Sunteți pe pagina 1din 42

I.METODE I TEHNICI DE LABORATOR N FITOPATOLOGIE 1.

Aparatur, sticlrie i instrumentar de laborator Aparatur de laborator n laboratorul de fitopatologie, precum n orice laborator de microbiologie, trebuie s existe aparatur de strict necesitate, precum: microscop, stereomicroscop, lup, termostat, etuv, frigider, autoclav etc. Microscopul. Aparatul de baz ntr-un laborator de fitopatologie este microscopul. Bacteriile i marea majoritate a ciupercilor, exceptnd macromicetele, sunt de dimensiuni mici i pot fi examinate numai cu microscopul. Examinarea preparatelor la microscopul optic se realizeaz prin diferite metode (examinare direct, examinare n cmp ntunecat, examinare n lumin fluorescent etc.). n cercetarea tiinific, microscopul electronic a ctigat tot mai mult teren. Astfel, n numeroase laboratoare de micologie, bacteriologie i virologie, studiul structurii agenilor fitopatogeni se realizeaz i cu ajutorul microscopului electronic. Stereomicroscopul. Acest aparat servete la cercetarea obiectelor netransparente, folosind lumina reflectat, natural sau electric. Stereomicroscopul este folosit n fitopatologie pentru studierea simptomelor de boal, cauzate de agenii patogeni, ale caracterelor morfologice ale sporulaiei, n special n cazul ciupercilor, pentru identificarea speciei parazite pe plante. Termostatul. Este un aparat de strict necesitate, n laboratoarele care lucreaz cu microorganisme. Este cunoscut faptul c agenii patogeni se dezvolt i se nmulesc ntre anumite limite de temperatur, specifice fiecrui gen sau chiar specie (Hulea, 1969). Etuva de sterilizare. Este folosit pentru sterilizarea sticlriei de laborator i a tuturor obiectelor (din porelan, de metal, fr suduri cu cositor etc.), care suport temperatura uscat i ridicat. La etuv nu se pot steriliza obiectele de cauciuc, vat, seringile de plastic i altele. Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz, de obicei, la 160oC timp de dou ore, de la atingerea acestei valori sau la 180C, timp de o or. Lupele. Pentru cercetri mai rapide i grosiere ale plantelor, care prezint simptome de mbolnvire, se pot folosi lupe (de buzunar, de mn), att n laborator, ct i n ser i cmpul de cultur.

Frigiderul. Este indispensabil pentru pstrarea mediilor necesare cultivrii agenilor fitopatogeni, a serurilor, a unor culturi de microoganisme i a oricrui material vegetal infectat care nu poate fi analizat imediat. Autoclavul. Este folosit pentru sterilizarea, prin vapori sub presiune, a mediilor de cultur, a pmntului, a soluiilor nutritive i a oricrui alt material care nu suport temperatur ridicat i uscat. De asemenea, autoclavul se folosete la sterilizarea vaselor cu culturi de microorganisme, nainte de a fi golite i splate. Aceast sterilizare este obligatorie, pentru a evita vicierea atmosferei din laborator, dar i pentru a proteja sntatea lucrtorilor care spal sticlria. La introducerea obiectelor n autoclav, se va asigura spaiul necesar, pentru o bun circulaie a vaporilor i realizarea unei bune sterilizri. ntre presiunea vaporilor i temperatura din autoclav exist o corelaie pozitiv (Tab. 1). Sterilizarea materialelor contaminate se face cel puin 20 minute la 121C (Constantinescu, 1974). Tabelul 1 Corelaia dintre temperatur (C) i presiune (atm.) (dup Constantinescu, 1974) C atm. 108 116 120 121 122 127 0,34 0,67 0,96 1,01 1,28 1,35

Controlul sterilizrii n autoclav se face cu un indicator bacterian sau cu un indicator chimic. Lampa cu radiaii ultraviolete. Dezinfecia prin radiaii ultraviolete (UV) este indicat pentru boxe de nsmnare (la microbiologie), sli de aplicare a unor tratamente etc. (Mgureanu i colab., 1988). Din cauza puterii reduse de ptrundere, radiaiile UV sunt folosite pentru dezinfecia aerului n spaii relativ mici i a unor suprafee netede. Pentru sterilizarea ncperii, se aprinde lampa i se las s funcioneze 2 ore, nainte de nceperea lucrului n boxa de nsmnare. Sticlrie de laborator Pentru realizarea experienelor, n laboratorul de fitopatologie se folosesc diferite vase de sticl: eprubete, tuburi Roux, flacoane Erlenmeyer, vase (plci, cutii) Petri. De asemenea, n laborator se mai folosesc pipete gradate, lame de sticl, lamele etc. Pentru desfurarea activitii n condiii optime, trebuie s existe i s fie folosit sticlrie de laborator adecvat i steril. Orice resturi de 10

substane sau impuriti pe pereii sticlriei pot denatura rezultatele experimentale. Splarea vaselor de laborator, atunci cnd nu apar situaii speciale, se realizeaz cu parcurgerea etapelor: splare cu amestec cromic; splare cu ap i detergent; cltire cu ap; cltire cu ap distilat sau alcool etilic; uscare n etuv sau cu curent de aer. Pentru splare, se folosesc ap cldu, cu adaos de carbonat de sodiu 1-2% sau detergent i perii adecvate pentru instrumente i sticlrie. Tubulatura de cauciuc se spal prin brasaj (Mgureanu i colab., 1988). Vasele de laborator (eprubete, cutii Petri etc.) care conin microorganisme se sterilizeaz la autoclav, nainte de splare. Instrumentar de laborator Pentru desfurarea activitii ntr-un laborator de fitopatologie, trebuie s existe un instrumentar de strict necesitate. Astfel, acesta include: ace i anse de nsmnat, bisturiu, spatule, pensete etc. Cercetarea microorganismelor fitopatogene necesit aproape ntotdeauna cultivarea lor n condiii de laborator, pe medii de cultur sau pe alte materiale. Pentru realizarea unei activiti eficiente n laboratorul de fitopatologie, este necesar o dotare corespunztoare a acestora, dar i personal de specialitate bine instruit. 2. Metode de apreciere a atacului i a pagubelor produse de agenii fitopatogeni n procesele de infecie i de manifestare a simptomelor bolii la plante, se disting dou momente principale: atacul i dauna (paguba). Atacul este reprezentat valoric prin frecven, intensitate i grad de atac (Oroian, 2004). Frecvena (F) atacului este valoarea relativ a numrului (n) de plante sau organe ale plantei atacate de un agent fitopatogen (virus, bacterie, ciuperc) raportate la numrul (N) de plante sau organe observate. Valoarea frecvenei se obine prin observaii directe asupra unui numr de plante sau organe. Datele obinute se calculeaz dup relaia: F = nx100/N Intensitatea (I) atacului reprezint valoarea prin care este dat gradul de acoperire sau de extindere a atacului, raportnd suprafaa atacat fa de suprafaa total observat. Pentru redarea intensitii atacului se 11

folosesc scri ce pot avea un numr diferit de clase de notare. n majoritatea cazurilor, n ara noastr se folosete scara cu 4, 5 sau 6 clase de intensiti ale atacului. Aceste clase corespund unor anumite intervale de procente ale intensitii atacului (Tab. 2). Expresia relativ a intensitii atacului este dat de relaia: I = (ixf)/n, n care: i =nota sau suprafaa atacat (%); f= numrul de cazuri cu atac la fiecare not; n= numrul total de cazuri cu atac. Tabelul 2 Scara de notare a intensitii atacului la bolile plantelor Suprafaa atacat (%) 1-3 4-10 11-25 26-50 51-75 76-100 Nota intensitii atacului 1 2 3 4 5 6

Spre exemplu, dac ntr-o observaie avem urmtoarele cazuri: 74 cazuri cu 3% = nota 1 23 cazuri cu 10% = nota 2 18 cazuri cu 25% = nota 3 14 cazuri cu 50% = nota 4 13 cazuri cu 75% = nota 5 11 cazuri cu 100% = nota 6 I=(ixf)/n=(3x74)+(10x23)+(25x18)+(50x14)+(75x13)+(100x11)/153= 3675/153=24,04% Gradul de atac (GA) este expresia extinderii gravitii atacului culturii sau numrul total de plante la care efectum observaiile. Expresia valoric a acestuia este dat de relaia:
GA=FxI/100

Dauna sau paguba este exprimat prin noiunea grad de dunare (GD). Aceasta reprezint valoric pierderea relativ a cantitii de recolt la o plant sau cultur atacat n raport cu recolta obinut de la o plant sau cultur neatacat (sntoas). Dauna este redat prin relaia: 12

GD= (s-b/s)x100=(1-b/s)x100 , n care s=producia plantei sau culturii sntoase; b=producia plantei sau culturii bolnave. Presupunnd c la o parcel cu vi de vie, producia a fost de 8000 kg la hectar, pe o suprafa fr atac, iar la alt suprafa atacat numai de 3000 kg, gradul de dunare este: GD=(1-3000/8000)x100=62,5% Pragul economic de dunare (PED). Prin prag economic de dunare se nelege nivelul de atac al agenilor patogeni, respectiv valoarea pagubelor din recolt, la care trebuie aplicat tratamentul (Tab. 3). Tabelul 3 Pragul economic de dunare (PED) al unor ageni fitopatogeni la care se aplic tratamente de avertizare Planta cultivat Triticum spp. Fenofaza plantei nflorire Coacere n lapte Maturitatea cariopselor Formarea fructului (atac pe tiulei) Apariia mtsii Maturitate nflorire Creterea n greutate a rdcinilor Agentul patogen Puccinia striiformis Puccinia recondita Puccinia graminis Ustilago maydis Helminthosporium turcicum Piricularia oryzae Sclerotinia sclerotiorum Cercospora beticola Peronospora schachtii PED (paguba, % din recolt) 2,5 3,0 1,0 5,0 2,5 1,0 5,0 1,0 2,0

Zea mays

Oryza sativa Helianthus annuus Beta vulgaris

Conform cu PED, agentul fitopatogen a produs deja pagube (de 15%) recoltelor, egale cu costul tratamentelor i se prognozeaz condiii favorabile ce pot imprima bolii un caracter epidemic (Oroian, 2004). Valoarea pagubei din recolt, la care trebuie avertizate tratamentele chimice, este cuprins ntre 1-5%. Aceasta este diferit, ntre limitele men13

ionate, n funcie de planta cultivat, fenofaza dezvoltrii ei i agentul patogen (Tab. 3). Eficacitatea tratamentelor. n aprecierea msurilor de combatere a bolilor la plante, o importan practic deosebit prezint cunoaterea eficacitii tratamentelor. Eficacitatea (E) tratamentelor se calculeaz dup relaia: E = 1- Gav/GAMtx100 E = eficacitatea; Gav = grad de atac la varianta tratat; GAMt = grad de atac la martor netratat. Determinarea frecvenei, intensitii i a gradului de atac are o importan deosebit n evaluarea pagubelor produse, n estimri de producie pe parcursul vegetaiei, n stabilirea ritmului de aplicare a tratamentelor, precum i n stabilirea eficacitii diferitelor metode i mijloace de protecie a culturilor mpotriva agenilor fitopatogeni (Rdulescu i Rafail, 1967). 3. Msuri i metode de combatere a bolilor la plante n combaterea bolilor (viroze, bacterioze, micoze, antofitoze) la plante, se folosesc diferite msuri: agrofitotehnice, fizico-mecanice, chimice, biologice, legislative (de carantin fitosanitar), de prognoz i avertizare (Oroian i Oltean, 2003). Msurile de combatere a agenilor fitopatogeni pot fi preventive (profilactice) i curative (terapeutice). Aplicarea msurilor de protecie a plantelor se realizeaz pe mai multe ci numite metode. Pentru aplicarea unei msuri de combatere pot exista una sau mai multe metode. 3.1. Msuri agrofitotehnice Aceste msuri sunt cele mai vechi i n acelai timp cele mai eficace, n ceea ce privete prevenirea bolilor la plante. Ele mai sunt cunoscute sub denumirea de msuri culturale sau msuri de igiena plantelor. Prin aceste msuri (alegerea terenului de cultur, pregtirea terenului, distrugerea samulastrei, rotaia culturilor, cultivarea de soiuri rezistente, folosirea de smn sntoas etc.) se creeaz condiii nefavorabile dezvoltrii agenilor fitopatogeni i se mrete rezistena plantelor fa de boli (Prvu, 1996).

14

3.2. Msuri fizico-mecanice n general, msurile fizico-mecanice sunt simple i eficace. Aceste msuri au aplicare restrns, dar sunt de perspectiv, fiind nepoluante. n vederea combaterii paraziilor vegetali, se folosesc ca ageni fizici: temperatura, lumina solar i radiaiile. Temperatura Temperatura ridicat cldura este folosit la dezinfectarea solului i a seminelor. Prin aceast metod se distrug prin ardere plantele bolnave i resturile de plante rmase pe cmp dup recoltare, se devirozeaz butaii i materialul sditor. Dezinfectarea termic a solului. Prin aceasta se obin rezultate bune n combaterea ciupercilor i bacteriilor fitopatogene termosensibile. Durata tratamentului termic i valoarea temperaturii difer n funcie de punctul termic de inactivare a agentului patogen. n dezinfectarea termic a solului sunt folosite mai multe metode. Sterilizarea prin cldur uscat a terenului de cultur a plantelor n cmp. Aceast metod nu are posibiliti mari de aplicare. n aceast categorie, poate intra vechea practic de ardere a resturilor vegetale, dup recoltare. Sterilizarea prin cldur uscat a solului din sere. Este o metod simpl i se aplic uor n practic. Se folosete pentru dezinfectarea cantitilor mici de pmnt necesare n rsadnie i sere. Sterilizarea se face prin nclzirea pmntului (la peste 80C) pe foi de tabl. Sterilizarea prin cldur umed. Aceast metod se folosete la dezinfectarea ghivecelor, a utilajelor mici, care se introduc timp de 5-10 minute n ap clocotit. Pentru suprafee mici de rsadnie i sere se poate aplica oprirea solului prin turnare de ap clocotit (10 l/m2). nainte de a se realiza dezinfecia termic, se sap solul pe o adncime de 30-40 cm, se scot rdcinile sau alte resturi de plant i se mrunesc bulgrii de pmnt, pn la dimensiuni de 5-6 cm. Totodat, se dezinfecteaz chimic scheletul intern al serei. Sterilizarea prin aburi. Aceast metod se aplic pentru dezinfectarea unor cantiti mici de pmnt sau pentru solul de la locul definitiv (rsadnie, sere). n timpul sterilizrii, aburii circul n pmnt pn la cel puin 30-40 cm adncime, timp de 60 minute. Temperatura solului, n timpul tratamentului, este de 75-80C. La tratarea pe cale termic, n special cnd se folosete metoda sterilizrii prin aburi, trebuie s se in seama de faptul c, n afar de 15

agenii fitopatogeni, sunt distruse i o serie de microorganisme folositoare din sol. De aceea, plantarea pmntului se face dup 15 zile de la sterilizare, perioad de timp n care se reface microflora util. Dezinfectarea termic a seminelor. Prin intermediul tratamentului termic se pot combate agenii patogeni care se transmit prin smn. Pentru tratarea termic a seminelor se folosesc diferite metode: metoda tratrii cu ap cald, metoda tratrii cu cldur (aer) uscat etc. Durata tratamentului termic difer n funcie de specia patogen i metoda de dezinfecie folosit. Este necesar ca tratamentul termic s fie realizat n ntreprinderi specializate, deoarece exist diferene mici de valoare, ntre temperatura de inactivare a agenilor patogeni i cea care distruge embrionul seminei. Lumina solar n combaterea unor ageni patogeni se folosete lumina solar (helioterapia). Tuberculii de cartof expui la soare timp de 3-4 zile se clorofilizeaz i sunt mai rezisteni fa de agenii patogeni (Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum etc.), care produc putregaiuri n depozite. Radiaiile Diferite radiaii (gamma, beta, infraroii, ultraviolete) au fost experimentate cu succes n combaterea agenilor patogeni. Aceste radiaii inactiveaz i distrug o serie de ageni patogeni (virusuri, bacterii i ciuperci). Mijloacele mecanice Pentru nlturarea unor parazii de pe suprafaa plantelor i ndeprtarea organelor vegetative bolnave se folosesc mijloace mecanice. Aceast msur de combatere se poate realiza prin metode diferite: extirparea, curirea trunchiurilor, decuscutarea, sortarea plantelor sntoase de exemplarele bolnave etc. Electricitatea Ca i alte surse de nclzire, electricitatea poate fi folosit la sterilizarea solului prin nclzire direct sau prin nclzire indirect.

16

Metoda sterilizrii prin nclzire indirect a solului sau prin imersiune se aplic n instalaii speciale de forma unor cutii, n care se introduce pmntul de sterilizat. Metoda sterilizrii prin nclzirea direct a solului, cu ajutorul electricitii, se bazeaz pe principiul trecerii curentului direct prin sol. n timpul sterilizrii, temperatura pmntului care se pune n instalaii speciale ajunge la 70C i dureaz 30 minute (Popescu, 1993). Mijloacele electronice Aparatele electronice se folosesc pentru elaborarea avertizrilor, sortarea seminelor i n efectuarea tratamentelor chimice etc. Unele aparate electronice servesc la separarea seminelor necorespunztoare de cele sntoase, pe baza diferenei de culoare. Tot cu ajutorul aparatelor electronice, poate fi dirijat soluia fitofarmaceutic numai asupra plantelor pe care vrem s le tratm (Popescu, 1993). 3.3. Msuri chimice Combaterea chimic constituie i n prezent un mijloc important pe care practica agricol l are la dispoziie pentru reducerea pagubelor produse de agenii fitopatogeni. Astfel, n combaterea speciilor Plasmopara viticola, Phytophthora infestans, Tilletia spp. i altele, trebuie s se aplice tratamente chimice, fr de care nu se poate garanta producia plantelor cultivate. 3.3.1. Noiuni generale despre produsele farmaceutice folosite n protecia plantelor Msurile chimice se bazeaz pe folosirea unor substane toxice pentru paraziii vegetali. Produsele chimice preparate pe baza acestor substane active se numesc produse antiparazitare i fac parte din categoria produselor fitofarmaceutice. Clasificarea produselor fitofarmaceutice se face dup mai multe criterii. Dup agentul patogen de combtut (virusuri, bacterii, ciuperci), se clasific n virusocide (produse antivirale), bactericide i fungicide. n funcie de locul unde acioneaz, aceste produse sunt exoterapeutice (de suprafa, de contact) i endoterapeutice (sistemice). Dup natura lor chimic, substanele i produsele fitofarmaceutice sunt anorganice i organice. Dintre produsele fitofarmaceutice anorganice utilizate n protecia plantelor menionm: produse pe baz de cupru 17

(Zeam bordelez, Champion 50 WP, Kocide 101, Oxicig 50 PU etc.), produse pe baz de sulf (Polisulfur de calciu, Kumulus S, Sulfomat PU, Microthiol, Thiovit etc.). Dintre numeroasele produse organice fitofarmaceutice menionm: Dithane M45 (mancozeb 80%), Polyram combi (metiram 80%), Benlate 50 WP (benomil 50%), Topsin 70 PU (metil tiofanat 70%), Sumilex 50 PU (procimidon 50%), Anvil 5 SC (hexaconazol 50g/l), Systhane 12,5 CE (miclobutanil 125g/l), Tilt 250 CE (propiconazol 250 g/l), Curzate super C (cimoxanil 4,5%+ mancozeb 68%) etc. De la aplicarea ultimului tratament pn la darea n consum a produselor vegetale tratate, este necesar s treac o perioad de timp n care produsul fitofarmaceutic folosit se degradeaz i devine netoxic pentru consumator. Aceast perioad de timp se numete timp de pauz. Pentru fiecare produs fitofarmaceutic folosit n protecia plantelor este stabilit o toleran limita maxim admisibil (LMA). Aceasta (LMA) se stabilete pentru ca produsele agricole tratate s poat fi consumate, fr a fi afectat sntatea consumatorilor. LMA se exprim n pri per milion (ppm) i este de 100 ori mai mic dect concentraiile sau dozele care, administrate n hrana animalelor de experien, le produc primele tulburri (Baicu i esan, 1996). Respectarea timpilor de pauz, n mod normal asigur i respectarea limitelor maxime admisibile pentru produsele fitosanitare (Baicu i esan, 1996). La aplicarea tratamentelor chimice se ine cont de remanena reziduurilor de pesticide, de timpul de pauz i de limita maxim admisibil (LMA). 3.3.2. Metode de aplicare in vivo a produselor fitofarmaceutice Produsele fitofarmaceutice se folosesc n practic pentru tratarea seminelor, a tuberculilor, bulbilor i rizomilor la plante. De asemenea, aceste produse se aplic pe plante n timpul perioadei de vegetaie. Unele produse fitofarmaceutice se folosesc pentru dezinfectarea solului pe cale chimic. 3.3.2.1. Metode de tratare a seminelor Tratarea pe cale chimic d rezultate bune, n practic, n combaterea agenilor patogeni localizai pe smn sau n aceasta. n funcie de substana activ a produsului folosit, de seminele de tratat, de biologia

18

agenilor fitopatogeni i altele, tratarea sau dezinfectarea chimic a seminelor se face prin mai multe metode. Metoda tratrii uscate (prin prfuire). Aceast metod const n acoperirea seminelor cu produse fitofarmaceutice, sub form de pulberi, care ader pe suprafaa tegumentului seminal. n practic, o importan deosebit pentru dezinfectarea seminelor prezint produsele sistemice. Acestea protejeaz embrionul i plantulele tinere de aciunea agenilor fitopatogeni localizai n smn. Metoda tratrii umede. Metoda se bazeaz pe folosirea de produse fitofarmaceutice, sub form de soluii sau suspensii, n care se introduc seminele de tratat. Aceast metod prezint avantajul unei economii de substan activ i al unei dezinfectri complete. Tratarea pe cale umed se recomand n zonele aride, cu solul uscat n momentul semnatului. Metoda tratrii prin mocirlire. Aceast metod este folosit pentru a realiza pe suprafaa seminelor un strat mai consistent de produs. Produsul fitofarmaceutic se prezint sub form de suspensie dens ntr-o cantitate mic de ap i se amestec cu smna (andru, 1996). 3.3.2.2. Metode de tratare a tuberculilor, bulbilor i rizomilor Aceste metode de tratare se aplic frecvent la plantele horticole, pentru dezinfectarea chimic a tuberculilor, bulbilor i rizomilor. n funcie de produsul utilizat, tratamentele chimice se aplic pe cale umed sau prin prfuire. 3.3.2.3. Metode de dezinfectare chimic a solului Dezinfectarea solului pe cale chimic are drept scop distrugerea agenilor fitopatogeni (bacterii, ciuperci), insectelor, nematozilor etc. care atac plantele. Tratamentele chimice se aplic cu precdere solului din sere i rsadnie, dar i n cmpul de cultur al plantelor horticole. Dezinfectarea chimic a solului se realizeaz prin metoda tratrii umede i metoda tratrii uscate (prin prfuire). Tratarea solului pe cale umed. Aceast metod se bazeaz pe stropirea solului cu o soluie sau o suspensie a produsului fitofarmaceutic, pn la o adncime de 20 cm. n tratarea solului din sere i rsadnie se folosete frecvent Formalin 1,0 %. Pentru dezinfectarea solului se folosesc 10 l soluie (de Formalin 1,0 %)/m2, apoi se acoper pmntul tratat timp de 2-3 zile pentru sudaie. nsmnarea solului se face dup cel puin 12-15 zile, de la aplicarea tratamentului (andru, 1996). 19

nainte sau dup semnat, pmntul din rsadni poate fi dezinfectat cu Previcur N. Pentru dezinfectarea solului, se folosesc 2-3 l soluie de Previcur N 0,25%/m2 (andru, 1996). Tratarea solului pe cale uscat. Prin aceast metod, se realizeaz dezinfectarea chimic a solului, folosindu-se produs fitofarmaceutic sub form de pulbere. Produsul fitofarmaceutic este ncorporat n sol prin spare, pn la o adncime de 20 cm sau prin amestecarea pmntului prin loptare. De exemplu, pentru dezinfectarea solului prin prfuire, se folosete Basamid 200 g/m3 de pmnt sau 20-50 g/m2. Acest produs este eficient mpotriva ciupercilor fitopatogene tericole i nematozilor la plante. Dup aplicarea tratamentului chimic, timpul de ateptare, pn la folosirea amestecului de pmnt, este de 10-30 zile, n funcie de temperatura solului. Timpul de ateptare crete, la temperaturi mai sczute de 15-20C (andru, 1996). 3.3.2.4. Metode de tratare a plantelor n timpul perioadei de vegetaie Aplicarea produselor fitofarmaceutice pe plante se realizeaz prin diferite metode. Metoda tratrii umede. Aceast metod const n aplicarea produselor fitofarmaceutice sub form lichid (soluie, suspensie, emulsie) i poate fi realizat, n practic, sub diferite forme: stropit, pulverizare, cea toxic. Metoda tratrii prin prfuire. Aplicarea produselor fitofarmaceutice pe plante, prin prfuiri, asigur o mai bun ptrundere a pulberii n interiorul vegetaiei stufoase. De asemenea, aceast metod asigur o distribuire mai uniform a particulelor pe suprafaa tratat. 3.3.3. Testarea aciunii in vitro a produselor fitofarmaceutice Pentru testarea aciunii in vitro, a produselor farmaceutice asupra agenilor fitopatogeni, se folosesc diferite metode. Metoda includerii produsului n mediul de cultur Prin aceast metod se testeaz aciunea in vitro a produselor fitofarmaceutice asupra agentului fitopatogen (bacterie, ciuperc) cultivat pe mediu de cultur. Pentru fiecare produs testat se realizeaz mai multe concentraii. La fiecare concentraie a produsului fitofarmaceutic, se fac mai multe repetiii. Pentru cultivarea speciilor studiate se folosesc medii

20

nutritive solidificate (mal-agar, cartof-dextroz-agar, Czapek-agar etc.) sau lichide. n cazul folosirii unui mediu ce se solidific, acesta se distribuie, dup includerea produsului fitofarmaceutic, cel mai frecvent n vase Petri. Inoculul speciei pe care o cercetm se plaseaz cu acul de nsmnare n mijlocul vasului Petri (metoda nsmnrii n punct central). Periodic, la intervale egale de timp, se fac observaii asupra mrimii, aspectului coloniei pe suprafaa mediului, sporulaiei, dac este cazul, comparativ cu martorul, fr produs fitofarmaceutic. Rezultatele obinute se interpreteaz statistic (testul student, ANOVA etc.). Pe baza rezultatelor obinute se stabilete concentraia limit de toxicitate i concentraia letal a produsului fitofarmaceutic asupra speciei studiate. Metoda includerii n mediul de cultur se poate folosi i pentru testarea aciunii in vitro a altor produse (antibiotice, extracte vegetale etc.) asupra agenilor fitopatogeni. 3.4. Msuri biologice Combaterea biologic a agenilor fitopatogeni se realizeaz prin hiperparazitism, antagonism microbian, imunizarea plantelor i altele. Hiperparazitismul. Combaterea agenilor fitopatogeni cu ajutorul paraziilor naturali (bacteriofagi, ciuperci), denumii hiperparazii, a dat rezultate bune i prezint perspective de extindere n practic. Cele mai cunoscute cazuri de hiperparazitism sunt micoparazitismul i bacteriofagia. Micoparazitismul este un fenomen biologic ntlnit frecvent n natur. Ciupercile hiperparazite au o virulen pronunat i inhib dezvoltarea, reproducerea i rspndirea speciilor fungice pe seama crora se dezvolt. De exemplu, Trichoderma viride reprezint principala specie micoparazit i antagonist, folosit ca mijloc de prevenire i combatere biologic a diferitelor specii de ciuperci fitopatogene. Coniothyrium minitans este un hiperparazit al fungilor (Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis spp.) formatori de scleroi. Bacteriofagia este un fenomen biologic care se bazeaz pe distrugerea unor bacterii fitopatogene de ctre virusuri denumite bacteriofagi. Antagonismul microbian. ntre diferite microorganisme (bacterii, ciuperci) din natur exist relaii antagoniste. Aceste relaii au la baz concurena sau anabioza. S-a constatat c pentru fiecare agent patogen exist microorganisme antagoniste. Antagonismul microbian este utilizat n practic, pentru combaterea unor ageni patogeni.

21

Studierea relaiilor (micoparazitismul, antagonismul microbian etc.) ntre diferite specii de microorganisme, care se pot cultiva pe medii nutritive, se realizeaz prin metoda culturilor duble. Aceast metod const n nsmnarea n acelai vas Petri cu mediu nutritiv agarizat a cte dou specii ale cror interrelaii sunt observate in vitro. Antibioticele. Acestea sunt produi ai metabolismului unor microorganisme care distrug selectiv sau mpiedic multiplicarea altor organisme patogene. n combaterea agenilor fitopatogeni, s-au experimentat i s-au folosit n practic, pe scar mic, numai cteva antibiotice, datorit costului foarte ridicat al acestor tratamente (Prvu, 1996). 3.5. Msuri de carantin fitosanitar Carantina fitosanitar reprezint un ansamblu de msuri care se iau pentru a preveni rspndirea paraziilor vegetali, duntorilor i buruienilor (obiectelor de carantin), deosebit de periculoi, dintr-o ar n alta sau dintr-o regiune n alta. Carantina fitosanitar este de dou tipuri: extern i intern. 3.6. Msuri de prognoz i avertizare Un rol important n prevenirea i combaterea bolilor la plante au msurile de prognoz i avertizare. Prin prognoz se nelege stabilirea anticipat a datei apariiei n mas a agenilor fitopatogeni, n anumite perioade de timp i pe anumite teritorii, precum i estimarea gravitii atacurilor pe care le pot produce. Avertizarea const n determinarea momentului optim de aplicare a tratamentelor, a metodelor i mijloacelor eficace pentru combatere, n funcie de biologia agentului patogen, fenofaza plantei gazd i condiiile climatice locale. 4. Metode i tehnici de lucru n studiul virusurilor fitopatogene Pentru studierea virusurilor fitopatogene, se folosesc diferite metode. Dintre acestea, n continuare vor fi prezentate cteva metode uzuale folosite n virologia vegetal. 4.1. Metode de determinare a caracteristicilor biologice Virusurile fitopatogene prezint o serie de caracteristici biologice care pot fi determinate n laborator. 22

Determinarea rezistenei in vitro Pentru determinarea rezistenei in vitro se folosete suc vegetal brut care conine virus sau preparat viral purificat. Rezistena virusului n sucul vegetal se testeaz, de obicei, la temperatura camerei. Pentru aceasta, se determin imediat infectivitatea inoculului proaspt preparat, precum i la diferite intervale de timp de la preparare. Determinarea infectivitii se realizeaz prin infecii mecanice pe plante test sensibile. n timpul testrii, inoculul este inut la temperatura camerei. Cu timpul, infectivitatea scade, pn ce dispare. Se noteaz limita de timp la care inoculul nc mai pstreaz infectivitatea. Determinarea punctului de inactivare termic Pentru determinarea punctului de inactivare termic, se nclzete inoculul viral la diferite temperaturi, o perioad de timp (1 minut, 5 minute sau cel mai frecvent 10 minute). Se noteaz prima valoare de temperatur la care, nclzind inoculul, acesta i pierde infectivitatea dup 10 minute. Determinarea infectivitii se face prin metoda infeciilor mecanice pe plante test sensibile. Determinarea rezistenei la pH Se modific pH-ul suspensiei de inocul viral, pn ce se constat pierderea infectivitii. Se noteaz valoarea acelui pH. 4.2. Metode de identificare a infeciilor virotice la plante Identificarea infeciilor cu virusuri la plante prezint importan teoretic, dar mai ales practic. Pentru identificarea infeciilor virotice se folosesc diferite metode, dintre care vom prezenta cteva (observaia vizual, tehnici serologice, microscopia imunoelectronic). 4.2.1. Observaia vizual Aceast metod de identificare a infeciilor virotice la plante este cea mai expeditiv, dar i cea mai puin sigur. Metoda se bazeaz pe observarea simptomelor (reducerea taliei, tumori, scurtarea internodiilor, 23

ptri foliare etc.) evideniate de plantele infectate. Observaia vizual a virozelor prezint anumite limite. Astfel, prin aceasta nu se stabilete cu certitudine virusul sau virusurile care au produs infecia. De asemenea, se tie c simptomele produse de virusuri difer n funcie de planta gazd i de condiiile de cretere a acestora. De exemplu, Plum pox virus determin de multe ori infecii latente la prun. 4.2.2. Tehnici serologice Tehnicile serologice sunt foarte precise, dau rezultate rapide, sunt laborioase i permit efectuarea unui numr foarte mare de teste. Cele mai multe dintre ele au fost preluate din medicina uman i au fost adaptate pentru studiul virusurilor fitopatogene. Reacia serologic are la baz contactul dintre suspensia viral i antiserul specific. Evidenierea reaciei specifice dintre antigen i antiser se realizeaz prin diferite teste, precum testul de floculare, testul de difuzie n gel, testul ELISA etc. Testul de floculare Cnd particulele virale interacioneaz cu anticorpii specifici, n mediu lichid, formeaz combinaii care precipit. Aceste precipitate pot fi observate n tuburi (testul tub) sau n picturi plasate pe suprafee netede (testul de microprecipitare). Testul de microprecipitare se utilizeaz, n principal, pentru diagnoza virusurilor alungite. De obicei, se folosete sucul plantei purificat prin centrifugare i aezat n vase Petri, sub form de picturi. Testul ELISA Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este un test imunologic foarte sensibil al crui principiu se bazeaz pe interaciunea antigen-anticorp. Aceast tehnic a fost introdus n virologia vegetal n anul 1976 (Clark i Adams, 1977). Spre deosebire de testele de difuzie n gel i de floculare, ELISA permite detectarea virusurilor care se gsesc n concentraie foarte mic n plante i chiar direct din vectorii lor. Datorit sensibilitii ridicate a testului, virusurile se pot evidenia naintea manifestrii simptomelor. Testul ELISA utilizeaz o metod de dozare imunoenzimatic de tip double antibody sandwich(DAS), n care anticorpi specifici sunt cuplai direct cu o enzim (fosfataz alcalin). Antigenul (A) este capturat pe faza solid, de ctre anticorpii (IgG) fixai anterior. n urmtoarea etap, 24

anticorpii cuplai cu fosfataza alcalin vin i se leag pe antigen. n final, hidroliza substratului (p-nitrofenilfosfat) de ctre enzim duce la obinerea unei coloraii galbene a crei intensitate poate fi msurat fotometric prin citirea densitii optice la 405 nm (valoarea absorbiei). Testul ELISA este folosit pentru detectarea a numeroase virusuri la plante (Clark i Adams, 1977; Flegg i Clark, 1979 etc.). Microscopia imunoelectronic Microscopia imunoelectronic (IEM) este o tehnic recent (Derrick, 1973) care permite vizualizarea reaciei serologice (antigenanticorp) la microscopul electronic. Are mare precizie i prezint dou mari avantaje: consumul de antiser este extrem de redus, iar antigenul poate fi folosit direct din extract vegetal brut. 4.3. Metode de obinere a unor plante libere de virus n combaterea virusurilor fitopatogene, s-au experimentat mai multe metode (termoterapia, chimioterapia, culturile meristematice, radioterapia etc.). Prin acestea, s-a urmrit obinerea de plante libere de virus. Termoterapia Inactivarea termic (termoterapia) este metoda cea mai folosit pentru combaterea in vivo a virusurilor fitopatogene din plante. Pentru combatere, se folosesc ap i aer cald. n cazul utilizrii apei, temperaturile oscileaz n jurul a 40C, iar timpul de expunere este scurt (cteva minute sau ore.). Cnd se folosete aerul cald, temperaturile pot fi de 35-40C, cu timp lung de expunere. n ara noastr, termoterapia cu aer cald a fost folosit cu succes n combaterea unor virusuri fitopatogene la via de vie, cpun, pomi fructiferi. Aceast metod se aplic numai n institute dotate cu camere termostat pentru termoterapie. Chimioterapia n literatura de specialitate sunt menionate numeroase substane (antibiotice, vitamine i altele) care inhib activitatea virusurilor fitopatogene i determin dispariia simptomelor de boal. n practic ns, combaterea virusurilor fitopatogene prin chimioterapie nu se aplic, deoarece aceste tratamente sunt costisitoare, iar rezultatele obinute sunt limitate.

25

5. Metode i tehnici de lucru n studiul bacteriilor fitopatogene 5.1. Metode de cercetare a bacteriozelor Diagnosticul unei boli bacteriene prezint mai multe etape: examinarea direct a simptomelor, izolarea bacteriei n stare pur, examenul microscopic al celulelor, determinarea caracterelor morfologice, fiziologice i biochimice etc. 5.1.1. Examinarea direct a materialului vegetal Materialul vegetal atacat de bacteriile patogene este colectat de specialiti i este expediat la laboratorul de bacteriologie. Numai pe materiale vegetale proaspete se pot face investigaii. Persoanele care execut examinarea direct a materialului vegetal trebuie s ia n considerare toate detaliile tabloului simptomatologic. n acest sens, este indicat ca examinarea direct s se realizeze cu ajutorul unui stereomicroscop. n cazul examinrii fructelor, tulpinilor, rdcinilor etc., atacate de bacterioze, se impune cu necesitate efectuarea de seciuni, prin aceste organe, pentru a forma o imagine clar a tabloului simptomatologic. La plantele care prezint ofiliri, se examineaz n mod obligatoriu, vasele conductoare din organe (rdcin, tulpin etc.), secionate la diferite nivele (Severin i colab., 1985). 5.1.2. Izolarea bacteriilor fitopatogene Izolarea bacteriilor din plantele atacate este obligatorie, deoarece, de cele mai multe ori, aceleai simptome (ptri, putregaiuri, ofiliri etc.) pot fi provocate de mai multe specii patogene. 5.1.2.1. Izolarea bacteriilor din organe vegetative Izolarea bacteriilor fitopatogene se face mai uor din probe proaspt recoltate i din esuturi n primele stadii de infectare. Dezinfectarea suprafeei organelor respective trebuie fcut cu mare atenie, pentru a nu distruge nsui agentul patogen. esuturile vegetale verzi se dezinfecteaz 1 minut cu hipoclorit de sodiu 5,0 % sau cloramin 1,0 %, dup care se spal bine cu ap distilat. n unele cazuri, este suficient doar splarea suprafeei organului vegetal cu ap de robinet i apoi cu ap steril.

26

Izolarea bacteriei patogene din organele vegetale care sunt ntr-un stadiu avansat de degradare este destul de anevoioas, datorit numeroilor infectani care au invadat esuturile (Severin i colab., 1985). Astfel de situaii se ntlnesc n cazul izolrii i purificrii bacteriei patogene Erwinia carotovora pv. atroseptica care produce putregaiul moale al tuberculilor de cartof. n acest caz, pentru izolarea bacteriei patogene, se folosete un tubercul de cartof sntos. Acesta se spal cu ap, se dezinfecteaz suprafaa cu alcool etilic 70% i se flambeaz cteva secunde. Astfel pregtit, tuberculul sntos se secioneaz cu un cuit steril. Pe suprafaa seciunii proaspete, se aaz o poriune mic de esut infectat al unui tubercul cu putregai moale, din care dorim s izolm bacteria patogen. Tuberculul sntos inoculat se introduce ntr-o plac Petri, cptuit cu hrtie de filtru umed. Se incubeaz la 26-28C, timp de 2-3 zile. Dup incubare, esutul sntos al tuberculului prezint o leziune, datorit infectrii cu bacteria fitopatogen din esutul bolnav. Din leziunea proaspt, se izoleaz bacteria patogen i se studiaz la microscop. De asemenea, se poate nsmna pe medii de cultur. Din plantele lemnoase, bacteriile patogene care produc infecii sistemice (Agrobacterium tumefaciens la via de vie, Xanthomonas campestris pv. juglandis la nuc etc.) pot fi izolate din lichidul de lcrimare. Pentru aceasta, n perioada cnd lcrimarea este mai intens (primvara la via de vie, primvara i toamna la nuc etc.), se dezinfecteaz suprafaa unei coarde sau a unei ramuri, se taie cu un instrument steril i se introduce ntr-o eprubet steril. Locul rmas gol, ntre gura eprubetei i ramur, se umple cu vat steril. Eprubeta se fixeaz pe ramur cu ajutorul unui dispozitiv. Dup colectarea a cca. 20 ml lichid de lcrimare, se centrifugheaz la 10 000 turaii/minut, iar sedimentul se nsmneaz pe mediu de cultur. 5.1.2.2. Izolarea bacteriilor din semine Multe semine cu aspect sntos pot fi purttoare de bacterii patogene. Analiza seminei cu privire la infecia cu bacterii se realizeaz prin diferite metode: examinare macroscopic, metoda indirect sau cultural, metoda sugativei etc. Examinarea macroscopic Pentru examinarea macroscopic a seminelor se poate folosi stereomicroscopul. Cu ajutorul acestuia, se evideniaz pete mai mult sau mai puin caracteristice, determinate de bacterii patogene (Raicu i Baciu, 1978). 27

Metoda indirect sau cultural Seminele cu simptome evidente se nsmneaz n nisip steril, care se gsete n vase sau ldie, acoperite cu geam. Dup semnat, acestea se pstreaz la temperatura optim bacteriei respective (18-25C). Dup 5-8 zile, cnd s-au deschis complet cotiledoanele, pe acestea apar simptome de boal. Unele simptome sunt tipice bacteriozei urmrite, iar altele sunt atipice. De cele mai multe ori, observarea simptomelor de boal de pe cotiledoane nu este suficient. De aceea, trebuie efectuate analize suplimentare: executarea unui preparat microscopic, izolarea i cultivarea bacteriei patogene etc. Metoda cultural de analiz poate fi folosit n cazul bacteriozelor care produc arsuri la leguminoase, ptarea unghiular la castravei etc. Metoda sugativei Seminele se dezinfecteaz (Tab. 4) n prealabil, dup care se spal bine cu ap steril. Incubarea se realizeaz n vase Petri, pe sugativ umezit, timp de 1-2 zile, la temperatura de 25-30C. Dup incubare, seminele se analizeaz i se observ dac prezint exsudat bacterian pe suprafaa lor (Raicu i Baciu, 1978). n cazul formrii exsudatului, se ia cu ansa din acesta i se dilueaz ntr-o eprubet cu ap steril. Din aceast diluie se efectueaz preparate microscopice i/sau se nsmneaz prin epuizare de ans, pe mediu cu agar. Dup incubare (1-2 zile, la 25-30C), se face purificarea coloniilor bacteriene. 5.2. Cercetarea i identificarea bacteriilor pe medii de cultur Identificarea unei bacterii nu se poate face dect dup ce este izolat n cultur pur i este cultivat pe diferite medii nutritive. 5.2.1. Morfologia bacteriilor Bacteriile au diferite forme: de bastona (bacil), sferic (coc), de virgul (vibrion), form filamentoas ondulat (spiril), de filament ramificat etc. (Fig. 1). Forma coloniilor bacteriene este foarte diferit n funcie de specie i de tulpin (Florian, 2001; Muntean, 2009). Pentru stabilirea ct mai exact i complet a caracterelor de cultur, bacteriile se nsmneaz, pe medii solide i lichide. Pentru nregistrarea caracterelor creterii, examinarea culturilor bacteriene se face zilnic. 28

Fig.1. Morfologia bacteriilor: A. coci: a. coci (cu i fr flagel); b. stafilococi; c. i peritrih); B. cocobacili;C.bacili; D. vibrion; E. spiril*; F. filamente ramificate (cu i fr endospori); G. filamente**; (*tip Treponema; ** tip Beggiatoa). Morfologia coloniilor bacteriene pe medii solidificate Tehnica nsmnrii bacteriilor (Fig. 2) pe medii de cultur din eprubete i vase Petri este prezentat n diferite lucrri de specialitate. Dup nsmnarea bacteriei pure, prin tehnic adecvat, pe mediu nutritiv solidificat n vase Petri, se asigur incubarea la termostat. Dup incubare, pe baza observaiilor zilnice, se noteaz: momentul apariiei coloniilor, gradul de uniformitate, forma coloniilor, aspectul suprafeei, aspectul marginii, profilul, culoarea, mrimea etc. Informaiile despre caracterele coloniilor bacteriene obinute pe medii nutritive permit identificarea speciei cercetate (Gerhardt, 1981).

29

Fig. 2. Tehnica nsmnrii bacteriilor i ciupercilor pe medii solidificate: a. n vas Petri; b. n eprubet. 5.2.2. Medii uzuale pentru bacterii fitopatogene Bulionul de carne Acesta reprezint mediul de baz n bacteriologie. Este un mediu aproape universal pentru cultivarea multor grupe de bacterii. Prepararea lui se realizeaz n dou etape: prepararea maceratului de carne i prepararea bulionului propriu-zis. Prepararea maceratului de carne (zemii de carne). Se iau 500 g carne de vac sau cal, se cur de oase, tendoane, aponevroze, grsime i se taie n fragmente mici. Apoi, carnea se introduce ntr-o oal emailat i se adaug 1000 ml ap de robinet. Se ine 24 ore la rece pentru macerare, dup care se fierbe 30 minute. Dup fierbere i rcire, se filtreaz prin tifon, apoi prin hrtie de filtru sau vat. Filtratul obinut constituie zeama de carne. Acesta se completeaz cu ap la volumul iniial i se repartizeaz n baloane mari, splate i sterilizate, care se nchid cu dopuri de vat, nvelite n tifon. Sterilizarea se realizeaz la 120C, timp de 30 minute. Astfel pregtit, zeama de carne se poate pstra timp ndelungat la rece i ntuneric, servind la prepararea mediilor lichide i solide. Prepararea bulionului propriu-zis. La 1000 ml zeam de carne se adaug 10 g pepton i 5 g NaCl. Se amestec i se nclzete pn la dizolvarea complet a peptonei. Se las s se rceasc, apoi se determin 30

pH-ul i se ajusteaz la 7,5-7,8, cu ajutorul unei soluii de NaOH 10%. Apoi, mediul se autoclaveaz timp de 15 minute, la 120C, pentru precipitarea srurilor alcalino-pmntoase. Pentru ndeprtarea precipitatului i a resturilor de grsime, mediul se filtreaz prin hrtie de filtru, dup care se repartizeaz n baloane sau eprubete. Acestea se nchid cu dopuri de vat i se sterilizeaz n autoclav la 120C, timp de 30 minute. Mediul cu extract de porumb Acest mediu nlocuiete bulionul de carne, n cultivarea multor bacterii, mai ales a celor fitopatogene. Se prepar din : Ap distilat1000 ml Pepton. 5 g Extract de porumb 10 g Clorur de calciu.. 0,5 g Clorur de sodiu.. 5 g Agar 15-18 g Agarul se topete n ap i apoi se adaug peptona, extract de porumb i srurile indicate. Se amestec bine pentru uniformizarea soluiei, se filtreaz la cald i se ajusteaz pH-ul la 7,4 -7,5. Apoi, se distribuie n vase i se sterilizeaz 30 de minute la 1,2 atm. Mediile cu extract de carne i extract de porumb permit dezvoltarea a numeroase grupe de bacterii, ceea ce ngreuneaz purificarea culturii cercetate. Prezena n acest mediu a anumitor substane inhib dezvoltarea unor grupe de bacterii. Verdele malachit i cristalul violet inhib n mare parte dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive. Bicromatul de potasiu inhib dezvoltarea bacteriilor Gram-negative. Mediul Lieske Mediul este folosit pentru izolarea bacteriei Agrobacterium tumefaciens. Pentru prepararea mediului se folosesc: 1 litru ap, 20 g glicin, 5 g KNO 3 , 1g KH 2 PO 4 , 0,1 g MgSO 4 i 18 g agar. La acest mediu se adaug 10 ml soluie 1:400 rou de Congo. Se ajusteaz pH-ul la 7,2-7,4 i se sterilizeaz la 1 atm., timp de 20 minute. Mediul Hugh i Graham Este un mediu selectiv pentru Erwinia carotovora. Mediul se prepar din 1 litru ap, 10 g salicin, 5 g taurocolat de sodiu, 1 g NH 4 K 2 PO 4 , 31

0,2 MgSO 4 , 0,2 g KCl, 0,05 g albastru de bromtimol (se dizolv separat n ap) i 18-20 g agar. Se sterilizeaz 20 minute la 1 atm. (120C). Mediul cartof - dextroz - agar Acest mediu este foarte bun, pentru cultivarea bacteriilor. Se prepar precum mediul folosit pentru cultivarea ciupercilor. Trebuie ajustat ns la un pH=7,4 7,6. 5.3. Tehnici de colorare a bacteriilor Dintre tehnicile de colorare, pentru studiul bacteriilor fitopatogene se folosesc frecvent coloraia vital, coloraia simpl i coloraia Gram. 5.3.1. Coloraia vital Aceast metod folosete colorani netoxici sau foarte diluai, care nu omoar microorganismele, ci doar le coloreaz, fcndu-le mai uor vizibile. Pentru realizarea coloraiei vitale sunt necesare: cultur bacterian, colorant, lame i lamele, pipet Pasteur. Pentru colorarea celulelor bacteriene se pot folosi diferii colorani: rou neutru (0,5g/100 ml ap distilat), albastru de metilen (0,1g/100 ml ap distilat), albastru de Nil (0,1g/100 ml ap distilat) sau verde de metil (0,1g/100 ml ap distilat). Tehnica de lucru. Pe o lam de microscop se amestec o pictur din soluia de colorant, cu o pictur de suspensie bacterian. Se examineaz la microscop, ntre lam i lamel, cu obiectivul 40x. Interpretare. Celulele bacteriene apar mai colorate, n raport cu fondul preparatului. n cazul n care au flageli, celulele sunt mobile. Examinarea bacteriilor pe preparate fixate Pentru efectuarea unui preparat fixat cu bacterii care urmeaz a fi examinate, trebuie parcurse urmtoarele etape: etalonarea celulelor pe suprafaa unei lame de microscop, fixarea frotiului i apoi colorarea. Preparatul astfel obinut este cunoscut sub denumirea de frotiu. Pentru realizarea unui frotiu sunt necesare urmtoarele: cultur bacterian (dezvoltat pe mediu solidificat sau lichid), soluie salin fiziologic (NaCl 0,85%), ans sau pipet Pasteur, lame de sticl curate i degresate, cristalizoare, stative i bec Bunsen.

32

Tehnica de lucru. Pentru realizarea frotiului se parcurg mai multe etape. Pe o lam de microscop se pune, cu bucla ansei sau cu pipeta Pasteur, o pictur de ap fiziologic. n bucla ansei se recolteaz o cantitate mic din suspensie sau dintr-o colonie bacterian i apoi se disperseaz omogen n pictura de ap fiziologic. Pentru etalonare, se descriu cu bucla ansei trasee concentrice ovale. n cazul culturilor foarte srace n celule, se recomand punerea pe lam, cu ajutorul ansei sau al pipetei Pasteur, a uneia sau mai multor picturi. Apoi, acestea sunt lsate s se usuce. n toate cazurile, uscarea se face la temperatura camerei, acoperind frotiurile cu capacul unei plci Petri. De asemenea, uscarea se poate realiza la termostat, la 37C (Drgan-Bularda i Kiss, 1986). Fixarea frotiurilor. Prin fixarea frotiurilor, se omoar celulele, se asigur aderena bacteriilor pe lam, o mai bun colorare i posibilitatea de studiere a detaliilor. De asemenea, prin aceasta crete permeabilitatea peretelui celular pentru colorani etc. Fixarea frotiurilor se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici (cldura) sau chimici (alcool absolut, alcool metilic, acid osmic etc.). Fixarea cu ajutorul cldurii. Prin flacra unui bec Bunsen se trece lama de microscop care este inut de margini, la una din extremiti, avnd frotiul n sus. n timpul trecerii, se efectueaz o micare lent de clcare a flcrii. Operaia se repet de trei ori, iar fiecare trecere dureaz aproximativ o secund. Pentru a evita supranclzirea lamei, care poate determina carbonizarea celulelor, dup fiecare trecere prin flacr, se controleaz gradul de nclzire a preparatului. n acest sens, se atinge cu lama dosul palmei, aproape de baza degetului mare. Fixarea se efectueaz corect, cnd temperatura poate fi suportat cu uurin (Drgan-Bularda i Kiss, 1986). Colorarea frotiurilor La colorarea frotiurilor, trebuie cunoscute i respectate cteva reguli generale. Frotiurile se aaz, dup fixare, pe suporturi metalice sau suporturi formate din dou baghete de sticl, reunite la capete printr-un tub de cauciuc i aezate deasupra unui cristalizator folosit numai pentru coloraii. La colorare, colorantul se aplic direct pe frotiu, cu sticla picurtoare sau cu ajutorul unei pipete tetin de cauciuc. n cazul n care coloraia necesit o expunere prelungit sau acoperirea complet a frotiului, lama cu frotiul se cufund n vase speciale (pahare Borrel, plci Laveron). 33

Dup aciunea colorantului, splarea lamei cu frotiul se face sub curent de ap direct de la robinet sau cu ajutorul unei pipete. Pentru colorare la cald, flambarea se face prin trecerea lamei prin flacra unui bec Bunsen. Pentru uscarea frotiului, se aaz lamele pe mas n poziie vertical, n stelaje de lemn speciale, n termostat sau ntre dou foi de hrtie de filtru. Nu se recomand uscarea frotiului la flacr. n cazul utilizrii uleiului de imersie, pentru studiul microscopic al preparatelor, acesta trebuie ndeprtat de pe lam cu xilol sau benzol. Pentru aceasta, se acoper frotiul cu o bucat de hrtie de filtru sau vat bine umezit cu una din aceste substane i se terge suprafaa lamei printr-o micare de translaie (Drgan-Bularda i Kiss, 1986). 5.3.2. Coloraia simpl Tehnica utilizeaz aciunea unui singur colorant care transfer culoarea sa celulelor din preparat. Pentru colorarea celulelor bacteriene sunt necesare: colorant Loeffler, cultur bacterian (de 24-48 ore), lame de microscop degresate, ap fiziologic (soluie fiziologic de NaCl 0,85%) i ans de platin. Colorantul Loeffler (soluie alcoolic de albastru de metilen) se prepar din albastru de metilen (0,3g), alcool etilic (30 ml), soluie apoas de KOH 1% (1,0 ml) i ap distilat (100 ml). Albastrul de metilen se dizolv n alcool etilic, dup care se adaug soluia de KOH 1% i apa distilat. Tehnica de lucru. Pe lame de microscop, se realizeaz frotiuri. Acestea se fixeaz termic (la flacr) i apoi se coloreaz cu soluie Loeffler, 1-2minute. Dup colorare, se spal cu ap de robinet. Frotiul se usuc la temperatura camerei i se examineaz la obiectivul cu imersie (Drgan-Bularda i Kiss, 1986). 5.4. Testul ELISA n cercetrile moderne, pentru determinarea corect a bacteriilor fitopatogene se folosete tot mai frecvent testul ELISA. Unele bacterii fitopatogene (Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae etc.) prezint numeroase tulpini (patovaruri). De aceea, identificarea acestora necesit folosirea unor metode i tehnici de mare sensibilitate i precizie. Prin testul ELISA se determin diferite bacterii fitopatogene, precum Pseudomonas syringae pv. phaseolica, Clavibacter michiganense pv. michiganense etc.

34

6. Metode i tehnici de lucru n studiul ciupercilor fitopatogene 6.1. Metode de izolare a ciupercilor fitopatogene Izolarea ciupercilor fitopatogene din substratul pe care se dezvolt se realizeaz prin metode generale i metode speciale. 6.1.1. Metode generale Dintre metodele generale de izolare, la studierea ciupercilor fitopatogene se folosesc izolarea direct, metoda diluiilor etc. Metoda izolrii directe Aceast metod se folosete pentru izolarea ciupercilor care formeaz fructificaii abundente la suprafaa substratului pe care se dezvolt. n unele cazuri, sporulaia ciupercii poate fi observat cu ochiul liber. Examinarea mai detaliat a sporulaiei se realizeaz cu ajutorul stereomicroscopului. Din materialul infectat se detaeaz spori sau miceliu de ciuperc, cu ajutorul unui ac de nsmnat, umectat n prealabil n mediul nutritiv. Materialul izolat este folosit pentru efectuarea de preparate microscopice sau se nsmneaz pe un mediu de cultur. Pentru evitarea contaminrii cu bacterii, la mediul de cultur se adaug substane bactericide. Stimularea dezvoltrii i sporulrii ciupercii fitopatogene, n vederea identificrii, se realizeaz n camer umed, care asigur speciei cercetate condiii optime de temperatur (20-22C) i umiditate. Materialul vegetal infectat se pregtete corespunztor, nainte de a fi introdus n camera umed. Astfel, acesta se spal bine la suprafa cu ap steril, apoi se introduce ntr-un dezinfectant (Tab. 4). Dup aceasta, se spal bine cu ap steril i se introduce n camera umed. Pentru pregtirea camerei umede, se folosesc cteva rondele de hrtie de filtru, umectate cu ap steril, care sunt puse ntr-un vas Petri sterilizat. Camera umed cu materialul vegetal infectat se acoper i se introduce ntr-un termostat la temperatura de 20-22C, timp de cteva zile, n funcie de specia cercetat. n aceast perioad de timp, ciuperca se dezvolt, formnd miceliu i sporulaie caracteristic, necesare pentru determinarea speciei.

35

Metoda diluiilor Este folosit, atunci cnd ciupercile sunt slab dezvoltate pe substrat sau cresc n amestec cu alte specii de microorganisme. Pentru realizarea metodei, se cntrete un gram din materialul de analizat (esut vegetal infectat, suc vegetal infectat etc.) i se pune n 9 ml ap steril. Astfel se obine diluia de 1:10, din care se ia 1 ml i se pune ntr-o eprubet cu 9 ml ap steril, dup ce n prealabil s-a agitat coninutul. n acest mod, s-a obinut diluia 1:100. Prin acest procedeu i n acelai mod se obin diluii de 1:1000; 1:10 000; 1:100 000 etc. O cantitate foarte mic din suspensia iniial (1:10) se transfer cu ajutorul unei anse pe suprafaa mediului agarizat, turnat n vase Petri. Pentru a inhiba dezvoltarea bacteriilor, n mediul de cultur se adaug substane bactericide. Folosind i celelalte soluii cu diluii mai mari, se nsmneaz i alte vase Petri cu mediu agarizat, n acelai mod. Suspensia optim pentru inoculare este aceea care prin inocularea unui mililitru de soluie, pe suprafaa mediului, se vor dezvolta numai 3-6 colonii. Frecvent se folosesc diluii de 1:10 000 (Constantinescu, 1974). Aceast metod se aplic i pentru izolarea ciupercilor fitopatogene din sol. 6.1.2. Metode speciale Pentru izolarea ciupercilor de pe unele organe ale plantelor sau pentru izolarea anumitor grupe de ciuperci s-au adoptat metode speciale. Aproape ntotdeauna, pe organele plantelor, n afara ciupercilor parazite, se afl i bacterii sau ciuperci saprofite. Pentru ndeprtarea contaminanilor de pe suprafaa materialelor colectate, se folosesc diferite metode. Una dintre acestea se bazeaz pe utilizarea de sterilizani sub form de soluii (Tab. 4). Cnd se folosesc sterilizani sub form de soluii, dezinfectarea la suprafa se realizeaz astfel: se spal materialul vegetal i se taie n fragmente mici, de cca. 1 cm lungime, apoi se imerseaz n alcool etilic 75% i imediat n soluie de sterilizare. Dup scoaterea din soluie, se spal de mai multe ori n ap steril, se zvnt ntre foi de hrtie steril, se secioneaz i se transfer pe mediul de cultur. Dup sterilizarea la suprafa a materialului vegetal, urmeaz etapa de izolare a ciupercilor fitopatogene. Metoda de izolare folosit, difer n funcie de grupul de ciuperci, de locul unde este localizat agentul patogen (la suprafaa plantei sau n esuturi profunde), de organul vegetal afectat (tulpin, smn etc.) etc. 36

Tabelul 4 Sterilizarea la suprafa a materialului vegetal (dup Booth , 1971, citat de Constantinescu, 1974) Sterilizantul Formaldehid (40%) H2O2 KMnO 4 Hipoclorit de calciu sau sodiu Alcool etilic AgNO 3 Concentraia (%) 51 3 2 0,35 75 1 Timp (min.) 1-5 1-5 1-5 1-5 1-5 1-5 Soluia de splare Alcool etilic 70%, apoi ap steril Ap steril Ap steril Ap steril Ap steril NaCl steril, apoi ap steril

Izolarea ciupercilor care sporuleaz la suprafaa plantelor Izolarea ciupercilor care produc ptri ale frunzelor se realizeaz n mai multe etape: sterilizarea la suprafa a materialului vegetal (Tab. 4); introducerea n camera umed; incubarea (la 20-22C, timp de cteva zile); izolarea direct a miceliului i sporulaiei; identificarea speciei prin studiul preparatelor microscopice. Izolarea ciupercilor din esuturile profunde ale organelor vegetative Izolarea ciupercilor, care paraziteaz esuturile profunde i care, de obicei, nu sporuleaz la suprafaa organelor atacate (bulbi, tuberculi, tulpini etc.), se realizeaz prin parcurgerea urmtoarelor etape: sterilizarea, splarea, secionarea esuturilor i depunerea fragmentelor pe mediu de cultur sau n camere umede. Dup cteva zile de incubare la temperatura camerei (20-22C), din miceliul care se dezvolt n jurul fragmentului de esut, se poate izola agentul patogen. 6.1.3. Metode de analiz a seminei cu privire la infecia cu ciuperci Seminele plantelor sunt infectate uneori de diferite specii de ciuperci. Datorit infeciei, seminele prezint diferite simptome de boal (pete de decolorare, culori diferite etc.), care se deosebesc de seminele sntoase. 37

Ciupercile se pot localiza pe suprafaa seminelor sau pot ptrunde prin tegumentul seminal n interiorul acestora. Pentru determinarea precis a agenilor patogeni purtai de smn, trebuie s se foloseasc diferite metode, pe lng metoda examinrii macroscopice. Dintre aceste metode menionm: metoda suspensiei de spori, metoda sugativei, metoda plcilor cu agar, metoda Hiltner etc. Metoda suspensiei de spori Aceast metod de analiz const n examinarea microscopic a suspensiilor de spori obinute prin splarea seminei. Este o metod calitativ, deoarece servete numai la depistarea sporilor, dar nu stabilete viabilitatea acestora sau gradul de contaminare a seminelor. Mod de lucru. Din proba de analizat, se iau cte 200 semine, care se mpart, n mod egal, n dou loturi. Fiecare lot se pune ntr-un balon de sticl i se adaug cte 100 ml ap steril. Apoi, se agit puternic balonul de sticl (cu mna sau la agitator mecanic), timp de 10 minute. Suspensia din baloane se transfer n dou tuburi de centrifug. Dup centrifugare (la 2000-2500 turaii/min., timp de 10-15 min.), se decanteaz supernatantul, iar sedimentul fiecrui tub se examineaz. Din fiecare tub se iau cte 4 picturi i se pun n cte 4 picturi de lactofenol pe lame microscopice. Se identific la microscop prezena sporilor de la diferite specii de ciuperci. Metoda sugativei Seminele cercetate sunt puse n condiii optime de temperatur i umiditate, astfel nct ciupercile care le-au infectat s se poat dezvolta pe ele. Mod de lucru. Seminele se aaz n vase Petri, pe hrtie sugativ umectat i se incubeaz cca. 7 zile, la temperatura camerei (20-22C). Observaiile cu privire la prezena sau lipsa infeciei pe smn se fac la stereomicroscop. n cazul unor semine care sunt puternic contaminate cu ciuperci saprofite (Rhizopus spp., Mucor spp. Aspergillus spp. etc.) este necesar s se fac o dezinfecie superficial (Tab. 4), n prealabil. Metoda sugativei este mult folosit n acele laboratoare care efectueaz, n mod curent, analize de stare sanitar a seminelor. Aceast metod ofer condiii optime pentru creterea miceliului la multe ciuperci patogene, ct i pentru dezvoltarea simptomelor produse de aceste specii pe germenii care se dezvolt n timpul incubrii.

38

Metoda plcilor de agar Este folosit pentru izolarea i identificarea pe mediu agarizat a agenilor patogeni localizai n smn. Cel mai frecvent sunt folosite mediile extract mal-agar (MA) i extract cartof-agar (CA), cartof-dextroz-agar etc.. Mod de lucru. Seminele testate se dezinfecteaz, n prealabil cu un sterilizant slab (Tab. 4), iar apoi sunt plasate pe mediu de cultur n vase Petri, fiind distanate n funcie de mrimea lor. Incubarea se realizeaz la temperatura camerei (20-22 oC), pe o perioad de 5-8 zile. Estimarea infeciei se face prin examinarea coloniei de ciuperci la stereomicroscop. De asemenea, se efectueaz preparate microscopice, pentru identificarea speciei patogene (Raicu i Baciu, 1978). 6.2. Noiuni de tehnic micologic Examinarea ciupercilor se poate face direct pe substratul pe care se dezvolt n natur, cu ajutorul aparatelor optice (lup, microscop), fie n culturi pure pe diferite medii de cultur. Culturile pure sunt indispensabile, pentru cercetrile din micologie. Ele permit izolarea i determinarea diferitelor specii de ciuperci, cunoaterea morfologiei, fiziologiei i altor caractere ale lor. Nu toate ciupercile pot fi cultivate pe medii de cultur. Pe aceste medii pot fi cultivate ciupercile saprofite (obligate i facultative) i parazite facultative. Ciupercile parazite obligate nu pot fi cultivate pe medii de cultur acelulare. Studierea lor se face direct pe planta gazd pe care se dezvolt. 6.2.1. Medii de cultur pentru ciuperci Necesitile nutritive ale ciupercilor sunt att de diverse nct nu exist un mediu standard pentru toate speciile. Unele medii de cultur (Czapek-agar, cartof-dextroz-agar, mal-agar etc.) permit dezvoltarea unui numr mare de ciuperci, iar altele sunt specifice unui numr restrns sau chiar unei singure specii. Mediile de cultur se folosesc n stare lichid sau n stare solid. Solidificarea mediilor de cultur se realizeaz prin adugare de agar sau silicagel (Constantinescu, 1974). Pentru cultivarea ciupercilor, n literatur s-au descris cteva sute de medii nutrtive, dintre care, n continuare, sunt prezentate cteva.

39

Ap-agar Mediul de cultur ap-agar se prepar din: Agar .......................... 20 g Ap distilat ............. 1000 ml Agarul se dizolv n ap timp de 30 minute i apoi se sterilizeaz 20 minute, la 1210C. Acest mediu specific este folosit pentru cultivarea i iden-tificarea drojdiilor (Constantinescu, 1974). Bere (must)-agar Mediul de cultur se prepar din: Agar 30 g Must de bere .. 1000 ml Agarul se topete n must de bere, prin fierbere pe baie de ap, timp de 15 minute. Dup ajustarea pH-lui la 5,0-5,5, se sterilizeaz 10 minute la 1160C (Constantinescu, 1974). Cartof-dextroz-agar Mediul cartof-dextroz-agar este cel mai utilizat n micologie i este foarte favorabil pentru creterea majoritii ciupercilor. Se prepar din: Cartof Dextroz Agar .. Ap distilat .. 200 g 20 g 20 g 1000 ml

Pentru prepararea mediului, se spal i se cur cartofii, iar apoi se taie n cuburi de circa 12 mm. Se cntresc 200 g cartofi, se cltesc repede n ap i se fierb ntr-un vas de sticl sau smluit, timp de o or, pn se nmoaie. Se sfrm cartofii i se strecoar ct mai mult pulp printr-o sit fin sau printr-un tifon. Se adaug agarul i se fierbe pn se dizolv. Se ia de pe foc, se adaug dextroza i se amestec pn se dizolv. Se completeaz la un litru cu ap distilat. n timpul turnrii n eprubete, se va agita soluia, pen-tru a repartiza n fiecare eprubet o parte din substana solid. Se sterilizeaz la 1210C, timp de 15 minute. n funcie de calitatea agarului, se poate folosi 15 g la un litru de mediu (Constantinescu, 1974). 40

Fa de formula standard, exist mai multe variante ale acestui mediu. Pentru producerea de conidii la Venturia inaequalis, se recomand acest mediu preparat din 40 g cartofi, 5 g dextroz, 17 g agar i 1000 ml ap distilat (Boone i Keitt, 1956, citat de Constantinescu, 1974). Czapek-agar Soluie A .50 ml Soluie B .50 ml Sucroz 30 g Agar.. 20 g Ap distilat ...900 ml Soluia A Soluia B NaNO 3 .. 40 g K 2 HPO 4 ............. 20 g KCl ............... 10 g Ap distilat....1000 ml MgSO 4 ..10 g FeSO 4 ..............0,2 g Ap distilat...1000 ml

Preparare. Se dizolv sucroza n 50 ml soluie A, diluat cu aproxi-mativ 500 ml ap distilat. Se adaug 50 ml soluie B, se completeaz la un litru cu ap distilat, se adaug agarul i se topete. Se sterilizeaz 20 minute, la 1210C (dup Booth, 1971, citat de Constantinescu, 1974). Czapek soluie-agar Compoziie/l: Sucroz 30 g KCl ... 0,5 g Agar .. 15 g MgSO 4 . 7H 2 O ... 0,5 g NaNO 3 .. 2 g FeSO 4 . 7H 2 O ..0,01 g K 2 HPO 4 . 1 g pH: 7,3 0,2 la 25 0C Componentele se amestec n ap distilat i se aduce la volum de 1,0 l. Se distribuie n vase i se autoclaveaz 15 minute la 1210C. Se folosete pentru cultivarea speciilor de Aspergillus, Penicillium i altor ciuperci (Atlas, 2004). Fasole-agar Reeta de preparare cuprinde: Fasole 100 g Agar ... 15 g Ap distilat .. 1 000 ml Fasole lima (Phaseolus lunatus) proaspt sau ngheat se umecteaz ntr-un litru de ap cldu timp de 30 minute. Se nltur lichidul i se completeaz cu ap, se filtreaz prin sit, se adaug agarul i se fierbe pn 41

la topirea agarului. Se filtreaz prin vat. Se sterilizeaz 20 minute, la 1210C. Acest mediu este recomandat pentru cultivarea speciei Phytophthora infestans. Mal (extract)-agar Reeta standard cuprinde: Extract mal .. 30 g Agar . 15 g Ap distilat 1000 ml Se nclzete extractul de mal n ap pn se dizolv, se adaug agarul i se fierbe pn se topete. Se ajusteaz pH-ul final la 5,5 0,2, la 250C. Se sterilizeaz prin autoclavare la 1210C, timp de 15 min. (Samson i Van Reenen-Hoekstra, 1988). Sabouraud-glucoz-agar Reeta standard cuprinde: Glucoz . 40 g Pepton granulat . 10 g Ap distilat .. 1000 ml Se amestec ingredientele, se fierb pn la dizolvare i se ajusteaz pH-ul la 5,6. Se sterilizeaz la 1200C, timp de 10 minute. Acest mediu este foarte sensibil i nu trebuie supranclzit, la sterilizare. Se folosete n derma-tologie pentru cultivarea ciupercilor care produc micoze ale pielii i prului, la om (Constantinescu, 1974). Extract de orez-agar Compoziie/l: Agar ... 20 g Orez alb (extract) 5,0 g Polisorbat 80 .. 10,0 ml pH: 6,60,2 la 25 0C

Se amestec componentele, cu excepia polisorbatului 80, n ap dis-tilat/deionizat i se aduce la un volum de 990 ml. Se fierbe pn la dizol-vare i apoi se adaug polisorbatul 80. Se sterilizeaz 15 minute, la 1210C. Mediul este folosit pentru cultivarea i diferenierea speciilor de Candida albicans i Candida stellatoidea, de alte specii de Candida, pe baza formrii clamidosporilor (Atlas, 2004). 42

Sterilizarea mediilor de cultur Dup preparare, mediul de cultur se toarn n vase de cultur (eprubete, plci Petri, flacoane Erlenmeyer etc.). Toat sticlria care se folosete pentru cultivarea microorganismelor trebuie splat, uscat i sterilizat. Toate aceste etape sunt descrise amnunit n diferite manuale de laborator Sterilizarea sticlriei se realizeaz n etuv la 180oC cel puin 60 minute sau la 160oC, cel puin dou ore(Constantinescu, 1974). Mediul de cultur se toarn n vase cu ajutorul unei plnii de sticl. Sterilizarea lor se face prin cldur umed n autoclav. Durata sterilizrii i valoarea temperaturii sunt indicate n reeta de preparare. Dup sterilizare, vasele cu medii se scot din autoclav i pot fi folosite pentru cultivarea ciupercilor. Mediile de cultur i soluiile care conin substane (zaharuri, vitamine etc.) termolabile i ai cror constitueni ar putea fi denaturai sub aciunea temperaturilor ridicate se sterilizeaz complet prin tindalizare. Sterilizarea prin tindalizare const n trei pasteurizri repetate (30 minute la 56-90C), efectuate la intervale de 24 ore, prin imersia recipientelor respective n bi de ap electrice, cu temperatur constant (Prvu, 2007). Culturile n vase Petri se practic n special pentru izolarea ciupercilor prin nsmnri repetate. Aceste culturi nu se pstreaz mult vreme, deoarece se usuc mai repede i se pot infecta mai uor prin deschiderea vaselor. De asemenea, ciupercile pot fi cultivate pe medii de cultur n eprubete i n flacoane Erlenmeyer. Pe aceste medii de cultur, culturile de ciuperci pot fi pstrate la temperaturi sczute (2-4oC) 2-3 luni, dup care trebuie rensmnate. 6.2.2. nsmnarea ciupercilor pe mediul de cultur Dei par simple, inocularea i transferul sunt efectuate de multe ori greit. Aceasta duce la contaminri nedorite ale culturilor, la infestarea laboratorului i chiar a operatorului (Constantinescu, 1974). Prin nsmnare se nelege trecerea pe medii de cultur a microorganismelor din diferite surse (ap, sol, produse patologice etc.), n vederea cultivrii i izolrii lor n culturi pure. Ciupercile se cultiv pe medii de cultur n diferite scopuri: pentru examinarea caracterelor culturale, morfologice, biochimice i serologice, n vederea identificrii lor; pentru a le conserva, prin rensmnare din culturi vechi pe medii proaspete etc. nsmnarea ciupercilor se poate executa cu ansa sau cu pipeta Pasteur. 43

nsmnarea cu ansa Pentru inoculare, trebuie folosit un ac de nsmnat confecionat din platin sau un aliaj care nu vibreaz. n timpul inoculrii, acul de nsmnat nu se introduce fierbinte n cultur. Dup inoculare, se recomand ca acul de nsmnat s fie imersat n alcool etilic 70% i dup aceea trebuie trecut n flacra becului de gaz. Aceast ordine a operaiilor trebuie respectat deoarece, prin nclzire brusc, fragmente de inocul sunt dispersate n aer. n timpul inoculrii mediilor de cultur, trebuie s se lucreze sub hot, n condiii sterile. Tehnica transferului inoculului fungic n eprubet, vas Petri sau alt vas de cultur este prezentat detaliat n diferite manuale de laborator (Botton i colab., 1985; Kreisel i Schauer, 1987). Materialul de nsmnat se introduce n mediul de cultur din diferite vase (eprubete, vase Petri etc.), cu ajutorul ansei de nsmnat. Dac nu dispunem de o cultur pur a unei anumite ciuperci, este necesar s o izolm i s o purificm. Din zonele n care ciuperca apare mai puin amestecat i cu alte microorganisme, se ia o mic poriune care se nsmneaz din nou. Repetnd aceast operaie de mai multe ori, se purific cultura, de microorganisme strine, izolnd astfel ciuperca pe care dorim s o studiem. Dup ce s-a obinut cultura pur n vase Petri, ciuperca se nsmneaz din nou n eprubete, spre a putea pstra izolatul mai mult vreme (2-3 luni), la temperatur sczut (2-4oC). Dup aceast perioad, culturile trebuie nsmnate din nou, spre a le mprospta. Pentru purificarea culturilor de ciuperci, se folosesc o serie de factori chimici care inhib creterea bacteriilor. Dintre aceti factori chimici, se folosesc frecvent penicilina, streptomicina, cloramfenicolul etc. Penicilina (20-40 uniti/ml mediu de cultur) i streptomicina (40-100 uniti/ml mediu de cultur) se adaug dup sterilizare, cnd mediul s-a rcit la 45oC. Cloramfenicolul (0,05 mg/ml mediu de cultur) poate fi inclus nainte de sterilizare (Constantinescu, 1974). Dup efectuarea nsmnrii, pe vasele cu mediul de cultur se noteaz specia cultivat, data efecturii operaiei, mediul de cultur folosit etc. Mediile de cultur nsmnate cu ciuperci se pun n termostat, la temperatura optim (20-22 oC) de cretere i dezvoltare, timp de 10-15 zile. Periodic, la intervale egale de timp, se fac observaii i se noteaz caracterele morfologice ale coloniilor obinute.

44

6.3. Tehnica examenului microscopic al ciupercilor Caracterele morfologice i/sau ultrastructurale ale ciupercilor pot fi studiate n preparate la microscopul optic i/sau la microscopul electronic. Microscopie optic la ciuperci Pentru examinare la microscopul optic, ciupercile trebuie fixate pe un suport transparent, ntr-un mediu al crui indice de refracie este ct mai apropiat de cel al sticlei. n general, n preparate se monteaz sporii ciupercilor, mpreun cu structurile pe care se formeaz sau fragmente ori seciuni din esuturile vegetale n care acestea se gsesc. Preparatele microscopice pot fi provizorii sau permanente. Preparatele provizorii se pstreaz numai att ct este necesar pentru examinare rapid, iar cele permanente pot fi conservate timp ndelungat n colecii. Efec-tuarea preparatelor presupune parcurgerea mai multor etape: prelevarea, montarea, colorarea, fixarea i lutarea (Constantinescu, 1974). Prelevarea materialului Pentru efectuarea unui preparat microscopic, se detaeaz direct de pe substrat (frunze, semine etc.) sau din cultur, un fragment de ciuperc, folosind un ac spatulat sau un ac de nsmnat. Fragmentul detaat se pune pe o lam de sticl, ntr-un lichid de montare. Ulterior, se acoper cu lamela de sticl i se examineaz la microscop. Montarea Aceast etap const n includerea materialului fungic - miceliu, spori etc. - ntr-un mediu de montare. Mediul de montare - soluia n care se include materialul - poate rmne lichid sau se poate solidifica prin evaporarea solventului. Pentru efectuarea preparatelor micologice se pot folosi diferite medii de montare, precum apa, lactofenolul, acidul lactic etc. Apa. Dac exist suficient material, orice ciuperc trebuie examinat ntr-un preparat provizoriu n ap de robinet sau ap distilat, deoarece nici un mediu de montare nu are un indice de refracie, att de sczut, ca apa. Lactofenolul. Este cel mai folosit lichid de montare n micologie. ntr-o singur operaie se asigur fixarea, clarificarea esuturilor, colorarea 45

(dac se adaug un colorant), conservarea i red turgescena normal a miceliilor sau sporulaiei contractate. Lactofenolul este miscibil cu majoritatea coloranilor i mai ales cu derivaii de anilin (Constantinescu, 1974). Se prepar din: Fenol cristalizat .. 20 g Glicerin 31 ml Acid lactic . .. 16 ml Ap distilat . 20 ml Primele trei componente se amestec i se nclzesc pn se dizolv cristalele de fenol. Se filtreaz prin hrtie de filtru, obinndu-se astfel lactofenolul anhidru. Acesta se poate hidrata prin adugarea apei distilate (Constantinescu, 1974). La prepararea lactofenolului hidratat, se nclzete fenolul cu apa pn la dizolvare, apoi se adaug acidul lactic i glicerina. Pentru a mpiedica oxidarea (nnegrirea) sa, lactofenolul se pstreaz n sticle brune (erbnescu-Jitariu i colab., 1983). Cloral-lactofenol. Acest lichid de montare are un indice (1,49) de refracie ridicat i clarific mai bine dect lactofenolul (Dade, 1960a, citat de Constantinescu, 1974). Se prepar din: Cloral hidrat (cristalizat) 20 g Fenol (cristalizat) .. 10 g Acid lactic 10 ml Acidul lactic. Este un lichid (mediu) foarte bun de montare, dar mrete volumul materialelor incluse (Constantinescu, 1974). La acidul lactic se poate aduga bleu coton sau alt colorant. Colorarea n micologie, se folosesc diferii colorani. Dintre acetia, civa se folosesc pentru colorarea citoplasmei i pereilor celulari la ciuperci. Bleu coton (Albastru de anilin, Coton blue). n funcie de solventul folosit, se cunosc diferite reete de preparare a acestui colorant, n vederea utilizrii. Bleu coton n lactofenol. Se folosete pentru colorarea citoplasmei celulelor fungice. Se prepar din 1,0 g bleu coton pulbere la 200 ml ap distilat, se nclzete i se agit pn la dizolvarea complet a colorantului. Apoi, se filtreaz. Se amestec (per volum) o parte din soluia obinut cu 4 pri lactofenol anhidru. Astfel, se obine o soluie cu o concentraie de 0,10%. Colorarea se poate face prin introducerea materialului prelevat n soluia concentrat de 0,10%, nclzire i apoi transferare n lactofenol pur 46

sau prin montarea direct n soluie diluat. Soluia diluat se obine din o parte bleu coton 1,0% n lactofenol i 2 pri lactofenol hidratat. Bleu coton n acid lactic. Se obine prin dizolvare, la temperatura camerei, a 0,05 g bleu coton pulbere n 30,0 ml acid lactic. Dup 24 ore, soluia se filtreaz. Este un colorant la fel de bun ca bleu coton n lactofenol (Constantinescu, 1974). Bleu coton n acid acetic. Colorantul se prepar din ap distilat (100ml), bleu coton (0,5g) i acid acetic (3ml). Este indicat pentru colorarea culturilor fungice pe lame sau a seciunilor prin esuturi vegetale care conin ciuperci. Cultura se deshidrateaz la 37oC, se fixeaz cu o pictur de alcool etilic 95% care se las s se evapore. Se coloreaz cultura cteva minute cu o pictur de colorant, se spal n ap, se deshidrateaz cu alcool etilic i se monteaz n balsam (Constantinescu, 1974). Albastru de tripan (Trypan blue). Se folosete n concentraie de 0,1-0,5% n acid acetic, pentru colorarea ciupercilor. De asemenea, se poate folosi n concentraie de 0,2% n lactofenol. nclzirea preparatului grbete colorarea, care se continu apoi n timp. Coloreaz citoplasma n albastruindigo. Fucsin. Colorantul se poate prepara, dup diferite reete. Fucsin acid. Este un colorant citoplasmatic. Se prepar din fucsin acid 0,1 g n 100 ml lactofenol. Lacto-fucsin. Este un colorant superior bleu cotonului n lactofenol, deoarece colorarea este mai rapid, iar celulele se vd mai bine i pot fi fotografiate cu uurin. Se prepar din 0,1 g fucsin acid care se dizolv n 100 ml acid lactic anhidru. Este un colorant citoplasmatic. Montarea i lutarea preparatelor microscopice n laboratorul de micologie, se folosete frecvent lichid de montare care conine colorant. Aa sunt fucsina acid, lacto-fucsin, bleu coton n lactofenol etc. De aceea, montarea i colorarea materialului fungic prelevat se face concomitent pe aceeai lam de sticl, folosind lichide de montare care conin colorant. Dac lichidul de montare nu conine colorant, atunci, colorarea se face nainte de montare. Lamele de sticl i lamelele folosite pentru efectuarea preparatelor microscopice trebuie splate cu detergent, cltite cu ap de robinet, ap distilat i apoi uscate. Dup curire, lamele i lamelele se pstreaz n alcool etilic 70% sau n vase de sticl acoperite, pentru a fi ferite de praf. n cazul pstrrii n

47

alcool etilic, lamele i lamelele se scot din lichid i se terg cu o pnz moale, curat, nainte de utilizare. Montarea materialului Pe o lam microscopic curat se pune la mijloc sau la 1/3 fa de unul din capete o pictur din lichidul de montare (fucsin acid, lactofucsin, bleu coton n lactofenol etc.). Materialul fungic miceliu, spori etc. prelevat se pune apoi n lichidul de montare de pe lam, cu ajutorul unui ac de nsmnat. Dup aceea, se aaz lamela cu o latur pe suprafaa lamei, la o distan mic fa de pictura de lichid. Cu ajutorul unui ac, se coboar lent lamela peste pictura din lichidul de montare. Astfel pregtit, preparatul microscopic se poate examina la microscop. Dac dorim s realizm preparat durabil, acesta se nclzete pn la evaporarea complet a urmelor de lichid. Etanarea preparatelor Etanarea preparatelor n medii lichide este necesar, pentru a evita evaporarea lichidului de montare. Astfel, se obin preparate durabile. Preparatele microscopice montate n medii (balsam de Canada, gum arabic, glicerin gelatinat etc.) care se solidific, nu se etaneaz. Pentru etanarea preparatelor, se folosesc diferite materiale, precum: lacul pentru unghii, rini naturale, rini sintetice etc. Lacul pentru unghii a devenit cel mai utilizat lut, datorit faptului c se usuc rapid, se manipuleaz uor i este eficient (Constantinescu, 1974). Microscopie electronic la ciuperci Caracteristicile morfologice ale ciupercilor pot fi evideniate n pre-parate, la microscopul electronic scanning, iar cele ultrastructurale, la micros-copul electronic cu transmisie, conform datelor din literatur (Vanky, 1994; Hayat, 2000). Pentru evidenierea caracteristicilor ultrastructurale la microscopul electronic cu transmisie, se parcurg urmtoarele etape, necesare realizrii unei probe: recoltarea materialului micologic; prefixarea cu soluie de glutaral-dehid (2,7%) n tampon fosfat; splri succesive cu tampon fosfat 0,15 M (dup a patra splare se las peste noapte, la frigider); postfixarea n soluie de OsO 4 2 % n tampon fosfat 0,15 M; deshidratarea n soluii de aceton de concentraii cresctoare (50%-100%); infiltrarea i includerea n rin poliesteric; efectuarea seciunilor la ultramicrotom i contrastarea cu 48

acetat de uranil i citrat de plumb; examinarea seciunilor la microscop, analiza imaginilor i interpretarea rezultatelor. Pentru evidenierea aspectelor morfologice ale ciupercilor, la microscopul electronic scanning, trebuie parcurse urmtoarele etape: recoltarea direct a probelor; centrifugarea materialului, dac este necesar; acoperirea materialului, prin stropire, cu Au sau Ag, n vid; examinarea probei la microscop, analiza i interpretarea rezultatelor. 6.4. Noiuni de micrometrie Pentru studiul bacteriilor i ciupercilor microscopice, trebuie s cunoatem dimensiunile lor. Aceasta prezint importan pentru determinare. Pentru aceasta, se fac msurtori i este necesar s cunoatem puterea de mrire a aparatelor optice cu care se lucreaz. n micrometrie se folosesc micrometrul ocular i micrometrul obiectiv, pentru determinarea indicelui micrometric. Micrometrul ocular este un rondel (disc) de sticl care se introduce n ocularul microscopului cu care se lucreaz. Rondelul de sticl are gravat la mijloc o scar gradat de 1 cm i mprit n 100 pri egal deprtate una de alta. Fiecare diviziune a acestei scri este egal cu 1/10 de milimetru (0,1 mm). nainte de a efectua msurtori, trebuie stabilite, pentru fiecare ocular i obiectiv ale diferitelor microscoape, valoarea n microni (m) a unei diviziuni de pe micrometrul ocular. Pentru a afla aceasta, se determin indicele micrometric. Pentru determinarea indicelui micrometric, se folosete micrometrul obiectiv. Acesta este o lam de sticl n mijlocul creia este gravat o scar gradat lung de 1 mm i mprit n 100 pri egale. Fiecare diviziune este egal cu 1/100 de milimetru (0,01 mm). Pentru determinarea indicelui micrometric, aezm micrometrul ocular n ocularul microscopului i micrometrul obiectiv pe platina microscopului. Potrivim ca diviziunile scrii micrometrului ocular s se suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni ale micrometrului obiectiv. Indicele micrometric (Im) se calculeaz dup formula: Im = (ob x 10):oc n care: ob = reprezint numrul de diviziuni ale micrometrului obiectiv care se suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni din micrometrul ocular. 49

oc = reprezint numrul de diviziuni ale micrometrului ocular care se suprapun exact peste un anumit numr de diviziuni din micrometrul obiectiv. Im se exprim n microni (m). n acest mod se apreciaz ct este Im pentru fiecare obiectiv al microscopului cu care se lucreaz. Cunoscnd valoarea n microni (m) a unei diviziuni din micrometrul ocular i numrul de diviziuni corespunztoare dimensiunilor celulei fungice sau bacteriene, pe care o msurm, putem aprecia lungimea i limea acestora.

50