CULTURI PURE Cultura pura reprezinta biomasa de celule de acelasi tip provenita prin nmultire din o singura celula

situata ntr-un mediu nutritiv steril adecvat. n cazul n care, pe un mediu solidificat, prin dezvoltarea unei celule unice s-a obtinut o colonie, n cadrul coloniei biomasa dezvoltata reprezinta cultura pura. Pentru perpetuarea si ntretinerea puritatii culturilor, dupa obtinere, prin diferite metode de izolare a culturii pure, celule de acelasi fel se pot transfera n vase cu mediu steril, transfer care se numeste repicare si conduce la obtinerea unei culturi pure. Obtinerea culturilor pure are o importanta deosebita pentru tehnicile microbiologice si n biotehnologii. Izolarea n culturi pure permite identificarea si caracterizarea morfologica si fiziologica a microorganismului izolat. Pe culturi pure se fac studii pentru selectionarea tulpinilor cu performante de biosinteza si sub forma de culturi pure se face ntretinerea si conservarea culturilor valoroase. n industria alimentara, n subramurile n care microorganismele sunt folosite pentru obtinerea de produse alimentare acestea se folosesc sub forma de cultura pura, conditie obligatorie pentru a obtine produse cu o anumita calitate. Astfel, n industria prelucrarii laptelui, la fabricarea vinului, a spirtului, a berii, n panificatie, se folosesc culturi pure de microorganisme, care prezinta anumite proprietati biotehnologice. 4.1 TEHNICI GENERALE DE IZOLARE DIN MEDII NATURALE sI OBINEREA CULTURILOR PURE Pentru obtinerea culturilor pure se aplica metode fizice, metode fizico-mecanice si metode biologice. n prima etapa de izolare, stiind ca densitatea celulelor n mediul natural poate fi ridicata, se fac diluari ale suspensiilor de celule n ser fiziologic steril. Tehnica de diluare folosita este tehnica dilutiilor decimale. Se folosesc eprubete cu ser fiziologic steril ( 0,8 % NaCl) pentru a preveni turgescenta celulelor. Metodele bazate pe tehnici de raspndire au la baza principiul raspndirii celulelor prin diluare n medii lichide sau prin diseminare mecanica pe suprafata mediilor sterile. Metoda n strii foloseste drept suprafata de raspndire mediul nclinat din doua trei eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea succesiva de striuri. Aceste metode se folosesc si n cazul n care o cultura pura este contaminata n perioada de pastrare cu microorganisme straine si aceasta trebuie sa fie salvata. Metode scarificate n placa Petri se repartizeaza un mediu de cultura adecvat (MMA/BCA) si dupa solidificarea mediului, cu firul ansei se recolteaza celule din mediul natural si se executa trasari pe suprafata

mediului, astfel nct diversele celule ramn distantate ntre ele. Prin termostatare 2-3 zile, din colonia care corespunde microorganismului ce trebuie sa fie izolat, se face repicare ntr-o eprubeta cu mediu solid nclinat si astfel se obtine o cultura pura. Metoda culturala Koch este folosita n special pentru izolarea de drojdii. Ca mediu de raspndire se foloseste mustul de malt cu gelatina repartizat n trei eprubete, fluidificat si mentinut la 40 C. Din mediul natural, de exemplu un must n fermentatie, se recolteaza o ansa care se introduce succesiv n cele trei eprubete, cu agitare, care sa asigure desprinderea celulelor. Dupa inoculare si uniformizare, continutul fiecarei eprubete se repartizeaza n cte o placa Petri; prin solidificare, celulele ramn fixate n gel si prin multiplicare vor forma colonii/clone izolate. n functie de densitatea celulelor recoltate initial, n placa a doua sau a treia coloniile sunt suficient de distantate (2cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvata a culturii pure. Metode bazate pe tehnici de diluare Din suspensia de celule din care dorim sa facem izolarea se fac diluari n mediu steril si sub control microscopic se verifica daca s-a facut diluarea corespunzator si la o picatura de lichid se afla o celula. Metoda Lindner este cea mai cunoscuta metoda folosita la selectarea culturilor pure de drojdii n industria fermentativa. Pe o lamela se plaseaza cu ajutorul unui toc cu penita topografica steril o serie de picaturi. Apoi lamela se plaseaza cu picaturile n jos pe o lama cu escavatie. Apoi se studiaza la microscop si se noteaza picatura care contine o singura celula. Cu ajutorul unei hrtii de filtru sterilizata, luata cu o penseta sterila, se absoarbe picatura, prin absorbtie va trece si celula de drojdie. Dupa ce se absoarbe aceasta picatura, hrtia care contine celula se introduce ntr-o eprubeta care contine must de malt steril. Celula va da nastere prin nmultire n conditii favorabile la o biomasa care va reprezenta cultura pura. Metoda Hansen consta n diluari decimale n mediu steril, dupa care se numara celulele din 1 ml dilutie si se realizeaza nsamntarea pe mediu nutritiv solidificat pentru obtinerea de colonii. Pentru izolarea culturilor de mucegaiuri se folosesc metode scarificate de antrenare a sporilor n placi cu must de malt agar. O alta metoda care ne permite obtinerea de colonii izolate de mucegaiuri este metoda inundarii. n placa Petri cu must de malt agar se adauga ctiva ml din o suspensie diluata, cu o concentratie mica de spori; dupa clatirea suprafetei mediului, lichidul se scurge iar unii spori, cei retinuti de suprafata mediului, conduc la colonii izolate. Metoda lui Naumov izoleaza picaturi de MMA n care n prealabil s-au introdus un mediu restrns de spori. n mediu nca fierbinte, dupa inoculare, se adauga picaturi pe capacul placii Petri, iar dupa solidificare si cultivare se alege picatura de mediu solid care prezinta o singura colonie. Metoda cu micromanipulator este o metoda mecanica. Micromanipulatorul este alcatuit dintrun sistem de tuburi capilare cu care se poate lucra sub microscop, cu posibilitatea de a recolta

prin absorbtie n microcapilar unele celule izolate. Apoi celula este introdusa n mediu nutritiv adecvat. Metodele biologice au la baza principiul proprietatilor diferentiate ale culturii ce urmeaza a se izola (proprietati diferentiate de ale microorganismelor asociate). Ca proprietati distincte amintim comportarea fata de temperatura, pH, relatia fata de oxigen, rezistenta la plasmoliza sau rezistenta la anumite substante chimice sau antibiotice. Metoda Burri este metoda clasica care consta n izolarea bacteriilor aerobe de cele anaerobe prin metode biologice. Din suspensia de microorganisme n care se afla n amestec aerobi si anaerobi se face nsamntare n mediul BCA (bulion de carne cu agar) fluidificat si racit la 45C, turnnd ntr-un tub de sticla prevazut la partea inferioara cu un dop de cauciuc. Se acopera apoi tubul cu dop de vata si se termostateaza. n zona unde mediul este n contact cu aerul se vor dezvolta bacteriile aerobe. n restul mediului vor fi fixate bacteriile anaerobe. Pentru a ntelege modul de nmultire a microorganismelor n culturile pure este important sa cunoastem comportarea culturii ntr-un mediu nutritiv steril limitat cantitativ. 4.2 DINAMICA DE DEZVOLTARE A CELULELOR MICROBIENE Daca ntr-un mediu nutritiv lichid (steril ) este inoculat un numar de celule X0 care apartin unei culturi pure si la diferite intervale de timp se face determinarea numarului de celule rezultat prin nmultire, se poate aprecia viteza de nmultire si se pot distinge etapele de dezvoltare ale culturii precum si valoarea nutritiva a componentelor din mediu.

Figura 6: Dinamica de dezvoltare a celulelor microbiene

AB este faza lag sau faza de latenta n care nu are loc o crestere substantiala a numarului de celule. Aceasta este etapa n care celulele se adapteaza la conditiile de mediu, are loc o crestere importanta (de 3-10 ori) a concentratiei n acid ribonucleic. Are loc o biosinteza a enzimelor induse sau adaptive si cresterea n dimensiune a celulelor. Aceasta faza, n cazul drojdiilor, dureaza 2 ore si se poate reduce daca se repeta cultivarea celulelor pe medii cu aceeasi compozitie. Deci cunoasterea comportarii celulelor n aceasta perioada face ca, n practica, cnd urmarim nmultirea celulelor, sa se recurga la cultivarea repetata a microorganismelor n medii cu aceeasi compozitie cu cea a mediului industrial n care acestea urmeaza sa fie cultivate. BC este perioada de declansare a nmultirii - faza de accelerare a cresterii. n aceasta faza celulele cresc n dimensiune, ceea ce favorizeaza declansarea procesului de reproducere. Dupa aceasta etapa urmeaza faza exponentiala sau faza logaritmica care are importanta deoarece n acest interval de timp are loc cresterea cu viteza maxima a celulelor. xt = x02n - ecuatia generala de nmultire; xt - numarul de celule la un moment t; n - numarul de diviziuni; x0 - numarul initial de celule inoculate. Numeroase cercetari urmaresc sa se obtina un mediu de cultura n care faza exponentiala sa aiba o panta ct mai mare, sa dureze mai putin - conditii care se impun la obtinerea inoculului folosit industrial n toate biotehnologiile n care este important sa obtinem rapid un numar ct mai mare de celule. Faza exponentiala va depinde de natura microorganismelor si de conditiile de mediu. La un moment dat viteza de nmultire ncepe sa scada. DE reprezinta faza de ncetinire a cresterii, care se explica printr-o modificare a continutului n factori de crestere. Urmeaza faza EF - faza stationara de crestere - n care nu mai are loc o crestere a numarului de celule si daca se face o numarare globala a tuturor celulelor apare un echilibru ntre numarul celulelor nou formate si numarul celulelor care mor. Faza se explica prin scaderea concentratiei n substante nutritive, epuizarea din mediu a unor substante cu rol vital (bioelemente, factori de crestere), acumularea n mediu a unor substante rezultate prin catabolism care exercita un efect toxic asupra celulelor care au produs aceste substante. Perioada stationara este succedata de perioada FG - faza de declin care consta n scaderea treptata a numarului de celule vii ca urmare a pierderii viabilitatii acestora (prin procese de autoliza). Din punct de vedere fiziologic, fazele AB, BC, CD, DE se caracterizeaza prin cresterea celulelor si prin biosinteza produsilor primari de metabolism. Aceste faze formeaza tropofaza.

Fazele EF, FG formeaza idiofaza caracteristica perioadei n care celulele sintetizeaza produsele secundare de metabolism care nu au rol vital pentru celula (toxine, antibiotice, alcaloizi, alti compusi). Faza stationara are importanta n practica cnd se urmareste prelungirea timpului aferent deoarece se doreste pastrarea n stare vie a microorganismelor din culturile pure. n conditii de limitare a mediului nutritiv, prin acumularea unor compusi de catabolism, au loc modificari de pH si rH intracelular la valori care devin optime pentru enzimele proteolitice intracelulare. Se produce o eliberare a acestor proteaze din lizozomi si are loc moartea, inactivarea prin autoliza (solubilizarea sub actiunea enzimelor proprii). Daca mentinem o cultura de microorganisme ntr-un mediu un timp ndelungat, se ajunge la o autosterilizare a mediului. Pentru a evita moartea tuturor celulelor din cultura pura, celulele ramase vii se transfera prin repicare ntr-un mediu proaspat. La repicare se introduc numai celule de microorganisme nu si mediu, pentru a evita suplimentarea mediului proaspat cu substante toxice. S-a constatat ca n faza de declin apare o usoara stimulare a cresterii numarului de celule explicabila prin aceea ca celulele vii pot sa foloseasca n nutritie substante care s-au eliberat prin liza celulelor moarte. Cunoscnd evolutia dezvoltarii n practica cultivarii microorganismelor cu importanta industriala, se aplica diferite metodologii de cultivare. Dintre utilizarile culturilor pure n care tinem cont de aceasta dinamica face parte si prepararea inoculului. Inoculul reprezinta biomasa de celule apartinnd unei culturi pure - celule vii si active folosite ntr-o anumita concentratie drept starter (cultura de pornire) pentru declansarea proceselor fermentative. Pentru obtinerea cantitatii necesare de inocul, n industrie, se urmareste o nmultire succesiva a celulelor pornind de la o cultura pura n stadiu de cultivare n eprubeta si ajungnd la volume folosite n productie. Transferul celulelor n acest scop se face n volume de lichid din ce n ce mai mari, iar cantitatea de transfer este n medie : 1-3 % cnd preparam inocul pentru bacterii; 3-5 % cnd preparam inocul pentru drojdii; 5-10 % cnd preparam inocul pentru mucegaiuri.

Cresterea procentului de volum transferat este explicabila prin variatia dimensiunii celulelor. La prepararea de inocul transferul se realizeaza din mediul steril cu aceeasi compozitie ca a mediului ce urmeaza a fi fermentat pentru a elimina faza de adaptare.

Durata de timp ntre doua multiplicari succesive este echivalenta cu durata fazei exponentiale de crestere (transferul dintr-un volum mai mic ntr-un volum mai mare se face la sfrsitul fazei exponentiale de crestere). Bibliografie selectiv Bahrim Gabriela, 1999, Microbiologie tehnic, Editura Evrika, Brila. Bourgeois C.M., Mescle J.F., Zucca J.,1998, Microbiologie alimentaire, tome 1, 2, Ed. Apria, Paris. Dan Valentina, 1999, 2000, Microbiologia produselor alimentare, vol. I, II, Ed. Alma Galai. Dan Valentina, Oancea Ioana, Kramer Cristina, Zara Margareta, Tofan Clemansa, 1991, Controlul microbiologic al produselor alimentare, Ed. Univeristii din Galai. Dunca Simona, Octvia Ailiesei, Erica Nimian, tefan Marius, 2004, Microbiologie aplicat, Ed. Tehnopress, Iai. Gams W., Hoekstra E. S., Aptroot A. (Eds.), 2000, CBS Course of Mycology, Fourth Edition, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Delft, The Netherlands. Magearu V., 1988, Controlul analitic al proceselor microbiologice, Editura Tehnic, Bucureti. Mihail D.N., 1998, Biotehnologia i bioingineria, Editura tiinific i Enciclopedic, Bucureti. Oprean L., 2002, Microbiologia produselor alimentare, Ed. Universitii Lucian Blaga Sibiu. Samson, R. A., Van ReenHoekstra Ellen, 1988, Introduction to food borne fungi, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.