Principiile toxicologiei biochimice

Biometode cu aplicatii in farmacologie si toxicologie

Master in farmacologie si toxicologie

 Obiectiv general: Dobndirea cunotinelor viznd principiile moderne specifice design-ului cercetrii n domeniul farmacologiei i toxicologiei Obiective de nvare: a. Indicarea mecanismelor biochimice implicate n metabolizarea xenobioticelor b. Indicarea mecanismelor biochimice implicate n protecia i injuria celular general i specific fiecrui esut/organ c. Exemplificarea principiilor biometodelor cu poteniale aplicaii n cercetarea farmacologic i toxicologic

Coninutul prelegerilor
1. Definirea si scopul toxicologiei biochimice Principiile fundamentale ale recunoasterii xenobioticelor de catre celule. 2. Oxidarea biologica si reducerea biologica a oxigenului. Rolul oxidarii biologice in metabolizarea xenobioticelor 3. Metabolismul xenobioticelor: reactiile de faza I enzimologia reactiilor de faza I (OFMM Cit P450, alte oxidaze) 4. Metabolismul xenobioticelor: procesele din faza a II-a enzimologia proceselor de conjugare, eliminarea xenobioticelor 5. Rolul metalelor in biochimia toxicologica 6. Mecanisme biologice implicate in injuria celulara 7. Mecanisme biochimice in protectia celulara 8. Factorii care au influenta asupra metabolismului xenobioticelor. Polimorfisme ce afecteaza metabolismul xenobioticelor 9. Mecanisme biochimice ale hepatotoxicitatii 10. Mecanisme biochimice ale nefrotoxicitatii 11. Mecanisme biochimice ale neurotoxicitatii 12. Mecanisme biochimice ale toxicitatii cardiovasculare 13. Mecanisme biochimice ale toxicitatii aparatului respirator 14. Mecanisme biochimice ale toxicitatii reproductive

Definirea si scopul toxicologiei biochimice

Toxicologia stiinta care studiaz otrvurile, complexitate n mod de abordare i grad de exprimare Biochimia - tiina care studiaz compozitia, structura i reactiile dintre constituentii chimici din celulele vii
Toxicologie

Medicin

Biologie moleculara

Biochimie

Farmacologie

Imunologie

Patologie

Definirea si scopul toxicologiei biochimice

Toxicologia biochimic si moleculara definirea, la nivel molecular si celular, a cascadei de evenimente initiate de expunerea la un compus toxic, culminand cu un punct final al toxicitatii Utilizeaz tehnici variate chimie, biochimie, biologie moleculara Toxicologia biochimica studiul proceselor implicate in interactia toxic chimic organism viu la nivel celular, molecular sau pe organ Procesul otravirii cascada de evenimente complexe: 1. Expunere biomarkeri de expunere (A) 2. Captare si distributie (A, D) 3. Metabolizare (M) 4. Mod de actiune 5. Detoxifiere si eliminare (E) Scop final: - intelegerea toxicitatii acute si cronice, determinarea biohazardului - dezvoltarea de noi medicamente sau antidoturi

Definirea si scopul toxicologiei biochimice

Toxicologia celulara studiul efectelor toxice pe culturi celulare intacte, mai putin complexe decat organism. - util pentru teste toxicologice de rutina Toxicologia moleculara studiul rolului expresiei genice - farmacogenomica si toxicogenomica - proteomica - metabolomica

Principii fundamentale ale recunoaterii xenobioticelor de ctre celule Efectul terapeutic sau toxic al subst. chimice acces fiziologic la locul de aciune n conc. mare, mai mult timp Doza determin otrava (Paracelsus) Distribuia, conc., timpul determin interrelaia doz-rspuns Procese implicate expunere i absorbie, distribuie, metabolism eliminare (ADME) Influena transportorilor de xenobiotice dublu rol protecie acces limitat n compartimente importante - mpiedic farmacoterapia interacii medicament toxic Transportorii afecteaz eficacitatea i toxicitatea medicamentelor Ex. Tratament cu digoxina rspuns diferit pentru aceeai doz - Supraexprim. transportor reduce abs., crete elimin.fr efect - Subexprim. transportor crete abs., scade elimin.efect adverse competiie pt. transport cu alt S

Transportul la nivel celular

Biomembrane structuri fosfolipoproteice, permeabile selectiv

Proteinele membranare eseniale pentru permeabilitate - faciliteaz deplasarea compuilor polari - acioneaz selectiv - cupleaz energetic transportul cu procesele metabolice

Transportul prin membrane Clasificare transportori proteici

Factori care influeneaz coef. partiie lipide/ap structura i integritatea membranei

Transportul prin membrane Transport pasiv deplasare n sensul gradientului de conc. sau electrochimic (pt. ioni), fr consum de energie - difuzie simpl, difuzie facilitat Difuzie simpl fc. de gradientul de conc., anulare la egalarea conc. de o parte i de alta a membranei - vitez mic, neselectiv, cinetic liniar, necomp. - permeabilitatea fc. de dimensiune, liposolub.

 Difuzie facilitat mediat de permeaze (pt. molec. polare, ioni) - reduc energia de activare pentru transport - suport modificri conformaionale - leag S pe o fa, l elibereaz nemodificat - cinetic Michaelis-Menten - similar transportorilor pt. glucoz, Cl-, HCO3-

 Difuzie facilitat transportor GluT

Schimbtor de anioni eritrocit

 Canale ionice - proteine transmembranare canale hidrofile pt. ioni (funcioneaz cteva milisecunde) - mai multe tipuri de canale - deschise la modif. de potenial/la legare ligand

 Transportul activ - realizat unidirecional, contra gradientului de conc., cu consum de energie (ATP, deplasare ioni) - cinetic Michaelis-Menten - compuii ce reduc gradientul ionic - otrvuri Transportul activ a) primar b) secundar

 Tipuri de pompe pentru transport activ (ATP-aze)

 Pompe ionice - Na+K+ATP-aza (pompa de Na+ i K+) - menine gradientul conc. Na+ ,K+ n celul - activat prin fosforilare (crete afinitatea pt.K+ scade pt.Na+)

 Diferene ntre mecanisme de transport pasiv i activ

 Endocitoza nespecific (pinocitoz, fagocitoz) transport macromolecule (antigene, hormoni), celule

 Endocitoza receptor mediat

Exocitoza

Transportul la nivel tisular

Transportul sbst. n esuturile de eliminare epiteliu tub proximal - prin bariere tisulare (endoteliul capil. din creier) Etape consecutive intrare n celul la un pol - traversare celul-interacii cu proteine, organite - eliminare la alt pol celular Difuzie simpl sau transport specific, direcia de transport det.de: - distribuie polarizat transportor - selectivitate diferit - energia necesar transport

Transportorii de xenobiotice Studiul transportului xenobioticelor n trei etape descriptiv - mecanic - molecular Etapa descriptiv stabilire - ci de excreie a xenob. bila, urina - bariere pentru xenob. capilare creier testicul, placent, intestin Etapa mecanic stabilire mecanisme celulare de baz pt. excreia selectiv i funcia de barier - proteinele de captare i eflux mai multe familii Etapa molecular identificare i caracterizare molec. transportori - baza molecular a familiilor de transportori Furnizeaz modele moleculare pentru: a. descrierea funciei de transport i cuplarea cu metabolismul b. nelegerea modului de reglare c. elaborarea de modele complexe, integrative, farmacocinetice pentru studiul distribuiei i aciunii xenobioticelor

 Familii de transportori la mamifere Superfamilia de transportori ABC glicoproteina P (ABCB1, MDR) MRP 1-9 BCRP (ABCG2) Superfamilia de facilitatori majori SLC OAT polipeptide OAT (OATP) OCT PEPT1-2 (peptide) ENT (nucleozide)

 Superfamilia de transportori ABC influen asupra captrii, distribuiei i excreiei medicamentelor - transportori activi, pompe de eflux, multispecifici - superfamilia ABC (ATP-binding cassette) - 2 domenii intracelulare pt. nucleotide - 2 regiuni transmembranare - regiuni TM suplim. (MRP) - 1 domeniu legare nucleotide (BCRP) - n esuturi normale au rol n: - eliminare - rinichi (MRP2, BCRP) - de barier creier (p-gp) - absorbie intestin (MRP2) - la polul luminal - limit. captarea (creier, intestin) - favorizeaz eliminarea (rinichi)

 Glicoproteina P (ABCB1, MDR, p-gp) - glicoprotein fosforilat, 170 kD, transportor activ - transport cationi organici, baze org. slabe, unele medicamente nencrcate, chimioterapeutice tip derivai peptidici, blocante canale Ca, ciclosporin, digoxin, inhibitori HIV - transportor de eflux - superexprimat n celulele rezistente la medicamente - inhibare transportor creste sensibilitatea celulelor la tratament Multidrug resistance associated protein (MRP 1-9, ABCC) - izolat din celule tumorale rezistente ce nu exprim p-gp - transportor activ, mai multe forme (MDR 1-9), distribuite diferit - specificitate - prefer anioni, dar transport i metabolii - colocalizare cu enzimele implicate n metabolism (MRP 1-3) - MRP 4-5 localizare specific muchi (5), nervi (4,5) - supraexprimarea limiteaz acumularea unor chimioterapeutice - transport anioni organici (cAMP), acizi org. slabi, medicamente nencrcate, deriv. peptidici sau metabolii, statine, MTX, endoteline, nucleozide ciclice (AZT) (4-5), cefalosporine, GSH (1-2), conjugai

 BCRP (ABCG2) - izolat din placent sau din celule tumorale rezistente ce nu exprim p-gp i MRP - transportor activ, cu un singur domeniu de legare nucleotide - funcioneaz ca dimer sau oligomer superior - exprimare crescut n celulele tubului proximal - hipoxia det. Supraexprimarea sa - interacioneaz cu hem, porfirine protejeaz fa de acumulare n condiii de hipoxie - se exprim n diferite celule stem protecie fa de sbst.toxice - transport compui hidrofobi, baze slabe, anioni organici, diferii conjugai ai unor molecule exogene (medicamente, carcinogeni)

 Superfamilia de facilitatori majori Transportorii de anioni organici (OAT, SLC22A) - familie format din 6 membri, aciune multispecific - OAT1 i 3 implicai n elim. de anioni Na-dependent n rinichi - OAT3 creier (singurul transportor) - transport diferii anioni organici (medicamente, produi de metabolizare medicamente sau toxice: NSAID, fluorochinolone, antibiotice beta-lactamice, nucleozide, PAH, AZT, prostaglandine, statine, cimetidin, MTX, tiroxin, GSH, glucurono-, sulfoconjugai) Transportorii de cationi organici (OCT, SLC22A) - aciune multispecific, controlul captrii din snge n epiteliile excretorii (rinichi, ficat) OCT1-2 - OCT3 transport neurotransmitori (creier i alte esuturi) - transport diferii cationi organici: neurotransmitori, cimetidin, blocante ale canalelor de Ca - cotransport Na-dependent pentru carnitin i alte sruri de tetraalchilamoniu (OCTN 1-2 rol n interacia medic.- nutrient)

 Polipeptide transportori de anioni organici (OATP, SLC21A) - circa 50 polipeptide - dou grupe specificitate larg pentru S ficat, rinichi, bariere specificitate naltspecifice - transport PG-OATP2A1 - transport concentrativ independent de Na pentru diferii anioni organici: MTX, eicosanoide (PG), statine, tiroxin, digoxin, sruri biliare, GSH, glucurono i sulfoconjugai ai hormonilor

Transportorii de nucleozide i nucleotide (SLC28, SLC29) - 3 membri cu rol concentrativ cuplai cu Na (CNT 1-3) captare intracelular de nucleotide (1 pirimidine, 2 -purine) - exprimare la polul apical al epiteliilor polarizate - 4 membri cu rol echilibrativ (ENT 1-4) - difuzia facilitat a nucleotidelor - exprimare n diferite celule la polul bazolateral n rinichi - mediaz transportul absorbtiv (spre snge) al nucleozidelor, nucleotidelor i analogilor acestora (AZT, fluorouridin, 5-FU etc)

 Transportorii de peptide (SLC15) - familie format din 4 membri, contransport dependent de H+ - transport di i tripeptide, medicamente peptidomimetice - PEPT1 -2 n epitelii polarizate mediaz captarea la polul apical - afinitate diferit PEPT1 capacitate mare, PEPT2 - afinitate mare - favorizeaz abs. peptidelor din lumen n snge (intestin i rinichi) - substraturi oligopeptide, inhibitori ACE, antibiotice -lactamice Alterarea transportului xenobioticelor - Competiia pentru transport complic farmacoterapia efectul polifarmaciei - Importan clinic efecte adverse sau benefice Ex: asociere digoxin verapamil, statine substraturi pentru p-gp asociere penicilin probenecid (inhibitor OAT 1,3) asociere loperamid-chinidin substrat p-gp reducerea nefrotoxicitii unor nucleotide cu inhibitori OAT - Reglarea transportorilor exprimarea transportorului - funcia transportorului - heterogenitatea genetic

Interacia xenobiotic int biologic (xenobiotic receptor) Receptorii macromolecule care leaga molecule mici liganzi - liganzii endogeni, exogeni mas molecular mic sau mare - afinitate mare, initiaz un efect biochimic Receptori farmacologici, toxicologici situs de legare cu afinitate ridicat ce iniiaz modificrile funcionale induse de xenobiotic - mediaz abilitatea celulelor de a-i schimba comportamentul ca rspuns la interacia cu un xenobiotic Receptorii - proteine difer prin structur, specificitate pentru liganzi i localizarea n celul - domeniu funcional pt. recunoaterea ligandului - domeniu funcional de generare a semnalului ce cupleaz complexul LR cu o funcie celular

 Medicamentele i subst. toxice ca liganzi Medicamentul orice subst. chimic ce afecteaz organism. viu - benefice la doze clinice, toxice la doze mari Indicele terapeutic = TD50/ED50 - IT mare medicam. toxice la doze mult mai mari ca doza terap. - IT mic medicam. cu limite nguste de siguran Legtura X-R legturi slabe, necovalente, complementaritate

Tip de interacie toxic-receptor Agonist-compus diferit de ligand endogen, mimare aciune ligand Antagonist - compus care se leag la R, nu iniiaz un rspuns biologic, blocheaz legarea ligandului endogen Inhibiie alosteric toxic legat la alt situs, det. modif. conforma. Receptori fr liganzi endogeni, leag numai toxice

 Afinitatea tenacitatea prin care medicam se leag de R dependent de conc. ligand ce determin efectul reflect diferena ntre rata asociere rata disociere - afinitate mare conc. mic de ligand - afinitate mic conc. mare de ligand Potena abilitatea toxicului de a cauza modificri cuantificabile - poten mare modif. la conc. mic poten redus modif. la conc. mare de toxic Eficacitatea (activitatea intrinsec) efect. maxim det. de ligand - definit prin raportare la ligandul endogen - agonist total agonist parial agonist invers scade efectul constitutiv opus agonist. antagonist Receptorii pentru mai muli liganzi - au trsturi comune sunt grupai n familii

 Traducerea semnalului ligandului - activarea mecanismelor prin care semnalul este recepionat i prelucrat pt. exercitarea efectelor Cale de semnalizare - cascad de reacii ce det. modificarea funciei i amplific rspunsul celular la semnal extern

Caracteristicile sistemului de traducere a semnalului specificitate pentru un anumit ligand adaptare se satureaz cu ligand i se adapteaz la acesta integrare informaiile se integreaz pt. un singur rspuns biologic amplificare ligandul formeaz m. m. molecule mesageri secunzi

Superfamilii de receptori receptori intracelulari receptori steroizi receptor citoplasmatic sau nuclear - regl. rata de transcriere/traducere a genelor

Aciune lent Efect permanent

Regiunea ADN unde se leag ligandul element de rspuns Afecteaz dezvoltarea, diferenierea i maturarea celulelor Liganzi endogeni h.sexuali, corticosuprarenalieni, calcitriol, retinoide

Superfamilii de receptori receptori membranari 1. receptor enzimatic (cu un domeniu transmembranar) legarea ligandului la domeniul extracelular stimuleaz activitatea enzimatic a domeniului intracelular Ex. receptorii de tip tirozin kinaz (RTK), tirozin fosfataz (integrine), de tip guanilat ciclaz, de moarte celular (receptor pt. TNF-) etc.

Tipuri de receptori enzimatici

 Receptori tirozin kinazici agregare i autofosforilare ce activeaz

reacii n lan ce controleaz creterea, proliferarea i diferenierea celular - cuplai cu fosfolipaza C (PLC) sau cu fosfatidilinositol-3- kinaza (PI3K)

Receptori tirozin kinazici receptor pentru insulin

Receptor pentru EGF

Receptor pentru FGF

Receptori

serin/treonin kinazici

Receptor pentru TGF

Superfamilii de receptori receptori membranari

2. canale ionice cu poart ligandul modific permeabilitatea membranei pentru ioni sau molecule mici (n membranele postsinaptice); Ex. receptorul nicotinic, receptorii pentru aa. (GABA, glutamat, glicin), receptorii serotoninergici

Superfamilii de receptori receptori membranari

3. receptor transmembranar legat de proteine G (n serpentin, cu 7 domenii transmembranare) ligandul activeaz proteine G Ex. receptori pt. liganzi endogeni receptori -adrenergici, receptori muscarinici, histaminergici, serotoninergici, pt. GABA (GABAB), metabotropici pt. glutamat
Caracteristic - semnalizare mai rapid, amplificat n cascad

Receptor tip 7-TM

 Proteinele G - Cuplare funcional R - sistem generator de mesageri secunzi - Leag nucleotide cu guanin GTP, GDP - Trimeri de dimens.mari, monomeri cu mas mic (Rho) - confer individualitate interac. cu sisteme efectoare diferite Gs activ. adenilat ciclaza Gi - inhib adenilat ciclaza Gq activ. fosfolipaza C

 Receptori adrenergici 1, 2, (1,2,3)

Mesagerii secunzi

Sistem de transformare a mesajului extern n mesaj intracelular: a. receptor specific membranar b. sistem de cuplare a X-R cu sistemul ce genereaz mesager secund c. sistem efector form. mesagerul secund - adenilat ciclaza AMPc guanilat ciclaza GMPc fosfolipaza C DAG, IP3 d. sistem care mediaz efectele celulare: protein kinaze A, C, G etc.

1. Nucleotide ciclice: AMPc: adrenalin, ACTH, PTH, LH, MSH, FSH, TSH GMPc: factor atrial natriuretic, NO, rodopsin 2. Ca2+: oxitocin, vasopresin etc. 3. Diacilglicerol (DAG): angiotensina, factori de cretere, acetilcolin 4. Inozitoltrifosfat (IP3): angiotensin, factori de cretere, acetilcolin

Sistemul efector adenilat ciclaz AMPc - proteinkinaz A

Sistemul efector adenilat ciclaz AMPc - proteinkinaz A

Sistemul efector fosfolipaz C IP3, DAG proteinkinaz C

Sistemul efector guanilat ciclaz GMPc proteinkinaz G

NO semnal intracelular

Sistemul efector factori de cretere proteinkinaz B

 Oxidarea biologic i reducerea oxigenului

Oxidarea transformarea compuilor n prezena O2 transferul electronilor de la substraturi organice la O2 oxidare principii CO2, H2O cuplare cu fosforilarea oxidativ
Cuplu redox Red1 Ox2
- ne+ ne-

Ox1 - oxidare Red2 - reducere NAD+ + H2O

E0= - 0,32 V
E0= 0,82 V

NADH + (1/2)O2 + 2H+ + 2eNAD+ + 2H+ + 2e(1/2)O2 + 2H+ + 2eNADH, H+ H2O

Oxidarea biologic - proces general, localizare mitocondrial a) ciclul Krebs b) lanul transportorilor de H+ i electroni (lanul respirator) c) fosforilarea oxidativ sinteza ATP

 Lanul transportorilor de H+ i e- reoxidarea echivalenilor de reducere

- 2e- sunt cedai n final O2 cu formare de ap - energia eliberat la reducere O2 folosit pt. fosforilare oxidativ

NADH + (1/2)O2 + 2H+ + 2e-

NAD+ + H2O

E0 = E0ac - E0don = 0,82 + 0,32 = 1,14 V

 Componentele lanului transportorilor de H+ i e - flavinenzime - citocromi - centre FeS (proteine FeS) - coenzima Q - proteine cu cupru Flavinenzime conin FAD Ex. succinat dehidrogenaza transfer 2e- i 2H+

Citocromii hemoproteine, difer prin natura hem i a legturii hem-apoprotein - principalii citocromi a, b, c - transfer 1e-

Heme b

Proteine Fe-S
- centre Fe-S Fe2S2, Fe4S4 proteine Rieske - transfer 1e-

Fe2S2

Fe4S4

Coenzima Q ubichinona
- component liposolubil, mobil - preia H+ i e-

 Coenzima Q10
- forma din esuturi umane - sintetizat n ficat exogen - nuci, pete - cofactor esenial pentru enzimele din lanul respirator - cantitate mai mare n esuturi cu necesiti energetice mari inim, ficat, muchi - antioxidant liposolubil n organism, complementar cu vitamina E Efecte benefice ale coenzimei Q10 - asigur un sistem cardiovascular sntos (benefic n hipertensiune, hiperlipemie, tratam. cu statine) - asigur funcionarea normal a sistemului imun - eficient ca anticancerigen n cancerul de sn - inhib dezvoltarea afeciunilor periodontale - eficient n boala Parkinson

 Proteine cu cupru n complexul final

- transfer electronii nainte de a fi cedai oxigenului - n relaie cu proteinele cu fier

Complex I NADH dehidrogenaza

- NADH CoQ oxidoreductaza - conine FMN, centre FeS - preia protoni i electroni de la NADH - pompeaz 4 protoni n spaiul intermembranar

Complex II succinat dehidrogenaza - conine FAD, centre FeS, cit b - transfer protoni i electroni la CoQ - nu are energie s pompeze protoni n spaiul intermembranar

Complex III citocrom c reductaza (sau oxidoreductaza) - conine citb, cit c (mobil), centre FeS - produce 2 citc redus per UQH2 oxidat - pompeaz 4 H+ per UQH2

Complex IV - citocrom oxidaza - conine cita, cita3, cupru (CuA, CuB) - primete electroni de la cit c - pompeaz 2 H+ per 2 citc redus - produce 1 mol de H2O per 2 citc reoxidai - pentru 1 mol NADH reoxidat rezult 1 mol H2O

Lantul respirator surs de specii reactive

 Semiubiquinona poate genera radicali superoxid prin reacia: Radicalul superoxid poate dismuta la H2O2 - SOD

UQH. + O2 UQ + H+ + O2.
2O2. + 2H+ O2 + H2O2

H2O2 sufer reacia Fenton n prezena ionilor feroi radicali hidroxil

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH.

 Fosforilarea oxidativ
- procesul de sintez a ATP cuplat curgerii e- prin lanul respirator - fora motrice a protonilor acumulai n membran - complexele I, III, IV pompe de H+ - 3ADP + 3Pi = 3ATP + 3H2O
E0= - 0,27 V

E0= 0,22 V

E0= 0,53 V

NADH + (1/2)O2+3ADP + 3Pi

NAD+ + 3ATP +4H2O

Complex V - ATP sintaza (ATPaza tip F)

- Converteste gradientul de H+ in ATP, produce 1 mol ATP per 2 sau 4 H+ - Subunitatea F0 se roteste in timp ce protonii curg, iar ATP este sintetizat odata cu modificarile conformationale ale lui F1 - Necesar un proton pentru a transloca ATP n afara matricei (ADP+Pi n)

Inhibitori ai lanului transportorilor de protoni i electroni

 Oxidarea n metabolizarea xenobioticelor - Oxidaze cu funcie mixt - citocromii P450 - Alte enzime: oxidaze, reductaze etc. Biosinteze endogene: - Hormoni - Mediatori - Activare vitamine Catabolism comp.endogeni Degradri xenobiotice Reacii catalizate: - aromatizri - hidroxilri - oxidri