Sunteți pe pagina 1din 10

Experimente pe sistem cardiovascular i respirator de broasc

EXPERIMENTE PE SISTEM CARDIOVASCULAR I RESPIRATOR DE BROASC


Dr. Metz Jlia, Dr. Orbn-Kis Kroly, Dr. Szilgyi Tibor

SCOPUL LUCRRII
La aceast lucrare se dorete investigarea funciilor cardiovasculare i respiratorii la broasc. Analiza funcionrii in situ (in vivo) i in vitro a organelor de broasc reprezint metod experimental folosit pentru nelegerea fiziologiei umane, broasca avnd sisteme funcionale foarte similare cu cele umane. Scopurile definite ale lucrrii sunt: demonstrarea micrii ciliare la nivelul mucoasei respiratorii microcirculaia de la nivelul patului unghial demonstrarea circulaie arteriale i venoase pe limba de broasc nregistrarea activitii mecanice i electrice a inimii de broasc, demonstrarea efectului termic, a substanelor inotrope i cronotrope precum i a variaiei concentraiei ionilor asupra activitii cordului de broasc demonstrarea pragului de excitaie i a perioadelor refractare Animalele de experien sunt manevrate doar de ctre asistent! Nu atingei i nu dai mncare sau de but animalelor de experien!

PRINCIPII TEORETICE
Micarea ciliar. Toate cile respiratorii, de la cavitatea bucal/nazal i pn la bronhiolele terminale, sunt meninute umede de ctre un strat subire de mucus ce tapeteaz ntreaga suprafa. Mucusul capteaz particulele mici din aerul inspirat, mpiedicndu-le s mai ajung n alveole. Mucusul este n continuare rennoit datorit clearance-lui mucociliar. ntreaga suprafa a cilor respiratorii este acoperit de un epiteliu ciliat, aproximativ 200 cili/celul epitelial. Acetia se mic n continuu cu o frecven de 10-20 bti/s, iar direcia de micare a mucusului este spre faringe. Astfel, mucusul din cile respiratorii inferioare se deplaseaz n sus, iar la nivelul cavitii nazale n jos.

Figura nr. 1. Schema microcirculaiei de la nivelul patului unghiei umane. (adaptat dup D. P. Allen et al. Acquisition and analysis of nailfold capillary images)

Lucrri practice de fiziologie

Aceast micare continu face ca stratul de mucus s se deplaseze ncet, cu o vitez de aproximativ 1 cm/min, spre faringe unde mpreun cu particulele capturate este nghiit sau eliminat. Particularitatea anatomiei de broasc este c epiteliul ciliat exist i n 1/3 superioar a esofagului. Microcirculaia. Din punct de vedere structural microcirculaia cuprinde mai multe categorii de vase: arteriole, venule, capilare (Figura nr. 1). Acestea pot fi vizualizate la om la nivelul patului unghial n timp ce la broasc pe limb i membrana interdigital. Vizualizarea microcirculaiei la om permite numrarea arcurilor capilare, msurarea diametrelor vaselor la acest nivel i determinarea vitezei de circulaie prin metoda Doppler. Acest metoda poate fi folosit pentru diagnosticarea unor boli precum boala Raynaud, sclerodermia, etc. Vizualizarea vaselor de la nivelul limbii de broasc permite recunoaterea arteriolelor, n care circulaia sngelui este n direcia ramificaiilor n timp ce n venule direcia circulaiei este dinspre vase mici spre vene mai mari. n arteriole viteza sngelui este mai mare i se observ pulsaii. Vizualizarea vaselor mari permite i recunoaterea circulaiei laminare: se observ fluxul axial de vitez mai mare i fluxul parietal de vitez mult mai mic (Figura nr. 2).

Figura nr. 2. Circulaia laminar la nivelul arteriolelor (sgeile din stnga reprezint viteza straturilor de lichid).

Activitatea electric i mecanic a inimii. Potenialul de aciune reprezint rspunsul electric al celulelor miocardice la aciunea unui stimul a crei intensitate depete valoarea prag.

Figura nr. 3. Fenomenul electric i mecanic (FRA faza refractar absolut, PA potenial de aciune, MCG - mecanocardiogram).

Experimente pe sistem cardiovascular i respirator de broasc

Pe timpul potenialului de aciune miocardul este n perioad refractar, n acest timp fibra miocardic nu mai rspunde la stimuli electrici indiferent de intensitatea acestora. Potenialul de aciune este urmat de contracia celulelor miocardice dup un scurt interval de timp necesar cuplrii electromecanice. Fenomenul mecanic i electric au durat aproximativ egal (Figura nr. 3). Datorit existenei perioadelor refractare fenomenele mecanice nu pot fi sumate i astfel miocardul nu poate fi tetanizat. Succesiunea periodic a fazelor de contracie i relaxare este esenial pentru funcia de pomp (faz de umplere i ejecie). Modularea activitii inimii. 1. Efectul termic: nclzirea sinusului venos crete frecvena contraciilor cardiace, iar nclzirea ventriculilor crete amplitudinea contraciilor acestora. Rcirea sinusului venos i a ventriculilor scade frecvena respectiv amplitudinea contraciilor. Att contracia ct i excitabilitatea sunt dependente de activitatea unor sisteme enzimatice respectiv de modificarea conformaiei unor proteine (canale ionice), influenate de temperatur. 2. Mediatorii chimici: adrenalina produce creterea frecvenei i amplitudinii contraciilor prin aciune asupra receptorilor adrenergici 1. Acetilcolina produce scderea frecvenei i amplitudinii contraciilor cardiace prin intermediul receptorilor colinergici muscarinici (M2). Prezena acestor receptori la nivelul fibrelor miocardice face ca aplicarea mediatorilor sistemului nervos vegetativ pe inima denervat s reproduc efectele stimulrii simpatice, respectiv parasimpatice. 3. Concentraia ionilor din spaiul extracelular: creterea concentraiei Ca2+ extracelular are efecte "sistolizante", ducnd la creterea forei de contracie, n timp ce relaxarea diastolic devine din ce n ce mai redus, pn la oprirea inimii n sistol prin acumularea calciului n spaiul intracelular (fenomenul de "calcium rigor"). Creterea concentraiei K+ extracelular produce prin blocarea neselectiv a porurilor externe a canalelor de Ca2+ i Na+ scderea amplitudinii contraciilor, pn cnd inima se oprete n diastol (Figura nr. 4).

Figura nr. 4. Efectul concentraiei ionilor asupra activitii mecanice a inimii de broasc.

4. Efectul ndeprtrii pericardului: deschiderea pericardului permite o micare/expansiune mai a accentuat cavitilor inimii ceea ce duce la creterea sensibilitii mecanismului Frank-Starling i o cretere a volumului btaie. ndeprtarea pericardului duce la absena efectului vagal i prin acesta la creterea frecvenei cardiace.

METODA DE NREGISTRARE SIMULTAN A FENOMENELOR ELECTRICE I MECANICE


Pentru nregistrarea simultan a activitii electrice i mecanice a inimii de broasc (Figura nr. 5) se folosesc trei electrozi metalici. Primul este inserat la baza inimii, al doilea (un crlig

10

Lucrri practice de fiziologie

metalic) este prins la nivelul vrfului inimii, iar ultimul reprezint electrodul de pmntare. nregistrarea activitii electrice se realizeaz prin metod bipolar i amplificare difereniat. Semnalul electric preluat este amplificat i apoi digitalizat.

Figura nr. 5. Schema aparaturii necesare pentru nregistrare (explicaii n text).

nregistrarea activitii mecanice se efectueaz cu ajutorul unui traductor mecano-electric (Figura nr. 6). Pe scurt aceasta funcioneaz pe principiul dinamometrului, alungirea resortului elastic este proporional cu fora contraciei. Miezul de ferit al bobinei este conectat la vrful inimii prin intermediul crligului metalic, astfel contraciile cordului modific poziia miezului i prin aceasta proporional inductana bobinei.

Figura nr. 6. Schema traductorului mecanoelectric (explicaii n text).

Introducnd un crlig metalic prin vrful inimii aceasta strpunge att spaiul extracelular (EC) ct i cel intracelular (Figura nr. 7). Astfel se nregistreaz un potenial de leziune. Potenialul nregistrat seamn calitativ cu ceea ce se obine prin metoda intracelular cu microelectrozi dar exist un curent extracelular (shunt) care distorsioneaz semnalul util, deci va trebui micorat.

Figura nr. 7. nregistrarea potenialului de leziune (explicaii n text).

Experimente pe sistem cardiovascular i respirator de broasc

11

Aceasta se efectueaz prin creterea rezistenei spaiului extracelular; alungirea fibrei miocardice este realizat prin punerea sub tensiune a firului (vezi i ecuaiile):

V R L R S I
I curent, V diferena de potenial, R rezistena electric, L lungimea, S suprafaa de seciune, rezistena specific a esutului

ASPECTE DE ANATOMIE I FIZIOLOGIE DE BROASC


Broasca este folosit pentru experimente ntocmai pentru c are sisteme funcionale similare cu cele umane dar cu o sensibilitate a esuturilor mai sczut fa de hipoxie i ischemie. Principalele organe i sisteme ce vor fi identificate n timpul diseciei sunt prezentate ntr-un fiier [.pdf] intitulat Anatomia funcional de broasc ce poate fi accesat prin situl Disciplinei de Fiziologie (http://www.umftgm.ro/~fizio/edu/lp/data/anatomia_functionala_broasca.pdf). Inima de broasc prezint anumite particulariti anatomice fa de inima uman (Figura nr. 8). Inima de broasc se compune din patru compartimente: sinus venos, atrii, ventricul, bulb aortic, care se contract succesiv. n condiii normale excitaia se genereaz la nivelul sinusului venos i se conduce de la un compartiment la altul; dar fiecare compartiment dispune i de un pacemaker separat. n condiii fiziologice, pacemakerul sinusului venos genereaz frecvena cea mai mare, 60 bti pe minut, guvernnd activitatea electric a inimii (overdrive suppression). Pacemakerul atrial poate genera un ritm de aprox. 50 bti pe minut, cel ventricular un ritm de 25 bti pe minut, iar cel din bulbul aortic un ritm de 10 bti pe minut. ntre fiecare compartiment exist o zon joncional la nivelul creia conducerea electric este ncetinit. La aceste nivele impulsul electric ntrzie permind o umplere mai bun a compartimentului urmtor i prin acesta o hemodinamic mai eficient. La om sinusul venos este nglobat n peretele atrial, exist un pacemaker sinoatrial (denumire ce denot originea filogenetic a acesteia) iar nodul sinoatrial este nconjurat de prima jonciune (cel dintre SV i A la broasc) ceea ce poate cauza blocurile sinoatriale.

LIGATURILE LUI STANNIUS


Prin ligaturile lui Stannius se poate studia conducerea intracardiac a excitaiei. nconjurnd o zon joncional i strngnd aa, se ntrerupe mecanic conducerea impulsurilor electrice de la un compartiment la altul. Prima ligatur a Iui Stannius se face cu un fir de a subire la nivelul limitei de separaie dintre sinusul venos i atrii. Dup prima ligatur a lui Stannius, sinusul venos i continu contraciile cu frecvena iniial, de aproximativ 60/min, ritm impus de pacemakerul fiziologic, localizat la nivelul sinusului venos (ganglionul Remak, echivalentul nodului sinusal la om), iar atriile i ventriculul se opresc n diastol. Dup cteva minute acestea i reiau activitatea, dar cu o frecven mai sczut, de aproximativ 40/min; ritmul lor fiind determinat de un pacemaker localizat la nivelul atriilor (ganglionul Ludwig, echivalentul nodului atrioventricular la om). A doua ligatur a lui Stannius se face, cu pstrarea primei, la nivelul limitei de separaie dintre atrii i ventricul. Dup a doua ligatur a lui Stannius, sinusul venos se contract cu frecvena iniial, atriile se contract cu frecvena dobndit n urma primei ligaturi, n timp ce ventriculul, dup o pauz de obicei mai lung (timp n care se pot determina perioadele refractare), i reia activitatea cu o frecven mai sczut, de aproximativ 25/min, i total asincron fa de ritmul sinusal (se recreeaz astfel artificial blocul

12

Lucrri practice de fiziologie

atrioventricular gradul III la om). Ritmul ventricular este dat de ganglionul Bidder, localizat la acest nivel.

Figura nr. 8. Compartimentele inimii de broasc. Imaginea stnga sus poziie anatomic, imaginea dreapta sus, inima cu vrful ntors n sus pentru vizualizarea sinusului venos. Schema de jos prezint succesiunea celor patru caviti precum i poziia ligaturilor Stannius. SV sinus venos; A atriu; V ventricul; BAo bulb aortic; Ao aorta; VCS vena cav sup.; VCI vena cav inf.

DETERMINAREA PRAGULUI DE EXCITAIE I STUDIUL PERIOADELOR REFRACTARE


Se ataeaz la inim un stimulator bipolar. Se stimuleaz inima dup aplicarea ligaturii Stannius II (n perioada liber n care ventriculul nc nu i-a reluat activitatea). Se ncepe stimularea cu o intensitate minim crescnd treptat acesta pn la apariia primei contracii. Astfel se determin pragul de excitaie. Dac cordul nu i-a reluat nc activitatea stimulm cordul cu dou impulsuri succesive folosind cel puin intensitatea minim necesar iniierii potenialului de aciune. Apoi se scade treptat intervalul dintre impulsurile succesive pn la dispariia celui de al doilea potenial de aciune. Astfel determinm perioada refractar absolut. n cazul n care ventriculul i-a reluat activitatea se capteaz cu ajutorul plcii A/D potenialul de aciune propriu al miocardului (generat de pacemakerul ventricular) acesta fiind folosit de program ca un trigger pentru iniierea stimulului electric. Stimularea cordului n prima parte a potenialului de aciune nu produce nici un rspuns, acesta demonstrnd existena fazei

Experimente pe sistem cardiovascular i respirator de broasc

13

refractare absolute. La sfritul potenialului de aciune, miocardul fiind ieit din faza refractar, rspunde printr-o contracie suplimentar numit extrasistol. Ea este urmat de o pauz mai lung, numit pauz compensatorie; aceasta se datoreaz faptului c stimulul normal urmtor pornit din pacemakerul ventricular, gsete miocardul n faz refractar n urma extrasistolei. Folosind ghidul oferit pe urmtoarele pagini (Realizarea practic) rspundei la ntrebrile din Fia de lucru. Stimulatoarele biologice pot genera stimuli cu amplitudine mare, care pot fi periculoase dac electrozii sunt aezai n aa fel nct curentul electric poate s treac prin cord! Stimulatoarele biologice pentru animale de experien nu se utilizeaz niciodat la om! Nu atingei aparatura utilizat pentru nregistrare sau stimulare dect n prezena i la dorina expres a asistentului.

14

Lucrri practice de fiziologie

REALIZAREA PRACTIC
A. Examinarea microcirculaiei umane. Circulaia sngelui la om se poate vizualiza cu ajutorul microscopului capilar. Microscopul capilar este de fapt un microscop de disecie, la care obiectul examinrii este iluminat de sus. n acest caz se va folosi lumin de culoare verde sau albastr. Se pune o pictur de glicerin pe patul unghial al inelarului. Se aeaz degetul pe masa microscopului n aa fel, nct n cmpul vizual s apar limita dintre unghie i piele. Se ncepe de la mrirea minim a microscopului (ocular 10x, obiectiv 0,63x). Se crete treptat mrirea microscopului. La o mrire de 40 de ori, se observ ansele capilare (Figura nr. 9).

Figura nr. 9. Microcirculaia la nivelul patului unghial (explicaii n text).

B. Observarea circulaiei sanguine pe limba de broasc. Se cntrete broasca, dup care se nfoar cu ajutorul unei crpe. Se injecteaz intraperitoneal uretan 20% n doz de 1ml/50g. Instituirea narcozei este semnalat de abolirea reflexului de ntoarcere (broasca nu se ntoarce de pe spate n poziie normal) i lipsa reflexului cornean (broasca nu clipete la atingerea corneei cu un obiect bont). Broasca se aeaz pe o banchet fixat n poziie orizontal cu ajutorul unui stativ. Limba tras afar se fixeaz cu ace pe un placaj de plut gurit la mijloc. Placajul de plut se aeaz pe masa microscopului. (Figura nr. 10).

Figura nr. 10. Observarea circulaiei sanguine pe limba de broasc.

Experimente pe sistem cardiovascular i respirator de broasc

15

Se examineaz circulaia sngelui cu obiectiv mic (10x). n cazul unei examinri ndelungate, mucoasa se umezete periodic cu soluie Ringer la temperatura camerei. Soluia Ringer pentru broasc este o soluie ce conine clorur de sodiu, clorur de potasiu, bicarbonat de sodiu i glucoz (principalii ioni din spaiul extracelular n concentraii fiziologice, surs energetic, respectiv soluie de tampon pentru meninerea pH) ce este utilizat pentru meninerea n via a esuturilor n timpul experimentelor. Soluia Ringer pentru broasc a fost utilizat pentru prima oar n 1882 de ctre Sidney Ringer (clinician i farmacolog britanic, 1836-1910). Variante ale acestei soluii adaptate la fiziologia diferitelor specii sunt utilizate i astzi att experimental ct i n practica medical. C. Examinarea motilitii ciliare pe broasc. Broasca (deja) anesteziat se fixeaz din nou ntr-o crp. Se introduce unul din tiurile foarfecii n cavitatea bucal i se ndeprteaz capul deasupra liniei ochilor (Figura nr. 11).

Figura nr. 11. Metoda de decapitarea a broatei anesteziate.

Broasca se aeaz pe planeta de lemn. n continuare se lucreaz cu capul ndeprtat al broatei. Pe mucoasa palatului se pune o mic pictur de soluie Ringer ce conine particule de crbune suspendat n ser fiziologic. Dup cteva minute se poate observa cu ochiul liber cum particulele de crbune se deplaseaz spre esofag. D. Examinarea motilitii ciliare pe broasc la microscop optic. Din mucoasa palatului se efectueaz raclaj cu un bisturiu, se ntinde pe o lam degresat i se umezete cu o pictur de soluie Ringer la temperatura camerei. Se examineaz la microscop cu obiectiv de 10x i se observ micarea uniform a cililor. E. Disecia broatei i identificarea organelor interne. Examinarea inimii. Se continu cu disecia broatei. Se fixeaz broasca n decubit dorsal pe o planet de lemn i cu o pens chirurgical se prinde pielea la nivelul abdomenului ridicnd-o i efectund o incizie n form de "V". Se prelungete incizia pn la nivelul claviculelor, care se secioneaz, i cu o seciune transversal se ndeprteaz plastronul astfel pregtit. Se observ i se identific organele. Cavitatea toracic i cea abdominal nu sunt desprite, broasca neavnd diafragm. Se vede inima n sacul pericardic, arterele i venele mari precum i plmnii. Dac plmnul mai conine aer se observ structura acinar a plmnului. Se identific organele abdominale. Se numr frecvena ventricular a inimii n poziie anatomic. Cu o pens fin se prinde pericardul (vizualizat ca o membran fin alb mulat pe cord) i se secioneaz avnd grij s nu se lezeze inima. Se numr frecvena ventricular dup deschiderea sacului pericardic. Inima se observ n poziie anatomic i ntors n sens cranial, cu vrful ridicat sus cu ajutorul unei pense fine, dup secionarea ligamentului posterior al inimii. Se identific

16

Lucrri practice de fiziologie

cavitile inimii i se examineaz contracia succesiv a cavitilor. n continuare se examineaz efectul termic aplicnd soluie Ringer rece i apoi cald direct pe inim. Dup aplicarea diferitelor soluii se msoar frecvena ventricular. n continuare se ndeprteaz inima prin excizare cu foarfec la nivelul vaselor mari de la baza inimii i se aeaz ntr-un vas Petri n soluie Ringer, notnd frecvena ventricular. Apoi se adaug adrenalin n vasul Petri i se observ schimbarea frecvenei ventriculare. Dac dup ndeprtarea inimii acesta s-a oprit, se aplic stimulare mecanic cu un ac bont. F. Examinarea motilitii ciliare pe esofagul de broasc. Dup ndeprtarea inimii se identific esofagul, stomacul i intestinele, observnd motilitatea intestinal. Se identific ficatul cu vezica biliar i splina. Ridicnd intestinele, se vd rinichii cu glandele suprarenale, vezica urinar i organele genitale. Se prepar esofagul broatei, din partea superioar se taie o bucat de cca. 0,5 cm, care se trage pe o pipet de sticl gradat i se fixeaz n poziie orizontal. Dup cteva minute se observ deplasarea bucii de esofag ca urmare a micrii cililor. G. nregistrarea activitii mecanice i electrice ale inimii de broasc. Broasca anesteziat, decapitat, despinalizat se aeaz pe spate, se prepar (prin metoda deja descris) i se ndeprteaz plastronul sternal, vizualiznd inima. Se deschide pericardul. Se aeaz electrozii, crligul metalic fiind inserat la nivelul vrfului inimii. Inima se ridic punnd sub tensiune firul traductorului mecano-electric. Se nregistreaz simultan activitatea electric i mecanic a cordului n condiii bazale cu ajutorul calculatorului. Continund nregistrarea se aplic mai nti soluie Ringer nclzit la 40C i soluie Ringer de la ghea, iar apoi diveri mediatori chimici (adrenalin, acetilcolin) i electrolii (Ca2+ i K+) observnd efectele. Se aplic apoi ligaturile lui Stannius i se observ efectul acestora asupra activitii cordului. Se ataeaz electrodul stimulatorului la inim i se determin mai nti intensitatea minim de curent necesar atingerii potenialului prag (i iniierii potenialului de aciune) iar apoi se determin perioada refractar. n cazul n care ventriculul i reia activitatea spontan se demonstreaz extrasistola i pauza compensatorie.