Annales des falsifications, de lexpertise chimique et toxicologique, 2me Semestre 2004-N965-pp.

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Article original

Analyse de la fraction phnoliques des huiles dolive vierges

Denis Ollivier1, Estelle Boubault1, Christian Pinatel2, Sylvie Souillol1, Michel Gurre1, Jacques Artaud3
Laboratoire de Marseille, Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes, 146 traverse Charles-Susini, 13388 Marseille cedex 13 (denis.ollivier@dgccrf.finances.gouv.fr) 2 Association Franaise Interprofessionnelle de lOlive (AFIDOL), Maison des Agriculteurs, 22 avenue Henri-Pontier, 13626 Aix-en-Provence cedex 1 3 Laboratoire de Chimie Analytique de lEnvironnement, UMR CNRS 6171, IFR 112, Eutpole de lArboit, Btiment Villemin, BP80 Aix-Marseille III.
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Titre abrg : Phnols dans les huiles dolive vierges Rsum : Ce travail est une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiomtrique dans le visible des composs phnoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des ortho-diphnols dans les huiles dolive vierges. Nous avons tudi linfluence de certains paramtres analytiques sur ces dosages. Une dtermination par chromatographie liquide des composs phnoliques dhuiles dolive vierges a t ralise pour caractriser des conditions de stockage de lhuile et des tats de maturation des olives. Ce travail a t ralis avec notamment le soutient financier de la Commission europenne (programme de recherche et dveloppement Qualit de la vie et management des ressources ) dans le cadre du programme europen OLIV-TRACK (QLK1-CT2002-02386). Mots cls : Phnols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphnols, huile dolive vierge, chromatographie liquide. Title : Phenols analysis in virgin olive oils Abstract : This work focuses on the colorimetric determination of total phenols with the FolinCiocalteu and ortho-diphenols with bibliographic data. Different analytical methods by colorimetric determinations and liquid chromatography were developed to analyze the stability during olive ripening and the oil storage. This study has been carried out with financial support from the Commission of the European Communities, specific RTD programme "Quality of Life and Management of Living Resources", QLK1-CT-2002-02386, "Traceability of origin and authenticity of olive oils by combined genomic and metabolomic approaches (OLIV-TRACK)". Keywords : Phenols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphenols, virgin olive oils, liquid chromatography.

Introduction
Lhuile dolive vierge est obtenue uniquement par des procds physiques (lavage, broyage, malaxage, centrifugation, dcantation...) dans des conditions notamment thermiques qui n'entranent pas d'altration de l'huile. Ces procds la diffrencient des autres huiles alimentaires qui, pour la grande majorit d'ente elles, sont raffines. Les procds mis en uvre lui confrent une composition originale avec environ 98% de triglycrides et 2% de composs mineurs. Ces derniers appartiennent des familles trs diverses telles que : hydrocarbures (avec une prpondrance du squalne de 0,3 1,2 g/100g), tocophrols, strodes, alcools aliphatiques, composs volatils, composs phnoliques Les composs phnoliques, improprement appels souvent polyphnols , sont responsables de la bonne stabilit loxydation des huiles dolive vierges. Outre leur proprit anti-oxydante, ils

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possdent dintressantes proprits nutritionnelles et organoleptiques. Les principaux composs des huiles dolive vierges sont reprsents dans les figures 1, 2 et 3. La dtermination de la teneur en composs phnoliques des huiles dolive devient une analyse importante bien que non rglementaire ce jour. Elle fait cependant partie du cahier des charges de quelques huiles italiennes de dnomination dorigine protge (DOP, quivalent nos AOC ) avec une teneur minimale en phnols totaux respecter. La teneur en composs phnoliques des huiles d'olive vierges dpend : de la varit de l'olive ; du degr de maturit des olives (la teneur baisse avec la sur-maturation des olives) ; du niveau dinfestation des olives par la mouche Dacus oleae [1] ; du climat ; de la qualit du sol ; du procd d'extraction utilis pour sparer la phase huileuse de la phase aqueuse ; des conditions de conservation de l'huile Diverses techniques ont t mises en uvre pour lanalyse qualitative et quantitative des composs phnoliques : labsorptiomtrie dans le visible selon la mthode de Folin-Ciocalteu (FC) [2] ; la chromatographie en phase liquide (HPLC) avec dtection spectrophotomtrique ou lectrochimique [3,4] ; la chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse [5] ; lenzymologie [6] ; la spectromtrie de masse avec ionisation chimique la pression atmosphrique (ACPIMS) [7].

Le but du prsent travail est de : - raliser une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiomtrique dans le visible des composs phnoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des o-diphnols prsents dans les huiles dolive vierges ; - dtudier linfluence de certains paramtres analytiques sur ces dosages ; - deffectuer une tude en chromatographie liquide (CLHP) des composs phnoliques des huiles dolive vierges. Ce travail a t effectu avec notamment le soutient financier de la Commission europenne (programme de recherche et dveloppement Qualit de la vie et management des ressources ) dans le cadre du programme europen OLIV-TRACK (QLK1-CT-2002-02386).

1. Les composs phnoliques

Les huiles dolive vierges sont riches en composs phnoliques appartenant diverses familles : (phnols et hydroxyphnols, acides et alcools phnols, scoridodes, lignanes, flavonodes, ....). Certains composs phnoliques confrent aux huiles vierges une saveur amre et une sensation de piquant. L'oluropine et le ligstroside sont les scoridodes majoritaires de lolive [8]. Leur aglycone, lipophile, sont prsents dans lhuile dolive. Leurs formules sont reprsentes figure 2. Au cours de la maturation du fruit, les glucosides sont hydrolyss pour donner des aglycones qui confrent l'huile d'olive sa saveur si particulire. Des phnomnes doxydation se produisent
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galement lors de la trituration des olives et entranent la formation de composs qui contribuent aux armes et la saveur de l'huile. En gnral, les huiles d'olives fruit vert obtiennent les notes les plus fortes en dgustation car elles ont des fruits plus intenses et des armes plus complexes que les huiles fruit mr et fruit noir . Ces caractristiques sont dues leur forte teneur en composs phnoliques, aldhydes, alcools, alcnes Cependant, une trop grande concentration en phnols donne une amertume excessive et dplaisante, gnralement peu apprcie par les consommateurs bien quil sagisse dun critre de "qualit" pour lhuile.
Les alcools phnoliques
OH
OH OH

CH2-CH2-OH

CH2-CH2-OH

Tyrosol 2-(4-hydroxyphnyl)-thanol

Hydroxytyrosol 2-(3,4-dihydroxyphnyl)-thanol

Les acides phnoliques

OH OCH3
OH

COOH

CH=CH-COOH

Acide vanillique acide 4-hydroxy-3-mthoxybenzoque

OH OCH3

Acide p-coumarique acide para-hydroxycinnamique

OH OH

CH=CH-COOH

CH=CH-COOH

Acide frulique acide 4-hydroxy-3-mthoxycinnamique

Acide cafique acide 3,4-dihydroxycinnamique

Les flavonodes
OH OH HO O

OH HO O

HO
OH O

Lutoline

Apignine

Figure 1 : formules de quelques alcools, acides phnols et flavonodes

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Composs hydrophiles
fruits, feuilles
COOCH 3 O HO OH O O HO HO O O OH HO OH OH O OH O O COOCH 3

Composs lipophiles
huile

Oluropine,

Oluropine aglycone

COOCH 3 O HO O O HO HO O O OH HO O O COOCH 3 O OH

OH

Ligstroside

Ligstroside aglycone

Figure 2 : Les scoridodes de lolive, des feuilles et de lhuile.

OMe HO O R O OH OMe

R= H Pinorsinol R= OCOCH3 1-actoxypinorsinol

Figure 3 : Les lignanes de lhuile dolive

Les composs phnoliques et la sant humaine [9, 10] Activit antioxydante Les composs phnoliques de l'huile d'olive vierge ont des proprits antioxydantes qui rduisent les risques de maladies cardiovasculaires. Ceci est surtout vrai pour les ortho-diphnols comme l'hydroxytyrosol et l'oluropine aglycone. Leurs proprits antioxydantes sont dues leur capacit former une liaison hydrogne intramolculaire entre l'hydrogne libre du groupement hydroxy et l'hydroxyle du radical phnoxy pour conduire la formation dune quinone [11]. Interfrence avec les enzymes L'oluropine aglycone agit sur l'activit immunitaire des macrophages [12]. En effet, il a un effet positif sur la formation de bactricides et de l'enzyme oxyde nitrique synthtase. Cette enzyme joue un rle d'anti-inflammatoire.

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2. Dosage des phnols

La quantification des composs phnoliques est le plus souvent ralise par absorptiomtrie dans le visible ou par chromatographie en phase liquide (HPLC) avec une dtection spectromtrique dans lultraviolet. La mthode absorptiomtrique est facile mettre en uvre mais nest pas spcifique et ne permet pas une analyse fine des diffrents composs phnoliques prsents dans lhuile. En revanche, la chromatographie en phase liquide est sensible, spcifique mais demande un appareillage coteux et se heurte labsence de composs commerciaux de rfrence pour les identifications. 2.1. Mthode de Folin-Ciocalteu Rcemment, Singleton et al [13] ont ralis une mise au point importante sur le dosage des phnols selon Folin-Ciocalteu (FC). La mthode de FC a t trs utilise pour le dosage des phnols dans les vins et les spiritueux mais aussi dans divers substrats dont les huiles dolive. Les chantillons de composs phnoliques, traits avec le ractif de FC (htropolyphosphotungstates-molybdates) (mlange dacides phosphotungstinique et phosphomolybdique) (ractif commercial, Prolabo ref : 31 360.264), en milieu alcalin (carbonate de sodium), dveloppent une coloration bleue dont labsorption est mesure 760 nm. La temprature et le temps de raction influent sur le dveloppement de la coloration. Les conditions exprimentales proposes par diffrents auteurs [13, 14] sont donnes ci-dessous : 1 ml dchantillon (de blanc ou dtalon) est ajout au moins 60 ml deau distille dans une fiole jauge de 100 ml. Ajouter 5 ml de ractif de FC et mlanger. Aprs une minute et avant huit minutes, ajouter 15 ml de carbonate de sodium 20 %. Ajuster le volume 100 ml. Mesurer labsorbance de la solution au bout de 2 heures environ 23C (760 nm ; cuve de 1 cm) . La prparation de lchantillon peut se faire en diminuant les quantits dun facteur 5 : 2 ml dun chantillon dilu au 1/10 ;10 ml de ractif de FC dilu au 1/10 ; 8 ml de carbonate de sodium (7,5 g/100 ml deau) pour un volume final de 20 ml . Les mesures sont effectues par rapport un compos de rfrence qui pour lanalyse des phnols dans les vins est le plus souvent lacide gallique. Une liste de composs, susceptibles dinterfrer sur les mesures dabsorbance, est donne [12] avec leur absorptivit molaire. Lhuile dolive La teneur en composs phnoliques totaux dans les huiles dolive a t trs souvent dtermine en utilisant la mthode de FC (Tableau 1). Blekas et al. [14] indiquent que dans lhuile dolive, il ny a que peu de composs susceptibles dinterfrer sur les mesures (absence de sucres rducteurs, dacide ascorbique, dions ferreux ou zinc). Les rsultats sont exprims par rapport une substance de rfrence qui varie selon les auteurs (Tableau 1). Il est donc trs difficile de comparer les rsultats en raison dune part des diffrences dabsorptivit des composs de rfrence utiliss et dautre part de la variation des conditions exprimentales dans lesquelles la raction de FC est ralise. Pour le mme chantillon, les valeurs extrmes trouves pour les phnols totaux avec 12 talons diffrents, varient de 70 mg/kg pour lacide 3,4-dihydroxyphnylacetique 380 mg/kg avec lacide p-hydroxybenzoque [14]. Les valeurs [14] sont respectivement de 92 et 105 mg/kg avec lacide cafique et lacide gallique qui sont les talons les plus utiliss (Tableau 1). La mthode manque de spcificit, le dosage ne permettant pas de distinguer les phnols simples des phnols complexes [15, 16, 17, 18]. Les rsultats obtenus par absorptiomtrie selon FC diffrent de ceux obtenus par chromatographie en phase liquide [17, 19, 20].

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La stabilit loxydation, value par le test de Swift avec le Rancimat, ne serait pas corrle avec la teneur en composs phnoliques pour Pirisi et al. (18) ce qui est contraire aux rsultats dautres auteurs qui trouvent que la stabilit des huiles est bien corrle avec la teneur en phnols totaux [21, 22]. Malgr ces problmes et les divergences de la littrature, Blekas et al. [14] considrent que le dosage des phnols des huiles dolive selon FC constitue une bonne analyse de routine.

Tableau 1 : talons, de mesure, domaine de variation Ref. Auteurs talons [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [3] [15] [31] [32] [21] [33] Singleton, (1965) Montedoro, (1969) Montedoro, (1972) Ragazzi, (1973) Vazquez, (1978) Gutfinger, (1981) Cortesi (1983) Solinas, (1987) Nergiz, (1991) selon [21] Montedoro, (1992) Tsimidou, (1992) Favati, (1994) Stefanoudaki, (1995) Baldioli selon [3], (1996) Poiana selon [3], (1996) Ac gallique Gallotanin Ac gallique Tyrosol Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac gallique Ac cafique Tyrosol Ac cafique Ac gallique Ac gallique Ac gallique Ac gallique Ac cafique Ac cafique Ac gallique Ac cafique Ac cafique Ac gallique Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac cafique Ac gallique

mesure nm 765 765 725 725 765 725 725 765 765 765 765 725 725 765 725 725 765 725 725 725 765 725 750

Teneurs en phnols en mg/kg dhuile 76-442 34,90-271,04 mg/l 50-500 44-157 180-454 260-665 35-355 50-1000 18,7-242,5 98-458 153-400 190-500 85-195 110-180 119-139 175-490 99-203 100-904 52-356 59-255 73-265 115-159 19-380 20 339 42-124 130-170 98-209 FC FC FC FC FD FC FC FC FC FC FD FC

[19] Cioni, (1998) [34] Caponio (1999) [35] Ranalli (1999) [36] Beltran (2000) [37] Capannesi (2000) [38] Giacometti (2001) [39] Lo Curto 2001) [40] Pellegrini selon [22], (2001) [41] Ranalli [42] Salvador (2001) [43] Tasioula selon [27] [14] Blekas (2002) [44] Gimeno (2002) [45] Gomez-Alonso (2002) [46] Psomiadou (2002) [47] Bendini (2003) FC : Folin-Ciocalteu ; FD : Folin-Denis [13]

FC FC FC FC FC FC FC FC FC FC FC

Protocoles exprimentaux Les tableaux 2 et 3 rsument les diffrents protocoles exprimentaux dcrits dans la littrature en ce qui concerne lextraction des phnols et les conditions exprimentales de ralisation de la raction de FC.

Annales des falsifications, de lexpertise chimique et toxicologique, 2me Semestre 2004-N965-pp.169-196 Tableau 2 : Extraction des phnols Rf. Huile Solvant / ml Solvant extraction g v/v [27] 10 Hexane/50 3x20ml ;MeOH/H2O; 6/4 [3] 10 non 3x10ml ;MeOH/H2O; 8/2 [15] 50 Hexane/50 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 [19] 2 Hexane/1 3x2ml ;MeOH/H2O; 6/4 [37] 2,5 Hexane/2,5 3x2,5ml ;MeOH/H2O; 8/2 [38] 50 Hexane/50 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 [39] 40 non 20ml ;MeOH/H2O; 8/2 [14] 30 Hexane /30 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 [48] 10 non 2x10ml ; MeOH/H2O; 8/2 *Hexane satur en MeOH/H2O (8/2) Tableau 3 : Conditions de la raction de Folin-Ciocalteu Rf. Huile dpart Volume final Prise essai Folin g Extrait MeOH ml [27] 10 1ml 100l 0,5 [3] 10 np np np [15] 50 5ml 2ml 0,5 [19] 2 100l 100l 2,5 [37] 2,5 np 2,5 [38] 50 0,5 [39] 40 200l 200l 10ml 10% [14] 30 aliquote 5ml/25 puis 0,5 2ml [48] 10 50 ml 2ml 1,0 np : non prcis; obs : obscurit Tween 20 g non oui non non non non non non 0,2 Lavage ml Hexane 3x50 Hexane 2x2 Hexane 3x50 Hexane 1x50 Hexane* 10 puis 2x5ml

Na2CO3 1ml ; 35% np 1ml ; sat 5ml ; 7,5% 5ml ; 7,5% 1ml; satur 8ml ; 7,5% 1ml ; 35% 5ml ; 10%

V. final ml 10 np 25 50 50 25 20 25 20

Temps min 60 np 60; obs 1 nuit 60 60 60 90, obs

nm 725 np 725 765 765 725 725 725 750

La trs grande diversit des conditions dextraction et des conditions de ractions sont probablement une des causes de la variabilit des teneurs en phnols donnes dans le tableau 1. Il devient donc ncessaire de dfinir avec prcision lensemble des conditions exprimentales du dosage pour valuer les teneurs en phnols dans les huiles dolive. 2.2. Dosage des ortho-diphnols Les o-diphnols sont les anti-oxydants les plus puissants (hydroxytyrosol, acide cafique). Diffrents talons ont t utiliss en fonction des auteurs. Le tableau 4 donne les talons utiliss, la longueur donde de mesure et le domaine de variation des teneurs.
Tableau 4 : talons, de mesure, domaine de variation Rf. Rfrence talons [27] [49] [50] [51] [14] [14] [45] [47] Gutfinger, 1981 Ranalli 1997 Mateos, 2001 Salvador, 2001 Blekas, 2002 (mthode A) Blekas, 2002 (mthode B) Gomez-alonso, 2002 Bendini, 2003 Ac. cafique Ac. cafique Ac. cafique Ac. cafique Ac. 3,4-di OHPhnylAc Ac. cafique Ac. 3,4-di OHPhnyl Ac Ac. cafique Ac. gallique mesure nm 350 370 370 350 450 350 450 370 370 Teneurs en o-diphnols (mg/kg) 5-15 61-194 7,8 5,5 7-24 42-168 12-186 6-87 6,45-9,07 66,7-90,0

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Les deux mthodes les plus utilises ont t tudies. Ces mthodes daprs la littrature seraient spcifiques des o-diphnols. La mthode A est base sur la formation de complexes entre les o-diphenols et les ions molybdate, Les o-diphnols ragissent avec le molybdate pour former un complexe jaune. La mthode B est base sur la nitration des o-diphnols avec le nitrite de sodium en prsence dions molybdate. Ces derniers augmentent lintensit de la couleur des drivs nitrs probablement par formation de complexes. Le tableau 5 rassemble les diffrentes conditions analytiques de ce dosage.
Tableau 5 : Conditions de la raction de dosage des o-diphnols. Rf. Huile Extrait Prise Eau Phosphate Na2MoO4 Temps dpart MeOH essai pH=6,5 5% Min g ml ml ml 0,1 M, ml ml nm [27] 10 1 0,2 1 1 2 15 350 [49] np [50] 2,5 101 4 1 15 370 [51] 370 [14] 30 22 0,2 1 1 2 350 [14] 3 30 22 0,2 1 450 [45] 370 [47] 370 1 MeOH/H2O (1/1) ; 22ml fraction polaire dans 5 ml mthanol puis ajust 25 ml avec H2O 3 mthode B diffrente base sur la nitration en prsence de molybdate

3. Matriels et mthodes
3.1. Les chantillons Les analyses ont port sur : - Une huile dolive vierge dorigine espagnole ; - Une huile monovaritale de Picholine a t conserve au laboratoire diffrentes tempratures (- 18C, +4C et TC ambiante) depuis 2001 et labri de la lumire, les analyses ont t effectues aprs 36 mois de stockage; - Quatre huiles issues dolives de la varit Tanche des tats de maturit diffrents ; - Deux huiles mono-varitales (Bouteillan et Salonenque) en vue de dterminer des profils spcifiques. 3.2. Dosages absorptiomtriques Extraction des composs phnoliques 10 g d'huile d'olive ( 0,01 g prs) et 10 ml de solution mthanolique (mthanol/eau; 80/20, v/v) sont placs dans un tube centrifuger. On agite pendant 10 minutes au Vortex. Aprs centrifugation, pendant 15 min 3800 rpm, la phase mthanolique est rcupre et transfre dans une fiole jauge de 50 ml. Lopration est reconduite 2 fois et on complte au trait de jauge avec la solution mthanol/eau (80/20). Dosage absorptiomtrique Folin-Ciocalteu Une solution mre de tyrosol (Extrasynthse, 4834) 1mg/ml dans le mlange mthanol/eau (80/20, v/v) est utilise pour prparer des solutions filles 10, 20, 80 et 200 g/ml. 2 ml de solution extraite sont ajouts 5 ml deau distille, 1 ml de ractif et 5 ml dune solution aqueuse de Na2CO3 ( 10%, p/v). Aprs agitation, la solution est laisse lobscurit avant la mesure de labsorbance 750 nm. Des quantits de ractifs de 1 5 ml de ractifs ont t utilises, des temps de contact de
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30, 60 et 90 min ont t utiliss. Le dosage a t ensuite ralis avec 2 autres talons lacide syringique (Fluka, 86230) et lacide 4-hydroxyphnylactique (Fluka, 56140). Dosage absorptiomtrique des ortho-diphnols partir de la mthode A [14, 50] Une solution mre dacide cafique (Extrasynthse, 6018) 2,617 mmol-1 dans le mlange mthanol/eau (1/1, v/v) est utilise pour prparer des solutions filles comme dfinies dans le tableau 6. 2 ml de solution extraite sont ajouts 0,5 ml dune solution de molybdate de sodium dihydrat ( 5%, p/v, dans un mlange thanol/eau, 1/1, v/v). Le mlange est agit vigoureusement et aprs 15 minutes, l'absorbance des solutions phnoliques est mesure 370 nm. On observe une coloration jaune plus ou moins intense.
Tableau 6 : Solutions talons Sol. mre d'acide cafique (ml) Volume fioles jauges (ml) Sol. mthanolique (1:1) Concentration en acide cafique (10-3 mmol.l-1) E1 0,4 20 52,33 E2 E3 E4 1 2,1 3,2 20 20 20 Complter au volume 130,83 274,75 418,67 E5 4,2 20 549,51

3.3. Dosage par chromatographie liquide Extraction des composs phnoliques [50] On introduit 2,5 g d'huile dans un ballon auquel on ajoute 200 l de chaque solution talon (acide para-hydroxyphnylactique dans MeOH 4,64.10-2 mg/ml et/ou de lacide syringique 9,6.10-3 mg/ml). On vapore au rotavapor une temprature infrieure 40C le solvant de ltalon. On reprend le rsidu dans 6 ml d'isooctane pour passage sur SPE. Extraction sur phase solide (SPE) [50] Lextraction est ralise avec une cartouche de phase diol Supelclean LC-DIOL (500 mg/3ml) SUPELCO (greffage polymrique: 2,3-dihydroxypropoxypropyl (7% C)). On conditionne les cartouches avec 6 ml de mthanol puis 6 ml d'isooctane. On lue lextrait prcdent, puis on lave une 1re fois avec 23 ml d'isooctane, puis une 2e fois avec 4 ml d'un mlange d'isooctane/actate d'thyle (90/10, v/v). Llution des composs phnoliques seffectue avec 10 ml de mthanol que l'on transfre dans un ballon conique. On vapore sec une temprature infrieure 40C. Le rsidu est extrait avec 100 l de mthanol/eau (1/1, v/v) 40C. On injecte 10 l de la solution obtenue. Analyse par chromatographie liquide [52] Lanalyse de la fraction phnolique est ralise sur une chane Lachrom (MERCK). Le solvant dlution est un gradient binaire A= H2O/ CH3COOH (98/2, v/v), B= CH3OH/CH3CN (50/50, v/v) suivant un gradient dont les conditions sont reprises dans le tableau 7. L'appareil utilis est un systme avec un dtecteur spectrophotomtrique UV2000 (Spectra-Physics) fonctionnant 2 longueurs donde. Le systme de sparation est un ensemble de deux colonnes ChromolithTM Performance RP-18e MERCK (4,6 mm x 100 mm) montes en srie prcd dune pr-colonne ChromolithTM Guard Cartrridge RP-18e MERCK (4,6 mm x 5 mm). Lanalyse est ralise a un dbit constant de 4 ml/min.
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Annales des falsifications, de lexpertise chimique et toxicologique, 2me Semestre 2004-N965-pp.169-196 Tableau 7 : Gradient d'lution Temps A (en %) B (en %) 0 95 5 6 90 10 30 60 40 35 50 50 37 0 100 40 0 100 42 95 5 45 95 5

4. Rsultats-Discussion
4.1 tude des conditions exprimentales du dosage absorptiomtrique selon Folin-Ciocalteu 4.1.1 Influence du temps de contact et des quantits de ractifs La figure 4 montre la variation de labsorbance dun talon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium en prsence de 0,5 ml de ractif de Folin et 1 ml de Na2CO3 ( 7,5%, p/v).

Etalonnage TYROSOL
0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 100 T eneur en p p m 150 200 T = 3 0 min T = 6 0 min T = 9 0 min

Figure 4 : Variation de labsorbance 765 nm en fonction du temps de contact des ractifs

Le complexe color est vert. On constate quil ny a pas linarit des rponses en fonction de la teneur en tyrosol et cela quel que soit le temps de contact lobscurit avec le carbonate de sodium. La figure 5 montre la variation de labsorbance dun talon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium et une augmentation de la quantit des ractifs savoir 1 ml de ractif de FC et 5 ml de Na2CO3 ( 7,5%, p/v). Laugmentation de ractifs permet dobtenir la linarit de la rponse partir dun temps de contact de 60 min Cette dure correspond au temps moyen de la plupart des mthodes dcrites dans le tableau 3.

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Etalonnage TYROSOL
1,20 1,00 0,80 0,60 T = 3 0 min 0,40 0,20 0,00 0 50 100 T eneur en p p m 150 200 T = 6 0 min T = 9 0 min

Figure 5 : Variation de labsorbance 765nm en fonction du temps de contact et aprs augmentation de la quantit des ractifs.

4.1.2 Influence du choix de ltalon pour tablir la courbe de calibration

Figure 6 : Influence du choix de ltalon
Courbe d'Eta lonna ge R a ctif de FOLIN-CIO CALTEU
1,4 1,2 1 Absorbance 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 50 100 T e n e u r e n m g /l 150 200
A c id e 4 - hyd r o xyp h nyla c t iq ue

y = 0,0061x + 0,0309

y = 0,0059x - 0,0159

T yr o s o l

A c id e S yring iq ue

y = 0,0038x + 0,0054

La figure 6 montre linfluence du choix de ltalon sur la rponse. Les rponses diffrent en fonction de ltalon choisi. La tendance actuelle des ngociants est de demander une valeur minimale en phnols totaux aux producteurs. Cette tude montre que cette exigence doit tre associe un protocole prcis danalyse de la teneur en phnols spcifiant la nature de ltalon utilis Nous proposons dutiliser le tyrosol comme talon car dune part il donne une rponse satisfaisante avec le ractif de FC et dautre part parce quil est un des constituants de la fraction phnolique dans les huiles dolive alors que celles-ci ne contiennent ni lacide 4-hydroxy phnyl actique ni l'acide syringique. 4.2 Analyse chromatographique La figure 7 montre un chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge. Lidentification des diffrents pics a t ralise laide de composs de rfrence (tyrosol, vaniline, ac. vanillique, ac. cafique, ac. p-coumarique, ac. frrulique, querctine, lutoline) et par rapport aux donnes de la littrature [45, 47, 50, 53,54]. Certains composs nont pas t identifis
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tandis que dautres nont pas une identification certaine en raison de labsence de composs de rfrence.

Figure 7 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge dorigine espagnole (talon 1 : ac. syringique, talon 2 : ac. 4-hydroxy phnyl actique)

4.2.1 Influence des conditions de stockage sur la teneur en phnols dune huile dolive (Picholine) La figure 8 montre les variations des principaux phnols dune huile de Picholine conserve trois tempratures diffrentes pendant 36 mois.
90.00 80.00 70.00 Teneur en mg/Kg 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 T ambiante 4C -18C

W e S ni n + ig R Ap + O l no si r N no pi )(+ lin e o t Lu e K ti n rc ue

Figure 8 : volution de la composition phnolique dune huile de Picholine en fonction des conditions de stockage, dtermination effectue par HPLC.

Les phnols voluent diffremment suivant leur nature : - Lhydroxytyrosol et le tyrosol augmentent en fonction de llvation de la temprature de stockage ; - Les phnols complexes (C et D notamment) diminuent lorsque la temprature de stockage augmente.
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C ol ol s os ro y r Ty x yt ro yd

D +E

+F

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Lors du vieillissement des huiles, les phnols complexes (secoridodes) se dcomposent en librant de lhydroxytyrosol et du tyrosol. Lhydroxytyrosol est un anti-oxydant qui protge lhuile de loxydation. Dans une huile frache et non dgrade, les teneurs en hydroxytyrosol et en tyrosol sont trs faibles car ils se trouvent principalement sous forme complexe (secoridodes) et trs faiblement sous forme libre. Les phnols totaux des trois chantillons de lhuile de Picholine, dtermins par la mthode de FC et par HPLC, sont compars figure 9. La mthode de FC donne des rsultats toujours trs suprieurs la mthode HPLC. Les deux mthodes donnent des rsultats qui varient peu avec la temprature toutefois la figure 8 montre des variations quantitatives entre les diffrents phnols. En conclusion, si lanalyse des phnols totaux permet dapprocher le potentiel anti-oxydant dune huile, seule une analyse par HPLC permettra dvaluer sa capacit la rsistance loxydation.

600 Teneur en phnols totaux en mg/kg 500 400 300 200 100 0 Tamb 4C -18C Folin-Ciocalteu HPLC/UV

Figure 9: volution de la teneur en phnols totaux en fonction des conditions de stockage et de la mthode de dosage.

4.2.2 Influence de la maturit des olives de la varit Tanche sur la teneur en phnols des huiles La figure 10, montre les rsultats des dosages des phnols totaux selon FC et des o-diphnols dtermins par absorptiomtrie sur quatre chantillons dhuiles provenant dolives de la varit Tanche. Ces rsultats sont compars aux teneurs en phnols totaux et en ortho-diphnols dtermins par HPLC. En ce qui concerne les phnols totaux, dtermins selon FC, les quatre chantillons prsentent des teneurs qui varient en sens inverse de celles dtermines par HPLC. Les variations observes peuvent tre dues la diffrence de maturit des olives. Plus la maturit des olives augmente, plus la teneur en phnols dtermine par HPLC diminue ce qui est en accord avec la littrature. Le fait que la teneur en phnols, dtermine par FC, augmente montre quil y a formation de composs secondaires doxydation qui ragissent avec ce ractif dans les conditions prcdemment dcrites. En ce qui concerne les o-diphnols, les dosages par absorptiomtrie ou par HPLC donnent des teneurs faibles mais du mme ordre de grandeur. Ces dterminations qui prsentent peu de variation, ne sont pas trs significatives pour valuer ltat de maturit des olives.

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300 250
Ph nols par Folin-Ciocalte u Ph nols totaux par HPLC O -diPh nols par colorim trie O -diPh nols par HPLC

Teneurs en mg/kg

200 150 100 50 0

Ech 1

Ech 2

Ech 3

Ech 4

Figure 10 : volution des diffrentes fractions phnoliques en fonction de la maturit des olives (Tanche).

4.2.3. Caractrisation dune huile par son profil chromatographique La figure 11 montre lanalyse de la fraction phnolique par HPLC dune huile de la varit Bouteillan qui a une teneur en phnols totaux importante (349 mg/kg). Cette teneur a t dtermine par talonnage interne en chromatographie liquide. On constate que cette huile a un fort potentiel de conservation. En effet, cest une huile qui possde un important pouvoir anti-oxydant car elle contient beaucoup de phnols dits complexes (temps de rtention des composs entre 16 et 32 min).

Figure 11 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge de la varit Bouteillan.

Dautre part, cette huile est peu oxyde car les teneurs en tyrosol et en hydroxytyrosol sont faibles ( temps de rtention entre 1 et 6min). En revanche, nous pouvons remarquer sur la figure 12 que lhuile de la varit Salonenque analyse, a subi une oxydation importante puisque sa teneur en phnols totaux est faible (118 mg/kg)

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Salonenque Phnols totaux: 117,90 mg/kg

Figure12 : Chromatogramme de la fraction phnolique dune huile dolive vierge de la varit Salonenque.

De plus, les teneurs en tyrosol et hydroxytyrosol sont importantes par rapport aux taux des phnols complexes. Cette huile peut tre issue dolives trop mres, dun stockage des olives avant trituration trop important ou de mauvaises conditions de stockage de lhuile.

Conclusion
Les mthodes absorptiomtriques danalyse de la fraction phnolique des huiles peuvent apporter des informations sur le potentiel anti-oxydant aux producteurs, aux ngociants des cots intressants. Il convient de prendre avec circonspection les rsultats issus de ces mesures tant que ces mthodes ne seront pas normalises tant dun point de vue mthodologique que dun point de vue de lexpression des rsultats. Les rsultats prliminaires concernant le dosage de la fraction phnolique par HPLC permettent de montrer quen plus dune teneur totale en phnols, on peut observer le "potentiel antioxydant de lhuile" par la prsence de phnols dits complexes alors que souvent le potentiel anti-oxydant dune huile ntait valu qu partir de composs simples comme le tyrosol et lhydroxytyrosol qui sont en fait des composs secondaires, anti-oxydant, dj issus dune dgradation de lhuile.
Remerciements Frdrique Franceschi et Muriel Richard pour leurs collaborations techniques.

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