a genei lectinei care indic
prezena soiei, a genei invertazei care indic prezena porumbului i a genei rbcL din
genomul cloroplastelor, care indic prezena materialului de origine vegetal.
Amplificrile se desfoar separat, conform pricipiilor PCR-ului clasic, iar
rezultatele amplificrii sunt evaluate prin electroforez n gel de agaroz i marcare cu
EtBr. Pentru validarea rezultatelor, kitul conine patru tipuri de probe pozitive de control:
pentru soia (denumit Soya Amplification Control), pentru porumb (denumit Maize
Amplification Control), pentru esut vegetal (denumit Plant Amplification Control) i
pentru P-35S i T-nos (denumit GMO Amplification Control). Fiecare dintre
secvenele int este prezent n soluie ntr-o concentraie de 10
6
copii/l (Biotools,
2007a). Pentru fiecare dintre cele cinci secvene int, proba pozitiv de control se obine
prin amestecarea soluiei stoc cu master mixul corespunztor, ntr-o proporie de 1:5.
n cadrul testelor pe care le-am efectuat, volumele indicate de productor n
documentaia kitului (vezi Biotools, 2007a) au fost reduse la jumtate. Aceast strategie a

118 pb
S1 S2 S3 S4 S5
C+ C- NTC M
100 pb
Testarea OMG

231
fost aplicat pentru a mri numrul reaciilor care pot fi efectuate cu un kit.
Modul de pregtire a amestecurilor de reacie este prezentat n Tabelul 14, iar
programul de amplificare n Tabelul 15.


Tabelul 14.
Pregtirea amestecurilor de reacie n cazul kitului Biogenics Standard
Preparation of reaction mixtures included in the Biogenics Standard Kit
Volum (l) pentru o prob
Volume (l) for one sample Reactiv
Reagent
35S nos
Porumb
Maize
Soia
Soybean
Plant
Plant
MgCl
2
1,25 1,25 1 1 1
Master mix* 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5
Polimeraz 0,7 0,7 0,6 0,5 0,5
ddH
2
O 10,55 10,55 10,9 11 11
ADN** 5 5 5 5 5
* Kitul include cinci tipuri de master mix, fiecare corespunznd uneia dintre cele cinci tipuri de reacii.
** Este recomandat includerea a 25-50 ng ADN ntr-un volum de reacie de 25 l.


Tabelul 15.
Programele de amplificare utilizate pentru kitul Biogenics Standard
PCR amplification programs used with the Biogenics Standard Kit
Specificitatea reacie
Reaction specificity Etap
Step 35S/nos/esut vegetal
35S/nos/plant tissue
Porumb
Maize
Soia
Soybean
Denaturare iniial 94 C/3 min 94 C/10 min 94 C/10 min
Denaturare 94 C/30 sec 94 C/30 sec 94 C/30 sec
Alipirea primerilor 55 C/40 sec 70 C/30 sec 60 C/30 sec
Extensie 72 C/60 sec 72 C/30 sec 72 C/60 sec
Numr de repetiii 45 40 40
Extensie final 72 C/3 min 72 C/10 min 72 C/3 min
Surs: Biotools (2007a).


Rezultatele unui astfel de experiment sunt prezentate n Figura 80. n Figura 80a
este exemplificat utilitatea extraciilor la scar mrit (i.e. creterea sensibilitii reaciei
Testarea OMG

232
de amplificare), soluiile de ADN obinute astfel (pistele PS* i TF*) genernd un semnal
mai intens dect cele obinute cu protocolul normal (pistele PS i TF).




(a)



(b)



(c)



(d)


Fig. 80. Screening OMG utiliznd kitul Standard. Probe: S, semine de soia; R, MRC soia RR; PS, PS*, pate vegetal
cu soia; TF, TF*, tofu; BS, biscuii ce conin soia; B20, MRC porumb Bt176; F, fulgi de porumb; BP, boabe de
porumb la conserv; N, mlai; E, prob de control pentru mediul de lucru; B, proba neutr de control a extraciei;
C+, prob pozitiv de control pentru ADN-ul int (n acest caz inclus n kit); C-, prob negativ de control pentru
ADN-ul int (B20 pentru soia i evenimentul de transformare GTS 40-3-2, respectiv R20 pentru porumb i
evenimentul de transformare Bt176); NTC, prob de control a reactivilor; M, marker ADN. (a) Detecia ADN-ului
specific soiei. (b) Detecia ADN-ului specific porumbului. (c) Detecia promotorului 35S. (d) Detecia terminatorului
nos.
Fig. 80. GMO screening using the Biogenics Standard Kit. Samples: S, soybeans; R, RRS CRM; PS, PS*, vegetarian
pt containg soybean; TF, TF*, tofu; BS, biscuits containing soybean; B, Bt176 maize CRM; F, cornflakes; BP
canned maize kernels; N, maize flour; E, environmental control; B, extraction blank; C+, positive DNA target
control (included in the kit); C-, negative DNA target control (B20 for soybean and GTS 40-3-2 transformation
event; R20 for maize and Bt176 transformation event); NTC, amplification reagent control; M, DNA ladder. (a)
Detection of soybean-specific DNA. (b) Detection of maize-specific DNA. (c) Detection of the 35S promoter. (d)
Detection of the nos terminator.
M C+ R50 R10 R10 PS PS* TF TF* S1 S2 BS S5 S6 C- NTC
100 pb
118 pb
M C+ B20 F1 F2 N1 N2 BP C- NTC
M C+ R50 R20 B20 S6 PS TF S1 S5 C- NTC
200 pb
225 pb
M C+ R10 R20 R50 S1 S6 NTC
200 pb
226 pb
200 pb
180 pb
Testarea OMG

233
3.6.4. Identificarea evenimentelor de transformare
3.6.4. Identification of transformation events

Probele pozitive din etapa de screening vor fi analizate n etapa urmtoare pentru
identificarea evenimentului/evenimentelor de transformare pe care le conin. Pentru
aceasta se vor folosi primeri specifici fiecrui eveniment de transformare. n general, se
folosesc protocoale PCR clasice sau nested PCR, cele din urm constituind metode de
detecie cu specificitate i sensibilitate mai mare. n Figura 81 sunt reprezentate tipurile
de secvene genice ce pot fi utilizate ca inte pentru reaciile PCR din cadrul unui protocol
integrat de testare OMG.
Metodele utilizate pentru transformarea plantelor determin integrarea
randomizat a construciilor n genomul plantei, una dintre consecine fiind unicitatea
secvenei regiunii de jociune dintre ADN-ul gazd i cel nou introdus (Berdal i Holst-
Jensen, 2001). Aceast regiune confer cel mai mare grad de specificitate evenimentului
de transformare i reprezint inta ideal pentru etapa de identificare. Urmeaz apoi
regiunile de jonciune ale elementelor construciei genice.
Detecia specific a casetei genice CTP/EPSPS din linia de soia Roundup Ready
poate fi efectuat cu diferii primeri, ca: GM09/GM05, GM08/GM07 i RR01/RR04
(Tabelul 11). Primele dou seturi au fost proiectate de Meyer i Jaccaud (1997) pentru
detecia specific a soiei Roundup Ready n cadrul unui protocol nested PCR (Figura 82)
(Querci i Mazzara, 2004b). Primerii externi, GM09 i GM05, sunt complementari genei
EPSPS, respectiv promotorului 35S, iar mrimea ampliconului este de 447 pb. Primerii
interni, GM08 i GM07, sunt complementari secvenei CTP de la petunia, respectiv
promotorului 35S, ncadrnd un fragment de 169 pb. Cel de-al treilea set a fost utilizat
pentru prima dat de Studer et al. (1998) i amplific o regiune de 356 pb
corespunztoare jonciunii EPSPS/CTP.
Primerii GM05/GM09 i GM07/GM08 au fost utilizai i n cadrul unei
amplificri de tip nested PCR, rezultatele fiind prezentate n Figura 83. Se poate observa
sensibilitatea diferit a amplificrii directe cu GM07/GM08 (pistele 2 i 4) comparativ cu
dubla amplificare (pistele 6 i 8).

Testarea OMG

234

F
i
g
.

8
1
.

T
i
p
u
r
i

d
e

s
e
c
v
e
n

e

g
e
n
i
c
e

s
p
e
c
i
f
i
c
e

O
M
G
-
u
r
i
l
o
r

c
a
r
e

p
o
t

f
i

a
m
p
l
i
f
i
c
a
t
e

n

c
a
d
r
u
l

a
n
a
l
i
z
e
l
o
r

d
e

d
e
t
e
c

i
e
,

i
d
e
n
t
i
f
i
c
a
r
e

i

c
u
a
n
t
i
f
i
c
a
r
e
.

F
i
g
.

8
1
.

T
y
p
e
s

o
f

G
M
O

s
p
e
c
i
f
i
c

g
e
n
i
c

s
e
q
u
e
n
c
e
s

w
h
i
c
h

c
a
n

b
e

u
s
e
d

w
i
t
h
i
n

d
e
t
e
c
t
i
o
n
,

i
d
e
n
t
i
f
i
c
a
t
i
o
n

a
n
d

q
u
a
n
t
i
f
i
c
a
t
i
o
n

a
n
a
l
y
s
e
s
.

D
u
p


Q
u
e
r
c
i

e
t

a
l
.

(
2
0
0
7
)

i

Q
u
e
r
c
i

e
t

a
l
.

(
2
0
0
5
)
,

m
o
d
i
f
i
c
a
t
.


Testarea OMG

235

Fig. 82. Strategii PCR de detecie a ADN-ului specific soiei Roundup Ready.
Fig. 82. PCR strategies for detecting DNA specific to Roundup Ready soybean.
Dup Pagette et al. (1995) n Meyer (1999), modificat.




Fig. 83. Detecia specific a soiei Roundup Ready n cadrul unui experiment de tip nested PCR utiliznd primerii
GM05/GM09 i GM07/GM08. Primele cinci probe au fost efectuate doar cu primerii GM07/GM08, iar urmatoarele
cinci reprezint a doua amplificare a protocolui nested PCR. Probe: M, marker; 1 i 5, extract din boabe de soia MG;
2 i 6, diluie 1:10 a extractului din boabe de soia; 3 i 7, extract din MRC cu coninut de soia MG de 5%; 4 i 8,
diluie 1:10 a extractului din MRC cu coninut de soia MG de 5%; NTC, prob de control a reactivilor.
Fig. 83. Specific detecion of Roundup Ready soybean using the primers GM05/GM09 and GM07/GM08 in a nested
PCR protocol.The first five samples were amplified with the primers GM07/GM08, while the next five correspond to
the second stage of the nested PCR. Samples: M, marker; 1 and 5, GM soybeans extract; 2 and 6, 1:10 dilution of
the GM soybean extract; 3 and 7, DNA extract from CRM containg 5% GM soybean; 4 and 8, 1:10 dilution of DNA
extract from CRM containg 5% GM soybean; NTC, amplification reagent control.


n Figura 84 sunt prezentate rezultatele obinute n condiiile descrise n
subcapitolul 3.6.1, utiliznd primerii GM09/GM05, GM08/GM07 i RR01/RR04.

M 1 2 3 4 NTC 5 6 7 8 NTC M
169 pb
447 pb
Testarea OMG

236

(a)

(b)

(c)

Fig. 84. Detecia specific a soiei Roundup Ready. Probele: S, semine de soia; C+, prob pozitiv de control pentru
ADN-ul int; C-, prob negativ de control pentru ADN-ul int; NTC, prob de control a reactivilor; M, marker
ADN. (a) Rezultatele amplificrii cu primerii GM05/GM09. (b) Rezultatele amplificrii cu primerii GM07/GM08. (c)
Rezultatele amplificrii cu primerii RR01/RR04.
Fig. 84. Specific detecion of Roundup Ready soybean. Samples: S, soybeans; C+, positive DNA target control; C-,
negative DNA target control; NTC, amplification reagent control; M, DNA ladder. (a) Results of PCR amplification
using GM05/GM09. (b) Results of PCR amplification using GM07/GM08. (c) Results of PCR amplification using
RR01/RR04.


3.6.5. Considerente generale referitoare la testarea calitativ
3.6.5. General considerations regarding the qualitative analysis

Nu considerm c aceast etap prezint dificulti deosebite, mai ales n cazul n
care se utilizeaz un protocol de lucru testat/validat n prealabil.
356 pb
S1 S2 S3 S4 S5
M C+ C- NTC
500 pb
S1 S2 S3 S4 S5
M C+ C- NTC
200 pb
500 pb
S1 S2 S3 S4 S5
M C+ C- NTC
447 pb
169 pb
Testarea OMG

237
Teoretic, lipsa produilor PCR specifici evenimentelor de transformare analizate
poate avea mai multe cauze:
- lipsa materialului MG din proba analizat;
- prezena materialului MG ntr-o cantitate foarte mic;
- degradarea ADN-ului n timpul procesrii, astfel nct analiza nu mai poate
fi efectuat;
- metodele utilizate nu sunt adecvate scopului propus (performanele
metodeluor sunt slabe).
Testarea calitativ poate fi efectuat i prin real-time PCR. Considerm c cea mai
potrivit abordare n acest sens este reprezentat de detecia cu ajutorul unei substane de
intercalare (vezi subcapitolul 2.9.9), datorit urmtoarelor avantaje:
- eliminarea etapei post-PCR; aceasta determin echilibrarea costurilor,
comparativ cu abordarea clasic, reducerea riscurilor de apariie a
contaminrilor ncruciate i reducerea timpului de lucru;
- costuri mai mici comparativ cu sistemul TaqMan;
- pretabilitate la multiplexing (vezi Hernandez et al., 2004a, 2004b i 2003);
- posibilitatea de a opta pentru kituri comerciale (ex. Biogenics Standard QL
produs de Biotools).

3.7. TESTAREA OMG CANTITATIV
3.7. QUANTITATIVE GMO TESTING

3.7.1. Design experimental
3.7.1. Experimental design

Literatura de specialitate cuprinde un numr mare de protocoale de cuantificare a
diferitelor evenimente de transformare genetic. Cteva surse reprezentative, ce cuprind
numeroase exemple de acest fel, sunt:
- CRL-GMFF Status of Dossiers (CRL-GMFF, 2009b); nu este o baz de
date n adevratul sens al cuvntului, dar cuprinde o serie de documente
foarte utile pentru exemplificarea metodologiei de validare a metodelor;
Testarea OMG

238
- standardul SR EN ISO 21750:2006 care include n anexele sale o serie de
metode de cuantificare, cel mai important aspect referitor la acestea fiind
faptul c au fost validate n cadrul unor studii de comparare interlaboratoare
i sunt considerate metode standardizate; trebuie amintite aici i standardele
SR EN ISO 21569:2006 i SR EN ISO 21571:2006 n anexele crora sunt
incluse metode de extracie, respectiv analiz calitativ;
- GMO Methods Database (http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/
methodsdatabase.htm), baz de date a JRC ce ofer acces la peste 300
metode analitice bazate pe tehnologia PCR sau ELISA; include i
protocoalele publicate de CRL-GMFF; metodele cuprinse n baza de date au
fost prezentate i n cteva publicaii care pot fi accesate on-line (vezi
Bonfini, 2008a i 2008b, sau Bonfini et al., 2007);
- GMO Detection Method Database (GMDD) (http://gmdd.shgmo.org/), parte
a platformei Shanghai GMO.
O alt categorie important de protocoale de cuantificare o constituie kiturile
comercializate de productori ca:
- Biotools Biogenics Line (http://www.biotools.eu/agrofood.html);
- Applied Biosystems TaqMan GMO Detection and Quantitation System
(https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavi
gate2&catID=601230);
- Roche Molecular Food Safety Testing Products (https://www.roche-
applied-science.com/servlet/RCConfigureUser?URL=StoreFramesetView
&storeId=10357&catalogId=10356&langId=-1&countryId=ro);
- Eurofins GeneScan GMO Test Kits (http://www.genescan.de/de/test-
kits/gmo-test-kits.aspx).
Strategia de cuantificare descris n continuare are la baz metoda curbelor
standard, amplificrile celor dou secvene int desfurndu-se deci n paralel, dar n
cadrul unor sisteme simplex.
Conform datelor din literatura de specialitate, pentru orice tip de prob, efectuarea
amplificrilor trebuie fcut n cel puin dou repetiii (SR EN ISO 21570:2006; Foti,

Testarea OMG

239

F
i
g
.

8
5
.

D
e
s
i
g
n

e
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

p
e
n
t
r
u

a
n
a
l
i
z
e
l
e

c
a
n
t
i
t
a
t
i
v
e

p
r
i
n

r
e
a
l
-
t
i
m
e

P
C
R
.

E

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

p
e
n
t
r
u

m
e
d
i
u
l

d
e

l
u
c
r
u
;

B

-

p
r
o
b
a

n
e
u
t
r


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

e
x
t
r
a
c

i
e
i
;

P

-

p
r
o
b


p
o
z
i
t
i
v


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

e
x
t
r
a
c

i
e
i
;

C
+

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

p
o
z
i
t
i
v


p
e
n
t
r
u

A
D
N
-
u
l

i
n
t

;

C
-

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

n
e
g
a
t
i
v


p
e
n
t
r
u

A
D
N
-
u
l

i
n
t

;

N
T
C

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

r
e
a
c
t
i
v
i
l
o
r
;

I

-

p
r
o
b


d
e

c
o
n
t
r
o
l

a

i
n
h
i
b
i

i
e
i

r
e
a
c

i
e
i

P
C
R
.

F
i
g
.

8
5
.

E
x
p
e
r
i
m
e
n
t
a
l

d
e
s
i
g
n

f
o
r

q
u
a
n
t
i
t
a
t
i
v
e

r
e
a
l
-
t
i
m
e

P
C
R

a
n
a
l
y
s
i
s
.

E

-

e
n
v
i
r
o
n
m
e
n
t
a
l

c
o
n
t
r
o
l
;

B

-

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n

b
l
a
n
k
;

P

-

p
o
s
i
t
i
v
e

e
x
t
r
a
c
t
i
o
n
;

C
+

-

p
o
s
i
t
i
v
e

D
N
A

t
a
r
g
e
t

c
o
n
t
r
o
l
;

C
-

-

n
e
g
a
t
i
v
e

D
N
A

t
a
r
g
e
t

c
o
n
t
r
o
l
;

N
T
C

-

a
m
p
l
i
f
i
c
a
t
i
o
n

r
e
a
g
e
n
t

c
o
n
t
r
o
l
;

I

-

P
C
R

i
n
h
i
b
i
t
i
o
n

c
o
n
t
r
o
l
.



Testarea OMG

240
2004; Germini et al., 2004), fiind ns recomandat amplificarea n triplicat (Cankar et
al., 2006; Foti et al., 2006; Moens et al., 2005; Querci et al., 2005; Applied Biosystems,
2001).
n ceea ce privete curbele standard, Querci et al. (2005) i Foti (2004) recomand
utilizarea a cel puin patru puncte de calibrare. Conform SR EN ISO 21570:2006, curbele
de etalonare/standard trebuie construite utiliznd cel puin patru puncte cu concentraii
diferite, amplificate n duplicat, sau cel puin ase puncte amplificate fr repetiii.
Querci et al. (2005) i Foti (2004) recomand de asemenea amplificarea probelor
necunoscute, att nediluate, ct i diluate (ex. 1:10), pentru a evalua efectul inhibitorilor
asupra eficienei de amplificare. Aceast strategie trebuie aplicat n cazul n care nu s-a
evaluat deja efectul substanelor inhibitoare utiliznd metodologia descris n
subcapitolul 2.6.3.
Probele de control care trebuie incluse n aceast etap au fost prezentate n
subcapitolul 2.8.5, iar importana MRC-urilor n subcapitolul 2.9.7.
Avnd n vedere cerinele prezentate mai sus, caracteristicile kiturilor utilizate,
precum i anumite considerente de ordin economic, recomandm efectuarea
experimentelor real-time PCR conform designului din Figura 85.

3.7.2. Cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000
3.7.2. Quantification on the Rotor-Gene 3000 platform

Pentru cuantificarea pe platforma Rotor-Gene 3000 se poate utiliza kitul
Biogenics RoundUp Ready Soya QT (Biotools), dedicat acestui aparat. Protocolul de
lucru utilizat de noi a fost elaborat pe baza considerentelor prezentate n subcapitolul 2.9
i a instruciunilor productorului.
n vederea exprimrii rezultatelor sub forma procentelor de ADN MG, conform
prevederilor Recomandrii 2004/787/EC, este necesar amplificarea i detecia unei
secvene de referin, i.e. gena lectinei de la soia (Le1), precum i a unei secvene
specifice evenimentului de transformare GTS 40-3-2 (soia Roundup Ready). Procedura
utilizat prevede desfurarea independent a celor dou reacii de amplificare, n cadrul
aceleiai analize real-time PCR (reacii simplex conform metodei curbelor standard).
Testarea OMG

241
Probele care constituie punctele curbei standard sunt pregtite ca diluii seriale ale
soluiei de calibrare incluse n kit PC SOYA. Aceasta conine cantiti cunoscute din
cele dou molecule de interes (Biotools, 2008):
- molecula de referin, reprezentat de o secven a genei lectinei de la soia,
cu o concentraie de 10
6
copii/l;
- molecula transgenic, reprezentat de o secvena a genei EPSPS de la soia
RR, cu o concentraie de 5x10
4
copii/l.
n Tabelul 16 este prezentat modul de pregtire a diluiilor seriale. Pentru aceasta
se poate utiliza Tris-HCl (10 mM pH=8) sau a ddH
2
O. Un aspect important ce trebuie
avut n vedere este asigurarea omogenitii soluiilor n momentul pregtirii diluiilor.


Tabelul 16.
Pregtirea probelor standard pentru cuantificarea soiei Roundup Ready prin real-time PCR
Preparation of standard samples real-time PCR quantification of Roundup Ready soya
Denumire
Code
Mod de obinere
Preparation
Conc. secv. endogene*
Reference sequence conc.
Conc. secv. transgenice*
Transgenic sequence conc.
STD 1 PC** diluat 1:5 200.000 copii/l 10.000 copii/l
STD 2
STD 1 diluat 1:5
(PC 1:25)
40.000 copii/l 2.000 copii/l
STD 3
STD 2 diluat 1:5
(PC 1:125)
8.000 copii/l 400 copii/l
STD 4
STD 3 diluat 1:5
(PC 1:625)
1.600 copii/l 80 copii/l
STD 5
STD 4 diluat 1:5
(PC 1:3125)
320 copii/l 16 copii/l
* Numrul absolut de copii al secvenei de interes dintr-o reacie reprezint dublul valorilor indicate deoarece,
conform master mixului prezentat n Tabelul 17, fiecare reacie conine 2 l din soluia standard. Acest aspect
trebuie avut n vedere n momentul introducerii informaiilor aferente reaciilor standard n software-ul de
cuantificare.
** Soluia de calibrare PC SOYA inclus n kitul Biogenics RoundUp Ready Soya QT.


Modul de pregtire a amestecului de reacie este redat n Tabelul 17. Dup
distribuirea master mixului, adugarea ADN-ului corespunztor fiecrei probe se face
deschiznd i nchiznd fiecare tub individual, pentru a evita contaminarea ncruciat.

Testarea OMG

242
Tabelul 17.
Pregtirea amestecului de reacie pentru amplificarea celor dou secvene
Preparation of reference and target amplification mixtures
Amestec de reacie pentru o prob (l)
Amplification mixture for one sample (l) Reactiv
Reagent Sistemul de referin
Reference system
Sistemul transgenic
Transgenic system
ddH
2
O 1 1
Master mix 18,7 18,7
Sond TaqMan (5FAM - TAMRA 3) 0,3 0,3
MgCl
2
2 2
Polimeraz 1 1
Extract ADN (50-100 ng/l) 2 2
Volum total 25 25


Dorim s atragem atenia c pregtirea soluiilor de calibrare i amestecul de
reacie prezentate anterior, difer fa de indicaiile productorului kitului. n acest
context, recomandm adaptarea/modificarea protocoalelor de lucru n funcie de
necesiti, ori de cte ori este necesar.
n Tabelul 18 este prezentat programul de amplificare utilizat n cadrul prezentului
protocol.


Tabelul 18.
Program de amplificare pentru sistemul Rotor-Gene 3000
Amplification program for the Rotor-Gene 3000 system
Ciclu
Cycle
Parametri temperatur/timp
Temperature/time parameters
Hold 1 95 C, 5 min
Etapa 1 @ 95 C, 30 sec, Not Acquiring
Etapa 2 @ 56 C, 20 sec, Not Acquiring Cycling (45 repetiii)
Etapa 3 @ 66 C, 60 sec, Acquiring to Cycling A (FAM/Sybr)
Hold 2 25 C, 5 min
Surs: Biotools (2008).


Testarea OMG

243
Datele vor fi analizate utiliznd modulul de analiz pentru cuantificare (i.e.
Quantitation) al software-ului Rotor-Gene 6. Detalii suplimentare referitoare la modul de
utilizare al software-ului pot fi gsite n instruciunile de utilizare a kitului (Biotools,
2008), precum i n cartea tehnic a instrumentului (Corbett Research, 2004).
Anexa IX cuprinde modul de setare a reaciilor aferente acestei metode, precum i
paii necesari pentru interpretarea datelor experimentale.



(a)

(b) (c)

(d)
Fig. 86. Detecia i cuantificarea evenimentului de transformare GTS 40-3-2 utiliznd aparatul Rotor-Gene 3000. (a)
Graficul de amplificare aferent reaciilor sistemului transgenic. (b) Curba standard generat pentru sistemul
transgenic. Punctele de calibrare sunt reprezentate cu albastru, iar probele necunoscute cu rou. (c) Graficul de
amplificare aferent reaciilor sistemului de referin. (d) Curba standard generat pentru sistemul de referin.
Puncele de calibrare sunt reprezentate cu albastru, iar probele necunoscute cu rou.
Fig. 86. Detection and quantification of event GTS 40-3-2 using the Rotor-Gene 3000 aparathus. (a) Amplification
plot for the transgenic system. Calibrators are represented by blue dots, while unknown samples correspond to red
dots. (b) Standard curve generated for the transgenic system. (c) Amplification plot for the reference system. (d)
Standard curve generated forthe reference system. Calibrators are represented by blue dots, while unknown samples
correspond to red dots.

Testarea OMG

244
n Figura 86 este prezentat un exemplu de analiz cantitativ la soia Roundup
Ready. n cadrul acestui experiment probele cuantificate au fost reprezentate de trei
MRC-uri, rezultatele determinrilor fiind prezentate n Tabelul 19. Probele au fost
analizate n duplicat, iar calibratorii (cinci) au fost analizai n triplicat. Au fost utilizate i
probe de control a reactivilor (NTC).
Pentru fiecare sistem de cuantificare (transgenic, de referin) pragul limit a fost
setat manual ntr-o regiune n care curbele de amplificare sunt aproximativ paralele.
Coeficienii R
2
sunt n ambele cazuri mai mari de 0,98, pantele se ncadreaz ntre -3,6 i
-3,1, iar eficienele de amplificare sunt similare.


Tabelul 19.
Rezultatele analizei prezentate n Figura 86
Results of the analysis presented in Figure 86
Prob
Sample
Met. de extr.
Extr. method
Diluie
Dilution
Coninut OMG teoretic
Theoretical GMO content
Coninut OMG msurat
Measured GM content
R20 1:1 2% 1,89%
R50* 1:1 5% 5,63%
R50* 1:2 5% 5,04%
R50* 1:4 5% 5,43%
R50
Kitul
QIAamp
DNA Stool
Mini
1:1 5% 4,55%
* Aceelai extract.


n Tabelul 20 sunt prezenatate datele utilizate pentru evaluarea unor parametri de
performan (i.e. justeea i repetabilitatea) ai metodei de cuantificare a coninutului de
soia MG. Modul de prelucrare a datelor a avut la baz studiile publicate de Foti et al.
(2006), Huang i Pan (2005) i Vatilingom et al. (1999). Datele avute la dispoziie nu au
permis i evaluarea reproductibilitii sau a IM.
Conform criteriilor enunate de ENGL, att biasul, ct i RSD
r
, nu trebuie s
depeasc 25% de-a lungul ntregii raze dinamice (ENGL, 2008; Wiseman, 2002, n
Burns i Valdivia, 2007). Subliniem faptul c datele utilizate n Tabelul 20 nu acoper
ntreaga raz dinamic i sunt bazate pe un numr redus de determinri. Cu toate acestea
considerm c rezultatele indic o performan satisfctoare a metodelor.
Testarea OMG

245
Tabelul 20.
Evaluarea justeei i repretabilitii metodei de cuantificare a soiei Roundup Ready
Trueness and repeatability of the quantitative method specific to RR soybean
Analiza rt-PCR i prelucrarea datelor
rt-PCR analysis and data processing
Rezultate
Results
Prob
Sample
R10 R20 R50 S1
1 1,02 1,89 5,63 57,93
2 0,97 2,09 5,04 64,21
3 1,17 2,21 5,43 63,14
Determinare
Measurement
4 - - 4,55 -
Coninut OMG teoretic (%)
Theoretical GMO content (%)
1 2 5 -
Media
Mean
1,053 2,063 5,163 61,67
Eroare (bias) (%)
Error (bias) (%)
5,333 1,666 3,25 -
Abaterea standard a repetabilitii (SD
r
)
Repeatability standard devition (SD
r
)
0,104 0,162 0,476 3,36
Abaterea std. rel. a repetabilitii (RSD
r
)
1

Rel. std. dev. of repeatability (RSD
r
)
9,881% 7,834% 9,224% 5,44%
1
Se obine ca raport ntre abaterea standard i medie.


3.7.3. Cuantificarea pe platforma LightCycler 480
3.7.3. Quantification on the LightCycler 480 platform

Pentru cuantificarea evenimentului pe platforma LightCycler 480 se poate utiliza
kitul LightCycler 480 Probes Master (Roche). Acesta include un master mix universal de
tip hot-start, optimizat pentru real-time PCR, la care utilizatorul adaug elementele de
amplificare i detecie ce confer specificitate reaciei, respectiv primerii i sonda
TaqMan.
Elementele aferente acestei metode sunt:
- amestecul de reacie prezentat n Tabelul 21 (similar celui din Tabelul 8,
subcapitolul 3.5.2.4.2);
- condiiile de amplificare prezentate n Tabelul 9, subcapitolul 3.5.2.4.2;
Testarea OMG

246
- modul de construire a curbelor standard prezentat n Tabelul 16, subcapitolul
3.7.2; calibratorul utilizat de noi a fost soluia PC SOYA (kitul Biogenics
RoundUp Ready Soya QT);
- secvenele primerilor i sondelor prezentate n Tabelul 7, subcapitolul
3.5.2.4.2 (sistemul de referin), i n Tabelul 22 (sistemul aferent
transgenei); lungimea ampliconilor afereni sistemului transgenic este de 82
pb (SR EN ISO 21750:2006).
La realizarea amestecului de reacie i a condiiilor de amplificare pe care le
propunem pentru utilizare n acest caz, au fost avute n vedere recomandrile
productorului (Roche, 2006b) i informaiile din SR EN ISO 21750:2006.
Pentru analiza datelor se va utiliza algoritmul de calcul Fit Points al software-
ului LightCycler 480 (Roche). Detalii suplimentare referitoare la modul de utilizare al
software-ului pot fi gsite n cartea tehnic oferit de productor (Roche, 2006a).
Modul de setare a reaciilor aferente acestei metode este descris n Anexa VII.


Tabelul 21.
Amestecul de reacie utilizat pentru cuantificarea soiei RR pe platforma LightCycler 480
Reaction mixture for the quantification of RRS on the LightCycler 480 platform
Amestec de reacie pentru o prob (l)
Amplification mixture for one sample (l) Reactiv
Reagent Sistemul de referin
Reference system
Sistemul transgenic
Transgenic system
H
2
O pentru PCR* 4,2 5,4
Primer F, 10 M 1,8 (conc. fin. 900 nM) 0,6 (conc. fin. 300 nM)
Primer R, 10 M 1,8 (conc. fin. 900 nM) 1,8 (conc. fin. 900 nM)
Sond TaqMan, 10 M 0,2 (conc. fin. 100 nM) 0,2 (conc. fin. 100 nM)
Master (2x)* 10 10
Extract ADN** 2 2
Volum total 20 20
* Reactiv inclus n kitul LightCycler 480 Probes Master.
** Maxim 40 ng/l conform protocoalelor originale. Concentraia utilizat n cadrul experimentelor a fost de
aproximativ 50 ng/l.



Testarea OMG

247
Tabelul 22.
Primeri i sonde utilizate n combinaie cu kitul LightCycler 480 Probes Master
Primers and probes used in combination with the LightCycler 480 Probes Master Kit
Denumitre
Name
int
Target
Secven 5-3
5- 3 sequence
Surse
References
RSR-F
RSR-R
RSR-TMP
Jonciunea
secvenei
CTP cu
promotorul
35S
GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT
GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C
FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG
TCA GCG-TAMRA
Debode et al. (2007); Brodmann et al. (2002), n
Cankar et al. (2006); Foti et al. (2006); SLMB**
(2000), n SR EN ISO 21570:2006; Taverniers et al.
(2001).
* Sond TaqMan.
** SLMB - Schweizerisches Lebensmittelbuch (Swiss Food Manual).


3.7.4. Considerente generale referitoare la testarea cantitativ
3.7.4. General considerations regarding the quantitative analysis

Analiza cantitativ a coninutului de material MG este un domeniu foarte
complex, prezentnd nc o serie de dificulti majore.
Deoarece performanele i rezultatele analizelor real-time PCR sunt influenate
substanial de proprietile probelor, sau mai bine zis de caracteristicile extractelor de
ADN obinute din acestea (Terry et al., 2002, n Smith i Maxwell, 2007; Cankar et al.,
2006), majoritatea studiilor au raportat dificulti n testarea alimentelor nalt procesate
(Corbisier et al., 2005). De asemenea, nu au fost publicate nc studii care s demonstreze
c procesarea i compoziia matricei nu influeneaz justeea cuantificrii OMG,
neputndu-se astfel stabili clar dac variabilitatea msurtorilor este o consecin a
fenomenelor ce afecteaz analitul sau corespunde erorilor inerente sistemului de
cuantificare (Engel et al., 2006). Se poate astfel conchide c determinarea exact i
precis a coninutului OMG este foarte dificil de realizat (Moriuchi et al., 2007), mai ales
n cazul probelor intens procesate sau compozite (Corbisier et al., 2005).
Amplificarea poate fi influenat negativ de prezena anumitor substane cu efect
inhibitor, extrase din matricea iniial odat cu ADN-ul, precum i de unii dintre reactivii
utilizai n cadrul protocolului de extracie a ADN-ului, dac la finalul procedurii acetia
se regsesc n soluia de ADN.
Integritatea structural a ADN-ului reprezint de asemenea un factor important
pentru succesul amplificrii. Pe lng fragmentarea macromoleculei, alte modificri
Testarea OMG

248
nefavorabile, determinate n principal n timpul proceselor de prelucrare, sunt
depurinarea, crosslinkingul sau hidroliza ADN-ului (Terry et al., 2002, n Smith i
Maxwell, 2007). Totui, Debode et al. (2007) susin c, exceptnd influena matricei,
degradarea fizic a ADN-ului nu va afecta semnificativ rezultatul final. Suntem i noi de
prere c degradarea ADN-ului n timpul extraciei nu reprezint un impediment major
pentru cuantificarea relativ, deoarece:
- degradarea ADN-ului n aceast etap este mult redus comparativ cu etapa
de procesare;
- cel puin teoretic, fenomenul afecteaz n mod similar cele dou fragmente
int (Corbisier et al., 2005).
Totui, trebuie avut n vedere posibilitatea ca degradarea (n timpul procesrii sau
extraciei) celor dou fragmente de interes s se fac difereniat, precum i faptul c
anumii factori celulari/nucleari pot influena extractibilitatea acestor molecule (Japanese
Agricultural Standard, 2001, n Moriuchi et al. 2007; Engel et al., 2006; Foti et al.,
2006). Cuantificarea acestor fenomene care ar putea modifica raportul real dintre cele
dou secvene de interes, este ns imposibil.
n concluzie, degradarea este considerat ca fiind un factor cu impact relativ
redus, imposibilitatea eliminrii complete a contaminanilor rmnnd sursa major de
preocupare. n acest context, eficiena reaciei PCR reprezint parametrul principal pe
baza cruia se poate evalua pretabilitatea extractului la PCR. Determinarea cantitativ
este corect doar dac eficiena de amplificare a probei necunoscute i a calibratorilor
sunt asemntoare, n caz contrar valoarea msurat abtndu-se de la cea real. Evident,
diferenele vor fi i mai mari n cazul n care ampliconii sunt afectai diferit de condiiile
de amplificare. De asemenea, n cazul n care eficienele sunt identice pentru cele dou
fragmente int, la nivelul probei, dar difer de cele ale calibratorilor, se vor nregistra
abateri ale rezultatului msurtorii de la valoarea adevrat (Cankar et al., 2006).
Indiferent care sunt factorii ce pot afecta calitatea ADN-ului obinut, rolul metodei
de extracie este esenial. Datorit diferenelor semnificative ntre diversele tipuri de
matrici, exist ndoieli c o metod care ofer rezultate corespunztoare ntr-un anumit
caz, va funciona la fel i n alte situaii (Corbisier et al., 2005). De aceea, metoda de
detecie/cuantificare trebuie validat n combinaie cu o anumit metod de extracie, iar
Testarea OMG

249
validarea unei metode de extracie ar trebui s fie fcut pentru fiecare tip de matrice n
parte (Cankar et al. 2006; Corbisier et al., 2005).
Alte elemente care influeneaz rezultatul cuantificrii sunt mrimile celor dou
secvene de interes i concentraiile oligonucleotidelor (primeri i sonde) aferente celor
dou sisteme de detecie. Diferenele de lungime dintre cele dou fragmente amplificate
pot determina un rezultat eronat, deoarece secvena int mai lung se va regsi ntr-o
cantitate mai redus, mai ales n cazul extractelor cu ADN puternic degradat. Este de
aceea necesar ca secvenele int s aib mrimi similare (Corbisier et al., 2005), care,
prin prisma faptului c ADN-ul poate fi puternic fragmentat, nu trebuie s depeasc
200 pb (Engel et al., 2006; Rossi et al., n Germini et al., 2004).
n general, secvena int endogen se regsete ntr-un numr mult mai mare de
copii dect cea transgenic, motiv pentru care se recomand ca oligonucleotidele (primeri
i sond) specifice celei din urm s se gseasc n concentraii mai ridicate n amestecul
de reacie (Alary et al., 2002). Optimizarea concentraiilor primerilor se va face n funcie
de concentraiile minime ale primerilor specifici sistemul endogen care dau valoarea
experimental C
T
cea mai apropiat de cea teoretic (Alary et al., 2002).
Dup cum s-a afirmat anterior, cantitatea de ADN recuperat nu reprezint factorul
cel mai important, deoarece utilizarea n reacie a unei concentraii mari de acid nucleic
poate afecta eficiena de amplificare i specificitatea acesteia, iar n situaia contrar
soluia de ADN poate fi concentrat sau se poate mri proporia extractului n amestecul
de reacie. n a doua situaie, factorul de multiplicare va trebui luat n considerare la
prelucrarea datelor experimentale (Rott et al., 2004).
Sursele din literatura de specialitate recomand utilizarea unei cantiti de 50-200
ng ADN/reacie. n general, se consider c sunt necesare cel puin zece copii ale
secvenei int pentru detecia PCR, respectiv 40 pentru cuantificare (Rnning et al.,
2003, Hbner et al., 2001, i Kay i Van den Eede, 2001, n Smith i Maxwell, 2007). n
aceste condiii, pentru a avea zece copii ale unei secvene specifice unui eveniment de
transformare heterozigot la porumb, care se gsete ntr-o concentraie de 1,5%, avem
nevoie de aproximativ 650 echivaleni genomici haploizi, ceea ce corespunde unei
cantiti de 3,5 ng ADN necesar n reacia final. n aceste condiii, cuantificarea
evenimentului de transformare va fi ns posibil doar la o concentraie de peste 6%.
Testarea OMG

250
Tabelul 23.
Rezultatele generale ale testrii OMG
General results of GMO testing
Detecia
Detection
Nr.
crt.
No.
Tipul matricei
Type of matrix
Cod
Code
Taxon
Taxon
Eveniment de
transformare
Transformation
event
Taxonului
Taxon-specific
OMG-ului
GMO-specific
% OMG
GMO %
1 TPS
1
, granule T1 Soia GTS 40-3-2 + - x
2 TPS, granule T2 Soia GTS 40-3-2 + -
x
3 TPS, granule T3 Soia GTS 40-3-2 + -
x
4 TPS, felii/niele T4 Soia GTS 40-3-2 + -
x
5 TPS, cuburi T5 Soia GTS 40-3-2 + -
x
6 TPS, cuburi T6 Soia GTS 40-3-2 + -
x
7 TPS, felii/niele T7 Soia GTS 40-3-2 + -
x
8 TPS, cuburi T8 Soia GTS 40-3-2 + -
x
9 Semine soia S1 Soia GTS 40-3-2 + + 63,14
4

10 Semine soia S2 Soia GTS 40-3-2 + + 63,47
11 Semine soia S3 Soia GTS 40-3-2 + + 34,12
12 Semine soia S4 Soia GTS 40-3-2 + + 76,15

13 Semine soia S5 Soia GTS 40-3-2 + -
x
14 Semine soia S6 Soia GTS 40-3-2 + -
x
15 Lapte de soia LS Soia GTS 40-3-2 + -
x
16 CVB
2
CS Soia GTS 40-3-2 + - x
17 Baton energizant BE Soia GTS 40-3-2 + - x
18 Pate vegetal TF Soia GTS 40-3-2 + - x
19 Tofu PS Soia GTS 40-3-2 + - x
20 Biscuii BS Soia GTS 40-3-2 + - x
21 ERM-BF410a
3
R0 Soia GTS 40-3-2 + - x
22 ERM-BF410b
3
R1 Soia GTS 40-3-2 + + 0,089

23 ERM-BF410c
3
R5 Soia GTS 40-3-2 + + 0,6

24 ERM-BF410d
3
R10 Soia GTS 40-3-2 + + 1,01
4
25 ERM-BF410e
3
R20 Soia GTS 40-3-2 + + 2,03
4
26 ERM-BF410f
3
R50 Soia GTS 40-3-2 + + 5,163
5
1
Texturat proteic de soia.
2
Crem vegetal de branz.
3
Material de referin certificat.
4
Valoarea reprezint media a trei determinri independente.
5
Valoarea reprezint media a patru determinri independente.
+ Secvena int a fost amplificat (rezultat pozitiv).
- Secvena int nu a fost amplificat (rezultat negativ).
x Analiza nu a fost efectuat.


Subliniem c toate valorile exprimate n copii sau n echivaleni genomici
haploizi, ce reprezint cantitatea sau concentraia moleculelor de interes n extracte sau
master mixuri, sunt teoretice. Diferenele ce pot apare n practic sunt datorate: efectelor
stocastice ce intervin n cazul realizrii diluiilor, efectelor stocastice ce afecteaz
Testarea OMG

251
fragmentarea ADN-ului, n special n cazul echivalenilor genomici, impreciziei ce
caracterizeaz metodele de determinare a concentraiei ADN-ului.
Real-time PCR rmne, deocamdat, cea mai precis metodologie de cuantificare
a acizilor nucleici. Cu toate c se caracterizeaz printr-o variabillitate, att intra-, ct i
interdeterminri, relativ redus, tehnica este puternic influenat de proprietile probei,
pentru o cuantificare precis fiind necesar un extract de foarte bun calitate (Cankar et
al., 2006). De aceea, proporia iniial a ingredientelor MG nu va putea fi determinat
exact i precis prin cuantificarea materialului genetic din matricea obinut prin
procesare, abaterile de la valorile ateptate putnd fi destul de mari i reprezentnd, de
obicei, supraestimri ale acestora (Allnutt et al., 2006; Corbisier et al., 2005; Yoshimura
et al. 2005b).

3.8. PREZENTAREA REZULTATELOR GENERALE ALE TESTRII OMG
3.8. GENERAL RESULTS OF GMO TESTING

Rezultatele analizelor calitative i cantitative efectuate n cadrul laboratorului
CERT-OMG, pentru evenimentul de transformare GTS 40-3-2, sunt prezentate sintetic n
Tabelul 23.
Testarea OMG

252

CAPITOLUL IV. CONCLUZII REFERITOARE LA ACTIVITATEA DE
TESTARE OMG
CHAPTER IV. CONCLUSIONS ON GMO TESTING


Impactul OMG-urilor

OMG-urile reprezint o realitate a societii moderne aflate n continu dezvoltare.
Indiferent de motivele pentru care acestea au fost create i comercializate, transgeneza
poate revoluiona multe domenii ale tiinei, agriculturii, industriei sau medicinei. Nu
trebuie ns ignorat faptul c utilizarea OMG-urilor prezint i un potenial factor de risc
pentru mediul nconjurtor, pentru cel economico-social i pentru sntatea
consumatorilor.
Utilizarea judicioas a acestor organisme poate determina sporirea profiturilor,
reducerea inputurilor sau o mai bun satisfacere a necesarului de hran. Cele mai aprinse
dezbateri pe marginea OMG-urilor au ns ca punct de plecare tocmai acest domeniu
aplicaiile n agricultur existnd o serie de preri extreme, att printre susintori, dar
mai ales printre opozanii tehnologiei. Considerm aceste atitudini ca fiind eronate i
contraproductive. Soluia optim necesit n primul rnd evaluarea i punerea n balan a
riscurilor i beneficiilor asociate PMG-urilor, iar utilizarea lor ulterioar trebuie s se
mpleteasc cu a celorlalte tehnologii, fie tradiionale, moderne, intensive sau organice.
Studiind literatura de specialitate, se poate observa c majoritatea situaiilor n
care utilizarea PMG-urilor a prezentat neajunsuri, nu au fost condiionate de proprietile
transgenice, ci s-au datorat unor cauze de natur agrotehnic determinate de factorul
uman. De asemenea, dorim s accentum faptul c, de multe ori, PMG-urile sunt utilizate
ca elemete ale retoricii discursului direcionat nspre atingerea unor obiective economice
sau sociale, pierzndu-i n majoritatea cazurilor substratul i fundamentarea tiinific.



Testarea OMG

253
Importana testrii OMG

n contextul evalurii i monitorizrii OMG-urilor, testarea molecular reprezint
un instrument important, avnd rolul de a spori transparena, de a facilita luarea deciziilor
la diferite niveluri i de a asigura trasabilitatea n vederea respectrii unor cerine
referitoare la biosecuritate. Astfel, existena laboratoarelor de testare la nivel naional
reprezint un deziderat important. n aceast conjunctur se nscrie i activitatea
desfurat n cadrul Laboratorului CERT-OMG, USAMV Cluj-Napoca.

Eantionarea i pregatirea probelor

Eantionarea este o etap foarte sensibil i problematic datorit complexitii
acestui proces ce are rolul de a asigura reprezentativitatea probei prelevate pentru ntregul
lot din care provine. Tocmai de aceea este foarte important, astfel nct s existe
posibilitatea extrapolrii rezultatului la nivelul ntregului lot. Responsabilitatea efecturii
eantionrii revine organismelor abilitate ale statului, de aceea considerentele prezentate
n cadrul acestei lucrrii au urmrit doar evidenierea importanei aceastei activiti i
influena pe care o poate reprezenta n ansamblul metodologiei de testare.
n ceea ce privete pregtirea probelor, considerm c mcinarea mecanic asigur
o procesare rapid i corespunztoare, iar utilizarea mai multor vase de mcinare va
permite scurtarea timpului total de pregtire n cazul n care numrul probelor este mai
mare. Este recomandat i folosirea unei site n vederea separrii unei fraciuni cu
granulaie ct mai redus din care s fie constituit proba test, ceea ce ar asigura
mbuntirea performanelor metodelor de extracie. De asemenea, s-a constatat c
umectarea matricilor uscate (ex. fina, CRM-urile sau texturatele) sporete cantitatea de
ADN recuperat.

Extracia ADN-ului

Metoda de izolare i purificare a ADN-ului influeneaz substanial activitatea de
testare, mai ales din punct de vedere al capacitii de a nltura substanele inhibitoare.
Testarea OMG

254
Cantitatea i calitatea ADN-ului prezint de asemenea importan n cadrul analizelor.
Deoarece nu exist nc o metod eficient de extracie care s rspund tuturor
cerinelor, alternativa ideal este reprezentat de utilizarea unei metode specifice fiecrui
tip de matrice. Acestea din urm sunt ns foarte variate i dificil de caracterizat, de aceea
este imposibil optimizarea procedurilor de izolare a ADN-ului pentru fiecare caz n
parte. Patru dintre metodele testate au produs rezultate satisfctoare, fiind astfel
recomandate pentru testrile de rutin, iar optarea pentru una dintre aceste metode se va
face n funcie de necesitile laboratorului, avnd n vedere urmtoarele caracteristici
principale:
- metoda CTAB permite, n general, obinerea unor extracte cu caracteristici
satisfctoare; este cea mai ieftin dintre metodele utilizate, fiind n acelai
timp i cea mai laborioas;
- kitul High Pure GMO Sample Preparation asigur recuperarea unei cantiti
mari de ADN, de puritate bun, dar i puternic fragmentat; timpul de
procesare este relativ scurt, dar costul unei probe este relativ ridicat;
- kitul QIAamp DNA Stool permite obinerea unor extracte cu concentraii
mai sczute dect n cazul kitului High Pure GMO Sample Preparation; pe
de alt parte, proporia ADN-ului fragmentat i costurile sunt mai reduse;
- pentru extracia cu MagNA Pure LC, laboratorul trebuie s dispun n
primul rnd de platforma de extracie; metoda permite automatizarea
procesului i procesarea simultan a unui numr relativ mare de probe;
calitatea extractelor este bun; costurile sunt depite doar de kitul High
Pure GMO Sample Preparation.
Concluzionam c pentru cele patru metode prezentate iniial, rezultatele obinute
n cadrul laboratorului nostru sunt n concordan cu datele din literatura de specialitate.
Trebuie ns remarcat c n cazul fiecrei metode exist o foarte mare variabilitate a
rezultatelor, mai ales ntre studii diferite. Uneori, la acest nivel, rezultatele pot fi chiar
contradictorii.
n cadrul experienelor noastre, rezultatele produse de kitul DNeasy i metoda
Maxwell 16 au fost nesatisfctoare, nefiind n concordan cu datele furnizate de alte
studii (n special n cazul kitului DNeasy).
Testarea OMG

255
Evaluarea extractelor

Considerm c evaluarea extractelor este o etap esenial care poate oferi
informaii utile pentru testarea propriu-zis. Toate metodele selectate (i.e. cuantificarea
spectrofotometric, migrarea n gel de agaroz i determinarea prezenei inhibitorilor) au
fost aplicate cu succes.
Subliniem ns c nu exist nicio modalitate precis i sigur de estimare a
concentraiei ADN-ului. n acest context, determinarea spectrofotometric este cea mai
expeditiv, dar se caracterizeaz i printr-o incertitudine de msurare nsemnat, iar
anumite proprieti ale extractelor (ex. starea de fragmentare sau prezena inhibitorilor)
nu pot fi evaluate.Valorile msurate spectrofotometric sunt, n general, supraestimate. Pe
lng aceasta trebuie luat n considerare faptul c o parte din ADN-ul prezent n extract
este degradat i deci neamplificabil. Subliniem c literatura de specialitate a evideniat
ns neajunsuri i n cazul altor metode utilizate n acelai scop, prerea general fiind
aceea c nu exist o modalitate precis i sigur de estimare a concentraiei. n ciuda
dezavantajelor, detereminarea concentraiei extractului este indispensabil n cazul n
care este necesar diluarea extractelor astfel nct s se utilizeze o concentraie optim
pentru reaciile real-time PCR.
Pentru evaluarea strii de fragmentare trebuie utilizat migrarea electroforetic.
Principalul incovenient n acest caz este creterea timpului total de lucru. De asemenea,
n special n cazul matricilor intens procesate, obinerea unor rezultate slabe nu poate fi
ntotdeauna corelat cu imposibilitatea desfurrii reaciei PCR, fiind recomandat
executarea unei amplificri de control detecia taxonului prin PCR clasic. Nici aceast
metod nu furnizeaz informaii asupra inhibitorilor copurificai. Se reduce astfel
posibilitatea obinerii unor rezultate fals negative n etapele de testare propriu-zis.
Totui, cea mai bun imagine cu privire la posibilitatea utilizrii extractului n
cadrul testrii OMG, att sub aspect calitativ, ct i cantitativ, este oferit de amplificarea
real-time PCR a unei serii de diluii a extractului de ADN. Dezavantajul major al metodei
este creterea costurilor totale.


Testarea OMG

256
Testarea calitativ

Concluzia general care se desprinde referitor la aceast faz este posibilitatea
utilizrii cu succes a tuturor protocoalelor testate, inclusiv a kitului Biogenics Standard.
Primerii specifici secvenei intronice aferente cloroplastelor se caracterizeaz
printr-o sensbilitate foarte mare, datorit numrului mare de copii ale genomului
cloroplastelor prezente n extracte. Recomandm ns utilizarea unor primeri specifici
taxonului, astfel nct prezena speciei din care deriv linia transgenic s fie clar
stabilit.
Dou elemente ce pot limita succesul analizelor bazate pe reacia PCR sunt
prezena unei cantiti reduse de material MG i degradarea analitului n urma procesrii.
n aceste condiii utilizarea protocoalelor de tip nested PCR sporete ansele de detecie a
moleculei de interes, dubla amplificare avnd practic rolul de a mri sensibilitatea
metodei. Se realizeaz ns i o cretere a timpului i costurilor testrii integrate.
n cadrul laboratorului nostru au fost testate mai multe perechi de primeri, iar n
vederea eficientizrii procesului de testare a fost utilizat un singur master mix, conceput
pe baza celor descrise n lucrrile originale. n cazul n care se opteaz pentru
implementarea unui anumit set de primeri, recomandm ns utilizarea protocolului
original n vederea maximizrii performanelor metodei. De asemnea, trebuie s se in
cont i de faptul c detecia unui amplicon de mrime ct mai redus sporete eficacitatea
metodei de detecie prin compensarea eventualei degradri excesive a ADN-ului.
Analiza curbei de disociere, specific deteciei cu substane de intercalare,
reprezint o alternativ simpl, relativ ieftin, rapid i sigur pentru testarea OMG
bazat pe PCR-ul convenional, att n etapa de screening, ct i n cazul identificrii
evenimentelor de transformare. Se pot utiliza n acest scop sisteme bazate pe kituri
comerciale universale (ex. LightCycler SYBR Green I Master/LightCycler 480) sau
dedicate (ex. Rotor-Gene 3000/Biogenics Standard QL).
O alt metod ce prezint un mare potenial aplicativ n practica testrii OMG este
amplificarea multiplex. Utilizarea acesteia n combinaie cu detecia prin microarray a
ampliconilor constiuie o soluie real i accesibil pentru eficientizarea procesului de
Testarea OMG

257
detecie n condiiile sporirii numrului elementelor genetice utilizate i a evenimentelor
de transformare, att cu unul, ct i cu mai multe inserturi.

Testarea cantitativ

Cuantificarea OMG este dificil de realizat n cazul produselor alimentare
procesate sau compozite, datorit proprietilor intrinseci ale acestor matrici, care se
reflect n calitatea extractului. Astfel, moleculele degradate i calitatea insuficient de
ADN amplificabil impiedic detecia, iar prezena substanelor inhibitoare afecteaz
eficiena reaciei PCR. De asemenea, incidena efectelor stocastice n cazul
extractibilitii sau degrdrii celor dou molecule int i al pregtirii diferitelor
diluii/amestecuri pot determina modificarea proporiei reale de material MG. Dac
intervin, fiecare dintre aceti factori vor afecta corectitudinea rezultatelor obinute. Toate
elementele menionate anterior depind de tipul matricei i de metoda de extracie,
variabilitatea extractelor i implicit a msurtorilor cantitative putnd fi considerabil.
Recent au aprut i dovezi ce pun la ndoial stabilitatea genetic a insertului n
diferitele linii transgenice comerciale, aspect esenial pentru detecia prin metode
moleculare a evenimentelor de transformare.
Considerentele referitoare la mrimea fragmentelor de interes i concentraiile
primerilor i sondelor trebuie avute n vedere atunci cnd nu se utilizeaz kituri
comerciale, iar dac intervin probleme legate de calitatea extractului exist strategii de
reducere a efectului inhibitor sau de mrire a concentraiei analitului.
Problemele referitoare la calibratori i materialele de referin (certificate) rmn
n continuare de actualitate, calitatea i proprietile acestui tip de materiale avnd un rol
foarte important n cadrul metodologiei de testare OMG.

Laboratorul de testare i acreditarea metodelor

Etalonarea, calibrarea i ntreinerea instrumentelor i a spaiilor n care se
lucreaz sunt activiti necesare, deoarece contribuie la obinerea unor rezultate de
calitate. Este de asemenea esenial pregtirea corespunztoare a operatorului i
Testarea OMG

258
documentarea tuturor activitilor pe care acesta le desfoar. Aceste aspecte sunt cu
mult mai importante dac se dorete acreditarea metodelor utilizate.
Acreditarea atest utilizarea unei metodologii de testare performante i calitatea
rezultatelor furnizate. Componenta de baza a procesului de acreditare este reprezentat de
validarea metodelor. Dificultile sunt determinate de cerinele care trebuie respectate,
dar mai ales de faptul c nu exist o viziune general acceptat de ctre comunitatea
tiinific asupra procedurilor de validare, iar exemplele concrete din literatura de
specialitate sunt limitate.

Perspective

Piaa OMG-urilor cunoate n continuare o dezvoltare rapid, remarcndu-se
creterea numrului evenimentelor de transformare autorizate, n special a celor cu
inserturi multiple, precum i prezena tot mai frecvent a celor neautorizate. n acest
context, testarea OMG reprezint o activitate tot mai complex i problematic,
screeningul constituind deja o provocare major. Este deci necesar trecerea spre metode
care s asigure procesarea unui volum mai mare de probe i efectuarea unui numr mare
de teste n unitatea de timp (ex. multiplexing i microarray).
Dorim de asemenea s subliniem necesitatea elaborrii i implementrii unor
programe de informare a cultivatorilor, procesatorilor, dar mai ales a consumatorilor, cu
privire la problematica i implicaiile utilizrii comerciale a OMG-urilor.

Testarea OMG

259

BIBLIOGRAFIE
REFERENCES


1. Abdullah, T., S. Radu, Z. Hassan, J. K. Hashim, 2006, Detection of genetically
modified soy in processed foods sold commercially in Malaysia by PCR-based
method, Food Chemistry 98, 575-579.
2. Acutis, M., P. Trevisiol, R. Confalonieri, G. Bellocchi, E. Grazioli, G. van den
Eede, C. Paoletti, 2007. Analytical method performance evaluation (AMPE) A
software tool for analytical method validation, Journal of AOAC International,
90, 1432-1438.
3. Agodi, Antonella, Martina Barchitta, Agata Grillo, A. Sciacca, 2005, Detection of
geneticallz modified DNA sequences in milk from the Italian food market, Int. J.
Hyg. Eviron. Health, 209, 81-88.
4. Ahmed, F. E., Detection of genetically modified organisms in foods, 2002. Trends
Biotechnol, 20:5, 215-223.
5. Alary, R., A. Serin, Delphine Maury, H. B. Jouira,J.-P. Sirven, Marie-Franoise
Gautier, P. Joudrier, 2002, Comparison of simplex and duplex real-time PCR for
the quantification of GMO in maize and soybean, Food Control, 13, 235-244.
6. Allnut, T. R., J. McMillan, R. McArthur, C. Henry, 2006, A combined protocol for
PCR detection of GM in seed, http://www.gm-inspectorate.gov.uk/documents/
COPsFinalReportweb_000.pdf, pagin consultat n septembrie 2009.
7. Altieri, M. A., P. Rosset, 1999, Ten reasons why biotechnology will not ensure food
security, protect the environment and reduce poverty in the developing world,
AgBioForum, 2 (3 & 4), 155-162.
8. Andrews, Lucy, 2004, Polymerase chain reaction, http://www.dpo.uab.edu/
~landrews/genetics.htm, pagin consultat n iulie 2006.
9. Angonesi Brod, F. C., Cibele dos Santos Ferrari, Luciana Lehmkuhl Valente, Ana
Carolina Maisonnave Arisi, 2007, Nested PCR detection of genetically modified
soybean in soybean, LWT, 40, 748-751.
Testarea OMG

260
10. Bellocchi, G., F. Foscarini, M. Canonico, G. van den Eede, 2008a, DANA: a
platform-independent component for data analysis and assessment, 1
st
Global
Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-27 iunie 2008,
http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Presentations/Bellocchi%20-
%20GMOGC_Como_24-27June2008.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
11. Bellocchi, G., M. Acutis, C. Paoletti, R. Confalonieri, P. Trevisiol, E. Grazioli, C.
Delobel, C. Savini, M. Mazzara, G. van den Eede, 2008b, Expanding horizons in
the validation of GMO analytical methods: fuzzy-based expert systems, Food
Analytical Methods, 2, 126-135.
12. Bertheau, Y., 2007, GM and non-GM supply chains: their CO-Existence and
TRAceability (Co-Extra), http://www.eurofins-ifs.com/media/118117/ybertheau
_inra.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
13. Berdal, K. G., A. Holst-Jensen, 2001, Roundup Ready soybean event-specific real-
time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and
quantification limits in GMO analyses, Eur Food Res Technol, 213, 432-438.
14. Berk, Z., 1992, Technology of production of edible flours and protein products from
soybeans; Food and Agriculture Organization of the United Nations: Rome,
Italia.
15. Block, Annette, J. Eder, U. Busch, 2008, Influence of the agricultural practice on
GMO quantification; harvesting time and plant tissue composition, 1
st
Global
Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-27 iunie 2008,
http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.1.19%20BLOCK.p
df, pagin consultat n septembrie 2009.
16. Bonfini, 2008a, Report on PCR methods submitted to ring trial validation,
http://bgmo.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methods-doc/GMOmethods-Report-PCR.
pdf, pagin consultat n septembrie 2009.
17. Bonfini, 2008b, Report on ELISA methods submitted to ring-trial validation,
http://bgmo.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methods-doc/GMOmethods-Report-ELISA
.pdf, pagin consultat n septembrie 2009.
18. Bonfini, L., W. Moens. E. Ben, Maddalena Querci, B. Aygun, P. Corbisier, D.
Morisset, Jana el, G. Van den Eede, 2007, Analytes and related PCR primers
Testarea OMG

261
used for GMO detection and quantification, Office for Official Publications of
the European Communities, Luxemburg, disponibil on-line la
http://bgmo.jrc.ec.europa.eu/home/documents/Bonfini%20et%20al%20Analytes
%20for%20GMO%20Detection.pdf, pagin consultat n septembrie 2009.
19. Bruderer, Shirin, Katharina E. Leitner, 2003, Genetically modified (GM) crops:
molecular and regulatory details, BATS (Centre for Biosafety and Sustainability),
http://www.bats.ch/gmo-watch/GVO-report140703.pdf, pagin consultat n
octombrie 2009.
20. Burns, M., H. Valdivia, 2007, A procedural approach for the identification of
sources of uncertainty associated with GM quantification and real-time
quantitative PCR measurements, Eur Food Res Technol, 226, 7-18.
21. Burns M., P. Corbisier, G. Wiseman, H. Valdivia, P. McDonald, P. Bowler, Katrina
Ohara, H. Schimmel, D. Charels, A. Damant, N. Harris, 2006, Comparison of
plasmid and genomic DNA calibrants for the quantification of genetically
modified ingredients, Eur Food Res Technol, 224:249-258.
22. Burns, M. J., H. Valdivia, N. Harris, 2004, Analysis and interpretation of data from
real-time PCR trace detection methods using quantitation of GM soya as a model
system, Anal Bioanal Chem 378, 1616-1623.
23. Cankar, Katarina, D. tebih, Tanja Dreo, Jana el, Kristina Gruden, 2006, Critical
points of DNA quantification by real-time PCR effects of DNA extraction
method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms,
BMC Biotechnology, 6, 37-52.
24. Cardarelli, Paola, Maria Regina Branquinho, Renata T.B. Ferreira, Fernanda P. da
Cruz, A. L. Gemal, 2005, Detection of GMO in food products in Brazil: the
INCQS experience, Food Control 16, 859-866.
25. Cazzola, Mara Laura, Silvana Petruccelli, 2006, Semiquantitative analysis of
genetically modified maize and soybean in food, Electronic Journal of
Biotechnology, 9 (3), Special Issue, 2006.
26. Ciola, G., 2001, GMOs - Beware of the Coming Food Apocalypse!, Axion
Publishers, Alna, ME.
Testarea OMG

262
27. Cionga, Cristina, 2005, Romania Biotechnology Annual 2005, Global Agriculture
Information Network (GAIN) Report No. RO2008, USDA Foreign Agricultural
Service, http://www.gmo-free-regions.org/fileadmin/files/Romania_USDA_
Report_2005.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
28. Conner, A. J., T. R. Glare, J.-P. Nap, 2003, The release of genetically modified
crops into the environment. Part II. Overview of ecological risk assessment, The
Plant Journal 33, 19-46.
29. Corbisier, P., Stefanie Trapmann, D. Gancberg, Liesbeth Hannes, P. Van Iwaarden,
G. Berben, H. Schimmel, H. Emons, 2005, Quantitative determination of
Roundup Ready soybean (Glycine max) extracted from highly processed flour,
Anal Bioanal Chem, 383, 282-290.
30. Dale, P. J., 2002, The environmental impact of genetically modified (GM) crops: a
review, The Journal of Agricultural Science, 138 (3), 245-248.
31. Dalgleish, R., 2007, The polymerase chain reaction (PCR),
http://www.le.ac.uk/bs/resources/bs2060/The%20Polymerase%20Chain%20Rea
ction%20%28PCR%29.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
32. Davey, M. R., E.L. Rech, B.J. Mulligan, 1989, Direct DNA transfer to plant cells,
Plant Molecular Biology 13: 273-285.
33. Debode F., E. Janssen, G. Berben, 2007, Physical degradation of genomic DNA of
soybean flours does not impair relative quantification of its transgenic content,
Eur Food Res Technol (2007) 226:273-280.
34. Deisingh, A. K., Neela Badrie, 2005, Detection approaches for genetically modified
organisms in foods, Food Research International 38, 639-649.
35. Dinu, T. A., 2006, Cultivarea plantelor modificate genetic n Romnia Situaia
actual i perspective, A VII-a Conferin a Bioagricultorilor din Romnia
Bioterra, Cluj, 22-23 octombrie 2006.
36. Di Pinto, Angela, V. T. Forte, Maria Corsignano Guastadisegni, Carmela Martino,
F. P. Schena, Giuseppina Tantillo, 2007, A comparison of DNA extraction
methods for food analysis, Food Control, 18, 76-80.
Testarea OMG

263
37. Drge, M., A. Phler, W. Selbitschka, 1998, (Review article) Horizontal gene
transfer as a biosafety issue: A natural phenomenon of public concern, Journal
of biotechnology, 64, 75-90.
38. Duke, S. O., A. L. Cerdeira, 2005, Potential environmental impacts of herbicide-
resistant crops, n: Collection of biosafety reviews, 2, 2005, Ministero
dellAmbiente a della Tutela del Teritorio e del Mare - Direzione per la
protezione della Natura i International Centre for Genetic Engineering and
Biotechnology.
39. Endres, J. G., 2001, Soy protein products characteristics, nutritional aspects, and
utilization, AOCS Press, Champaign, IL, SUA.
40. Engel, K.-H., F. Moreano, Alexandra Ehlert, U. Busch, 2006, Quantification of
DNA from genetically modified organisms in composite and processed foods,
Trends in Food Science & Technology 17, 490-497.
41. Eyquem, F., Quantitative detection of Ready Soybean by ELISA, In: Querci,
Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the analysis
of food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for
the Official Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil
on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
%202006/Session12.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
42. Fernandez, S., C. Charles-Delobel, A. Geldreich, G. Berthier, F. Boyer, C.
Collonnier, G. Coue-Phillippe, A. Diolez, M. N. Duplan, N. Kebdani, M.
Romaniuk, M. Feinberg, Y. Bertheau, 2005, Quantification of 35S promoter in
maize DNA extracts from genetically modified organisms using real-time
polymerase chain reaction, part I: operating procedure. 2005. J AOAC Int., 88:2,
547-557.
43. Ferry, Natlie, A. M. R. Gatehouse, 2009, Environmental impact of genetically
modified crops, CAB Publishing, Marea Britanie.
44. Forte, V. T., A. Di Pinto, C. Martino, G. M. Tantillo, G. Grasso, F. P. Schena, 2005,
A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified
soya and maize, Food Control 16 (2005) 535-539.
Testarea OMG

264
45. Foti, Nicoletta, Roberta Onori, Erica Donnarumma, Barbara De Santis, Marina
Miraglia, 2006, Real-time PCR multiplex method for the quantification of
Roundup Ready soybean in raw material and processed food, Eur Food Res
Technol, 222, 209-216.
46. Foti, Nicoletta, 2004, Quantitative detection of Roundup Ready soybean by real-
time PCR In: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training
course on the analysis of food samples for the presence of genetically modified
organisms, Office for the Official Publications of the European Communities,
Luxemburg, disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/
manuals/Manual%20EN%202006/Session11.pdf, pagin consultat n octombrie
2009.
47. Gachet, E., G.G. Martin, F. Vigneau, G. Meyer, 1999, Detection of genetically
modified organisms (GMOs) by PCR: a brief review of methodologies available,
Trends in Food Science & Technology, 9, 380-388.
48. Germini, A., A. Zanetti, Claudia Salati, S. Rossi, Christel Forre, S. Schmid,
Rosangela Marchelli, 2004, Development of a seven-target multiplex PCR for
the simultaneous detection of transgenic soybean and maize in feeds and foods,
J. Agric. Food Chem., 52, 3275-3280.
49. Gherasimov, A., 2009, Comparri interlaboratoare organizate de BRML: etalonarea
mainilor statice monoaxiale de ncercat materiale, Metrologie 1, 44-53.
50. Hahnen, Silke, S. Offermann, Brigitte Miedl, Barbara Rger, C. Peterhnsel, 2002,
Automated DNA preparation from maize tissues and food samples suitable for
real-time PCR detection of native genes, Eur Food Res Technol 215:443-446.
51. Hails, R. and J. Kinderlerer, 2003, The GM public debate: context and
communication strategies, Nature Reviews Genetics, 4, 819-825.
52. Hamels, S., S. Leimanis, M. Mazzara, G. Bellocchi, N. Foti, W. Moens, J. Remacle,
G. van Den Eede, 2007, Microarray method for the screening of EU approved
GMOs by identification of their genetic elements Report of validation
coordinated by the Community Reference Laboratory for GM Food and Feed of
the Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection,
Biotechnology and GMOs Unit, Ispra, Italy.
Testarea OMG

265
53. Haugland, R. P., 2002, The handbook of fluorescent probes and research products,
Molecular Probes, Inc, Eugene, OR.
54. Hellmich, R. L., 2008, Monarch butterflies and Bt corn, http://agribiotech.info/
details/Hellmich-Monarch%20Mar%208%20-%2003.pdf.
55. Hernndez, Marta, Teresa Esteve, Salom Prat, Maria Pla, 2004a, Development of
real-time PCR systems based on SYBR Green I, Amplifluor and TaqMan
technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event
GA21, Journal of Cereal Science, 39, 99-107.
56. Hernndez, Marta, Marie-Nolle Duplan, G. Berthier, M. Vatilingom, W. Hauser,
Regina Freyer, Maria Pla, Y. Bertheau, 2004b, Development and comparison of
four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and
quantification of Zea mays L., J. Agric. Food Chem., 52, 4632-4637.
57. Hernndez, Marta, D. Rodrguez-Lzaro, Teresa Esteve, Salom Prat, Maria Pla,
2003, Development of melting temperature-based SYBR Green I polymerase
chain reaction methods for multiplex genetically modified organism detection,
Analytical Biochemistry, 323, 164-170.
58. Higgins, Holly, 2000. Romaina Planting seeds: Romanian legislation for GMO
seeds, Global Agriculture Information Network (GAIN) Report No. RO0005,
USDA Foreign Agricultural Service, http://www.fas.usda.gov/scripts/gd.asp?
ID=25667501, pagin consultat n iulie 2006.
59. Holst-Jensen, A., 2007, Validation of real-time PCR methods;-what can we learn
from the field of GMO detection?, http://fou02.planteforsk.no/Nordforsk
NetworkMycotox/PDFs/Validation%20of%20real-time%20PCR%20methods%2
0-%20what%20can%20we%20learn%20from%20the%20field%20of%20GMO
%20detection.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
60. Holst-Jensen, A., M. De Loose, G. Van den Eede, 2006, On the coherence between
legal requirements and approaches for detection of genetically modified
organisms (GMOs) and their derived products, J. Agric. Food Chem., 54, 2799-
2809.
61. Hbner, P., E. Studer, J. Lthy, 1999, Quantitation of genetically modified
organisms in food, Nature Biotechnology, 17, 1137-1138.
Testarea OMG

266
62. Huang, C.-C., T.-M. Pan, 2005, Event-specific real-time detection and
quantification of genetically modified Roundup Ready soybean, J. Agric. Food
Chem., 53, 3833-3839.
63. James, C., 2009a, 2008 ISAAA report on global status of biotech/GM crops,
http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/39/pptslides/Brief39Slides.pd
f, pagin consultat n octombrie 2009.
64. James, C., 2009b, Global status of commercialized biotech/GM crops: 2009. ISAAA
Briefs No. 41, ISAAA, Ithaca, NY.
65. James, C., 2008, Global status of commercialized biotech/GM crops: 2008. ISAAA
Briefs No. 39, ISAAA, Ithaca, NY.
66. James, C., 2007, Global status of commercialized biotech/GM crops: 2007. ISAAA
Briefs No. 37, ISAAA, Ithaca, NY.
67. James, C., 2005, An update of the role of GMOs in current and future production
worldwide, http://www.isaaa.org/Resources/publications/briefs/default.asp,
pagin consultat n octombrie 2009.
68. James, C., 2003, Global status of GM crops, their contribution to sustainability, and
future prospects, http://www.ibec.ie/Sectors/IBIA/ibiadoclib3.nsf/wvICSS/
7376439936CE0E6D80256E86004A384F/$File/Clive+James+GMO+%282.09
MB%29.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
69. James, C., 1998, Global review of commercialized transgenic crops: 1998. ISAAA
Briefs No. 8, ISAAA, Ithaca, NY.
70. James, C., A. F. Krattiger, 1996, Global review of the field testing and
commercialization of transgenic plants, 1986 to 1995: the first decade of crop
biotechnology. ISAAA Briefs No. 1, ISAAA, Ithaca, NY.
71. Jank, B., J. Rath, A. Spk, 2005, Co-existaence of agricultural production systems,
Trends Biotechnol, 23:5, 222-224.
72. Jasbeer, K., F. Mohamad Ghazali, Z. K. Cheah, R. Son, 2008, Comparison of
methods for the extraction of DNA from feeds for GMO analysis, 1
st
Global
Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-27 iunie 2008,
http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.2.44%20Jasbee%2
Testarea OMG

267
0et%20al%20poster%20COMPARISON%20OF%20METHODS%20FOR%20T
HE%20EXTRACTION.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
73. Kephart, D., S. Krueger, T. Grunst, H. Shenoi, 2006, A maximum instrument at a
minimum size Introducing the Maxwell 16 instrument: A simple, robust and
flexible tool for DNA purification, http://www.promega.com/pnotes/92/13408
_20/13408_20.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
74. Koller, Susan C., D. Storts, 2006, Promega Application Note #AP131: Purification
of genomic DNA from Glycine max seed using the Maxwell 16 system,
http://www.promega.com/maxwell16/application_notes/an131.1006.pdf, pagin
consultat n octombrie 2009.
75. Kubista, M., J. M. Andrade, M. Bengtsson, A. Forootan, J. Jonk, K. Lind, R.
Sindelka, R. Sjback, B. Sjgreen, L. Strmbom, A. Sthlberg, N. Zoric, 2006,
The real-time polymerase chain reaction, Molecular Aspects of Medicine, 27, 95-
125.
76. Kunert, Renate, J. S. Gach, Karola Vorauer-Uhl, E. Engel, H. Katinger, 2006,
Validated method for quantification of gentically modified organisms in samples
of maize flour, J. Agric. Food Chem., 54, 678-681.
77. Leau, Florentina, Handan Coste, Mirela Bosneag, Georgeta Diaconu, Iulia
Zybaczynski, Irina Olaru, 2008, PCR testing of RR soy in food and feed in
Romania, 1
st
Global Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-
27 iunie 2008, http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/
T.3.14%20FLORENTINA%20-%20COSTE.pdf, pagin consultat n octombrie
2009.
78. Lee, S.-H., D.-M. Min, J.-K. Kim, 2006, Qualitative and quantitative polymerase
chain reaction analysis for genetically modified maize MON863, J. Agric. Food
Chem., 54, 1124-1129.
79. Leimanis, S., S. Hamels, F. Naz, G. Mbongolo Mbella, M. Sneyers, R. Hochegger,
H. Broll, L. Roth, K. Dallmann, A. Micsinai, J. L. La Paz, M. Pla, C. Brnen-
Nieweler, N. Papazova, I. Taverniers, N. Hess, B. Kirschneit, Y. Bertheau, C.
Audeon, V. Laval, U. Busch, S. Pecoraro, K. Neumann, S. Rsel, J. van Dijk, E.
Kok, G. Bellocchi, N. Foti, M. Mazzara, W. Moens, J. Remacle, G. van Den
Testarea OMG

268
Eede, 2008, Validation of a GMO multiplex screening assay by the use of
microarray, Eur. Food Res. Technol., 227, 1621-1632.
80. Lin, H.-Y., H.-A. Wei, F.-P. Lin, D. Y.-C. Shih, 2006, Study of PCR detection
methods for genetically modified soybeans with reference molecules, Journal of
Food and Drug Analysis, 14, 194-202.
81. Lin, H.-Y., L.-C. Chiueh, D. Y.-C. Shih, 2000, Detection of genetically modified
soybeans and maize by the polymerase chain reaction method, Journal of Food
and Drug Analysis, 3, 200-207.
82. Losey, J. E., L. S.Rayor, M. E. Carter, 1999, Transgenic pollen harms monarch
larvae, Nature 399, 214.
83. Lthy, J., 1999, Detection strategies for food authenticity and genetically modified
foods, Food Control, 10, 359-336.
84. MacTavish, C., 2003, Frankenfood: It's Not Easy to Live GMO-Free,
http://www.democraticunderground.com/articles/03/10/31_gmo.html, pagin
consultat n octombrie 2009.
85. Matsuoka, T., H. Kuribara, K. Takubo, H. Akiyama, H. Miura, Y. Goda, Y.
Kusakabe, K. Isshiki, M. Toyoda, A. Hino, 2002, Detection of recombinant
DNA segments introduced to genetically modified maize (Zea mays), J. Agric.
Food Chem., 50, 2100-2109.
86. Mazzara, M., C. Charles-Delobel, C. Savini, G. Van den Eede, 2008, Method
validation for the detection of GMOs in the context of EU regulation, 1
st
Global
Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-27 iunie 2008,
http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.3.15%20CHARLES
%20DELOBEL.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
87. McClean, P., 1998, Analyzing plant gene expression with transgenic plants-
Agrobacterium-mediated transformation, http://www.cc.ndsu.nodak.edu/instruct/
mcclean/plsc731/transgenic/transgenic2.htm, pagin consultat n octombrie
2009.
88. Meyer, R., 1999, Development and application of DNA analytical methods for the
detection of GMOs in food, Food Control, 10, 391-399.
Testarea OMG

269
89. Mishra, I., 2007, Environmental impacts of genetically modified organisms,
Adhyayan Publishers & Distributors, India.
90. Moens, W., M. Deloose, J. Remarcle, A. Callebaut, G. Berben, 2005, Tracing and
authentication of GMOs and derived products in the food-processing area: final
report, Belgian Science Policy, Brussels: Federal Science Policy, disponibil on-
line la http://www.belspo.be/belspo/home/publ/pub_ostc/CPagr/rappCP32_en
.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
91. Morisset, D., Tina Demar, Kristina Gruden, Jana Vojvoda, Dejan tebih, Jana el,
2008, Detection of genetically modified organisms - closing the gaps, Nature
Biotechnology, 28:8, 700-701.
92. Monsanto, 2000, Updated molecular characterization and safety assessment of
Roundup Ready soybean event 40-3-2, Monsanto Company, St. Louis, MO,
SUA.
93. Moriuchi, R., K. Monma, N. Sagi, N. Uno, K. Kamata, 2007, Applicability of
quantitative PCR to soy processed foods containing Roundup Ready soy, Food
Control 18, 191-195.
94. Nap, J.-P., P. L. J. Metz, Marga Escaler and A. J. Conner, 2003, The release of
genetically modified crops into the environment. Part I. Overview of the current
status and regulations. The Plant Journal, 33, 1-18.
95. Onishi, M., T. Matsuoka, T. Kodama, K. Kashiwaba, S. Futo, H. Akiyama, T.
Maitani, S. Furui, T. Oguchi, A. Hino, 2005, Development of a multiplex
polymerase chain reaction method for simultaneous detection of eight events of
genetically modified maize, J. Agric. Food Chem., 53, 9713-9721.
96. Pcurar D. I., H. Thordal-Christensen, K. K. Nielsen, I. Lenk, 2008, A high-
throughput Agrobacterium-mediated transformation system for the grass model
species Brachypodium distachyon L., Transgenic Res., 17 (5), 965-975.
97. Permingeat, H. R., M. I. Reggiardo, R. H. Vallejos, 2002, Detection and
quantification of transgenes in grains by multiplex and real-time PCR, J. Agric.
Food Chem., 50 (16), 4431-4436.
98. Petit, Laetitia, Fabienne Baraige, Anne-Marie Balois, Y. Bertheau, P. Fach, 2003,
Screening of genetically modified organisms and specific detection of Bt176
Testarea OMG

270
maize in flours and starches by PCR-enzyme linked immunosorbent assay, Eur
Food Res Technol 217, 83-89.
99. Ponti, L., 2005, Transgenic crops and sustainable agriculture in the European
context, Bulletin of Science, Technology & Society, 25:4, 289-305.
100. Pretty, J., 2000, Genetic modification: overview of benefits and risks, http://www2.
essex.ac.uk/ces/ResearchProgrammes/SusAg/ofpandora.htm, pagin consultat
n octombrie 2008.
101. Querci, Madalenna, Claudia Paoletti, G. Van den Eede, 2007, From sampling to
quantification: developments and harmonization of procedures for GMO testing
in the European Union n: Collection of biosafety reviews, 3, 2007, Ministero
dellAmbiente a della Tutela del Teritorio e del Mare Direzione per la
protezione della Natura i International Centre for Genetic Engineering and
Biotechnology.
102. Querci, Maddalena, F. Weighardt, Nicoletta Foti, Claudia Paoletti, M. Mazzara,
2005, Detecting GMOs, European Communities, Office for the Official
Publications of the European Communities, Luxemburg.
103. Querci, Maddalena, 2004, Manual presentation, working methods and course
introduction n: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, Training
course on the analysis of food samples for the presence of genetically modified
organisms, Office for the Official Publications of the European Communities,
Luxemburg, disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/
manuals/Manual%20EN%202006/Session02.pdf, pagin consultat n octombrie
2009.
104. Querci, Maddalena, N. Foti, 2004, Samples used during the course n: Querci,
Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, Training course on the analysis of
food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for the
Official Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil on-
line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
%202006/Session03.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
105. Querci, Maddalena, M. Mazzara, 2004a, Characteristics of Roundup Ready
soybean, MON810 maize, and Bt176 maize n: Querci, Maddalena, M. Jeremi,
Testarea OMG

271
G. Van den Eede, Training course on the analysis of food samples for the
presence of genetically modified organisms, Office for the Official Publications
of the European Communities, Luxemburg, disponibil on-line la
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN%202006/
Session07.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
106. Querci, Maddalena, M. Mazzara, 2004b, Characteristics of the qualitative PCR
systems described in the manual n: Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den
Eede, Training course on the analysis of food samples for the presence of
genetically modified organisms, Office for the Official Publications of the
European Communities, Luxemburg, disponibil on-line la
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN%202006/
Session08.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
107. Querci, Maddalena, G. Van den Eede, M. Jermini, 2004a, Overview, general
introduction on Genetically Modified Organisms (GMOs), EU legislation n:
Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the
analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms,
Office for the Official Publications of the European Communities, Luxemburg,
disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/
Manual%20EN%202006/Session01.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
108. Querci, Maddalena, M. Maretti, M. Mazzara, 2004b, Qualitative detection of
MON810 maize, Bt176 maize and Roundup Ready soybean by PCR n: Querci,
Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, Training course on the analysis of
food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for the
Official Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil on-
line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
%202006/Session09.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
109. Rao, C. K., 2008, Gene use restriction technologies, http://fbae.org/2009/FBAE/
website/our-position-gene-use-restriction-technologies.html, Foundation for
Biotechnology Awarenessand Education.
Testarea OMG

272
110. Rott, M. E., Tracy S. Lawrence, Erika M. Wall, Margaret J. Green, 2004, Detection
and quantification of Roundup Ready soy in foods by conventional and real-time
polymerase chain reaction, J. Agric. Food Chem., 52, 5223-5232.
111. Raney, T, 2006, Economic impact of transgenic crops in developing countries,
Current Opinion in Biotechnology, 17, 1-5.
112. Reiting, R., H. Broll, H.-U. Waiblinger, L. Grohmann, 2007, Collaborative Study of
a T-nos Real-Time PCR Method for Screening of Genetically Modifi ed
Organisms in Food Products, J. Verbr. Lebensm., 2, 116-121.
113. Rudi, K., Ida Rud, A. Holck, 2003, A novel multiplex quantitative DNA array based
PCR (MQDA-PCR) for quantification of transgenic maize in food and feed,
Nucleic Acids Research, 31 (11), e62.
114. Sakai, E., M. Mori, K. Nakagawara, 2002, Automated DNA isolation from
genetically modified soybeans and soybean derived food material with the
MagNA Pure LC System, Biochemica, 1, disponibil on-line la
https://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/BIOCHEMI/no1_02/PDF/p
16.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
115. Schulze, Manuela, 2008, Experiences with accreditation of laboratories for GM(O)
detection, 1
st
Global Coference on GMO Analysis, Villa Erba, Como, Italia, 24-
27 iunie 2008, http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Presentations/
Schulze%20-%20Como_27-June-2008_4.pdf, pagin consultat n octombrie
2009.
116. Sisea, C. R., D. Pamfil, Iulia Francesca Pop, Ioana Virginia Petricele, 2008,
Technical requirements for the accreditation of GMO analysis procedures, In:
Bulletin of the USAMV-Iai, 51, 69, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iai.
117. Smith, Donna S., P. W. Maxwell, 2007, Use of quantitative PCR to evaluate several
methods for extracting DNA from corn flour and cornstarch, Food Control 18,
236-242.
118. Somma, M., 2004, Extraction and purification of DNA In: Querci, Maddalena, M.
Jeremi, G. Van den Eede, Training course on the analysis of food samples for
the presence of genetically modified organisms, Office for the Official
Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil on-line la
Testarea OMG

273
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN%202006/
Session04.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
119. Somma, M., Maddalena Querci, 2004a, Agarose gel electrophoresis In: Querci,
Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the analysis
of food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for
the Official Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil
on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
%202006/Session05.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
120. Somma, M., Maddalena Querci, 2004b, The polymerase chain reaction (PCR) In:
Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the
analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms,
Office for the Official Publications of the European Communities, Luxemburg,
disponibil on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/
Manual%20EN%202006/Session06.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
121. Studer, E., C. Rhyner, J. Lthy, P. Hbner, 1998, Quantitative competitive PCR for
the detection of genetically modified soybean and maize, Z Lebensm Unters
Forsch A, 207, 207-213.
122. Studer, E., I. Dahinden, J. Lthy, P. Hbner, 1997, Nachweis des gentechnisch
vernderten Maximizer-Mais mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR),
Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und Hygiene, 88, 515-524.
123. Tani, H., N. Noda, K. Yamada, S. Kurata, S. Tsuneda, A. Hirata, T. Kanagawa,
2005, Quantificationog genetically modified soybean by quenching probe
polymerase chain reaction, J. Agric. Food Chem., 53, 2535-2540.
124. Taverniers, Isabel, P. Windels, M. Vatilingom, Anne Milcamps, E. Van Bockstaele,
G. Van Den Eede, M. De Loose, 2005, Event-specific plasmid standards and
real-rime PCR methods for transgenic Bt11, Bt176, and GA21 maize and
transgenic GT73 canola, J. Agric. Food Chem., 53, 3041-3052.
125. Taverniers, Isabel, E. Van Bockstaele, M. De Loose, 2001, Use of cloned DNA
fragments as reference materials for event specific quantification of genetically
modified organisms (GMOs), Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep
Biol Wet., 66:3b, 469-472.
Testarea OMG

274
126. Tengel, C., P. Schler, E. Setzke, J. Balles, M. Sprenger-Hauels, 2001, PCR-
based detection of genetically modified soybean and maize in raw and highly
processed foodstuffs, BioTechniques 31, 426-429.
127. Thion, L., Christine Vossen, Bettina Couderc, Monique Erard, Blandine Clemenon,
2002, Detection of genetically modified organisms in food by DNA extraction
and PCR amplification, Biochemistry and Molecular Biology Education, 30 (1),
51-55.
128. Thompson M., S. L. R. Ellison, R. Wood, 2002, Harmonized guidelines for single-
laboratory validation of methods of analysis (IUPAC technical report), Pure
Appl. Chem., 74 (5), 835-855.
129. Thomson, Jennifer A., 2006, Seeds for the future: The impact of genetically
modified crops on the environment, Cornell University Press, Marea Britanie.
130. Toyota, A., H. Akiyama, M. Sugimura, T. Watanabe, H. Kikuchi, H. Kanamori, A.
Hino, M. Esaka, T. Maitani, 2006, Quantification of genetically modified
soybeans using a combination of a capillary-type real-time PCR system and a
plasmid reference standard, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70 (4), 821-827.
131. Trapmann, Stefanie, M. Burns, H. Broll, R. Macarthur, R. Wood, J. el, 2007
Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories,
Office for Official Publications of the European Communities, Louxembourg,
disponibil on-line la http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials
_catalogue/user_support/EUR22756EN.pdf, pagin consultat n octombrie
2009.
132. Trapmann, Stefanie, H. Emons, 2005, Reliable GMO analysis, Anal Bioanal Chem,
381, 72-74.
133. Trapmann, Stefanie, H. Schimmel, P. Corbisier, H. Emons, 2004, Production and
certification of reference materials for GMO detection and quantification, XII
Agrogene Seminar, Eurofins, Paris, Frana, 26-27 februarie 2004, disponibil on-
line la http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/publications/scientific_publications/
IRMM_2004_publications_bulletin%Trapmann.pdf, pagin consultat n martie
2008.
Testarea OMG

275
134. Tripathi, Leena, 2005, Techniques for detecting genetically modified crops and
products, African Journal of Biotechnology, 4 (13), 1472-1479.
135. Ujhelyi, Gabriella, B. Vajda, Emese Bki, K. Neszlnyi, Jlia Jakab, Anna Jnosi,
Erzsbet Nmedi, va Gelencsr, 2007, Surveying the RR soy content of
commercially available food products in Hungary, Food Control.
136. Vatilingom, M., H. Pijnenburg, F. Gendre, P. Brignon, 1999, Real-time quantitative
PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready
soybean in some representative foods, J. Agric. Food Chem., 47, 5261-5266.
137. Van den Bulcke, M., Amaya Casi Leunda, D. de Bernardi, Adinda De Schrijver, G.
MbongoMbella, Myriam Sneyers, 2005, Detection of Genetically Modified
Crops in Real-Time Practice: a State of the Art, http://www.economia.
uniroma2.it/conferenze/icabr2005/papers/VAn_de_Bulcke.pdf, pagin consultat
n octombrie 2009.
138. Waiblinger, H.-U., B. Ernst, N. Graf, K. Pietsch, 2006, Ring trial validation of a
method for the Extraction of DNA from Soy Lecithins, J. Verbr. Lebensm. 1,
113-115.
139. Weighardt, F., 2004, Quantitative PCR for the detection of GMOs In: Querci,
Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course on the analysis
of food samples for the presence of genetically modified organisms, Office for
the Official Publications of the European Communities, Luxemburg, disponibil
on-line la http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
%202006/Session10.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
140. Wilkinson, M. J., Caroline S. Ford, 2007, Estimating the potential for ecological
harm from gene flow to crop wild relatives n: Collection of biosafety reviews, 3,
2007, Ministero dellAmbiente a della Tutela del Teritorio e del Mare -
Direzione per la protezione della Natura i International Centre for Genetic
Engineering and Biotechnology.
141. Wilkinson, M. J., L. J. Elliott, J. Allainguillaume, M. W. Shaw, C. Norris, R.
Welters, M. Alexander, J. Sweet, D. C. Mason, 2003, Hybridization between
Brassica napus and B. rapa on a national scale in the United kingdom, Science
302, 457-459.
Testarea OMG

276
142. Wolf, C., M Scherzinger, A. Wurz, U. Pauli, P. Hbner, J. Lthy, 2000, Detection of
cauliflower mosaic virus by the polymerase chain reaction: testing of food
components for false-positive 35S-promoter screening results, European Food
Research and Technology, 210 (5), 367-372.
143. Wurz, A., A. Bluth, P. Zeltz, C. Pfeifer, R. Willmund, 1999, Quantitative analysis of
genetically modified organisms (GMO) in processed food by PCR-based
methods, Food Control 10, 385-389.
144. Xu J., H. Miao, H. Wu, W. Huang, R. Tang, M. Qiu, J. Wen, S. Zhub, Y. Li, 2006,
Screening genetically modified organisms using multiplex-PCR coupled with
oligonucleotide microarray, Biosensors and Bioelectronics 22, 71-77.
145. Yoshimura, T., H. Kuribara, T. Matsuoka, T. Kodama, M. Iida, T. Watanabe, H.
Akiyama, T. Maitani, S. Furui, A. Hino, 2005a, Applicability of the
quantification of genetically modified organisms to foods processed from maize
and soy, J. Agric. Food Chem., 53, 2052-2059.
146. Yoshimura, T., H. Kuribara, T. Kodama, S. Yamata, S. Futo, S. Watanabe, N. Aoki,
T. Iizuka, H. Akiyama, T. Maitani, S. Naito, A. Hino, 2005b, Comparative
studies of the quantification of genetically modified organisms in foods
processed from maize and soy using trial producing, J. Agric. Food Chem., 53,
2060-2069.
147. Zafar, Z., M. Asif, A. M. Khalid, 2004, Capacity building in biosafety of genetically
modified crops: GMOs (genetically modified organisms) detection, National
Institute for Biotechnology and Genetic Engineering, Faisalabad, Pakistan.
148. Zule, Mihaela, Lavinia Rusu, Steliana Kevorkian, Ctalina Luca(1), Sorina
Mihacea, Elena Marcela Badea, Marieta Costache, 2009, Detection and
quantification of GMO and sequencing of the DNA amplified products,
Romanian Biotechnological Letters, 14 (5), 4733-4746.
149. el, Jana, M. Mazzara, C. Savini, S. Cordeil, Marjana Camloh, Dejan tebih,
Katarina Cankar, Kristina Gruden, D. Morisset, G. Van den Eede, 2008, Method
validation and quality management in the flexible scope of accreditation: an
example of laboratories testing for genetically modified organisms, Food Anal.
Methods 1, 61-72.
Testarea OMG

277
150. el, Jana, Katarina Cankar, Maja Ravnikar, Marjana Camloh, Kristina Gruden,
2006, Accreditation of GMO detection laboratories: improving the reliability of
GMO detection, Accred Qula Assur, 10, 531-536.
151. Zhang, M., X. Gao, Y. Yu, J. Ao, J. Qin, Y. Yao, Q. Li, 2007, Detection of
Roundup Ready soy in highly processed products by triplex nested PCR, Food
Control 18, 1277-1281.
152. Zhou, X., W. Liu, J. Lian, W. Zhang, 2007, Monitoring of Roundup Ready soybean
in Guangdong province in China, Food Control 18, 1219-1222.
153. *** AGBIOS, 2009a, GM Database, http://www.agbios.com/dbase.php, pagin
consultat n martie 2009.
154. *** AGBIOS, 2009b, GM Database MON-432-6 (GTS 40-3-2), http://www.
agbios.com/dbase.php?action=Submit&evidx=25, pagin consultat n martie
2009.
155. *** AGBIOS, 2009c, GM Database SYN-EV176-9 (176),
http://www.agbios.com/dbase.php?action=Submit&evidx=31, pagin consultat
n martie 2009.
156. *** AgResearch, 2001, GMOs Summary of Issues, http://www.agresearch.co.nz/,
pagin consultat n iunie 2006.
157. *** AgResearch, 2000a, GMOs The Advantages, http://www.agresearch.co.nz/,
pagin consultat n iunie 2006.
158. *** AgResearch, 2000b, GMOs The Disadvantages,
http://www.agresearch.co.nz/, pagin consultat n iunie 2006.
159. *** Applied Biosystems, 2009, Veriti 384-Well Thermal Cycler,
https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/htdocs/productMgr/images/38
4_big.jpg.jpg, pagin consultat n octombrie 2009.
160. *** Applied Biosystems, 2001, User Bulletin #2 ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System, http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_
support/documents/generaldocuments/cms_040980.pdf, pagin consultat n
octombrie 2009.
161. *** MBG, 2009, Molecular Biology and Genomics Unit,
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/, pagin consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

278
162. *** Biotools, 2008, Biogenics QT RoundUp Ready Soya QT Kit, Instructions for
use, http://www.biotools.eu/pdf/manuals/117.%20RoundUp%20Ready%20SOYA
%20QT-Corbett-ing%20eng.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
163. *** Biotools, 2007a, Biogenics Standard Kit, Instructions for use,
http://www.biotools.eu/pdf/manuals/105.%20BIOGENICS%20Standard%20eng.
pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
164. *** Biotools, 2007b, Biogenics QT Bt-176 Maize QT Kit, Instructions for use,
http://www.biotools.eu/pdf/manuals/119.%20Bt-176%20MAIZE%20QT%20Kit-
Corbett-ing%20eng.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
165. *** CEN/TS 15568:2006 - Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of
genetically modified organisms and derived products - Sampling strategies.
166. *** Center for Medical Genetics, 2007, RDML Real-time PCR data markup
language, Discussion forum, http://www.rdml.org/RDML_Freising_2007.pdf,
pagin consultat n octombrie 2009.
167. *** Checkbiotech, 2005, Hepatitis B vaccination by eating a banana?,
http://www.monsanto.co.uk/news/ukshowlib.phtml?uid=9668, pagin consultat
n octombrie 2009.
168. *** Comisia Europeana, 2009, Genetically modified food and feed,
http://ec.europa.eu/food/food/biotechnology/index_en.htm, pagin consultat n
octombrie 2009.
169. *** Commission Recommendation 2004/787/EC of 4 October 2004 on technical
guidance for sampling and detection of genetically modified organisms and
material produced from genetically modified organisms as or in products in the
context of Regulation (EC) No 1830/2003, Official Journal L 348, 24/11/2004 P.
0018-0026, disponibil on-line la http://eur-lex.europa.eu/Notice.do?mode=
dbl&lang=ro&lng1=ro,en&lng2=cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,nl,pl,pt,sk,sl,
sv,&val=391701:cs&page=1&hwords=, pagin consultat n octombrie 2009.
170. *** Corbett Research, 2004, Operator Manual, Rotor-Gene 3000 Real-Time
Thermal Cycler, Corbett Research.
Testarea OMG

279
171. *** CPB, 2000, Secretariat of the Convention on Biological Diversity,
http://www.cbd.int/biosafety/protocol.shtml, pagin consultat n octombrie
2008.
172. *** CRL-GMFF, 2009a, Legal basis, http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/
legalbasis.htm, pagin consultat n octombrie 2009.
173. *** CRL-GMFF, 2009b, Status of dossiers, http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/
statusofdoss.htm, pagin consultat n octombrie 2009.
174. *** CRL-GMFF, 2009c, Community Reference Laboratory for GM Food and Feed,
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/default.htm, pagin consultat n octombrie 2009.
175. *** CRL-GMFF, 2007, Report on the validation of a DNA extraction method for
soybean seeds, http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/40-3-2_DNAExtr
_report.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
176. *** Directiva 2001/18/CE a Parlamentului European i a Consiliului din 12 martie
2001 privind diseminarea deliberat n mediu a organismelor modificate genetic
i de abrogare a Directivei 90/220/CEE a Consiliului, JO L 106, 17.4.2001, p. 1-
39, disponibil on-line la http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do
?uri=OJ:L:2001:106:0001:01:RO:HTML, pagin consultat n octombrie 2009.
177. *** ENGL, 2009, European Network of GMO Laboratories, http://engl.jrc.ec.
europa.eu/, pagin consultat n octombrie 2009.
178. *** ENGL, 2008, Definition of minimum performance requirements for analytical
methods of GMO testing, http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/Min_Perf_Requir
_Analyt_methods_131008.pdf, pagin consultat n septembrie 2009.
179. *** EnviroLogix, 2009, QuickScan The Next-Generation Quantification and
Traceability System, http://www.envirologix.com/artman/publish/article
_306.shtml, pagin consultat n octombrie 2009.
180. *** Eppendorf, 2008, See what you can eat, Eppendorf, http://www.eppendorf.com/
int/index.php?l=251&action=products&contentid=1&productpage=12&catalo
gnode=34880.
181. *** FAO, 2005, World cereal output revised downward, http://www.fao.org/
newsroom/en/news/2005/107900/, pagin consultat n septembrie 2009.
Testarea OMG

280
182. *** FAO, 2002, What should be the role and focus of biotechnology in the
agricultural research agendas of developing countries?, http://www.fao.org/
biotech/C8doc.htm, pagin consultat n septembrie 2009.
183. *** Fermentas, 2009, GeneRuler and O'GeneRuler DNA Ladders, http://www.
fermentas.com/catalog/electrophoresis/generulers.htm, pagin consultat n
septembrie 2009.
184. *** Flickr, 2008, Anti GMO G2 Guardian, http://www.flickr.com/photos/
13176933@N05/2223675429/, pagin consultat n septembrie 2009.
185. *** Genome News Network, 2004, Genetics and Genomics Timeline 1973,
http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1973_Boyer.php, pagin
consultat n octombrie 2009.
186. *** GMO Compass, 2009, GMO Database, http://www.gmo-compass.org/eng/
gmo/db/, pagin consultat n octombrie 2009.
187. *** GMO Compass, 2008a, EU Commission: New genetically modified soybean
authorised in the EU, http://www.gmo-compass.org/eng/news/407.docu.html,
pagin consultat n octombrie 2009.
188. *** GMO Compass, 2008b, China plans to invest US$3.5 billion in GM crops R&D
and consumer education, http://www.gmo-compass.org/eng/news/stories/
381.china_plans_invest_gm_crops_rd_consumer_education.html, pagin
consultat n octombrie 2009.
189. *** GMO Compass, 2007, Labelling of GMO products: Freedom of choice for
consumers, http://www.gmo-compass.org/eng/regulation/labelling/, pagin
consultat n octombrie 2009.
190. *** GMO Compass, 2006a, Verdict in WTO conflict: EU moratorium on approval
of GMOs was unlawful, http://www.gmo-compass.org/eng/news/messages/
200610.docu.html, pagin consultat n octombrie 2009.
191. *** GMO Compass, 2006b, Genetically modified food and feed: The EU regulatory
process, http://www.gmo-compass.org/eng/regulation/regulatory_process/,
pagin consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

281
192. *** GMO Compass, 2006c, Coexistence: Different agricultural systems working
side by side, http://www.gmo-compass.org/eng/regulation/coexistence/, pagin
consultat n martie 2009.
193. *** Golden Rice Project, 2009, http://www.goldenrice.org/, pagin consultat n
octombrie 2009.
194. *** Greenacresfarm, 2008, http://www.greenacresfarm.com/comic_relief.htm,
pagin consultat n octombrie 2009.
195. *** Greenpeace, 2003, GMO Maize: a dangerous experiment, http://
www.greenpeace.org/canada/en/photos-and-video/latest/gmo-mais-dangerous,
pagin consultat n octombrie 2009.
196. *** Grenswetenschap, 2008, Frankenfood hoax, http://www.grenswetenschap.nl/
permalink.asp?grens=1954, pagin consultat n octombrie 2009.
197. *** GSLC (Genetic Science Learning Center, Univerisity of Utah), 2003, Gel
electrophoresis virtual lab, http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/,
pagin consultat n septembrie 2009.
198. *** Idaho Technology, 2009, LC Green information sheet, http://www. gene-
quantification.de/LC-Green-info.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
199. *** IGBMC Microarray and Sequencing Platform, 2008, IGBM microarray and
sequencing platform, http://www-microarrays.u-strasbg.fr/base.php?page
=facilityEquipmentsE.php, pagin consultat n octombrie 2009.
200. *** ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation), 2002, The scope of
accreditation & consideration of methods & criteria for the assessment of the
scope in testing, http://www.ilac.org/documents/ILAC_G18-2002_the_scope_of
_accred_and_consid_of_methods_Word_Version.pdf, pagin consultat n
octombrie 2009.
201. *** Invitrogen, 2009, Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, http://products.
invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&productI
D=P11496&CID=Search-Product, pagin consultat n octombrie 2009.
202. *** IRMM, 2009, Certified Reference Materials 2009, http://irmm.jrc.ec.europa.eu/
html/reference_materials_catalogue/catalogue/RM_Catalogue.pdf, pagin
consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

282
203. *** IRMM, 2008a, Update on some reference material activities of IRMM: year
2007, Accred Qual Assur, 13:241-342.
204. *** IRMM, 2008b, Certificate of analysis ERM- BF410dk, http://www.erm-
crm.org/html/ERM_products/search/certificates/BF410dk.pdf, pagin consultat
n octombrie 2009.
205. *** ISF (International Seed Federation), 2003, Genetic Use Restriction
Technologies, http://www.worldseed.org/cms/medias/file/PositionPapers/OnSust
ainableAgriculture/Genetic_Use_Restriction_Technologies_20030611_(En).pdf.
206. *** ISCID (International Society for Complexity, Information, and Design)
Encyclopedia of Science and Philosophy, 2005, Gel electrophoresis,
http://www.iscid.org/encyclopedia/Gel_Electrophoresis, pagin consultat n
octombrie 2009.
207. *** MAF (The Ministry of Agriculture and Forestry/Ministerul Agriculturii i
Pdurilor, Noua Zeeland), 1996, Genetically Modified Food (GMF),
http://www.maf.govt.nz/mafnet/schools/activities/gmfbio.htm, pagin consultat
n iunie 2006.
208. *** MAPDR, 2008, Legislatia nationala in domeniul organismelor modificate
genetic, http://www.mapam.ro/pages/page.php?self=06&sub=0604&tz=060404,
pagin consultat n octombrie 2009.
209. *** MATC (Madison Area Technical College), 2009, The biotechnology project
Laboratory exercise 15: UV spectrophotometry of DNA, RNA, and proteins,
http://biotech.matcmadison.edu/resources/methods/labManual/unit_4/exercise_1
5.htm, pagin consultat n octombrie 2009.
210. *** Molecular Station, 2007a, http://www.molecularstation.com/molecular-biology-
images/508-microarray-pictures/, pagin consultat n octombrie 2009.
211. *** Molecular Station, 2007b, http://www.molecularstation.com/ molecular-
biology-images/509-pcr-pictures/, pagin consultat n octombrie 2009.
212. *** NCHGR (National Center for Human Genome Research), 1992, Polymerase
chain reaction xeroxing DNA, http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BC/
PCR_Xeroxing_DNA.php, pagin consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

283
213. *** NIST (National Institute of Standards and Technology), 2000, Uncertainty of
measurement results, http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/ index.html, pagin
consultat n octombrie 2009.
214. *** Office of Biotechnology, Iowa State University, 2009, QuickStix Strip Kit
Envirologix Inc.Corn Leaf Tissue, http://www.biotech.iastate.edu/publications/
lab_protocols/QuickStix-corn_leaf/, pagin consultat n octombrie 2009.
215. *** Promega, 2009, Molecular weight markers, http://www.promega.com/catalog/
category.aspx?categoryname=productgroup_23&ckt=1, pagin consultat n
octombrie 2009.
216. *** Promega, 2006, Maxwell 16 DNA Purification kits, Technical manual,
Promega Corporation.
217. *** Qiagen, 2007, QIAamp DNA Stool Handbook, Qiagen, disponibil on-line la
http://www1.qiagen.com/HB/QIAampDNAStoolMiniKit_EN, pagin consultat
n octombrie 2009.
218. *** Qiagen, 2006, DNeasy Plant Handbook, Qiagen, disponibil on-line la
http://www1.qiagen.com/HB/DNeasy96PlantKit_EN, pagin consultat n
octombrie 2009.
219. *** R-Biofarm, 2009, SureFood GMO 35S/NOS Screening, http://www.r-
biopharm.com/product_site.php?product_id=801&product_class_one=R1ZP&p
roduct_class_two=U2NyZWVu&product_class_three=MzVTICsgTk9T&product
_class_four=&product_range=Food%20and%20Feed%20Analysis&, pagin
consultat n octombrie 2009.
220. *** Regulamentul (CE) nr. 641/2004 al Comisiei din 6 aprilie 2004 privind normele
de aplicare a Regulamentului (CE) nr. 1829/2003 al Parlamentului European i
al Consiliului n ceea ce privete cererea de autorizare a noilor produse
alimentare i noile furaje modificate genetic, notificarea produselor existente i
prezena ntmpltoare sau tehnic inevitabil a unui material modificat genetic
care a fcut obiectul unei evaluri de risc i a obinut un aviz favorabil, Jurnalul
Oficial L 102, 7.4.2004, p. 14-25, disponibil on-line la http://eur-
lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2004:102:0014:01:RO:HT
ML, pagin consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

284
221. *** Regulamentul (CE) nr. 1981/2006 al Comisiei din 22 decembrie 2006 privind
normele de aplicare a articolului 32 din Regulamentul (CE) nr. 1829/2003 al
Parlamentului European i al Consiliului n ceea ce privete laboratorul
comunitar de referin pentru organismele modificate genetic, Jurnalul Oficial L
314, 01/12/2007 p. 0641-0651, disponibil on-line la http://eur-lex.europa.eu/
LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:368:0099:01:RO:HTML, pagin
consultat n octombrei 2009.
222. *** Regulamentul (CE) nr. 1829/2003 al Parlamentului European i al Consiliului
din 22 septembrie 2003 privind produsele alimentare i furajele modificate
genetic, Jurnalul Oficial L 268, 18/10/2003 P. 0001-0023, disponibil on-line la
http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2003:268:0001:
01:RO: HTML, pagin consultat n octombrie 2009.
223. *** Regulamentul (CE) nr. 1830/2003 al Parlamentului European i al Consiliului
din 22 septembrie 2003 privind trasabilitatea i etichetarea organismelor
modificate genetic i trasabilitatea produselor destinate alimentaiei umane sau
animale, produse din organisme modificate genetic, i de modificare a Directivei
2001/18/CE, Jurnalul Oficial L 268, 18.10.2003, p. 24-28, disponibil on-line la
http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2003:268:0024:
01:RO:HTML, pagin consultat n octombrie 2009.
224. *** Retsch, 2009, Knife mill Grindomix GM 200, http://www.retsch.com/
products/milling/cutting-mills/gm-200/, pagin consultat n octombrie 2009.
225. *** Roche, 2009a, The LightCycler 480 System Unleash the potential of real-time
PCR, Roche Applied Science, disponibil on-line la https://www.roche-applied-
science.com/sis/rtpcr/htc/htc_docs/LC480_0608_LR_final.pdf, pagin consultat
n octombrie 2009.
226. *** Roche, 2009b, MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, Roche Applied Science,
disponibil on-line la https://www.roche-applied-science.com/pack-insert/
3003990a.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
227. *** Roche, 2006a, LightCycler 480 Instrument - Operators Manual, Roche
Diagnostics GmbH.
Testarea OMG

285
228. *** Roche, 2006b, LightCycler 480 Probes Master, Roche Applied Science,
disponibil on-line la https://www.roche-applied-science.com/pack-insert/
4707494a.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
229. *** Roche, 2005, MagNA Pure LC Operators Manual Version 3.0, Roche Applied
Science.
230. *** Roche, 2004, High Pure GMO Sample Preparation Kit Instruction Manual,
Roche Applied Science, disponibil on-line la https://www.roche-applied-
science.com/pack-insert/3267202a.pdf, pagin consultat n octombrie 2009.
231. *** Sigma-Aldrich, 2009, Zinc Finger Nuclease (ZFN), CompoZr Zinc Finger
Nuclease Technology, disponibil on-line la http://www.sigmaaldrich.com/life-
science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology.html,
pagin consultat n octombrie 2009.
232. *** SOT (Society of Toxicology), 2003, The safety of genetically modified foods
produced through biotechnology, Toxicological Sciences, 71, 2-8.
233. *** SR ISO 5725-1:1997 Exactitatea (justeea i fidelitatea) metodelor de
msurare i a rezultatelor msurtorilor. Partea 1: Principii generale i definiii.
234. *** SR ISO 5725-3:1997 Exactitatea (justeea i fidelitatea) metodelor de
msurare i a rezultatelor msurtorilor. Partea 1: Msurri intermediare ale
fidelitii unei metode de msurare standardizate.
235. *** SR EN ISO 24276:2006 Produse alimentare. Metode de detecie a
organismelor modificate genetic i a produselor derivate. Cerine generale i
definiii.
236. *** SR EN ISO 21569:2006 Produse alimentare. Metode de analiz pentru
detectarea organismelor modificate genetic i a produselor derivate. Metode
calitative bazate pe utilizarea acizilor nucleici.
237. *** SR EN ISO 21570:2006 Produse alimentare. Metode de analiz pentru
detectarea organismelor modificate genetic i a produselor derivate. Metode de
determinare cantitativ bazate pe utilizarea acizilor nucleici.
238. *** SR EN ISO 21571:2006 Produse alimentare. Metode de analiz pentru
detectarea organismelor modificate genetic i a produselor derivate. Extracia
acizilor nucleici.
Testarea OMG

286
239. *** SR EN ISO/CEI 17025:2005 Cerine generale pentru competena
laboratoarelor de ncercri i etalonri.
240. *** Strategic Diagnostics, 2004, GMOChek RUR Soya Test Kit,
http://www.sdix.com/PDF/Products/7100000PP.pdf, pagin consultat n
septembrie 2009.
241. *** The Future of Things, 2007, Biopen senses biothreats,
http://thefutureofthings.com/articles.php?itemId=37/56/, pagin consultat n
octombrie 2009.
242. *** Truth about Trade & Technology, 2003, Biotech saves Romania,
http://www.truthabouttrade.org/article.asp?id=2181, pagin consultat n
octombrie 2006.
243. *** UNFPA, 2009, Linking population, poverty and development - Rapid growth in
less developed regions, http://www.unfpa.org/pds/trends.htm, pagin consultat
n martie 2009.
244. *** UVP, 2009, BioSpectrum AC Imaging System, http://www.uvp.com/
biospectrum.html, pagin consultat n octombrie 2009.
245. *** Wikipedia, 2009a, Accuracy and precision, http://en.wikipedia.org/wiki/
Accuracy_and_precision, pagin consultat n octombrie 2009.
246. *** Wikipedia, 2009b, rpd Pusztai, http://en.wikipedia.org/wiki/%C3%81rp%
C3%A1d_Pusztai, pagin consultat n octombrie 2009.
247. *** Wikipedia, 2009c, Bacillus thuringiensis, http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_
thuringiensis, pagin consultat n octombrie 2009.
248. *** Wikipedia, 2009d, Cornmeal, http://en.wikipedia.org/wiki/Cornmeal, pagin
consultat n octombrie 2009.
249. *** Wikipedia, 2009e, Corn syrup, http://en.wikipedia.org/wiki/Corn_syrup, pagin
consultat n octombrie 2009.
250. *** Wikipedia, 2009f, DNA electrophoresis, http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_
electrophoresis, pagin consultat n octombrie 2009.
251. *** Wikipedia, 2006g, Denaturation (biochemistry), http://en.wikipedia.org/wiki/
Denaturation_%28biochemistry%29, pagin consultat n octombrie 2009.
Testarea OMG

287
252. *** Wikipedia, 2009h, Frster resonance energy transfer, http://en.wikipedia.org/
wiki/F%C3%B6rster_resonance_energy_transfer, pagin consultat n
octombrie 2009.
253. *** Wikipedia, 2009i, Genetically modified food controversies, http://en.wikipedia.
org/wiki/Frankenfood, pagin consultat n octombrie 2009.
254. *** Wikipedia, 2009j, GMO, http://en.wikipedia.org/wiki/GMO, pagin consultat
n octombrie 2009.
255. *** Wikipedia, 2009k, Golden rice, http://en.wikipedia.org/wiki/Golden_rice,
pagin consultat n octombrie 2009.
256. *** Wikipedia, 2009l, Green revolution, http://en.wikipedia.org/wiki/Green_
Revolution, pagin consultat n octombrie 2009.
257. *** Wikipedia, 2009m, Grits, http://en.wikipedia.org/wiki/Grits, pagin consultat
n octombrie 2009.
258. *** Wikipedia, 2009n, Least squares, http://en.wikipedia.org/wiki/Least_squares,
pagin consultat n octombrie 2009.
259. *** Wikipedia, 2009o, Soy protein, http://en.wikipedia.org/wiki/Soy_protein,
pagin consultat n octombrie 2009.
260. *** Wikipedia, 2009p, Starch, http://en.wikipedia.org/wiki/Starch, pagin
consultat n octombrie 2009.
261. *** Wikipedia, 2009q, SYBR Green I, http://en.wikipedia.org/wiki/SYBR_Green_I,
pagin consultat n octombrie 2009.
262. *** Wikipedia, 2009r, Textured soy protein, http://en.wikipedia.org/wiki/Textured_
soy_protein, pagin consultat n octombrie 2009.
263. *** Wikipedia, 2009s, Traceability of genetically modified organisms, http://
en.wikipedia.org/wiki/Traceability_of_genetically_modified_organisms, pagin
consultat n octombrie 2009.
264. *** Wikipedia, 2009t, Zinc finger nuclease, http://en.wikipedia.org/wiki/Zinc_
finger_nuclease, pagin consultat n octombrie 2009.
265. *** Xty Digital Design, 2001, Monsantosoy, www.xtywebworks.ns.ca/images/
monsantosoy.jpg, pagin consultat n martie 2009.

Testarea OMG

288

















ANEXE
ANNEXES
Testarea OMG

289
Anexa I. Forme de protest mpotriva utilizrii PMG-urilor
Annex I. Forms of protesting against the use of GM crops


Surs: MacTavish (2003). Surs: Grenswetenschap (2008)

Surs: Greenacresfarm (2008). Surs: Ciola (2001). Surs: Greenpeace (2003).
Surs: Xty Digital Design (2001). Surs: Flickr (2008).
Fig. 87. Forme de protest mpotriva utilizrii PMG-urilor.
Fig. 87. Forms of portesting against GMCs.
Testarea OMG

290
Anexa II. Aspecte ale activitii de eantionare
Annex II. Aspects of sampling activities














(a) (b) (c)
Fig. 88. Aspecte ale activitii de eantionare a produselor n vrac. (a) Prelevarea probelor din loturi de loturi de
dimensiuni reduse i utilizarea testelor rapide pentru screeningul OMG. (b) Prelevarea probelor din loturi de loturi
de dimensiuni mari. (c) Recepionarea probei de laborator i pregtirea acesteia n vederea obinerii probei test.
Fig. 88. Aspects of sampling bulk commodities. (a) Sampling of small sized lots and using test strips for GMO
screening. (b) Sampling of large sized lots. (c) Receiving the laboratory sample and preparing the test portion.
Surse: Schulze (2008); Bertheau (2007).
Testarea OMG

291
Anexa III. Testele rapide (lateral flow strips)
Annex III. Lateral flow strips testing procedure




Fig. 89. Utilizarea testelor rapide QuickStix Strip (EnviroLogix) pentru detecia porumbului Bt.
Fig.89. Using QuickStix Strip (EnviroLogix) to detect Bt maize.
Surs: Office of Biotechnology, Iowa State University (2009).

Testarea OMG

292
Anexa IV. Produse alimentare ce conin soia
Annex IV. Foods containing soybean





















Fig. 90. Tipuri de produse alimentare n care extractul proteic din soia nlocuiete ingredientele de origine animal.
Fig. 90. Types of foods in which the soybean protein is substituting the animal-derived ingredients.


Testarea OMG

293














Fig. 90. Tipuri de produse alimentare ce conin soia ca ingredient i produse alimentate pe baz de soia.
Fig. 90. Types of foods containg soybean as ingredient and soybean-based foods.
Testarea OMG

294






Fig. 91. Tipuri de texturate proteice din soia utilizate ca alimente.
Fig. 91. Types of textured soybean protein used as foods.

Testarea OMG

295
Anexa V. Metode de extracie a ADN-ului
Annex V. DNA extraction methods

1. Extracia ADN-ului utiliznd metoda pe baz de CTAB
1. DNAextraction using the CTAB-based method

Echipamentele i consumabilele utilizate n cadrul acestui protocol de extracie sunt:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule i tvie pentru cntrire;
- suport pentru cntrire;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- vase de laborator pentru pregtirea soluiilor;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200, 1000 i 5000 l
(Eppendorf) i vrfuri cu barier;
- incubator Inkubator 1000 (Heidoplph);
- agitator Titramax 1000 (Heidolph);
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma).

Reactivi:
- cloroform (CHCl
3
);
- etanol (C
2
H
5
OH);
- isopropanol (CH
3
CH(OH)CH
3
);
- proteinaz K 100 mg/ml (Qiagen);
- RNaz A, 100 mg/ml (Qiagen).



Testarea OMG

296
Soluii de lucru:
- tampon CTAB de extracie, c(CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 M, c(Tris) = 0,1 M,
c(Na
2
EDTA) = 0,02 M;
- tampon CTAB de precipitare, c(CTAB) = 5 g/l, c(NaCl) = 0,04 M;
- soluie de clorur de sodiu, c(NaCl) = 1,2 M;
- soluie de etanol, c(C
2
H
5
OH) = 70%;
- soluie de proteinaz K, c = 20 mg/ml, n ap steril; nu se autoclaveaz, se
pstreaz la -20 C, se evit congelarea/decongelarea repetat.

Prepararea tamponului CTAB de extracie:
se msoar un volum de 100 ml de ap deionizat i se introduce n paharul
Berzelius;
se incubeaz la 50 C, sub agitare continu;
se cntresc 4 g CTAB, 16,4 g NaCl, 3,15 g Tris i 1,5 g Na
2
EDTA i se introduc
n paharul cu 100 ml de ap;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de ~180 ml;
se aduce pH-ul la valoarea 8,0 cu soluia de NaOH;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de 200 ml; apoi soluia se trece
ntr-un recipient autoclavabil cu dop;
se autoclaveaz;
se noteaz pe recipient data preparrii i se pstreaz la 4 C.

Prepararea tamponului CTAB de precipitare:
se msoar un volum de 100 ml de ap deionizat i se introduc n paharul
Berzelius;
se incubeaz la 50 C, sub agitare continu;
se cntresc 1 g CTAB i 0,5 g NaCl i se introduc n paharul cu 100 ml de ap;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de ~180 ml;
se aduce pH-ul la valoarea 8,0 cu soluia de NaOH;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de 200 ml; apoi soluia se trece
ntr-un recipient autoclavabil cu dop;
Testarea OMG

297
se autoclaveaz;
se noteaz pe recipient data preparrii i se pstreaz la 4 C.

Etapele preparrii soluiei de NaCl 1,2 M:
se msoar un volum de 100 ml de ap deionizat i se introduc n paharul
Berzelius;
se incubeaz la 50 C, sub agitare continu;
se cntrete 1 g CTAB i 0,5 g NaCl i se introduc n paharul cu 100 ml de ap;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de ~180 ml;
se aduce pH-ul la valoarea 8,0 cu soluia de NaOH;
se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de 200 ml; apoi soluia se trece
ntr-un recipient autoclavabil cu dop;
se autoclaveaz;
se noteaz pe recipient data preparrii i se pstreaz la temperatura camerei.

Etapele preparrii soluiei de etanol 70% (v/v):
se msoar 15 ml ap direct n tubul de centrifug;
cu cilidrul gradat se msoar 35 ml etanol care se adaug apoi n tubul de
centrifug.

Succesiunea etapelor de lucru este prezentat n continuare:
- peste proba test, (100 mg material vegetal i 300 l ap) se pipeteaz 700 l
tampon CTAB de extracie prenclzit la 55 C i se omogenizeaz;
- se pipeteaz 20 l de proteinaz K i se agit;
- se incubeaz timp de 60 min la 55 C, sub agitare uoar;
- se pipeteaz 30 l de RNaz A i se agit uor;
- se incubeaz timp de 30 min la 37 C, sub agitare uoar;
- se centrifugheaz timp de 10 min la 12.000 rpm;
- se pipeteaz supernatantul (500 l) ntr-un tub de 1,5 ml;
- se pipeteaz 500 l de cloroform i se amestec bine;
- se centrifugheaz timp de 10 min la 12.000 rpm;
Testarea OMG

298
- se transfer 500 l din faza superioar ntr-un tub 1,5 ml;
- se pipeteaz 500 l de cloroform i se amestec bine;
- se centrifugheaz timp de 5 min la 12.000 rpm;
- se pipeteaz faza superioar (apoas) ntr-un tub de 1,5 ml;
- se pipeteaz 2 volume de tampon CTAB de precipitare i se amestec prin
inversare;
- se incubeaz timp de 60 min la temperatura camerei, fr agitare;
- se centrifugheaz timp de 5 min la 12.000 rpm;
- se elimin supernatantul;
- se dizolv ADN-ul precipitat pipetnd 350 l soluie de NaCl 1,2 M;
- se pipeteaz 350 l soluie de cloroform i se amestec bine;
- se centrifugheaz timp de 10 min la 12.000 rpm;
- se pipeteaz faz apoas (superioar) ntr-un nou tub de 0,5 ml;
- se pipeteaz 0,6 volume de isopropanol i se amestec uor prin inversare;
- se pstreaz la rece timp de 15 min;
- se centrifugheaz timp de 10 min la 12.000 rpm i se elimin supernatantul;
- se pipeteaz 500 l de soluie de etanol 70% i se amestec prin inversare;
- se centrifugheaz timp de 10 min la 12.000 rpm i se elimin supernatantul;
- se usuc peletele i se redizolv n 100 l ap steril liber de DNaze.

2. Extracia ADN-ului cu kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen)
2. DNA extraction with the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)

Echipamente necesare:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule;
- suport pentru cntrire;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
Testarea OMG

299
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200, 1000 i 5000 l
(Eppendorf) i vrfuri cu barier;
- incubator Inkubator 1000 (Heidoplph);
- agitator Titramax 1000 (Heidolph);
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- coloane de purificare DNeasy (DNeasy Mini Spin Columns), incluse n kitul
DNeasy Plant Mini (Qiagen);
- coloane de purificare QIAshredder (QIAshredder Mini Spin Columns), incluse n
kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen)
- tuburi de colectare, incluse n kitul DNeasy Plant Mini (Qiagen).

Reactivi:
- etanol (C
2
H
5
OH).

Soluii:
- tampon AP1 (Buffer AP1), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- tampon AP2 (Buffer AP2), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- tampon AP3/E (Buffer AP3/E), soluie concentrat inclus n kitul de extracie;
pentru obinerea soluiei de lucru se dilueaz cu etanol conform manualului de
utilizare;
- tampon AW (Buffer AW), soluie concentrat inclus n kitul de extracie; pentru
obinerea soluiei de lucru se dilueaz cu etanol conform manualului de utilizare;
- tampon AE (Buffer AE), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- RNaz A (100 mg/ml), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie.

Protocol de lucru:
- se cntrete proba test, reprezentat de 20 mg material uscat i mrunit sub
forma unei pudre fine, i se introduce ntr-un tub de 1,5 ml;
- se adaug 400 l tampon AP1 i 4 l soluie stoc de RNaz (100 mg/ml);
Testarea OMG

300
- se omogenizeaz i se incubeaz tip de 10 minute la 65 C; se agit de 2-3 ori prin
inversare;
- se adaug 130 l de tampon AP2, se omogenizeaz i se incubeaz pe ghea timp
de 5 minute;
- se centrifugheaz 5 minute la 14.000 rpm;
- faza superioar (lizatul celular) este transferat n coloana QIAshredder (culoare
violet) plasat ntr-un tub de colectare;
- se centrifugheaz 2 minute la 14.000 rpm;
- fraciunea din tubul de colectare este transferat ntr-un tub nou de 1,5 ml, fr a
agita peletul depus;
- se adaug 1,5 volume de tampon AP3/E peste lizat i se amestec prin pipetare;
- se transfer 650 l din amestecul obinut anterior (inclusiv precipitat, dac acesta
s-a format), ntr-o coloana DNeasy (transparent) plasat intr-un tub de colectare;
- se centrifugheaz timp de 1 minut la 8.000 rpm i se elimin fraciunea din tubul
de colectare;
- se repet pasul anterior, cu proba rmas; se elimin tubul de colectare i
coninutul acestuia;
- coloana DNeasy este plasat ntr-un tub de colectare nou;
- se adaug 500 l tampon AW i se centrifugheaz timp de 1 minut la 8.000 rpm;
- se golete tubul de colectare, care se reutilizeaz n etapa urmtoare;
- se adaug 500 l tampon AW i se centrifugheaz timp de 2 minute la 14.000 rpm;
membrana trebuie s fie uscat; se elimin tubul de colectare i coninutul
acestuia;
- coloana DNeasy este transferat ntr-un tub nou de 1,5 ml;
- se adaug 100 l tampon AE direct pe membran i se incubeaz la temperatura
camerei timp de 5 minute;
- se centrifugheaz 1 minut la 8.000 rpm;
- se repet etapa de eluare.


Testarea OMG

301
3. Extracia ADN-ului cu kitul QIAamp DNA Stool (Qiagen)
3. DNA extraction with the QIAamp DNA Stool Kit (Qiagen)

Echipamente necesare:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- suport pentru cntrire;
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200, 1000 i 5000 l
(Eppendorf) i vrfuri cu barier;
- incubator Inkubator 1000 (Heidoplph);
- agitator Titramax 1000 (Heidolph);
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- coloane de purificare QIAamp (QIAamp Mini Spin Columns), incluse n kitul
QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen);
- tuburi de colectare, incluse n kitul QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen).

Reactivi:
- etanol (C
2
H
5
OH).

Soluii:
- tablete InhibitEX, incluse n kitul de extracie;
- tampon ASL (Buffer ASL), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- tampon AL (Buffer AL), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- tampon AW1 (Buffer AW), soluie concentrat inclus n kitul de extracie; pentru
obinerea soluiei de lucru se dilueaz cu etanol conform manualului de utilizare;
Testarea OMG

302
- tampon AW2 (Buffer AW), soluie concentrat inclus n kitul de extracie; pentru
obinerea soluiei de lucru se dilueaz cu etanol conform manualului de utilizare;
- tampon AE (Buffer AE), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- proteinaz K, soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie.

Protocol de lucru:
- se cntrete proba test, reprezentat de 100 mg material uscat i mrunit sub
forma unei pudre fine, i se introduce ntr-un tub de 1,5 ml;
- se adaug 1.400 l tampon ASL i se omogenizeaz prin vortexare;
- se incubeaz tip de 5 minute la 70 C;
- se omogenizeaz prin vortexare;
- se centrifugheaz 1 minut la 14.000 rpm;
- se pipeteaz 1,2 ml din faza superioar ntr-un tub nou;
- se adaug 1/2 dintr-o tablet InhibitEX; se agit imediat pn la suspendarea
complet a tabletei;
- se incubeaz 1 minut la temperatura camerei pentru ca inhibitorii s fie adsorbii
de matricea InhibitEX;
- se centrifugheaz 3 minute la 14.000 rpm;
- se transfer supernatantul ntr-un tub nou de 1,5 ml;
- se centrifugheaz 3 minute la 14.000 rpm;
- se pipeteaz 15 l soluie Proteinaz K ntr-un tub nou de 1,5 ml;
- se transfer 200 l din supernatantul obinut dup centrifugare;
- se adaug 200 l tampon AL;
- amestecul se omogenizeaz i se incubeaz 10 minute la 70 C;
- se adaug 200 l etanol absolut i se omogenizeaz;
- se transfer tot lizatul ntr-o coloana QIAamp plasat intr-un tub de colectare;
- se centrifugheaz timp de 1 minut la 14.000 rpm i se elimin tubul de colectare;
- coloana de purificare este plasat ntr-un tub de colectare nou;
- se adaug 500 l tampon AW1 i se centrifugheaz timp de 1 minut la 14.000
rpm;
Testarea OMG

303
- coloana de purificare este plasat ntr-un tub de colectare nou;
- se adaug 500 l tampon AW2 i se centrifugheaz timp de 3 minute la 14.000
rpm; membrana trebuie s fie uscat; se elimin tubul de colectare i coninutul
acestuia;
- coloana QIAamp este transferat ntr-un tub nou de 1,5 ml;
- se adaug 200 l tampon AE direct pe membran i se incubeaz la temperatura
camerei timp de 1 minut;
- se centrifugheaz 1 minut la 14.000 rpm;

4. Extracia ADN-ului cu kitul High Pure GMO Sample Preparation (Roche)
4. DNA extraction with the High Pure GMO Sample Preparation Kit (Roche)

Echipamente necesare:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- suport pentru cntrire;
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200, 1000 i 5000 l
(Eppendorf) i vrfuri cu barier;
- baie WNB 10 (Memmert GmbH);
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- coloane de purificare High Pure (High Pure Filter Tubes), incluse n kitul High
Pure GMO Sample Preparation (Roche);
- tuburi de colectare, incluse n kitul High Pure GMO Sample Preparation (Roche).

Reactivi:
- ap bidistilat liber de nucleaze;
Testarea OMG

304
- etanol (C
2
H
5
OH);
- isopropanol (CH
3
CH(OH)CH
3
);
- proteinaz K, liofilizat, inclus n kitul de extracie.

Soluii:
- tampon de extracie (Extraction Buffer), soluie gata de lucru inclus n kitul de
extracie;
- tampon de legare (Binding Buffer), soluie gata de lucru inclus n kitul de
extracie;
- tampon de splare (Wash Buffer), soluie concentrat inclus n kitul de extracie;
pentru obinerea soluiei de lucru se dilueaz cu etanol conform manualului de
utilizare;
- tampon AW2 (Buffer AW), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- tampon AE (Buffer AE), soluie gata de lucru inclus n kitul de extracie;
- proteinaz K, soluie de lucru obinut prin resuspendare n ap bidistilat.

Protocol de lucru:
- se cntrete proba test, reprezentat de 200 mg material uscat i mrunit sub
forma unei pudre fine, i se introduce ntr-un tub de 1,5 ml;
- se adaug 1000 l tampon de extracie i se omogenizeaz prin vortexare;
- se incubeaz tip de 30 minute la 80 C; se amestec de 2-3 ori prin inversare;
- se centrifugheaz 10 minute la 12.000 rpm;
- se transfer faza superioar ntr-un tub nou;
- se adaug 600 l tampon de legare; se amestec uor prin pipetare;
- se adaug 80 l soluie Proteinaz K; se amestec uor prin pipetare;
- se incubeaz 10 minute la 72 C;
- se adaug 200 l izopropanol i se omogenizeaz;
- se transfer 650 l amestec ntr-o coloana de purificare High Pure plasat ntr-un
tub de colectare;
Testarea OMG

305
- se centrifugheaz timp de 1 minut la 8.000 rpm i se elimin coninutul tubului de
colectare;
- se transfer amestecul rmas n coloana de purificare High Pure;
- se centrifugheaz timp de 1 minut la 8.000 rpm i se elimin tubul de colectare;
- se adaug 450 l tampon de splare i se centrifugheaz 1 minut la 8.000 rpm;
- se elimin coninutul tubului de colectare i se centrifugheaz 10 minute la 14.000
rpm pentru uscarea membranei;
- coloana de purificare este plasat ntr-un tub de colectare nou;
- se adaug 50 l tampon de eluie prenclzit la 70 C i se incubeaz la
temperatura camerei timp de 5 minut;
- se centrifugheaz 1 minut la 8.000 rpm.

5. Extracia ADN-ului pe platforma MagNA Pure LC (Roche)
5. DNA extraction on the MagNA Pure LC platform (Roche)

n continuare este descris protocolul propus de Sakai et al. (2002), care utilizeaz
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Pentru mai multe detalii vezi Roche (2009b),
Schulze (2008), Roche (2005), Hahnen et al. (2002) i Sakai et al. (2008).

Echipamente necesare:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule i tvie pentru cntrire;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- suport pentru cntrire;
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 200, 1000 i 5000 l (Eppendorf) i
vrfuri cu barier;
- incubator Inkubator 1000 (Heidoplph);
- agitator Titramax 1000 (Heidolph);
Testarea OMG

306
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- apartul MagNA Pure LC (Roche) conectat la PC-ul pe care este instalat software-
ul de control;
- consumabile specifice pentru MagNA Pure LC (ex. cuve de diferite mrimi pentru
ncrcarea reactivilor, cartu pentru ncrcarea/eluarea probelor, cartue de
procesare sau vrfuri pentru pipetare).

Reactivi:
- proteinaz K liofilizat, inclus n kitul de extracie;
- dodecil sulfat de sodiu (C
12
H
25
SO
4
Na);
- tiocianat de guanidin (C
2
H
6
N
4
S);
- cloroform (CHCl
3
);
- tampon CTAB de extracie, c(CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 M, c(Tris) = 0,1 M,
c(Na
2
EDTA) = 0,02 M; se aduce la pH 0,8 cu HCl sau NaOH.

Soluii de lucru:
- tampon SDS de extracie, c(Tris) = 10 mM, Tris, c(NaCl) = 100 mM NaCl,
c(EDTA) = 2 mM, c(SDS) = 1% (w/v);
- soluie de tiocianat de guanidin, c(GTC) = 5M;
- soluie de proteinaz K, soluie de lucru obinut prin resuspendare n tampon de
eluie;
- tampon de splare I (Wash Buffer I), soluie gata de lucru inclus n kit;
- tampon de splare II (Wash Buffer II), soluie gata de lucru inclus n kit;
- tampon de liz/legare (Lysis/Binding Buffer), soluie gata de lucru inclus n kit;
- suspensie de particule de sticl magnetice (Magnetic Glass Particles Suspension),
suspensie gata de lucru inclus n kit;
- tampon de eluie (Elution Buffer), soluie gata de lucru inclus n kit.


Testarea OMG

307
Etapele pregtirii tamponului SDS de extracie:
- se msoar un volum de 100 ml de ap deionizat i se introduc n paharul
Berzelius;
- se incubeaz la 50 C, sub agitare continu;
- se cntresc 0,242 g Tris, 0,168 g NaCl 2, 0,117 g EDTA, 2 g SDS i se introduc
n paharul cu 100 ml de ap;
- se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de ~180 ml;
- se aduce pH-ul la valoarea 8,0 cu soluia de NaOH;
- se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de 200 ml; apoi soluia se trece
ntr-un recipient autoclavabil cu dop;
- se autoclaveaz;
- se noteaz pe recipient data preparrii i se pstreaz la temperatura camerei.

Pregtirea soluiei de tiocianat de guanidin:
- se msoar un volum de 50 ml de ap deionizat i se introduc n paharul
Berzelius;
- se incubeaz la 50 C, sub agitare continu;
- se cntresc 59,08 g GTC i se introduc n paharul cu 50 ml de ap;
- se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de ~80 ml;
- se aduce pH-ul la valoarea 8,0 cu soluia de NaOH;
- se completeaz cu ap deionizat pn la un volum de 500 ml; apoi soluia se trece
ntr-un recipient autoclavabil cu dop;
- se autoclaveaz;
- se noteaz pe recipient data preparrii i se pstreaz la temperatura camerei.

Protocol:
- se cntrete proba test (50 mg) ntr-un tub de microcentrifug de 1,5 ml i se
adaug 800 l tampon SDS de extracie i 100 l soluie GTC 5M;
- se omogenizeaz amestecul i se incubeaz la 60 C timp de 10 minute;
- se adaug 1 ml de cloroform i agit foarte bine;
Testarea OMG

308
- se centrifugheaz la 12.000 rpm timp de 5 minute;
- un volum de 200 l din supernatant este transferat n cartuul pentru probe;
- odat cu pregtirea probei se seteaz extractorul;
- se pornete PC-ul i extractorul MagNA Pure LC; detalii referitoare la modul de
utilizare a aparatului i software-ului de comand sunt disponibile n manualul
utilizatorului;
- se deschide software-ul de comand; setarea reaciei presupune n primul rnd
introducerea datelor referitoare la probe i la protocolul de extracie;
- software-ul calculeaz apoi automat materialele consumabile i volumele
reactivilor care trebuie ncrcate pentru extracie;
- dup ncrcarea probelor, a consumabilelor i a reactivilor, se iniiaz procedura
de extracie;
- dup terminarea extraciei probele se pstreaz n cartuul n care au fost eluate,
sau pot fi transferate n tuburi de microcentrifug.

6. Extracia ADN-ului pe platforma Maxwell 16 (Promega)
6. DNA extraction on the Maxwell 16 platform (Promega)

Echipamente necesare:
- mnui din latex fr pudr;
- spatule;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- suport pentru cntrire;
- tuburi de microcentrifug de 1,5 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 20, 200 i 1000 l (Eppendorf) i vrfuri
cu barier;
- agitator Titramax 1000 (Heidolph);
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- aparatul Maxwell 16 (Promega);
Testarea OMG

309
- cartue de extracie Maxwell 16 Tissue DNA (Maxwell 16 Tissue DNA
Cartridges), incluse n kitul Maxwell 16 Tissue DNA Purification (Promega),
conin soluiile pentru extracie;
- pistoane de purificare (Purification Plungers), incluse n kitul Maxwell 16 Tissue
DNA Purification (Promega);
- tuburi de eluie (Elution Tubes), incluse n kitul Maxwell 16 Tissue DNA
Purification (Promega);
- suport pentru cartuele de extracie (Promega);
- suport magnetic pentru tuburile de eluie (Promega).

Soluii:
- CelluACE XG (Promega), amestec enzimatic pentru digestia esuturilor vegetale;
- tampon XG Buffer (Promega);
- soluie 10% Triton X-100;
- tampon de liz (Lysis Buffer), soluie cu particule magetice (MagneSil PMPs) i
tampon de splare (Wash Buffer); soluii gata de lucru introduse n cartuele de
purificare;
- tampon de eluie (Elution Buffer), soluie gata de lucru inclus n kitul de
extracie.

Protocol de lucru:
- o smn mrunit se introduce ntr-un tub de 1,5 ml;
- se adaug 100 l tampon XG, 10 l 10% Triton X-100 i 10 l amestec enzimatic;
se omogenizeaz prin vortexare;
- se incubeaz tip de 120 minute la 50 C; se amestec de 2-3 ori prin inversare;
- cartuele sunt aezate n suportul special; se ndeprteaz folia din partea
superioar a cartuelor;
- se transfer amestecul n primul godeu ( cel pe care se afl eticheta) al cartuului
de extracie, iar n ultimul godeu se introduce un piston;
Testarea OMG

310
- se pornete extractorul i se pargurg etapele de selectare a programului de extracie
pentru ADN;
- cartuele cu probe i tuburile de eluie sunt transferate pe platforma de extracie; se
pipeteaz 300 l tampon de eluie n tuburi;
- se iniiaz protocolul de extracie;
- dup terminarea protocolului de extracie, cartuele sunt eliminate iar tuburile de
eluie, care conin extractul, sunt transferate pe suportul magnetic;
- extractul este pipetat ntr-un tub de 1,5 ml, fr a transfera i eventualele particule
magnetice prezente n tubul de eluie.
Testarea OMG

311
Anexa VI. Separarea n gel de agaroz i marcarea cu EtBr
Annex VI. Agarose gel electrophoresis and EtBr staining

Echipamentele utilizate pentru separarea produilor PCR sunt enumerate n continuare:
- mnui din latex fr pudr;
- tvi de cntrire;
- spatul;
- balan analitic Precisa XT 220A (Precisa Instruments);
- cilindru din sticl gradat pentru pentru msurarea volumelor de ap i de soluii
tampon;
- flacon de sticl pentru pregtirea gelului de agaroz;
- cuptor cu microunde (Sharp);
- plac pentru turnarea gelului SUPER MAXIGEL (Apelex);
- suport pentru turnarea gelului Fisherbrand (Fisher Scientific);
- abloane pentru aplicarea probelor Fisherbrand (Fisher Scientific);
- cuv de electroforez cu Fisherbrand (Fisher Scientific);
- sursa de curent electric i conductori EV261 (Consort);
- suporturi pentru tuburile de reacie;
- pipet micrometric Eppendorf Research 10 i 20 l (Eppendorf) i vrfuri
corespunztoare.

Materialele necesare pentru electroforez:
- ap bidistilat;
- agaroz (Promega);
- tampon de electroforez TAE 40X, c(Tris-Acetat) = 1,6 M, c(EDTA) = 40 mM
(Promega);
- marker 100bp DNA Step Ladder, 1 g/l (Promega) amestecat n proporie de 5:1
cu tampon de ncrcare a probei Blue/Orange 6X Loading Dye (Promega).


Testarea OMG

312
Dotare necesar pentru marcarea cu EtBr:
- cuv de marcare;
- agitator Unitwist 3-D (UniEquip);
- pipet micrometric Eppendorf Research 20 l (Eppendorf) i vrfuri
corespunztoare;
- suport transparent pentru introducerea gelului n apartul de preluare a imaginii;
- sistem pentru vizualizarea rezultatului electroforezei cu trans-iluminator i
dispozitiv de nregistrare BioSpectrum AC Imaging System (UVP);
- software pentru achiziia i analiza imaginilor VisionWorksLS (UVP).

Reactivi pentru marcare:
- tampon de electroforez TAE 40X, c(Tris-Acetat) = 1,6 M, c(EDTA) = 40 mM
(Promega);
- soluie de EtBr (C
21
H
20
N
3
Br), c(EtBr) = 10 mg/ml (Promega).

Etape de lucru:
- se pregtete un volum corespunztor de soluie tampon TAE 1X, prin diluarea
soluie stoc 40X cu ap bidistilat;
- se cntrete cu balana cantitatea de agaroz corespunztoare concentraiei finale
i se introduce n flacon;
- se msoar cu cilindrul gradat cantitatea de tampon de electroforez
corespunztoare volumului final al soluiei de agaroz i se introduce n flaconul
cu agaroz;
- se fierbe soluia n cuptorul cu microunde pn la dizolvarea complet a agarozei;
- se completeaz volumul pierdut prin evaporare cu o cantitate echivalent de ap,
se amestec prin agitare;
- se rcete soluia la circa 60 C, timp n care se pregtesc placa i suportul pentru
turnarea gelului i abloanele pentru applicarea probelor;
- se toarn soluia de agaroz pe placa de gel i se las gelul s se solidifice la
temperatura camerei;
Testarea OMG

313
- placa de turnare pe care se afl gelul este transferat n cuva de electroforez cu
godeurile nspre anodul negativ; cuva este umplut cu tampon TAE astfel nct
aceast s acopere gelul cu aproximativ 2 mm, apoi se ndeprteaz abloanele
pentru ncrcarea probelor;
- 10 l din fiecare prob sunt ncrcai cu ajutorul micropipetei direct n godeuri
deoarece tamponul PCR conine soluie colorat de ncrcare a probei;
- 2 l din amestecul marker ADN/tampon de ncrcare (6:1) sunt depui cu
micropipeta n godeurile marginale ale gelului;
- se aeaz capacul peste cuva de electroforez, se conecteaz conductorii ntre cuv
i sursa de curent i se pornete sursa;
- se apas butonul SET, se regleaz intensitatea la 100 V i apoi se apas butonul
RUN/STOP;
- dup terminarea migrrii gelul este introdus n cuva de marcare care conine
tampon de electroforez (i.e. TAE) i 0,01 mg/ml EtBr; trebuie acordat o
deosebit atenie manipulrii materialelor/obiectelor care vin n contact cu EtBr
precum i deeurilor rezultate;
- gelul este incubat la temperatura camerei, dub agitare uoar;
- dup marcare, ADN-ul este vizualizat n prezena luminii UV.

Testarea OMG

314
Anexa VII. Amplificarea real-time PCR utiliznd kitul LightCycler 480 Probes
Master (Roche)
Annex VII. Real-time PCR amplification using the LightCycler 480 Probes Master
(Roche)

Echipamentele necesare sunt enumerate n continuare:
- mnui din latex fr pudr;
- recipient pentru ghea;
- plac de reacie cu 96 godeuri;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- suport metalic pentru tuburi de reacie (Corbett Research);
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200 i 1000 l (Eppendorf)
i vrfuri protejate mpotriva aerosolilor;
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- LightCycler 480 (Roche);
- staie de lucru (PC) pe care este instalat software-ul LightCycler 480 Software v.
1.2 (Roche).

Reactivi utilizai:
- ap liber de nucleaze, inclus n kitul LightCycler 480 Probes Master (Roche)
- master mix universal pentru sistemul TaqMan; acesta este inclus n kitul
LightCycler 480 Probes Master (Roche) i conine toate elementele necesare
reaciei, exceptnd primerii i sondele;
- sonde TaqMan pentru cele dou secvene de interes (vezi Tabelul 7, subcapitolul
3.5.2.4.2, respectiv Tabelul 22, subcapitolul 3.7.3); sondele sunt marcate cu
florocromii FAM la captul 5, respectiv TAMRA la captul 3; trebuie evitat
expunerea de durat la lumin;
- soluia de calibrare (i.e. PC SOYA inclus n kitul Biogenics RoundUp Ready
Soya QT);
Testarea OMG

315
- extracte ADN din probele necunoscute.

Setarea reaciei (se realizeaz dup setarea instrumentului):
- pentru realizarea amestecului de reacie se pregatesc dou tuburi de 0,5 ml, unul
pentru sistemul de referin iar cellalt pentru sistemul transgenic;
- se pegtete o placa de reacie cu 96 de godeuri;
- probele de calibrare (standard) sunt pregtite sub form de diluii seriale ale
standardelor incluse n kit, conform Tabelului 16 (subcapitolul 3.7.2);
- pentru realizarea celor dou master mixuri reactivii sunt adugai prin pipetare
conform Tabelului 8 (subcapitolul 3.5.2.4.2) sau Tabelului 21 (subcapitolul 3.7.3)
i innd cont de numrul total de probe;
- dup constituirea master mix-ului tubul este vortexat i centrifugat scurt;
- se repartizeaz volumul corespunztor de master mix n godeurile corespunztoare
probelor incluse n analiz;
- dup repartizarea master mix-ului se adaug soluia de ADN n tubul
corespunztor fiecrei probe; n cazul probelor NTC, soluia de ADN este
nlocuit cu ap;
- placa de reacie este transferat n aparatul LightCycler 480.

Setarea aparatului LightCycler 480 i preluarea datelor se face parcurgnd urmtoarele
etape (pentru mai multe detalii vezi Roche, 2006a i 2006b):
- n meniul principal se selecteaz opiunea New Experiment;
- apoi, n fereastra Experiment se editeaz programul de amplificare, n fereastra
Subset Editor se indic godeurile urilizate n cadrul analizei, repartizate pe cele
dou sisteme (transgenic i de referin), iar n fereastra Sample Editor se
introduc datele aferente fiecrei probe;
- analiza poate fi iniiat dup ncrcarea plcii de analiz i salvarea
experimentului;
- dup terminarea experimentului, analiza este efectuat n fereastra Analysis
algoritmul i probele;
Testarea OMG

316
- software-ul calculeaz automat parametri afereni reaciei i probelor incluse n
experiment ;
- se evalueaz corectitudinea datelor obinute utiliznd parametri menionai
anterior;
- numrele de copii aferente celor dou secvene de interes sunt utilizate la
determinarea procentului de material transgenic (vezi metoda curbelor standard,
subcapitolul 2.9.1.6).

Testarea OMG

317
Anexa VIII. Setarea reaciei PCR
Annex VIII. PCR reaction set up

Echipamente necesare pentru realizarea reaciei PCR:
- hot cu flux laminar de aer Gemini (Foster Wheeler-Steril);
- mnui din latex fr pudr;
- suport pentru pstrarea tuburilor la temperatur de 4 C;
- tuburi de reacie de 0,2 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- suporturi pentru tuburile de reacie;
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200 i 1000 l (Eppendorf)
i vrfuri cu barier;
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- termocycler Palm-Cycler (Corbett Research).

Reactivi PCR:
- ap liber de nucleaze (Promega);
- tampon PCR 5X Green GoTaq Reaction Buffer; conine MgCl
2
, c(MgCl
2
) =

15
mM (Promega);
- soluie MgCl
2
, c(MgCl
2
) = 25 mM (Promega);
- soluie dNTP Mix, c(dNTP) = 10 mM (fiecare) (Promega);
- primer forward, c = 10 M;
- primer reverse, c = 10 M;
- enzim GoTaq DNA Polymerase, 5 U/l (Promega).

Etape de lucru:
- pentru realizarea master mix-ului se pregatete un tub de 0,5 ml; se pegtesc de
asemenea tuburi de reacie de 0,2 ml (cu dom) pentru fiecare prob; pe lng
Testarea OMG

318
probele necunoscute care fac obiectul analizei este necesar includerea unor probe
de control;
- pentru constituirea master mix-ului reactivii sunt adugai ntr-un tub de reacie
conform Tabelului 12 (subcapitolul 3.6.1) i innd cont de numrul total de probe;
n vederea compensrii erorilor de pipetare la constituirea master mix-ului, se
adaug un surplus de aproximativ 10% din fiecare reactiv;
- dup constituirea master mix-ului tubul este vortexat i centrifugat scurt;
- cu ajutorul pipetei micrometrice se repartizeaz cte 23 l n tuburile de reacie de
0,2 ml corespunztoare probelor analizate i probelor de control;
- se adaug 2 l din soluia de ADN n tubul corespunztor fiecrei probe; n cazul
probelor NTC, soluia de ADN este nlocuit cu ap steril;
- tuburile de reacie sunt transferate pe blocul thermocycler-ului;
- se deschide programul PalmCycler i din meniul File al aparatului PalmCycler
se selecteaz opiunea Open; din fereastra deschis se alege programul PCR.
Testarea OMG

319
Anexa IX. Amplificarea real-time PCR utiliznd kiturile dedicate platformei Rotor-
Gene 3000 (Corbett Research)
Annex IX. Real-time PCR amplification using the kits designed for the Rotor-Gene
3000 platform (Corbett Research)

n continuare este descris protocolul pentru cuantificarea ADN-ul specific
evenimentului de transformare GTS 40-3-2 utiliznd kitul Biogenics RoundUp Ready
Soya QT (Biotools).

Echipamentele necesare sunt enumerate n continuare:
- mnui din latex fr pudr;
- recipient pentru ghea;
- tuburi de reacie de 0,2 ml;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- suport metalic pentru tuburi de reacie (Corbett Research);
- pipete micrometrice Eppendorf Research 10, 20, 100, 200 i 1000 l (Eppendorf)
i vrfuri protejate mpotriva aerosolior;
- vortex MS2 Minishaker (IKA Works);
- microcentrifug Sigma 1-15 (Sigma);
- Rotor-Gene 3000 (Corbett Research);
- staie de lucru (PC) pe care este instalat software-ul Rotor-Gene 6.0.34 (Corbett
Research).

Reactivi utilizai:
- ap liber de nucleaze;
- master mix-uri PCR pentru secvena de referin (REFERENCE MASTER MIX),
respectiv secvena transgenic (TRANSGENE MASTER MIX); fiecare master
mix conine tampon de reacie, dNTPs i primeri specifici; soluiile sunt incluse n
kitul Biogenics RoundUp Ready Soya QT i sunt gata de lucru;
- soluie MgCl
2
, c(MgCl
2
) = 50 mM; soluia este inclus n kitul Biogenics
RoundUpReady Soya QT i este gata de lucru;
Testarea OMG

320
- ADN polimeraz inclus n kitul Biogenics RoundUp Ready Soya QT i gata de
lucru;
- sonde TaqMan pentru secvena de referin (REFERENCE PROBE), respectiv
secvena transgenic (TRANSGENE PROBE); sondele sunt marcate cu
florocromii FAM la captul 5, respectiv TAMRA la captul 3; trebuie evitat
expunerea de durat la lumin; soluiile sunt incluse n kitul Biogenics RoundUp
Ready Soya QT i sunt gata de lucru;
- soluia de calibrare PC SOYA ce conine produi de amplificare ai genei EPSPS
prezent n soia Roundup Ready i ai genei lectinei de la soia; concentraiile
produilor PCR sunt de 5x10
4
copii/l, respectiv 10
6
copii/l;
- extracte ADN din probele necunoscute.

Setarea reaciei (se realizeaz dup setarea aparatului):
- pentru realizarea amestecului de reacie se pregatesc dou tuburi de 0,5 ml, unul
pentru sistemul de referin iar cellalt pentru sistemul transgenic;
- se pegtesc cte dou tuburi de reacie de 0,2 ml (fr dom) pentru fiecare prob
(necunoscute, standard, de control);
- probele de calibrare (standard) sunt pregtite sub form de diluii seriale ale
standardelor incluse n kit, conform Tabelului 16 (subcapitolul 3.7.2);
- pentru realizarea celor dou master mixuri reactivii sunt adugai prin pipetare
conform Tabelului 17 (subcapitolul 3.7.2) i innd cont de numrul total de probe;
- dup constituirea master mix-ului tubul este vortexat i centrifugat scurt;
- se repartizeaz volumul corespunztor de master mix n tuburile de reacie de 0,2
ml corespunztoare probelor incluse n analiz;
- dup repartizarea master mix-ului se adaug soluia de ADN n tubul
corespunztor fiecrei probe; n cazul probelor NTC, soluia de ADN este
nlocuit cu ap;
- tuburile de reacie sunt transferate pe rotorul platformei Rotor-Gene 3000.


Testarea OMG

321
Setarea aparatului Rotor-Gene 3000 i preluarea datelor se face parcurgnd urmtoarele
etape (pentru mai multe detalii vezi Biotools, 2008):
- se selecteaz opiunea Quick Start;
- se selecteaz opiunea Dual-Labeled Probe;
- se selecteaz opiunea New;
- se selecteaz tipul de rotor utilizat (cu 36 sau 72 tuburi n funcie de numrul total
de probe analizate) n ecranul Rotor Selection;
- n ecranul Sample Setup se selecteaz opiunea Edit Grid, iar n fereastra
aprut sunt introduse datele aferente probelor; dup completarea operaiunii se
selecteaz OK;
- n ecranul Confirm Profile sunt introdui parametrii programului de amplificare;
- dup introducerea parametrilor de amplificare i nregistrare a semnalului
fluorescent se selecteaz opiunea Start Run; analiza real-time PCR va ncepe
dup confirmarea destinaiei de salvare a datelor analizei;
- analiza este salvat n memoria PC-ului ntr-un fiier cu extensia .rex, specific
software-ului Rotor-Gene 6.0.34;
- pentru fiecare dintre cele dou sisteme (transgenic, respectiv de referin) se alege
nivelul optim al pragului limit, iar software-ul va calcula automat parametri de
interes pentru probele incluse n analiz i pentru reacie;
- se evalueaz corectitudinea datelor obinute utiliznd parametri menionai
anterior;
- numerele de copii aferente celor dou secvene de interes sunt utilizate la
determinarea procentului de material transgenic (vezi metoda curbelor standard,
subcapitolul 2.9.1.6).

Testarea OMG

322
Anexa X. Lista abrevierilor i acronimelor utilizate n cadrul lucrrii
Annex X. List of abbreviations and acronyms used in this paper

1C masa (pg) unui echivalent genomic haploid
5, 3 capetele convenionale ale unei secvene de nucleotide
A adenin
A
260
/A
280
, A
260
/A
230
raport ntre absorbane la dou lungimi de und diferite, utilizate
pentru estimarea puritii extractului de ADN
ADN/DNA acid dezoxiribonucleic/deoxyribonucleic acid
ADNdc ADN dublu-catenar
ADNg ADN genomic
ADNp ADN plasmidial
ARN/RNA acid ribonucleic/ribonucleic acid
B intersecia dreptei de regresie cu axa OY
bar gen de rezisten la antibiotic provenit de la specia bacterian
Streptomyces hygroscopicus
Bt176 eveniment de transformare genetic la porumb
C citozin
CaMV Cauliflower Mosaic Virus/Virusul Mozaicului Conopidei
EPSPS gena 5-enolpiruvishikimat-3-fosfat sintaza provenit de la
Agrobacterium tumefaciens linia CP4
CryIA(b) gen de tip Cry provenit de la de la Bacillus thuringiensis ssp.
kurstaki linia HD-1
CRL-GMFF Community Reference Laboratory for Genetically Modified Food
and Feed/Laboratorul Comunitar de Referin pentru Alimente i
Furaje Modificate Genetic
CTAB cetyltrimethyl ammonium bromide/bromur de
deciltrimetilamoniu
C
T
cycle threshold/valoare zecimal ce exprim numrul de cicluri
PCR la care curba de amplificare generat de modificarea intensitii
semnalului fluorescent intersecteaz pragul limit
Testarea OMG

323
CTP chloroplat transfer peptide/peptid de transfer n cloroplaste
C
V
coefficientul de variaie
C
T
. diferena ntre valoarea C
T
corespunztoare transgenei i valoarea
C
T
corespunztoare genei de referine, ambele determinate n urma
amplificrii
ddH
2
O ap steril dublu distilat
dNTPs deoxynucleosid thriphpsphates/dezoxinucleozid trifosfai
E eficiena de amplificare a unei reacii PCR
EDTA acid etilendiamintetraacetic
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
ENGL European Network of GMO Laboratories/Reeaua European de
Laboratoare OMG
EtBr bromur de etidiu/ethidium bromide
F factorul (exponentul) amplificrii
FAO Food and Agriculture Organization/Organizaia pentru Alimentaie
i Agricultur
G guanin
GTS 40-3-2 eveniment de transformare genetic la soia
IM incertitudinea de msurare
IRMM Institute of Reference Materials and Measurements/Institutul
pentru Materiale de Referin i Msurtori
IQC internal quality control (in-house quality assurance)/controlul
intern al calitii
ISO International Organization for Standardization/Organizaia
Internaional de Standardizare
JRC Centrul Comun de Cercetare (al Comisiei)/Joint Research Centre
k factor de acoperire
LC critical level/nivelul critic
Le1 gena lectinei de la soia
LOD limit of detection/limita de detecie
LOQ limit of quantification/limita de cuantificare
Testarea OMG

324
M panta curbei standard
MAPDR Ministerul Apelor, Pdurilor i Dezvoltrii Rurale (Romnia)
MG/GM modificat genetic/genetically modified
MR/RM material de referin/reference material
MRC/CRM material de referin certificat/certified reference material
nos gena sintezei de nopalin (nopaline synthase)
nptII gen de rezisten la kanamicin
NTC no template control/prob de control fr ADN
OMG/GMO organism modificat genetic/genetically modified organism
P- promotor
P-35S/P-E35S/35S promotorul constitutiv P-35S
PAT phosphinothricin-N-acetyltransferase/fosfinotricin-N-
acetiltransferaza
pb/bp perechi de baze/base pair
PCR polymerase chain reaction/ reacia n lan a polimerazei
PMG/GMC plant de cultur modificat genetic/genetically modified crop
R
2
coeficient de corelaie; exprim procentual msura n care
rezultatele corespund ipotezei statistice
RSD
r
abaterea standard relativ a repetabilitii
RSD
R
abaterea standard relativ a reproductibilitii
RSU relative standard uncertainty/incertitudinea standard relativ
SD standard deviation/abaterea standard
SNP single nucleotide polymorphism/polimorfismului determinat de o
singur nucleotid
T- terminator
T timin
TAE soluie tampon care conine Tris, acid acetic glacial i EDTA
TE soluie tampon care conine Tris i EDTA
T
m
melting temperature/temperatur de denaturare
Tris tris(hidroximethil)aminometan/tris(hydroxymethyl)aminomethane
Testarea OMG

325
trnL secve intronic de ADN specific genomului de la nivelul
cloroplastelor
u, u
i
standard uncertainty/incertitudinea standard
U expanded measurement uncertainty/incertitudinea de msurare
extins
u
0
absolute standard uncertainty/incertitudinea standard absolut

u
c
combined standard uncertainty/incertitudinea standard compus
v/v volume to volume pri de volum la pri de volum
w/v weight to volume pri de mas la pri de volum
w/w weight to weight pri de mas la pri de mas

S-ar putea să vă placă și