Acizi nucleici

Structura acizilor nucleici Structura ADN

Introducere
Acizii nucleici sunt produi de policondensare a nucleotidelor Au rolul de a pstra i mijloci transferul de informaie genetic n lumea vie Dogma central a biologiei moleculare:
replicare reverstranscriere ADN transcriere ARNm traducere Protein

Introducere
Se cunosc 2 clase de acizi nucleici:
Acid dezoxiribonucleic (ADN) Acid ribonucleic (ARN)

ADN conine informaia genetic cu privire la biosinteza proteinelelor (la om 50 000-100 000 proteine); are rolul de a stoca i transmite aceast informaie la generaia urmtoare ARN ndeplinete diverse funcii n procesul de biosintez a proteinelor:
ARNm ARN mesager, transport informaia genetic din nucleu la ribozomi ARNt ARN de transport, transport aminoacizii necesari biosintezei proteice ARNr ARN ribozomal, este component esenial al ribozomilor

Structura acizilor nucleici

Pentoz D-b-riboz (n ARN) sau D-bdezoxiriboz (n ADN) Baze azotate molecule plane, relativ insolubile n ap avnd un maxim de absorbie n UV ntre 252-271 nm.
Purinice (derivai ai purinei): adenina (6-aminopurina), guanina (2-amino-6-hidroxi-purina) Pirimidinice (derivai ai pirimidinei): citozina (2hidroxi-4-aminio-pirimidina), timina (2,4-dihidroxi-5metil pirimidina sau 5-metil uracil; se gsete numai n ADN) i uracilul ( 2,4-dihidroxi-pirimidina; se gsete numai n ARN)

Acid fosforic

1N 2

6 5

4 N 7 8 3N 2 N 1 5 6

N 4 3 Purin
NH2

N9 H

Pirimidin
O

N N

N N H

HN H2N N

N N H

Adenin
NH2 N O N H HN O N H O

Guanin
O HN O N H CH3

Citozin

Uracil

Timin

Baze azotate
Prezint tautomerie:
Lactam-lactim; structurile lactam sunt mai stabile Amino-imino (cele care nu conin grupri hidroxil); structurile amino sunt mai stabile
O C NH

OH
C

forma lactam (mai stabil)

forma lactim

NH2 N C NH

NH C

forma amino (mai stabil)

forma imino

Nucleozide
Rezult prin stabilirea unei legturi Nglicozidice ntre hidroxilul glicozidic de la C 1 al pentozei i atomul de N din poziia 9 a unei baze purinice, sau atomul de N din poziia 1 a unei baze pirimidinice

Ribonucleozide
NH2 N N N N HN H2N N O N N O N N NH2 HN O N O

CH2OH O H H H H OH OH

CH2OH O H H H H OH OH

CH2OH O H H H H OH OH

CH2OH O H H H H OH Uridin OH

Adenozin

Guanozin

Citidin

Dezoxiribonucleozide
NH2 N N N N HN H2N N O N N O N N NH2 HN O N O CH3

CH2OH O H H H H OH H

CH2OH O H H H H OH H

CH2OH O H H H H OH H

CH2OH O H H H H OH H

Deoxiadenozin

Deoxiguanozin

Deoxicitidin

Timidin

Nucleotide
Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor; n structura acizilor nucleici intr nucleozide fosforilate la C 5 al pentozei Se pot aduga 1,2 sau 3 resturi fosfat formnd nucleozid mono, di i trifosfai

Nucleotide
NH2 N N N N

O -O
P OO

O
P OO

O
P O 5' H H O H H 1'

OH X Acid adenilic (adenozin 5'-monofosfat, AMP) or acid deoxiadenilic (deoxiadenozin 5'-monofosfat, dAMP) Adenozin 5'-difosfat, ADP or deoxiadenozin 5'-difosfat, dADP) Adenozin 5'-trifosfat, ATP or deoxiadenozin 5'-trifosfat, dATP)

Nucleotide naturale libere

Pe lng nucelotidele care constituie elemente de construcie a acizilor nucleici, exist o serie de nucleotide care ndeplinesc roluri importante n esuturi:
Compui macroergici ATP, GTP Componeni structurali ai unor coenzime NAD+, NADP+, FAD Mesageri secunzi ai unor hormoni AMPc, GMPc Donori de grupri metil S-adenozil metionina (SAM) Acceptori de fosfat n fosforilarea oxidativ ADP Efectori alosterici ai activitii enzimelor

Nucleotide naturale libere

NH2 N N CH3 N N O CH2 H H OH OH O H H O O P CH2 H O H OH N N NH2 N N

HOOC

CH NH2

CH2

CH2

O H H

S-adenozilmetionina

AMP ciclic (AMPc)

Nucleotide naturale libere

Metilxantinele = derivai metilai ai xantinei, identificai la plante; prezint proprieti O O CH farmacologice
3

HN O N H

N N H

H3C

N N

N
N

CH3
Xantina O

Cafeina
O N HN O N

CH3 N
N

H3C
O

N N

N H

CH3 Teofilina

CH3 Teobromina

Structura primar covalent a acizilor nucleici

Acizii nucleici sunt formai din nucleozide legate fosfat diesteric Gruparea OH de la C 5 a unui nucleozid este legat de gruparea OH de la C 3 a nucelozidului urmtor prin legtur fosfat diesteric Fiecare caten are dou capete:
Captul 5 la care gruparea OH de la C 5 are ataat un rest fosfat Captul 3 la care gruparea OH de la C 3 nu este angajat ntr-o legtur internucleotidic

Prin convenie o caten este scris ntotdeuna n direcia 5 3

Structura primar covalent a acizilor nucleici

n fiecare caten polinucleotidic (cu mai mult de 50 nucleotide), legturile dintre nucleotide au aceeai orientare de-a lungul lanului, catenele avnd o polaritate specific Dou lanuri polinucleotidice sunt antiparalele cnd unul evolueaz n direcia 5 3 iar cellalt n direcia 3 5 Diversitatea polinucleotidelor este dat de bazele azotate legate de scheletul format de moleculele de monozaharid legate ntre ele fosfat disteric

Capt 5'-terminal
N

NH2 N N 5' P N 5' P H H O OH,H O O CH2 H H O O P O H H OH,H O H2N O CH2 H H OH O H H OH,H N HN N N O 3' O N N 5' O P 3' G NH2 3' 5' C 3' A

O O P O H O CH2 H

legtur fosfat diesteric

Capt 3'-terminal

Structura secundar a ADN

Propus de Watson i Crick (1953) pe baza rezultatelor altor cercettori:
Prin analiz cromatografic s-a stabilit c n toate tipurile de ADN numrul de baze purinice este egal cu numrul bazelor pirimidinice (A+G = T+C) Prin difracie cu raze X s-a stabilit c ADN are 2 perioade de identitate, una de 34 iar alta de 3,4

Structura secundar a ADN

Dou catene antiparalele formeaz o dubl elice cu orientare dreapt prin rsucire de la stnga la dreapta n jurul unui ax. Scheletul extern este format din ciclurile pentozelor legate ntre ele fosfat diesteric Resturile fosfat sunt ionizate i ncrcate negativ la pH fiziologic Bazele azotate sunt orientate spre interior i perpendicular pe axul helixului ntre o baz purinic de pe o caten i o baz pirimidinic de pe cealalt caten, numite baze complementare, se formeaz legturi de hidrogen; adenina se leag de timin prin 2 legturi de hidrogen iar guanina se leag de citozin prin 3 legturi de hidrogen

Sant mare H N H Adenin N N N N H Sant mic H H O N N O CH3 H Timin

Sant mare H H Guanin N N N O N N H H Sant mic H N N N O H H Citozin

Structura secundar a ADN

Diametrul moleculei este de 20 Distana dintre 2 baze adiacente este de 3,4 Pasul elicei are 10 perechi de baze i o lungime de 34 Helixul prezint n exterior dou anuri: unul mic, cu limea de 12 i unul mare, cu limea de 22 , prin inetrmediul crora unele proteine i medicamente vin n contact cu bazelel azotate fr s fie necesar desfacerea dublu helixului ntre bazele azotate se stabilesc legturi dipol-dipol, interacii van Der Waals i interacii hidrofobe; acestea produc stivuirea bazelor i determin conformaia helicoidal a catenei

Forma B a ADN

Formele structurale A i Z ale ADN

Structura ADN este dinamic n mediul apos al celulei Pe lng forma B, predominant n celule, pot exista formele A-E i Z. Conformaia A este o elice dreapt mai compact, cu un pas de 28 si avnd 11 perechi de baze Conformaia Z corespunde unei elice stng, cu 12 perechi de baze pe spir i cu un pas al elicei de 57 . Aspectul catenei este de zigzag, datorit conformaiei adoptate de bazele azotate din componen

Denaturarea i renaturarea ADN

Ruperea legturilor de hidrogen i a diferitelor tipuri de interaciuni dintre catenele moleculei de ADN se poate realiza prin creterea temperaturii, la valori extreme de pH (ADN este stabil ntre pH 4-10) sau la modificarea triei ionice a soluiei; acesta duce la separarea celor 2 catene = denaturare Dac denaturarea este determinat de modificri de temperatur procesul se numete topire Prin denaturare se modific unele proprieti fizice ale ADN:
Scade vscozitatea Crete absorbana la 260 nm (absorbana bazelor azotate n catenele libere este cu 40% mai mare dect n ADN = efect hipercrom) Crete densitatea Se modific capacitatea de rotire a luminii polarizate

Denaturarea i renaturarea ADN

1.5 1.4

Densitate optic (260 nm)

100 1.3 1.2 1.1 1.0 30 50 ( C)

o

50 Tm 0 70 90

Denaturarea i renaturarea ADN

Denaturarea se poate urmri prin creterea absorbanei la 260 nm Temperatura de topire, Tm, este temperatura la care jumtate din ADN este denaturat Compoziie ADN n baze azotate influeneaz Tm; un procent mai mare de GC fa de AT din ADN determin o cretere a Tm. Coninutul de perechi de baze GC la om este de 40% iar punctul de topire in jur de 87 C n celule pentru denaturare se folosesc enzime numite helicaze, care utilizeaz ATP

Denaturarea i renaturarea ADN

pH >11,3 determin deprotonarea bazelor azotate, ceea ce le mpiedic s mai formeze legturi de hidrogen Se prefer denaturarea cu soluii de baze pentru a preveni ruperea legturilor fosfat diesterice (se poate ntmpla n cazul temperaturilor mari sau a pH acide) La adugarea unor ageni denaturani (formaida) se produce destabilizarea legturilor de hidrogen dintre baze, putndu-se face denaturarea la temperaturi mai mici

Denaturarea i renaturarea ADN

Renaturarea este procesul prin care se reface dublul helix prin restabilirea valorilor de pH, temperaturii sau tariei ionice la valorile fiziologice Renaturarea este folosit n tehnica hibridizrii moleculare care permite combinarea unei catene de ADN cu o caten de ARN dac exist un grad mare de complementaritate ntre cele dou catene.

Hidroliza acizilor nucleici

ADN este rezistent la hidroliza bazic; ARN este hidrolizat la un amestec de 2 i 3 nucleotide ADN este relativ stabil poate fi pstrat n soluii apoase la pH ~ neutru ADN mono i bicatenar precum i ARN poate fi hidrolizat de enzime numite nucleaze:
Exonucleaze- hidrolizeaz nucleotidele terminale de la capetele 3 sau 5 ale unui lan polinucleotidic (ex. ADN polimerazele I i II)producnd 3 monocleozid fosfai sau 5 mononucleozid fosfai Endonucleaze- hidrolizeaz legturi fosfat diesterice din interiorul catenei polinucleotidice; pot hidroliza i polinucleotide ciclice

Hidroliza acizilor nucleici

Un grup special de endonucleaze produse de microorganisme se numesc endonucleaze de restricie sau restrictaze Au fost izolate peste 100 restictaze i au fost denumite n funcie de specia bacterian de la care au fost izolate (deoarece fiecare bacterie conine mai multe restictaze, se utilizeaz o cifr roman pentru a identifica fiecare enzim) Enzimele recunosc secvene specifice, numite secvene de recunoatere de 4-6 nucleotide i taie ambele catene Scevenele de recunoatere sunt palindroame = secvene cu dubl simetrie rotaional, n care secvena nucleotidic, citit pe ambele catene n direcia 5 3 este identic

Hidroliza acizilor nucleici

Unele endonucleaze de restricie taie ADN bicatenar formnd capete boante, drepte, neadezive (blunt ends), altele formeaz capete monocatenare, coezive (sticky ends)
5' 3' AAGCTT TTCGAA 3' 5' 5' 3' TGGCCA ACCGGT 3' 5' 5' 3' GAGCTC CTCGAG 3' 5'

Hind III 5' 3' A TTCGA AGCTT A 3' 5' 5' 3' TGG ACC

Bal I CCA GGT 3' 5' 5' 3' GAGCT C

Sst I C TCGAG 3' 5'

capete coezive

capete boante

capete coezive

Hidroliza acizilor nucleici

O enzim de restricie are aceeai secven de recunoatere indiferent de sursa ADN (bacterian, din plante sau din animale) O molecul de ADN poate s nu aib nici un situs de recunoatere, unul sau mii de situsuri Capetele ADN pot fi legate de ADN ligaz rezultnd ADN recombinat, utilizat n ingineria genetic, diagnosticul prenatal al unor boli genetice sau la alctuirea hrilor de restricie

Organizarea ADN la procariote i eucariote

Moleculele de ADN dintr-o celul alctuiesc cromozomii celulei Fragmentele cromozomiale care conin informaia genetic cu privire la sinteza unui singur lan polipeptidic au fost denumite gene. Fiecare cromozom conine un set unic de gene Totalitatea genelor cuprinse n cromozomii unei celule constituie genomul acesteia La procariote avem un singur cromozom, circular, care conine setul complet de gene pentru specificarea caracterelor celulei (4,6 x 106 perechi de baze, lungime aprox. 1,6 mm)

Organizarea ADN la procariote i eucariote

n celulele procariote, ADN este distribuit ntr-o mas cromozomial n citoplasma celulei se afl cantiti mici de ADN extracromozomial. Aceste molecule se numesc plasmide i conin o cantitate redus de informaie genetic Plasmidele:
Trec uor prin membrana celulei gazd Conin gene ce le confer bacteriei rezisten la antibiotice Se autoreplic extrem de rapid, independent de ADN cromozomial Pot migra de la o celul cu rezisten la antibiotic la alt celul, cu sensibilitate la antibioticul respectiv, fcnd-o i pe aceasta rezistent

Organizarea ADN la procariote i eucariote

La eucariote ADN se afl n nucleu n perioadele de repaus, materialul se gsete sub form de cromatin = material amorf, dispersat n nucleu, care conine ADN, proteine bazice (histone), proteine nehistonice (hertine) i mici cantiti de ARN n timpul mitozei cromatina se condenseaz i se subdivide n cromozomi = complexe ADNproteine (o singur molecul de ADN)

Organizarea ADN la procariote i eucariote

Genomul uman const n 46 cromozomi grupai n 23 perechi i conine aproximativ 6 x 109 perechi de baze Cea mai mare parte a genomului este necodificatoare avnd rol n reglarea exprimrii genelor n timpul dezvoltrii, diferenierii i adaptrii la condiiile de mediu n mitocondrii se afl molecule de ADN circular, cu mas mic, care difer de ADN nuclear prin structur i proprieti (reprezint 1% din ADN total) ; specific proteine mitocondriale, cum ar fi proteine ale lanului respirator; majoritatea proteinelor mitocondriale sunt ns specificate de ADN nuclear.

Cromozomii eucariotelor
Fiecare cromozom conine o singur molecul de ADN cu o lungime de aprox. 2 m !!! mpachetarea presupune scurtarea de 10 000 ori a lungimii sale Primul stadiu n condensarea ADN, realiznd un grad de compactare egal cu 7, este nucleozomul Nucleozomul este unitatea de baz a cromatinei; fibra de cromatin arat ca un irag de mrgele, mrgelele fiind nucleozomii iar aa poriuni de ADN liber (ADN de legtur cu 8-120 perechi de baze)

Cromozomii eucariotelor
Histonele sunt proteine bazice, cu mas molecular mic, care interacioneaz ionic cu anionii fosfat din catenele de ADN; exist 5 clase de histone:
Histone bogate n lizin H2A, H2B Histone bogate n arginin H3, H4 Histone de legtur H1, cu rol de protejare a ADN de aciunea nucleazelor

Cromozomii eucariotelor
Nucleozomul are forma unui cilindru si cuprinde un octamer histonic constituit din 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 n jurul cruia se nfoar de aprox. 2 ori cu rsucire spre stnga ADN format din 140 perechi de baze Histona H1 se leag de ADN de legtur; ea are rol esenial n etapa urmtoare de compactare cu formarea unei structuri care arat ca un solenoid i care asigur o scurtare de 40 ori a moleculei de ADN Solenoizii se asociaz ntre ei determinnd o condensare suplimetar Proteinele nehistonice din structura cromatinei au rol n destinderea strii condensate a cromatinei, pentru a permite replicarea i transcrierea, au rol n viabilitatea celulei

 Nucleozom

Solenoid