Sunteți pe pagina 1din 6

1

Lp Imunologie nr. 1

Reactii Ag-Ac

Reactia Ag-Ac - introducere


Reprezinta asocierea dintre cele 2 molecule prin legaturi necovalente; aceasta reactie nu determina modificari chimice ireversibile in nici una dintre cele 2 molecule; Ac este receptor specific, solubil pentru un anume Ag. Legaturile necovalente (legaturi de hidrogen, legaturi ionice, legaturi hidrofobe, reactii van der Waals ) intre cele Ag si Ac se realizeaza intre epitopul antigenului ( determinantul antigenic ) si CDR-urile regiunilor variabile ale lanturilor H si L ale Ig (VH si VL ) CDR = complementaritydetermining regions, regiuni de determinare ale complemetaritatii (paratop). Aceste legaturi necovalente sunt relative slabe (comparativ cu cele covalente) si se realizeaza daca moleculele se afla la distante mici una fata de cealalta; astfel ca o legatura puternica intre Ag si Ac depinde de o potrivire intre domeniile Ac si Ag = complementaritate care sa asigure aceasta distanta mica si care sa asigure realizarea unui numar mare de asfel de legaturi; complemetaritatea dintre Ac si Ag determina specificitatea legaturii. Legaturile intre Ag si Ac sunt reversibile. Reactia Ag-Ac poate fi influentata de mai multi factori:

Afinitatea, aviditatea Ac fata de Ag Titrul Ac Concentratia Ag; starea Ag: Ag solubile/corpusculate Conditii de mediu: pH, temperatura

Caracterstici ale legaturii intre Ac si Ag:


1. Specificitatea = Ac recunoaste in mod ideal un singur tip de antigen fata de care are
complementaritate Afinitatea este puterea combinata a legaturilor necovalente intre un singur Fab si un singur determinant antigenic/epitop. - reactia dintre Ac si Ag este cu dublu sens, asociere si disociere: Ag+AcAgAc - constanta de asociere se noteaza cu: Ka=[AgAc]Ag[Ac]; Ka este o masura a afinitatii; dializa de echilibru: masoara afinitatea Ac fata de Ag. 3. Aviditatea este suma afinitatilor intre situsurile de legare ale Ac si toti determinantii Ag pe care ii leaga. - este o masura mai buna de evaluare a capacitatii de legare a Ac in vivo. - aviditatea crescuta poate compensa pentru o afinitate scazuta: ex. IgM au afinitate mai scazuta de cat IgG dar avand mai multe situsuri de legare ( in forma lor pentamerica ) pot lega mai eficient Ag. Cross-reactivitatea = in practica, uneori, un Ac[1] poate recunoaste un alt Ag[2] decat cel specific(Ag[1]), daca acest Ag[2] are un epitop identic sau asemanator cu Ag[1]. *De obicei aviditatea Ac[1] pentru Ag[2] este mai mica decat pentru Ag[1].

2.

Imunoserologia - domeniul imunologiei care studiaza reactiile Ag-Ac in vitro;


Aplicatii diagnostice: serotipie (caracterizarea unei celule normale/tumorale/bacterii etc. prin evidentierea unor Ag specifice de suprafata); dg imunologic. Componente esentiale ale reactiilor serologice: Ag, Ac

Ag

2
Se utilizeaza pentru: - imunizarea animalelor de laborator in scopul obtinerii serurilor imune - reactii imune de serodiagnostic. Metode de preparare a Ag: purificarea Ag prin electroforeza - SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) cu transfer ulterior pe nitroceluloza; dificil de extras proteinele de pe nitroceluloza; necesita reactivi de disociatie puternici si care pot contamina Ag; daca acest Ag este ulterior utilizat pentru imunizarea animalului de experienta pot apare reactii adverse importante la acesta din cauza reactivilor de disociere. purificarea Ag prin affinity chromatography: principiul metodei: Ac specific antigenului este fixat pe particule sintetice (de Sepharose); aceste particule de sefaroza cu Ac specificifixati se amesteca cu solutia in care se gaseste si Ag de extras; Ag se va fixa pe Ac, respectiv pe particulele de sefaroza; restul solutiei se va spala; ulterior legaturile Ag-Ac se rup prin modificarea pH-ului mediului. producerea de epitopi (peptide) prin ADN recombinat in culturi de celule.

Serurile imune (Ac) Se folosesc pentru teste diagnostice, tehnici de cercetare, terapia unor afectiuni cum ar fi PR, SA, artrita psoriazica, proriazis, diverse tipuri de tumori, SM, Sd GB, sd. imunodeficienta (imunizare pasiva). Se pot obtine seruri policlonale/monoclonale: Seruri POLICLONALE = se obtin de la pacienti (bolnavi/convalescenti) sau prin imunizarea
animalelor (animale mari utilizare pe scara larga, comercializare; animale mici pentru cercetare) cu un Ag; se obtin de obicei un seruri policlonale = care contin mai multe tipuri de Ac, fiecare din ei specific pentru unul din mai multi determinanti antigenici al Ag respectiv. Serurile policlonale pot fi monospecifice = Ac impotriva a diversi epitopi ai aceluiasi Ag sau polispecifice = pentru mai multe Ag.

Seruri MONOCLONALE = Ac impotriva unui singur tip de epitop, secretat de o singura clona
de LB; Tehnica: se folosesc hybridomas = rezultate din fuziunea unei celule normale secretante de Ig (prelevate de la un animal imunizat in prealabil cu Ag specific) si celule tumorale de mielom multiplu; acesti hibrizi, spre deosebire de plasmocitele normale cresc si se inmultesc pe medii de cultura si pot avea o viata lunga; prin procese de selectie se obtine o clona care produce 1 singur tip de Ac. Avantaje/dezavantaje seruri poli/monoclonale: serul monoclonal obtinut dintr-un anume hybridom are proprietati standard referitor la structura, specificitatea, afinitatea. serul monoclonal nu va mai recunoaste un epitop daca acesta a fost denaturat in cadrul procesului de purificare a Ag. serul policlonal, cu Ac care recunosc mai multi epitopi ai aceluiasi Ag e mai putin probabil sa fie afectata de aceasta conditie. serul policlonal trebuie sa fie de o specificitate inalta si cat mai putin contaminat de Ac nenecesari . serurile policlonale variaza intre ele in ceea ce priveste specificitatea, afinitatea, aviditatea.

3
Evidentierea reactiei Ag-Ac:

Reactii de neutralizare Reactii de fixare a complemetului

Reactii de aglutinare Reactii de precipitare Reactii cu liganzi marcati

Reactii de neutralizare
Reactiile de neutralizare reprezinta reactii Ag-Ac in care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus sunt blocate; ex. ASLO, hemaglutinoinhibarea virala,etc. ASLO (Ac anti streptolizina O) Streptolizinele sunt exotoxine produse de streptococi; cu functie de hemolizina determina liza hematiilor (si a alor celule ex. leucocite). Streptolizina O (SLO) se leaga de colesterolul membranar, polimerizeaza si formeaza canale transmembranare . Streptolizina O produsa de streptococi -hemolitici grup A (=Streptococcus pyogenes) dar si C sau G; numita O pentru ca e inactivata de oxigenul atmosferic; este intens imunogenica. (streptolizina S: stabila in oxigenul atmosferic, mai slab imunogena) Determinarea ASLO prin test de neutralizare - testul se bazeaza pe faptul ca, in vitro Ac antiSLO blocheaza liza hematiilor.

metoda Todd (Rantz-Randall): in eprubete se pune: serul pacientului in dilutii seriate, SLO ;
se amesteca usor; se incubeaza 15 minute la 37C; apoi se adauga 0,5 ml suspensie de hematii ( om grup O sau iepure) in concentratie de 5%; se amesteca usor; se incubeaza la 37C timp de 45 minute si apoi se centrifugheaza la 1.500 rpm timp de 1 minut. Titrul ASLO = inversul ultimei dilutii a serului care neutralizeaza complet activitatea SLO = nu produce hemoliza. 1 unitate Todd = cantitatea de Ac care blocheaza 2,5 x doza minima hemolitica de SLO (cantitatea de toxina care hemolizeaza complet 0,5 ml de suspensie de hematii de iepure in concentratie de 5%) Titrul ASLO normal < 125 U Todd; < 200 UI/ml (<16 ani); <150 UI/ml (adulti); pot exista variatii in functie de varsta, expuneri anterioare la streptococ grup A, capacitatea de reactivitate imuna; etc. ***Se poate face si un test rapid de aglutinare pe particule de latex pe care e adsorbita SLO. Test pozitiv = aglutinarea particuleleor de latex de catre Ac din serul pacientului. Dupa o infectie acuta cu streptococ titrul Ac antiSLO incepe sa creasca la 7 10 zile; ajung la titru maxim la ~ 6 saptamani (~3 saptamani de la instalarea RAA); dupa aceea titrul ASLO scade progresiv; la 12 luni de la infectie doar 20% din cei infectati mai au titru ASLO peste normal. Alte proteine streptococice: - Proteinele M sunt proteine ale peretelui bacterian; impreuna cu acidul lipotecoic mediaza adeziunea S. pyogenes la fibronectina din celula epiteliala a gazdei. Sunt proteine stabile termic, sensibile la tripsina, formate din 2 lanturi; capatul N-terminal este hipervariabil determina specificitatea de tip a streptococilor (grupul A prezinta aproximativ 120 tipuri). Proteina M reprezinta proteina majoritara de suprafata a tulpinilor virulente de S. pyogenes

4
reprezinta factorul major de virulenta; inhiba depunerea de complement si astfel previne fagocitarea bacteriei. Exotoxinele A si C ale lui S. pyogenis (SPE A si SPE C) superantigene care induc activarea LT, inhiba sinteza de Ac, potenteaza socul toxic, induc aparitia febrei, induc eliberare prompta de citokine proinflamatorii. Enzime: 2 streptokinaze ( imunogenice) care activeaza plasmina, 1 pana la 4 DNA-aze ( cea mai comuna DNA-aza B care e si cea mai imunogenica), s.a. enzime ( hialuronidaze, neuraminidaze, fosfataze...). protectivi anti infectie = Ac anti-proteina M ( sunt specifici de tip - in functie de proteina M a tipului); apar mai lent decat alti Ac; persista ani, posibil chiar toata viata; protejeaza impotriva reinfectiei. markeri ai infectie = Ac anti produse extracelulare: anti-SLO, anti-DNA-aza nu sunt protectivi;

Ac anti-streptococ:

S. pyogenes determina afectiuni prin 3 mecanisme principale: - supuratie ( facilitata de proprietatile antifagocitare ale proteinei M): faringita*, amigdalita*, limfadenita supurata*, sinuzita, pneumonie, empiem pleural, impetigo*, erizipel, celulita, limfangita, fasceita necrozanta, meningita, septicemie, s.a. - elaborare de toxine: afectiuni mediate de toxine streptococice: scarlatina*, soc toxicoseptic (STSS) - inflamatie mediata imun non-supurativa: afectiuni post-infectie streptococica: RAA*, glomerulonefrita acuta(GNA)*. *mai frecvent/exclusiv copii, adolescenti. RAA - reumatismul articular acut (febra reumatica) Susceptibilitate genetica: HLA-DR2 ( albi), HLA-DR4 (negri); marker non-HLA - un marker al LB = D8/17 Mecanismul aparitiei manifestarilor RAA: cross-reactivitatea datorita mimetismului molecular intre componente antigenice ale streptococilor -hemolitici grup A (proteina M) si proteine proprii ale organismului. Clinica: debut brusc la copii, adolescenti, tineri( rar < 4 ani, adulti ), la 2-3 saptamani dupa o angina streptococica cu S. -hemolitic grup A (uneori paucisimptomatica, dificil uneori de identificat in anamneza) cu febra, stare de rau, paloare, artralgii. - artrita migratorie asimetrica a articulatiilor mari (genunchi, glezne, coate, RCC) - cardita reumatismala: dispnee, palpitatii, tahicardie, dureri retrosternale, sufluri noi, frecaturi pericardice; pot fi afectate valvele, miocardul si pericardul; o parte din pacientii care prezinta cardita la primul episod de RAA pot ramane cu sechele cardiace ( mai ales St.Mi.); o mare parte se vindeca, dar, fara profilaxie secundara au risc crescut de recurenta si deci de sechele. - coreea acuta (Sydenham) miscari involuntare, grimase, debutaza de obicei mai tardiv la 6-8 saptamani dupa infectie; - eritema marginatum, noduli subcutanati ( mai frecvent la nivelul genunchilor, cotului, umarului, occiputului). Laborator: - teste care confirma infectia recenta streptococica: exudat faringian ( insa frecvent negativ), Ac anti-SLO (ASLO), Ac anti-DNA-aza

5 markeri inflamatori (reactanti de faza acuta; VSH si CRP care pot ramane crescute saptamani, luni) modificari EKG ( tulburari de conducere, supradenivelare de ST in cazul pericarditei) sau ecocord ( lichid pericardic, regurgit, FE..)

Criterii Jones: Majore: Minore: cardit a artrit a

coree eritem marginat noduli subcutanati

artralgii febra

VSH, CRP, alti reactanti de faza acuta PR prelungit

Diagnostic pozitiv: 2 criterii majore sau 1 criteriu major + 2 minore + evidenta infectiei cu Streptococ grup A in antecedente: exudat faringian + cultura, sau markeri imunologici: ASLO titru etc. Tratament: penicilina/moldamin (eritromicina), antialgice (paracetamol), AINS (aspirina), AIS GNA poststreptococica Debut: la 10 zile dupa infectii faringiene sau la 3 saptamani dupa infectii cutanate cu streptococ hemolitic grup A (altul decat RAA) Cauza: depunere de CIC la nivelul MBG (contin IgG si Ag) se activeaza C, factori chemoatractanti, infiltrat inflamator celular. Clinic: de obicei sindrom nefritic = edeme, hematurie, frecvent HTA, oligurie. Paraclinic: - Urina: hematurie micro-/macro-scopica, +/- cilindri ( hialini, granulari, hematici), +/- piurie; proteinurie, uneori de rang nefrotic; - Plasma: CH50, C3; moderate uree, creatinina; CIC; VSH; hipoproteinemie cu hipoalbuminemie ( in caz de sindrom nefrotic ); in caz de disfunctie renala severa pot apare acidoza metabolica, K, Cl, Na, hipoalbuminemie, anemie de dilutie. Diagnosticul: clinic + paraclinic + evidenta de infectie Streptococica recenta : ASLO, Ac anti-DNAaza B, culturi din faringe/piele Alte teste de neutralizare: Testul Schick: se injecteaza intracutanat o mica doza de toxina difterica purificata; daca pacientul nu are Ac anti-toxina difterica circulanti, la locul injectarii, dupa 5 zile apare apare o zona rosie, indurata si dureroasa cu diametrul > 10 mm; daca pacientul are respectivii Ac atunci acestia vor neutraliza toxina difterica si nu apare inflamatie locala. (exotoxina difterica inhiba sinteza proteica a celulelor organismului gazda, este citotoxica si produce necroze tisulare)

Reactia de fixare a complementului


Se foloseste pentru evidentierea unor Ac specifici [1] in serul pacientului ( sau in LCR...)

6
Principiu: cand IgG sau IgM fixeaza Ag specific acestia fixeaza complementul; daca reactia are loc pe suprafata hematiilor => liza. Sistem-indicator: eritrocite preincubate cu Ac [2] specifici anti-hematie, in concentratii care nu produc aglutinare = eritrocite sensibilizate; sistemul indicator nu contine complement. Sistemul test: serul pacientului se incalzeste la 56C pentru inactivarea complementului pacientului; (apoi este adsorbit cu hematii de oaie spalate pentru a elimina din reactie eventualii Ac anti-hematie); apoi serul se amesteca cu Ag [1] purificat si o solutie de complement (ser proaspat diluat de porcusor de guinea). Amestecul se incubeaza 30 minute la 37C pentu a se lasa timp Ac [1] din serul pacientului sa reactioneze cu Ag [1] si sa fixeze complementul. Se adauga apoi sistemul-indicator = adica eritrocitele sensibilizate. Test pozitiv: daca in serul pacientului exista Ac [1] specifici atunci acestia se vor atasa de Ag[1] specific si vor fixa complementul => nu exista complement liber => la adaugarea sistemului indicator hematiile sensibilizate nu vor mai fi lizate => nu apare hemoliza

Test negativ: daca apare hemoliza eritrocitelor sensibilizate => in sistemul-test exista complement ( acesta e liber sa se fixeze pe Ac [2] anti-hematie fixati pe hematiile sensibilizate, se declanseaza cascada complementului care determina liza hematiilor) = in sistemul test nu exista Ac [1] specifici = in serul pacientului nu exista Ac [1] specifici.

Aplicatii: reactia Wassermann pentru sifilis - foloseste ca Ag fosfolipide (cardiolipina) pentru a detecta aparitia unor Ac numiti reagine = Ac care apar in cursul infectiei luetice fara a fi Ac antitreponema! Reactii fals pozitive: malarie, mononucleoza, LES; : detectarea Ac anti-Mycoplasma, Bordetella, Ricketssi, virusuri, fungi (Cryptococcus, Histoplasma..).