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Viernes, 19 de octubre 2012.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENERIA.

Programa de Investigacin Estudios Nacionales y Servicios Ambientales.
Microbiologa. Maestra en Ingeniera Ambiental. Ciclo 2012-2013.
Laboratorio de: Tincin de Gram. Integrantes: Ing. Pablo Angulo. Ing. Alejandro Gonzales. Ing. Bayardo Bojorge. Ing. Julio Vado E. Ing. Henry Javier Vlchez.
Docente: MSc. Lic. Elda Escobar.
Programa de Investigacin Estudios Nacionales y Servicios Ambientales. Aislamiento de Microorganismo Mtodo de Drigalski.
Contenido
1 2 Introduccin ...................................................................................................... 3 Objetivos. .......................................................................................................... 4 2.1 2.2 3 Objetivo General ........................................................................................ 4 Objetivos especficos ................................................................................. 4
Fundamento de los mtodos. ........................................................................... 5 3.1Taxonoma. ..................................................................................................... 5 3.2 Tcnicas de tincin para la microscopia ptica. ............................................. 5 3.2.1 Preparacin del extendido ....................................................................... 5 3.2.2 Coloracin gram....................................................................................... 6 3.1 3.2 Materiales. .................................................................................................. 8 Procedimiento ............................................................................................ 8 Principio: .............................................................................................. 9 Observacin de la tincin de gram. ................................................... 10
3.2.1 3.2.2
3.2.3 Tincin de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (Frotis indirectos). ...................................................................................................... 12 4 5 6 7 Resultados obtenidos. .................................................................................... 14 Conclusiones .................................................................................................. 16 Anexos. ........................................................................................................... 17 6.1 Cuestionario. ............................................................................................ 18 Referencias bibliogrficas ............................................................................... 23
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Introduccin
El laboratorio es una herramienta primordial, ya que por medio de este se diagnostican diferentes patologas y adems se realizan estudios para establecer el tipo de tratamiento que se debe administrar, al igual que el seguimiento del mismo. Es necesario conocer y llevar a la prctica ciertas actitudes correctas y necesarias para el buen uso de los materiales de la actividad practica en un laboratorio, es as como debemos informarnos sobre la bioseguridad y los posibles riesgos que conlleva un mal manejo de los instrumentos pertenecientes a este recinto. El dia sbado 13 de octubre se llevo acabo el segundo laboratorio de microbiologa que abordaba la temtica de tinciones de gram, por ende en este laboratorio se aplicaron dos procedimientos de tincin de Gram, el primer mtodo es el frotis es el mas completo y el segundo que es el mtodo rpido utilizando KOH. Para poder realizar estas actividades prcticas con microorganismos, debemos contar con medios de cultivo adecuados para el crecimiento y desarrollo de stas bacterias. Todos los microorganismos necesitan agua, carbono, hidrgeno, calcio, fsforo y hierro como elementos vitales, hay adems, microorganismo exigentes que requieres otros factores de crecimiento para poder vivir. En este curso se usaran principalmente agar McConkey, con el cual podremos realizar anlisis microscpicos. Los anlisis microscpicos deben ser precedidos por una tincin (tensin de Gram) la cual permite observar claramente la forma, el tamao y la agrupacin bacteriana en un microscopio. En este practico, el objetivo general ser conocer los materiales principales en la elaboracin de cultivos y practicar las tcnicas adecuadas y los procedimientos correctos en la elaboracin de siembra y anlisis microscpico. Entre los objetivos especficos encontramos: practicar diferentes tipos de siembra, describir colonias, practicar tinciones diferenciales y reconocer gneros de acuerdo a sus caractersticas macro y microscpicas.
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Objetivos.
2.1
Objetivo General
Identificar bacterias Gram + y Gram mediante la tincin de Gram.
2.2
Objetivos especficos
Conocer utilidad de la tincin de gram como herramienta para el diagnostico microbiolgico de algunos procesos bacterianos.
Aprender a hacer frotis y fijar la muestra para su visualizacin. Conocer el fundamento de la coloracin de Gram.
Adquirir conocimientos tericos prcticos sobre la realizacin de esta tcnica de coloracin.
Realizar lecturas microscpicas para identificacin bacteriana preliminar.
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Fundamento de los mtodos.
La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayora de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante bsico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).
3.1Taxonoma. Todos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el gnero seguido por la especie (ejemplo: el Homo sapiens). Las bacterias se han agrupado y denominado principalmente en su morfolgicas y bioqumicas / metablicas diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora tambin clasificadas de acuerdo a su inmunologa y las caractersticas genticas. Esta prctica se centra en la tincin de Gram, morfologa bacteriana, y caractersticas metablicas, todos los cuales permiten al mdico - clnico determinar rpidamente el organismo que est causando la infeccin de un paciente.
3.2 Tcnicas de tincin para la microscopia ptica. 3.2.1 Preparacin del extendido: Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con el asa bacterial que contiene el material. El material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si la muestra es lquida), o se rota (si esta en un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un largo aproximado de 2 cm por 1 cm de anch.
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Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no debe utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo.
Para la tincin de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solucin salina 0.9% estril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeas que puedan perderse incluso en una gota de solucin fisiolgica se puede utilizar un aplicador de madera estril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocacin sobre: 1).- una platina caliente (a 60C) durante por lo menos 10 minutos 2).- cubrindolo con metanol al 95% durante 1 minuto o 3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones
Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tincin. La preparacin de los frotis vara de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los mtodos de tincin que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparacin de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por ltimo, el mtodo de tincin que se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.
3.2.2 Coloracin gram. Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la microscopa de luz, diferentes tcnicas de tincin se han desarrollado para visualizarlas (Ver Figura 1 y 2). La ms til es la tincin de Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
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Esta tincin tambin permit determinar si el organismo es redondo o en forma de varilla, etc.
Figura 1 y 2: Paredes de Gram Positiva y negativa
Ambos organismos, gram-positivas y gram-negativas tienen ms que una capa de proteccin de su citoplasma y ncleo desde el medio extracelular, a diferencia de las clulas animales, que tienen una sola membrana citoplasmtica compone de una bicapa de fosfolpidos. La capa externa de la membrana citoplasmtica bacteriana es el peptidoglicano o pared celular. Est presente en ambos organismos gram-positivos y gram-negativas. La capa de peptidoglicano o pared celular est compuesta de repetidos disacridos con 4 aminocidos en una cadena lateral que se extiende desde cada disacrido.
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Las cadenas de amino-cidos del peptidoglicano se unen covalentemente a otros aminocidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable estructura reticulada. La enzima que cataliza la formacin de esta unin Se llama transpeptidasa y est situado en el interior citoplsmica
membrana. El antibitico se une a la penicilina
inhibe esta enzima. Por esta
razn, la enzima es tambin llamada protena de unin a la penicilina.
La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden detectarse con este mtodo. Las nicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las clulas husped (p. ej., clamidias). Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el microscopio ptico (p. ej., espiroquetas). Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias). 3.1 Materiales. Portaobjetos Cubreobjetos Asas de inoculacin Mechero Bunsen Pipetas Colorantes
3.2
Procedimiento
El procedimiento clsico de la tincin de Gram consiste en fijar el material orgnico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol.
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Despus de la fijacin el primer paso en la tincin de Gram es la aplicacin del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a travs de enlaces qumicos. La decoloracin distingue las bacterias grampositivas de las gramnegativas. Despus de la decoloracin los microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de contraste safranina (Contratincin) teir de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras.
3.2.1 Principio: Las diferencias de composicin de las paredes de las bacterias grampositivas, que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados de cido teicoico, y las paredes de las clulas gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es ms delgada, explican las diferencias de la tincin de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias es probable que la gran cantidad de enlaces cruzados de cido teicoico de los microorganismos gram positivos contribuya a su capacidad de resistir la decoloracin con alcohol.(Figura 3) Si bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se altera.
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Fig. 3.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y GRAM(-).
*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de la pared celular debido al tratamiento antibitico, al envejecimiento o a la accin de enzimas autolticas permiten que el violeta se elimine durante la decoloracin y pueden aparecer como gram variables, con algunas clulas coloreadas de rosa y otras de violeta.
Sin embargo, con propsitos de identificacin, estos microorganismos se consideran gram positivos verdaderos. Por otro lado, las bacterias gram negativas raras veces (o nunca) retienen el cristal violeta si el procedimiento de tincin se ha realizado de manera apropiada.
Las clulas husped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos), pierden el cristal violeta con la decoloracin y aparecen de color rosa en los frotis preparados y teidos de manera correcta. 3.2.2 Observacin de la tincin de gram. Una vez teido el frotis se observa con el objetivo de inmersin (1.000x). Cuando el material orgnico se tie con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evala en busca de la presencia de clulas bacterianas as como de las reacciones Gram, (Fig. 4) En el anlisis de muestras suele ser un estudio
fundamental por cumplir varias funciones:
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Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos.
Fig. 4: Resultados de las tinciones de Gram.
A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos (Ver Fig. 5): Los cocos son de forma esfrica. Los bacilos poseen forma alargada. Los cocobacilos. Los vibriones que son bacilos en forma de coma o curvados. Los espirilos, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Fig. 5. Clasificacin de las bacterias de acuerdo a su morfologa agrupacin.
Pueden aparecer agrupados de diferente forma: Aislados despus de la divisin celular (Micrococos).
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Aparecer por pares Diplococos. Formar cadenas Estreptococos. Agruparse de manera irregular Estafilococos. Los bacilos en general suelen agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos) o en empalizada. La tincin de gram proporciona una cantidad relativa de las bacterias infectantes.
Esta informacin a menudo proporciona un diagnostico preliminar con respecto a los agentes infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo inicial del paciente.
Si bien la evaluacin de la tincin de Gram del frotis directo se utiliza de rutina como una ayuda en el diagnostico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten y no deben ignorarse hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologas infecciosas. Por ejemplo, las clulas y los elementos micticos por lo general se tien como grampositivos pero pueden captar el cristal violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la tincin de Gram pueden detectarse otros agentes adems de las bacterias: Como clulas inflamatorias (PMN o mononucleares) Elementos sanguneos (eritrocitos) Restos celulares o mucosos (detritus celulares)
3.2.3 Tincin de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (Frotis indirectos). La tincin de Gram tambin desempea un papel clave en la identificacin de las bacterias en crecimiento en cultivos. De manera similar a los frotis directos, en los preparados a partir del crecimiento bacteriano se evalan las reacciones de Gram, las morfologas y no es valorable las disposiciones (agrupacin) de las clulas bacterianas. Si se va a teir ms de una muestra en el mismo portaobjeto, puede utilizarse un lpiz de cera para crear divisiones.es til dibujar una especie de mapa de ese portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones
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de Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados del examen del frotis se utilizaran para determinar comprobaciones ulteriores para la identificacin y la caracterizacin de los microorganismos aislados.
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Resultados obtenidos.
Esquema diferencial de las tinciones de gram observadas por microscopio: Gram Positivos. Tincin de gram Decoloracin Endotoxina Pared Superficie Lpidos Acido Teicoco Sensib. Betalactamico. Sensib. Lisozima Relacin DNA/RNA Violeta No de coloro No Fina Homognea + Si Notable ++ Si 8/1 Gram Negativos. Rosa Decoloracin Si Compleja Rugosa ++++ No Escasa + No 1/1
Observaciones de las tinciones en microscopio. Gram (+): Tras la observacin en el microscopio el bacilo es una bacterias gram (+) por que presenta una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en un tono azul claro, como se vizualisar en la Figura N6 de acuerdo a su forma es cocobacilar.
Fig. N6: Bacilo color azul.
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Gram (-) Tras la observacin en microscopio la ecoli es una bacterias gram () por que tiene en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante de hay que toma el color rosado indicativo que de las gram (-) como se puede ver en la figura N 7.
Fig. N9: E coli gram (-)
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Conclusiones
La prctica es de suma importancia ya que se conocieron los fundamentos bsicos de cmo realizar una impregnacin bacteriolgica en una lmina y poder identificar qu tipo de bacteria es. Cabe mencionar que el trabajo con bacterias representa un riesgo de contagio por lo cual conociendo las normas de bioseguridad y el manejo adecuado como se hizo, nos permite obtener tanto buenos resultados en la identificacin de la bacteria como en la prevencin de contagio. Se logro conceptualizar en la practica las diferencias en las tinciones de las gram negativas y postivas de las siguiente manera las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano presentado una tonalidad rosada, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptiglicano es mucho ms gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram presenta una tonalidad azul.
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Anexos.
Utensilios para la tincin de gram:
Esterilizacin de la Asa bacterial.
Utensilios para la tencin.
Flameado del porta objeto.
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6.1 Cuestionario. 1-Por qu la capa rgida de la pared celular bacteriana se llama peptidoglucano? R: La capa rigida de la pared celular bacteriana se llama peptidoglicano, debido a que esta se compone por finas lminas compuestas por dos derivados de azcares, N-acetilglucosamina y cido-N-acetilmurmico, y un pequeo grupo de aminocidos que incluyen L-alanina, D-alanina, D-glutmico y o bien lisina o cido diaminopimlico (DAP). Estos componentes se unen entre s para formar una estructura repetitiva que se denomina tetra pptido del glicano.
2-Cules son las razones qumicas de la rigidez que confieren a la pared celular la estructura del peptidoglicano? R: Las razones qumicas que confieren rigidez a la pared celular la estructura del peptidoglicano, es debido a que la estructura bsica del peptidoglicano est constituida por una lmina en la que las cadenas de derivados de azcares se
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conectan entre s por puentes peptdicos a travs de los aminocidos. Los enlaces glicosdicos que unen los azucares en las cadenas son muy fuertes, pero las cadenas por si solas no pueden conferir rigidez en todas las direcciones. Cuando las cadenas se entrecruzan mediante puentes peptdicos se logra la rigidez caracterstica de la pared. El nmero de puentes peptdicos no es igual en todas las especies de Bacteria y las paredes ms rgidas son aquellas que presentan mayor nmero de puentes intercatenarios.
3- Tanto la Lisozima como la penicilina provocan la lisis de la clula bacteriana, pero por mecanismos muy diferentes. Describa el mecanismo mediante el cual cada uno de estos agentes ocasiona la lisis celular. Asegrese de incluir en su explicacin una descripcin exacta de por qu ocurre la lisis. Lisis por medio de Lisozima: La Lisozima es una enzima que aparece de forma natural en algunas clulas eucariotas y es un componente de las lgrimas, mucosidad y saliva. Es particularmente activa sobre los principales componentes de la pared celular de la mayora de bacterias gram-positivas, hacindolas vulnerables a la ruptura o lisis. La lisozima cataliza la hidrlisis de los enlaces que unen las molculas de azcar en las cadenas polisacardicas del pptido glicano. Esta accin es anloga a cortar con un soplete los soportes de acero de un puente. La pared celular de las bacterias gram-positivas es destruida casi totalmente por la lisozima. Sin embargo, el contenido celular que permanece rodeado por la membrana citoplasmtica puede conservarse intacto si no tiene
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lugar la lisis osmtica (ver ms adelante); esta clula sin pared se denomina protoplasto. Los protoplastos son tpicamente esfricos y capaces an de realizar su metabolismo. Cuando se aplica la lisozima de forma similar a las clulas gram-negativas su pared no suele destruirse en la misma medida que las de las gram-positivas, conservndose adems parte de la membrana externa. En este caso el contenido celular, la membrana citoplasmtica y el resto de la capa externa de la pared, constituyen un esferoplasto, que es tambin una estructura esfrica. Para que la lisozima acte sobre las clulas gran-negativas es necesario tratarlas antes con cido etilndiamino tetractico (EDTA), compuesto que debilita las clulas inicas de la membrana externa y la altera, permitiendo el acceso de la lisozima al pptido glicano.
Lisis por medio de Penicilina: El proceso de sntesis de la pared celular comienza en el citoplasma bacteriano, a partir de N-acetilglucosamina-1-fosfato que se une al UDP (uridin difosfato).
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El UDP se combina con la N-acetilglucosamina-1-fosfato, para dar UDP-Nacetilglucosamina que primero forma el ter lctico y luego en sucesivos pasos enzimticos se unen al mismo los cinco aminocidos para formar el Nacetilmurmico.
En el siguiente paso, que ocurre en el mbito de la membrana citoplasmtica la molcula que es hidrfila cambia a lipfila, lo cual facilita su transporte, por el cambio del UDP por undecaprenil-fosfato y el agregado de un pentapptido de glicina a nivel de la L-lisina. En la siguiente fase, en el mbito de la pared celular, se produce la transglucosidacin y formacin del enlace beta alargando de esta manera la molcula. Los enlaces transversales entre molculas del polmero se produce por transpeptidacin, se libera una D-alanina y el grupo carboxilo se une a un grupo amino de la lisina de otro oligopptido, tambin se libera el undecaprenil-fosfato. La penicilina interfiere en este ltimo paso, es decir impide la unin transversal o puente interpeptdico pero no la elongacin del polmero. De la misma manera actan las cefalosporinas, vancomicina, bacitracina y cicloserina. Debe notarse que la sntesis de la pared no se realiza cuando no hay lisina disponible o cuando se impide la racemizacin de la L-alanina y por lo tanto la disponibilidad de la Dalanina por efecto de la c-clicoserina (oxamicina).
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La mayora de las bacterias gram-negativas no son tan sensibIes a la penicilina porque la membrana externa de las bacterias gram-negativas forma una barrera que impide la entrada de la penicilina y otras sustancias. 4- Describa lo que provoca el KOH en la pared celular de las bacterias Gram negativas. Este mtodo est basado en la rotura de la pared celular de las bacterias al ponerlas en contacto con soluciones alcalinas diluidas. Una suspensin de clulas bacterianas en KOH al 3% toma un aspecto viscoso debido a la liberacin del DNA cuando se trata de una bacteria Gram negativa. Sin embargo, Blachmann y col. (1980) y Bourgault y col.(1988) demostraron que el mtodo del KOH no tiene una correlacin muy precisa con la tincin de Gram.
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7 1. 2.
Referencias bibliogrficas Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana, Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual
moderno, Mxico, Mxico 2002. 3. Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2 004. 4. Salazar Wilson, Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa, Depart. de publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito Ecuador, 2007. 5. 2.- Prcticas de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y Gentica
Universidad de Salamanca 6. 3.- Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual
moderno, Mxico, Mxico 2002 7. 4.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnstico bacteriolgico de la
tuberculosis normas y gua tcnica. OPS 2008 8. 5.- Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2 004. 9. 6.- Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana, 110 111. 10. 7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases
6th ed. 11. 12. Copyright 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier. 8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm
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Figura 1 y 2: Paredes de Gram Positiva y negativa

membrana. El antibitico se une a la penicilina

inhibe esta enzima. Por esta

razn, la enzima es tambin llamada protena de unin a la penicilina.

Fig. 3.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y GRAM(-).

fundamental por cumplir varias funciones:

Fig. 4: Resultados de las tinciones de Gram.

Fig. N6: Bacilo color azul.

Fig. N9: E coli gram (-)

Utensilios para la tincin de gram:

Esterilizacin de la Asa bacterial.

Utensilios para la tencin.

Flameado del porta objeto.

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