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Universidade Católica de Goiás Departamento de Matemática e Física Curso de Engenharia de Alimentos

ENGENHARIA BIOQUÍMICA

Goiânia – Goiás

2009

Verônica Ortiz Alvarenga

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

4

1.1 Definição de Engenharia Bioquímica

4

1.2 Histórico e Evolução

4

1.3 Definição de Biotecnologia

6

1.3.1

Evolução da biotecnologia

7

1.4

Microrganismos e sua utilização na indústria

7

1.4.1 Fontes de microrganismos de interesse

8

1.4.2 Características desejáveis de microrganismos

8

1.4.3 Participantes na tecnologia de alimentos

9

2 TECNOLOGIA DAS FERMENTAÇÕES

11

2.1 Considerações sobre metabolismo energético

11

2.2 Os microrganismos e as fermentações dos alimentos

13

2.2.1

Definição de bioprocesso

13

2.2.2

Substrato

14

2.2.2.1

Fonte de energia

15

2.2.2.2

Fonte de carbono

15

2.2.2.3

Fonte de nitrogênio

16

2.2.2.4

Fonte de minerais

16

2.2.3

Esterilização

16

2.2.3.1

Esterilização pelo calor

17

2.2.3.1.1 Esterilização pelo calor seco

17

2.2.3.1.2 Esterilização por calor úmido

17

2.2.3.2

Esterilização química

18

2.2.3.3

Esterilização por irradiação de luz ultravioleta

18

2.2.4

Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigência de

oxigênio

18

2.2.5

Desenvolvimento dos agentes de fermentação e estado físico do

substrato

19

2.2.5.1

Fermentação em estado líquido

19

2.2.5.2

Processos de fermentação em meio líquido e na superfície

19

2.2.5.3

Processos de fermentação em meio líquido submersos

20

2.2.5.4

Fermentação em estado sólido

20

2.2.6

Cinética dos bioprocessos

22

2.2.6.1

Processo de fermentação

24

2.2.6.1.1 Descontínuo simples

24

2.2.6.1.2 Descontínuo com recirculação de célula

26

2.2.6.1.3 Semi-contínuo

26

2.2.6.1.4 Descontínuo alimentado (“fed batch”)

27

2.2.6.1.5 Contínuo

28

2.2.6.1.6 Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação ao

processo descontínuo

29

2.2.6.1.7

Definição dos parâmetros cinéticos

30

2.2.6.1.7.1

Definição das velocidades instantânea de crescimento ou de

transformação

30

2.2.6.1.7.2 Velocidades Específicas de crescimento ou transformação

31

2.2.6.1.7.3 Fatores de Conversão

31

2.2.6.1.7.3.1 Coeficiente de rendimento celular (rendimento de substrato

 

a células)

31

2.2.6.1.7.3.2 Coeficiente de rendimento de produto (rendimento de substrato a produto)

32

2.2.6.1.7.4

Determinação da velocidade de crescimento

32

2.2.6.1.7.5

Cinética de Crescimento de Monod

34

2.2.6.1.7.6

Metabolismo endógeno

35

2.2.6.1.7.7

Modelos de crescimento não estruturados

36

2.3

Biorreatores

38

2.3.1 Reatores Biológicos ideais

39

2.3.2 Reatores de mistura

39

 

2.3.2.1

Reatores em Batelada

39

2.3.2.1.1 Preparo do inóculo

39

2.3.2.1.2 Equações do reator em batelada

40

2.3.2.2 Reatores em batelada alimentada

41

2.3.2.3 Reatores de mistura contínuos

42

2.3.2.3.1

O Quimiostato: o reator de mistura ideal

42

2.3.2.3.1.1 Balanço de células

43

2.3.2.3.1.2 Balanço do substrato

43

2.3.2.3.1.3 Produtividade

45

2.3.2.3.1.4 Auto regulação de um quimiostato

46

1 INTRODUÇÃO 1.1 DEFINIÇÃO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA Durante muitos anos várias definições de Engenharia Bioquímica apareceram na literatura. Praticamente todas elas definem a Engenharia Bioquímica como uma ciência que nasceu pela combinação de 3 áreas do conhecimento científico:

Microbiologia, Bioquímica e Engenharia Química. Seu papel, na realidade, é de transformar conhecimentos obtidos por microbiologistas e bioquímicos em processos industriais, com vistas a aperfeiçoá-los, assim com aumentar produtividade e rendimento. Para isto, um engenheiro bioquímico deve não só ter sua formação em princípios básicos de engenharia, como também em ciências biológicas.

1.2 HISTÓRICO E EVOLUÇÃO Milênios antes de saber da existência de seres microscópicos, o homem já se utilizava deles. É assim que o homem das cavernas já sabia que a carne maturada tinha melhor sabor, produzia bebida alcoólica, assim como fabricava queijos e produzia coalhada e vinagre desde tempos remotos. O pão fermentado por leveduras foi encontrado em pirâmides egípcias construídas há milênios. Muitos produtos obtidos pela ação de microrganismos podem ser incluídos nesta lista histórica: vinho (conhecido pelos antigos gregos), cerveja (2000 anos A.C.), soja fermentada, etc. Até meados do século XIX o homem permaneceu na ignorância total sobre as causas da fermentação. Em 1857, Pasteur demonstrou que a fermentação alcoólica era produzida por leveduras e que estas eram células vivas. Demonstrou também que várias doenças eram causadas por microrganismos. Em 1901, Rudolf Emmerich e Oscar Loco, da Universidade de Munique, isolaram a piocianase de Pseudomonas aeruginosa. Centenas de pacientes foram tratados com sucesso pela piocianase, o primeiro antibiótico conhecido. Porém, a piocianase estava muito a frente de seu tempo e pela inexistência de técnicas seguras e apropriadas de produção e controle de qualidade, foi abandonada prematuramente pelos riscos apresentados. No início do século XX já se produzia levedura de panificação em tanques abertos e aerados. Durante a I Guerra Mundial, Chain Weismann conseguiu produzir acetona a partir de amido usando uma bactéria, Clostridium acetobutilicum, livrando a Inglaterra de uma séria falta de munição, pois acetona é usada na fabricação de cordite. Em 1923, Pfizer inaugurou a primeira fábrica para obtenção de ácido cítrico por fermentação, utilizando Aspergillus niger na conversão do açúcar em ácido, barateando o produto. Alexander Fleming, em 1928 manipulando Staphylococcus aureus, notou que numa das placas de cultura deste microrganismo

havia contaminação por bolor da família Penicillium, e que ao redor deste não houve crescimento da bactéria. Extraiu do bolor uma substância, a qual denominou de penicilina, ativa contra bactérias. Mas foi somente durante a II Guerra que a penicilina foi industrializada devido a grande necessidade de agentes bactericidas mais eficientes que a sulfa, até então utilizada. Seguiu-se após, o aparecimento de outros antibióticos. Selman Waskman isolou um actinomicete, Streptomyces grisens, da garganta de uma galinha, produtor de estreptomicina. Este antibiótico mostrou-se altamente eficaz contra bactérias causadoras da tuberculose. A lista dos antibióticos hoje é longa, além das penicilinas e estroptomicinas. A pesquisa é intensa e cada ano novos produtos, novas técnicas e novos processos vêm se juntar aos já existentes. Muitas vitaminas são produzidas por fermentações, com, por exemplo, vitamina B 2 (riboflavina), vitamina B 12 (Cianocobalamina) e vitamina C (ácido ascórbico). Processos fermentativos também são usados na produção de cortisona e seus derivados, assim como na síntese de aminoácidos (L-lisina e ácido glutâmico). A gibelerelina, hormônio regulador do crescimento das plantas, é um novo produto de fermentação usado principalmente no Oriente. Inseticidas bacterianos (B. thuringiensis) encontram grande aplicação na agricultura. Antes da produção de penicilina em escala industrial ter começado, já se produziam industrialmente certos produtos como leveduras de panificação, ácido cítrico e ácido glicônico onde as condições de acidez do meio de cultura eram adversas a microrganismos contaminantes. Da mesma forma, na obtenção de produtos como sorbose, acetona, butanol e etanol, as concentrações de substrato ou produto eram demasiadamente elevadas de forma que microrganismos contaminantes eram quase que inexistentes. Assim sendo, os requerimentos para uma cultura pura nos processos de obtenção dos produtos acima descritos, eram praticamente nulos. Porém, no caso da penicilina, as condições de operação tinham que ser estritamente assépticas. Assim, os engenheiros bioquímicos se encontraram em face de um grande problema. Esse desafio fez com que surgisse uma nova filosofia de “design” de fermentadores, de técnicas de operação e de equipamentos em geral, de forma que uma perfeita esterilidade fosse obtida. Além disso, para a extração de alguns produtos como a penicilina, que era encontrada no meio de cultura em pequenas concentrações e relativamente instável, exigiu o desenvolvimento de novas técnicas de filtração, extração, adsorção e concentração, dando origem a técnicas modernas de extração e purificação de produtos de origem biológica. As técnicas desenvolvidas para a produção de penicilina, como a fermentação submersa, foram posteriormente aplicadas em outros antibióticos e também a diferentes produtos, de forma que os equipamentos sofreram uma espécie de

padronização, com algumas adaptações dependendo das características de certos processos. Além disso, os equipamentos e operações empregados em diferentes processos fermentativos são similares aos de processos químicos. Por isso a Engenharia Bioquímica é baseada nos conceitos de operações unitárias e processos unitários da Engenharia Química, assim como em seus princípios estequiométricos, cinéticos e termodinâmicos. No entanto, é evidente que, apesar de características comuns entre as duas disciplinas, existem peculiaridades diferentes entre elas, de forma que a engenharia bioquímica é encarada como um ramo especializado da engenharia química. Como exemplo de operações unitárias comuns entre elas podemos citar: mistura de três fases heterogêneas (microrganismos, meio e ar), transporte de massa (oxigênio do ar para o microrganismo), transporte de calor (do meio de cultura para o ambiente). Transformações de matéria-prima em produtos por ação microbiológica possuem aspectos comuns sob o ponto de vista químico ou físico, fornecendo-nos a possibilidade de classificar os diferentes mecanismos de reação em processos unitários, como por exemplo, reduções, oxidações, conversões de substrato, transformações, hidrólises, polimerização, biossínteses complexas e formação de células.

1.3 DEFINIÇÃO DE BIOTECNOLOGIA É definido como uso de microrganismos, células de plantas, células de animais ou parte de células, assim como, enzimas, imunoglobulinas ou genes para elaboração de produtos ou para conduzir processos. A biotecnologia fornece diversas aplicações para melhorar a indústria de alimentos, como por exemplo, modificações genéticas em aves, como a redução na quantidade de gordura e aumento da massa muscular. A interação da biotecnologia industrial com os ramos dos conhecimentos está apresentado na figura 1.

os ramos dos conhecimentos está apresentado na figura 1. Figura 1. Interação da biotecnologia com os

Figura 1. Interação da biotecnologia com os ramos do conhecimento

1.3.1 Evolução da biotecnologia

As técnicas de fermentação, que até o presente momento constituem os processos principais da biotecnologia, são conhecidas e utilizadas desde a antiguidade, principalmente na produção de cervejas e vinhos. No oriente, os antigos já utilizavam bebidas fermentadas, da mesma forma de que, na América pré- colombiana, também já se produziam bebidas com a utilização de processos rudimentares de fermentação. Há séculos que no Japão e na China se utilizam processos de produção de bebidas e alimentos pela técnica de fermentação. O troglodita sabia que a carne deixada em repouso alguns dias era mais saborosa que aquela ingerida logo após a matança; Sabia, também que bebidas intoxicantes poderiam ser feitas de grãos e frutas. O envelhecimento da carne e a fabricação de bebidas alcoólicas foram os primeiros usos de fermentação pelo homem; A fabricação de queijo e molho de soja na China e no Japão é conhecida há milhares de anos; Foram encontrados pães nas pirâmides egípcias construídas há milhares de

anos

1.4 MICRORGANISMOS E SUA UTILIZAÇÃO NA INDÚSTRIA Muitos microrganismos, através de processos bioquímicos, são empregados em geral, para obtenção de produtos alimentícios, farmacêuticos, etc. Este meio sofre a ação dos biocatalisadores (microrganismos), pela inoculação de uma suspensão suficientemente concentrada de células ativadas ou recicladas ao processo. Bactérias: As bactérias são onipresentes na natureza, em ambientes aeróbios e anaeróbios contendo água. Entre os gêneros, as habilidades sintéticas variam desde àquelas das espécies autotróficas, que requerem apenas compostos inorgânicos para o crescimento, àquelas das espécies heterotróficas. Igualmente há uma enorme amplitude de habilidade degradativa. Por causa dessas capacidades diversas, as bactérias têm sido exploradas industrialmente para acumular produtos intermediários e finais do metabolismo. São uma rica fonte de produção de enzimas. Vírus: Os vírus são os menores microrganismos. Os vírus parasitos de bactérias são denominados bacteriófagos. A cultura de vírus para testar drogas

antivirais e para a produção de vacinas é um importante empreendimento industrial. Fungos: Os fungos são amplamente espalhados na natureza em ambientes de umidade mais baixa do que aquela que favorece as bactérias. O metabolismo de fungos é essencialmente aeróbio. Do ponto de vista morfológico os fungos são divididos em dois grandes grupos: os bolores e as leveduras.

o Bolores: caracterizam-se por formarem um micélio que é um conjunto de estruturas filamentosas denominadas hifas.

o Leveduras: são fungos geralmente unicelulares de forma e tamanho muito variados, indo desde elementos esféricos até células elípticas, quase filamentosas. Para todos os microrganismos existem três temperaturas cardeais:temperatura mínima abaixo da qual não há crescimento; temperatura máxima acima da qual não há crescimento; temperatura ótima, onde o crescimento é máximo. A temperatura ótima

de crescimento microbiano varia com o tipo de microrganismo. A faixa de crescimento mais comum situa-se entre 25 e 45 ºC.

Termófilas: em torno de 60ºC

Psicrófilas: em torno de 10ºC

Mesófilas: entre 20 e 40ºC

1.4.1

Fontes de microrganismos de interesse

Microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:

Isolamento a partir de recursos naturais; Compra em coleções de cultura; Obtenção de mutantes naturais; Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais; Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética.

1.4.2 Características desejáveis de microrganismos

Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais:

Permitir o acúmulo de produto no meio para se ter elevada

Elevada eficiência na conversão do substrato em produto;

concentração do produto no substrato;

Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico;

Não ser patogênico;

Não exigir condições de processo muito complexas;

Não exigir substratos dispendiosos;

Permitir a rápida liberação do produto para o meio.

1.4.3

Participantes na tecnologia de alimentos

Muitos alimentos devem suas produção e características às atividades fermentativas dos alimentos. Vários produtos, como queijos maturados, conservas, chucrutes, lingüiças fermentadas, são alimentos que possuem uma vida-de-prateleira consideravelmente maior que a matéria-prima da qual eles foram feitos. Além de serem mais estáveis, todos os alimentos fermentados possuem aroma e sabor característicos que resultam direta ou indiretamente dos microrganismos fermentadores. Em alguns casos, o conteúdo de vitaminas dos alimentos cresce juntamente com o aumento da disgetibilidade da matéria-prima. O processo de fermentação reduz a toxicidade de alguns alimentos (por exemplo, gari e peujeum 1 ), enquanto outros podem se tornar extremamente tóxicos durante a fermentação (como no caso do bangokrek 2 ) As transformações bioquímicas que ocorrem durante a fermentação, quando controladas são benéficas. Para tanto, as condições de fermentação, pH, temperatura e composição do mosto de fermentação, devem ser monitoradas, de forma que o microrganismo converta o substrato presente no mosto, em produtos de interesse. Caso haja descontrole nas condições de processo, as transformações bioquímicas podem ser indesejáveis como, por exemplo, putrefação de alimentos. Alguns alimentos, que passam pelo processo de fermentação estão relacionados na tabela 1. Tabela 1. Alimentos fermentados

1 Gari (África) e Peujeum (Indonésia) – alimentos típicos preparados a partir da mandioca. Depois de cozida a vapor e amassada, a mandioca é mistura com o ragi (farinha de arroz que age como cultura starter), embrulhada em folhas de bananeira e postas em potes de barro para fermentar por um ou dois dias.

2 Bangkrek – produto preparado a base da fermentação de tempe (comida típica da Tailândia feita com soja fermentada) e com resíduos de coco que sobram da extração do seu óleo. Pode ser mortal quando se desenvolve a bactéria Pseudomonas. Mesmo tendo sido proibida a sua fabricação e venda, 40 pessoas morreram intoxicadas em 1988 na Tailândia

Na indústria química, farmacêutica e na agricultura a aplicação da engenharia bioquímica está listada abaixo

Na indústria química, farmacêutica e na agricultura a aplicação da engenharia bioquímica está listada abaixo

2 TECNOLOGIA DAS FERMENTAÇÕES 2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE METABOLISMO ENERGÉTICO O termo metabolismo refere-se a todas

2 TECNOLOGIA DAS FERMENTAÇÕES

2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE METABOLISMO ENERGÉTICO

O termo metabolismo refere-se a todas as reações químicas que ocorrem na célula, incluindo tanta as reações que produzem energia como as que utilizam a energia para a biossíntese ou outras funções celulares. Energia é traduzida como a capacidade de realizar trabalho. Uma célula viva deve realizar diferentes tipos de

trabalho, tais como produzir enzimas, sintetizar parede celular e membrana citoplasmática e reparar danos ocorridos na célula. Para realizar o trabalho, a célula necessita de uma grande quantidade de energia. A fonte desta energia para alguns organismos são as moléculas químicas (nutrientes) que são absorvidas pelas células. Quando as ligações químicas desses nutrientes são quebradas, a energia é liberada em forma de energia química que a célula armazena e posteriormente utiliza para executar trabalho. Para outros

organismos, a fonte de energia é a luz; quando expostos a ela, eles convertem a

energia luminosa em energia química utilizada no metabolismo (Figura 2).

em energia química utilizada no metabolismo (Figura 2). Figura 2. Aspectos macroscópicos do metabolismo dentro do

Figura 2. Aspectos macroscópicos do metabolismo dentro do interrelacionamento global dos organismos vivos na biosfera. Fonte:

Lehninger, 1988.

O metabolismo é composto por duas reações básicas (Figura 3):

1-

Catabolismo: reações de degradação (liberação de energia)

2-

Anabolismo: reações de biossíntese (consumo de energia)

Anabolismo: reações de biossíntese (consumo de energia) Figura 3. Metabolismo = catabolismo+ anabolismo. Fonte:

Figura 3. Metabolismo = catabolismo+ anabolismo. Fonte: Lehninger, 1988

A célula requer energia para realizar diferentes tipos de trabalho:

Biossíntese das partes estruturais da célula: parede, membrana e

apêndices externos;

Síntese de enzimas, ácidos nuclêicos, polissacarídeos, fosfolipídeos,

proteínas e outros componentes químicos;

Transporte de nutrientes

Reparo de danos e manutenção da célula em boas condições;

Crescimento e multiplicação;

Armazenamento de nutrientes e excreção de produtos indesejáveis;

Mobilidade.

2.2 OS MICRORGANISMOS E AS FERMENTAÇÕES DOS ALIMENTOS

2.2.1 Definição de bioprocesso

Bioprocessos compreendem um conjunto de operações que incluem o:

Tratamento da matéria prima;

Preparo dos meios de propagação e produção;

Esterilização e a transformação do substrato em produto(s);

Processos de produção;

Processos de separação e purificação de produto(s).

A distinção entre bioprocessos e processos químicos está calcada na natureza dos

catalisadores utilizados em suas reações. Os bioprocessos são conduzidos mediante

ação de:

Microrganismos;

Células animais ou vegetais;

Enzimas.

Um esquema geral para processos fermentativos (bioprocesso) está representado na figura 4.

Figura 4. Esquema geral de um processo fermentativo 2.2.2 Substrato Uma grande variedade de matérias-primas,

Figura 4. Esquema geral de um processo fermentativo

2.2.2

Substrato

Uma grande variedade de matérias-primas, geralmente provenientes da agroindústria, são utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes. De uma forma geral, as matérias-primas de bioconversões podem ser agrupadas em função da estrutura e da complexidade molecular dos substratos. A matéria-prima é um dos componentes mais relevantes nos custos de produção, havendo casos em que pode representar até 75% do custo total, sendo esta uma das razões pelo crescente interesse no aproveitamento de resíduos agroindustriais. A escolha dos nutrientes adequados à geração do produto de interesse está relacionada à atividade metabólica desenvolvida pelos microrganismos. Nesse ponto, destaca-se a importância das informações obtidas sobre as exigências nutricionais da população microbiana envolvida no processo. Torna-se necessário, então, utilizar fontes adequadas, isto é, que possuam os componentes necessários são bom desempenho do microrganismo. Assim, é preciso fortificar a matéria-prima com os componentes que faltam e retirar aqueles que inibem, de modo a permitir uma rápida e eficiente conversão do substrato em produto com o rendimento desejado.

As condições que permitem a produção máxima de massa molecular não são necessariamente as mesmas que permitem a máxima produção de um determinado produto. Aspergillus niger, por exemplo, dá melhores rendimentos de ácido cítrico, quando seu crescimento é restringido, por concentrações de semi-inanição de nitrogênio, fósforo, porem com alta concentração de açúcar. Agrupamento das fontes de substrato em função da estrutura e da complexidade molecular dos substratos.

Substratos solúveis: que podem ser facilmente extraídos produto(s) como por exemplo, sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-açúcar, beterraba, melaço, soro de leite, etc.

Substratos insolúveis: que precisam de tratamento moderado para solubilização e hidrólise, antes da conversão em produto(s) comopor exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata, etc.

Substratos insolúveis muito resistentes: que necessitam de pré-tratamento físico, seguido de hidrólise química ou enzimática para produzir substratos na forma monomérica a ser convertidos em produto(s) como, por exemplo, celulose e hemicelulose.

2.2.2.1 Fonte de energia

A adenosina-trifosfato (ATP) é o composto mais importante nas transformações de energia das células. As bactérias e as algas fotossintéticas podem utilizar a energia da luz para formação de ATP; as bactérias autotróficas podem gerar ATP pela

oxidação de compostos inorgânicos; ao passo que as bactérias, leveduras e fungos heterotróficos formam ATP oxidando compostos orgânicos. Nas indústrias de fermentação, a fonte mais comum de energia é amido ou melaço.

2.2.2.2 Fonte de carbono

As necessidades de carbono são supridas com a fonte de energia, porém as bactérias autotróficas e fotossintéticas utilizam dióxido de carbono. A via pela qual os heterotróficos metabolizam carbono de substrato é importante para se determinar a quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos

facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam anaerobiamente, porém 50 -55% com metabolismo completamente aeróbio.

2.2.2.3

Fonte de nitrogênio

O nitrogênio pode ser suprido à maioria dos organismos industrialmente

importantes por meio de amônia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais rápido quando se utiliza nitrogênio orgânico. Os compostos orgânicos nitrogenados mais utilizados industrialmente são: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite.

2.2.2.4 Fonte de minerais

Fósforo e magnésio são constituintes particularmente importantes no meio de cultura, pois são relacionados com todas as reações de transferência de energia envolvendo ATP. Também são indispensáveis para o bom desenvolvimento da cultura, o cálcio, potássio, enxofre e sódio, assim como os micronutrientes: ferro,cobalto, cobre e zinco.

2.2.3 Esterilização A esterilização de um meio de cultura ou ambiente é a operação pela qual todas as formas de vida (sejam vegetativas ou esporuladas) são eliminadas (destruídas ou removidas) deste meio ou ambiente. Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eliminação parcial da população microbiana dos equipamentos e meios de crescimento é suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento são produzidos (fermentação alcoólica, produção de vinagre, ácido láctico, antibióticos e outro biocidas), o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microorganismos. Existem, também, bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia, como é o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa, atuando de forma consorciada é extremamente desejável, para que haja redução da carga orgânica poluidora. Na prática, considera-se que uma esterilização foi realizada com sucesso quando estiver garantida a assepsia adequada. O conceito de esterilização difere do conceito de desinfecção pelo fato de que neste último processo ocorre o emprego de uma substância que destrói ou inibe o crescimento de certos microrganismos em determinados meios.

Os agentes de esterilização e desinfecção podem ser físicos ou químicos:

Agentes físicos: calor (seco ou úmido); filtração (obtenção de meio ou ar estéril); radiação (ultra-sons, ultravioleta, raios catódicos).

Agentes químicos: ácidos, bases, sais, halogênios, alcoóis, aldeídos, éteres, fenóis.

A tendência atual é considerar os agentes químicos como ligados aos processos de desinfecção e os físicos aos de esterilização.

Os processos de maior interesse industrial são os efetuados por agentes físicos e consubstanciam os processos de esterilização.

A pasteurização (80 o C, 15’’) é um processo mais brando que a esterilização

(121 o C, 15’). Na pasteurização a intenção é a de eliminação de células vegetativas, sobretudo as células de microrganismos patogênicos que são mais sensíveis ao calor.

2.2.3.1 Esterilização pelo calor

2.2.3.1.1 Esterilização pelo calor seco

A esterilização pelo calor seco é feita a temperatura de 160-170 o C por duas

horas. Não é aplicada a meios de cultura ou líquidos. Aplicável à vidraria e material de laboratório, e no caso da esterilização do recheio fibroso dos filtros de ar.

2.2.3.1.2 Esterilização por calor úmido

É feita num ambiente de vapor saturado a 1atm de pressão (T=121 o C) durante

15-20min. Estas condições são suficientes para a eliminação das formas esporuladas (vida latente) de bactérias, muito mais resistentes que as formas vegetativas. Esta esterilização pode ser feita por dois métodos:

a) Com vapor latente (100 o C): é utilizado vapor à pressão atmosférica. Este método é preferido sempre que haja no meio de cultura compostos que se decomporiam ou reagiriam com outros à temperaturas mais elevadas, ou quando as condições de cultura inibem o crescimento de contaminantes (pH baixo, por exemplo). Existem basicamente 2 processos:

a 1 ) esterilização simples por vapor fluente: 20 a 30 minutos. a 2 ) tindalização: é o aquecimento em ambiente úmido com vapor fluente feito à

100 o C/30min e repetido mais 2 vezes com intervalos de 24horas. Os esporos sobreviventes ao primeiro aquecimento desenvolver-se-ão nas 24 horas seguintes e as formas vegetativas daí resultantes seriam eliminadas no segundo aquecimento. Por garantia faz-se um terceiro aquecimento após

24horas.

b) com vapor saturado sob pressão: é feita em autoclaves à 1atm (121 o C) por 15 a 20 minutos.

2.2.3.2 Esterilização química É um método menos importante que os anteriores. É utilizado para a esterilização de superfícies. Para a esterilização de equipamentos é muito utilizado o óxido de etileno. Ele destroe tanto células vegetativas, como esporos, mas só é efetivo em presença de água. Ë utilizado em mistura com dióxido de carbono ou nitrogênio, na forma gasosa (2-50% de concentração). Dois grupos:

Desinfetantes: são substâncias que agem diretamente sobre estruturas microbianas, causando a morte do microrganismo. Agem tanto sobre microrganismos como sobre seres superiores. São portanto, tóxicos gerais, sem especificidade;

Agentes quimioterápicos: São substâncias que interferem em determinadas vias metabólicas. São portanto específicos aos microrganismos que possuem a via metabólica sensível. Podem ser sintéticos como as sulfas e cloranfenicol ou naturais como os antibióticos.

2.2.3.3 Esterilização por irradiação de luz ultravioleta A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de modo mais significativo porácidos nucleicos, onde geralmente ocorrem as lesões. A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220 a 300 nm, muitas vezes chamada de região “abiótica”.

2.2.4 Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigência de

oxigênio Muitas células vivas necessitam de oxigênio para manutenção de seu metabolismo. Nos bioprocessos conduzidos com microrganismos aeróbios, (Bioprocessos aeróbicos)o oxigênio é suprido ao biorreator, via de regra, como bolhas de ar, através de um compressor, como será visto mais adiante. Nos bioprocessos anaeróbicos, os microrganismos obtém o oxigênio metabólico através de substâncias que contém oxigênio ligado molecularmente. Nos primeiros, o suprimento adequado de oxigênio para atender a demanda da célula é imperativo, assim como a manutenção de condições anaeróbias estritas no segundo caso. Se essas exigências não forem atendidas o processo terá seu potencial limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua interrupção, com a conseqüente morte da célula.

Fungos algas e algumas bactérias são aeróbicos obrigatórios;

Algumas bactérias são anaeróbicas estritas ;

Leveduras e muitas bactérias podem desenvolver-se em ambas as condições, são aeróbicas facultativas.

2.2.5 Desenvolvimento dos agentes de fermentação e estado físico do substrato

Substrato líquido

o

superfície

o

profundidade (submerso)

Substrato sólido ou semi-sólido.

2.2.5.1 Fermentação em estado líquido

É o processo que se desenvolve na presença de grande quantidade de água.

O processo de fermentação é conduzido em tanques de fermentação com grande

variação no tamanho, tipo de material de construção, abertos ou fechados, etc.

O surgimento desse processo permitiu o aumento de escala para muitos produtos

limitados pelo processo de fermentação em meio sólido. Vários produtos são obtidos por esse processo: álcool etílico; bebidas alcóolicas; antibióticos, vitaminas; vacinas; enzimas; insulina e muitos outros. A fermentação líquida apresenta uma série de

vantagens operacionais sobre a fermentação em meio sólido tais como:

Medição e controle de pH, temperatura, oxigênio, produto substrato;

Separação e purificação do produto;

Maior facilidade de se ter um processo contínuo e automatizado.

2.2.5.2 Processos de fermentação em meio líquido e na superfície São aqueles em que a biomassa situa-se na superfície do meio líquido, em contato direto com o ar atmosférico, que fornece o oxigênio necessário à produção microbiana. A diminuição da concentração de nutrientes nas camadas superficiais faz com que cheguem à superfície, por difusão, os nutrientes das camadas mais profundas.Também, por difusão, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m) no meio em fermentação. Portanto, a difusão e a relação entre a área oferecida e o volume de meio desempenham papel importante em bioprocessos operados em superfície. O meio de cultivo é colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer grande área ao desenvolvimento do agente. Como as taxas de transferência de massa

de nutrientes são lentas, os tempos de fermentação são consideravelmente longos.

Os processos em superfície são de operação difícil e são considerados antieconômicos, devido ao alto custo de produção resultante da manipulação custosa

da esterilização (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das várias bandejas necessárias a produção em larga escala. Este tipo de processo limita-se, via de regra, aos fungos filamentosos, que tendem a formar película micelial na superfície do meio.

2.2.5.3 Processos de fermentação em meio líquido submersos São aqueles em que o microrganismo produtor se desenvolve no interior do meio de fermentação, geralmente agitado. No caso de fermentações aeróbias, o oxigênio necessário à população em desenvolvimento é suprido, através de um compressor, por borbulhamento de ar. A maioria das fermentações industriais importantes é realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante redução no preço de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em superfície, foi a possibilidade de adaptá-los aos processos submersos. Comparados com os processos em superfície, os processos submersos oferecem uma série de vantagens:

Pode-se manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio;

A massa de microrganismos responsáveis pela transformação fica totalmente submersa no meio nutriente de maneira uniforme, o que pode ser ajustado para fornecer as condições ideais de crescimento e produção;

A absorção de nutrientes e excreção de metabólitos é executada com maior eficiência, levando a menores tempos de fermentação e, consequentemente, melhor produtividade;

2.2.5.4 Fermentação em estado sólido Processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou no interior de partículas em matriz sólida, onde o conteúdo de líquido ligado aela está a um nível de atividade de água que, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro lado, não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida.A fermentação em estado sólido, também denominada de Fermentação em meio semi- sólido, é o mais antigo processo fermentativo.

em estado sólido, também denominada de Fermentação em meio semi- sólido , é o mais antigo

Fermentação em estado sólido remete à idéia de dois tipos de materiais insolúveis em água, sobre os quais os microrganismos irão crescer: quando osuporte sólido atua ele próprio como fonte nutrientes e e no caso em que os nutrientes são solúveis em água e os microrganismos estão aderidos a uma matriz sólida, inerte ou não, que irá absorver o meio de cultura líquido. A maioria dos processos utiliza o princípio em que o suporte sólido atua também como fonte de nutrientes. Os Substratos tradicionalmente utilizados são produtos agrícolas como o arroz, o trigo, o painço, a cevada, o milho e a soja, além de substratos não convencionais como os resíduos agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagaço de cana-de- açúcar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. O grande interesse nesses processos decorre do fato dessas matérias-primas não possuírem custos de produção associados diretamente, sendo uma forma de se agregar valor a resíduos que se formam em abundância. Em linhas gerais, a operação dos bioprocessos em meios semi-sólidos, pode ser realizada sem agitação mecânica, com agitação ocasional ou contínua em reatores dos tipos: bandeja; tambor rotativo; esteira rolante; reator tubular horizontal; tubular vertical; sacos plásticos. A fermentação em meio sólido apresenta as seguintes vantagens:

Simplicidade dos meios de fermentação. O substrato sólido pode requerer somente adição de água, embora outros nutrientes possam ser adicionados;

Ausência de requerimentos de máquinas e equipamentos sofisticados;

Demanda reduzida de energia;

Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminação;

As condições de crescimento do microrganismo agente do bioprocesso são similares às encontradas em seu ambiente natural;

Ausência de formação de espuma;

Fatores limitantes:

o

Menor acessibilidade e disponibilidade de substrato;

o

Problemas de transferência de massa (oxigênio e nutrientes), calor;

o

Dificuldades no Controle de variáveis físico-químicas: pH, temperatura, oxigênio;

o

Dificuldades no aumento de escala.

2.2.6 Cinética dos bioprocessos

Quando uma pequena quantidade de células vivas é colocada numa solução

contendo nutrientes essenciais em condições favoráveis de pH e temperatura, as

células se reproduzirão. No caso de microorganismos unicelulares que se dividem

quando crescem, o aumento da biomassa (massa de material vivo) é acompanhado

pelo aumento do número de células, ou seja, aumento de população. Quando se trata

de bolores ou fungos filamentosos a situação é completamente diferente. Aqui

crescimento é associado ao comprimento e número de micélios, aumentando em

dimensão e densidade a biomassa, mas não em número.

Associados ao crescimento existem dois processos: consumo de material do

meio e liberação de metabólitos.

A medida do processo de crescimento é feita em geral por métodos gravimétricos

(peso seco) e turbidimétricos (densidade ótica).

A cinética de um bioprocesso consiste na análise da evolução dos valores de

concentração de um ou mais componentes do sistema produtivo, em função do tempo

do bioprocesso (figura 5). Entende-se, como componentes, o microrganismo

(biomassa), os produtos do processo (metabólitos) e os nutrientes ou substratos que

compõe o meio de cultura.

A Tabela 2 traça um perfil de quão complexo é o processo de crescimento de um

microrganismo.

Tabela 2. Processo de crescimento de um microrganismo.

Meio

População celular

Multicomponentes

Nutrientes

⇒⇒⇒⇒

Componentes múltiplos

Reações em solução

Equilíbrio ácido-base

Produtos

Heterogeneidade entre indivíduos

Reações múltiplas

pH, T,

variáveis

Prop. reológicas variáveis

Calor

Controles internos

€€€€

Adaptabilidade

Fases múltiplas (G-L, S-L, G-S )

Heterogeneidade espacial

Int. Mecânicas

Probabilidade

€€€€

Degenerescência

Figura 5. Cinética de processo fermentativo A curva de crescimento dos microrganismos está representada na
Figura 5. Cinética de processo fermentativo A curva de crescimento dos microrganismos está representada na

Figura 5. Cinética de processo fermentativo A curva de crescimento dos microrganismos está representada na figura 6.

dos microrganismos está representada na figura 6. Figura 6. Curva de crescimento microbiano ∑ Fase LAG

Figura 6. Curva de crescimento microbiano

Fase LAG (adaptação ) – As células que foram inoculadas se adaptam ao

novo meio. As células sintetizam as enzimas necessárias ao metabolismo dos

componentes presentes no meio. Não há reprodução celular. A duração dessa

fase varia com a concentração do inoculo, com a idade do microrganismo

(tempo de pré-cultivo) e com o seu estado fisiológico.

Fase exponencial ou logarítmica – Caracterizada por uma grande velocidade

de crescimento. A produção de biomassa atinge velocidade máxima.

Fase de transição – A velocidade de crescimento começa a diminuir por

motivos como:

a) inibição por produtos da fermentação

b) inibição pela alta concentração de biomassa

c) deficiência de oxigênio

d) inibição por produtos secundários tóxicos

Fase estacionária – A taxa de crescimento iguala-se à taxa de morte de

células.

Fase de morte – Caso o processo seja continuado, observa-se uma fase decrescente na curva de desenvolvimento celular porque a taxa de morte de células passa a ser maior do que a de crescimento.

2.2.6.1 Processo de fermentação Existem infinitas formas de se conduzir um reator biológico, dependendo das características próprias do microrganismo, meio de cultivo, e dos objetivos específicos do processo que se pretende executar. Serão abordadas as formas mais gerais, entendendo tal estratégia permitirá as particularizações que se fizerem necessárias:

Descontínuo

o

Com um inóculo por tanque

o

Com recirculação de células

Semi-contínuos

o

Sem recirculação de células

o

Com recirculação de células

Descontínuo alimentado

o

o

Contínuo

Sem recirculação de células

Com recirculação de células

o

o

Executado em um reator (com ou sem recirculação de células)

Executado em vários reatores (com ou sem recirculação de células)

2.2.6.1.1 Descontínuo simples

O processo descontínuo simples (figura 7 e 8), ou seja, aquele efetuado com um inoculo por tanque, consiste na preparação do substrato adequado ao desenvolvimento do microrganismo; colocar esse substrato em um biorreator; adicionar o microrganismo responsável pelo bioprocesso e aguardar que o processo ocorra. Após o tempo necessário de processo, retira-se o caldo do biorreator e executa-se as operações unitárias necessárias para a recuperação e purificação do produto. No nível de aplicações práticas, para um bioprocesso razoavelmente evoluído, dificilmente será conduzido como um reator descontínuo simples, havendo freqüentemente alguma elaboração adicional. O descontínuo será sempre a base para as comparações de eficiências atingidas nessas elaborações, mas a sua baixa eficiência estimula o surgimento das formas alternativas.

O principal problema desta forma de operar bioprocessos é decorrente de fenômenos de inibição pelo substrato, produto, ou outros metabólitos. Concentrações elevadas de substrato inibem o agente biológico. Este efeito está relacionado, em células vivas, a fenômenos osmóticos que resultam em plasmólise celular. As possíveis razões para o fenômeno são a repressão na síntese de enzimas e a desidratação dos sistemas enzimáticos, devida à perda de água da célula ou à inibição do transporte de nutrientes para o seu interior.

inibição do transporte de nutrientes para o seu interior. Figura 7. Esquema de um processo descontínuo

Figura 7. Esquema de um processo descontínuo

seu interior. Figura 7. Esquema de um processo descontínuo Figura 8. Cinética do processo descontínuo É

Figura 8. Cinética do processo descontínuo É fato bem conhecido que a célula viva polui seu ambiente com produtos do seu metabolismo até fazer cessar o crescimento e, eventualmente, perder sua viabilidade, fenômeno conhecido como inibição pelo produto.

2.2.6.1.2

Descontínuo com recirculação de célula

Uma alternativa ao processo batelada simples é a recirculação de células, ou seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separação das células por centrifugação ou mesmo sedimentação no interior do próprio biorreator, enviando apenas o líquido fermentado para a recuperação do produto. Com isso busca evitar o preparo de um novo inóculo para cada batelada, reduzindo custos e redução de tempo para a obtenção de altas concentrações de célula no reator. Esse processo é também conhecido como batelada repetida.

2.2.6.1.3 Semi-contínuo

O sistema semi-contínuo (figura 9 e 10) diferencia-se do descontínuo alimentado, pelo fato de se retirar o líquido processado e se proceder ao preenchimento do reator a uma vazão muito elevada, de forma a se imaginar que o reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo ciclo, procede-se novamente à retirada de uma dada fração do volume, 30 a 60% e se preenche o reator instantaneamente. Na verdade, na prática, para grandes volumes esse preenchimento contínuo não ocorre, recaindo no reator descontínuo alimentado. De qualquer forma, trata-se de uma técnica distinta, na qual está embutida a idéia a operação por choques de carga de substrato. Alertamos sobre a possibilidade de uso de misturas de conceito (descontínuo, contínuo, descontínuo alimentado), a fim de se conseguir o máximo de desempenho de um dado sistema biológico, reforçando a idéia sobre a enorme flexibilidade que dispõe para a operação de um biorreator.

enorme flexibilidade que dispõe para a operação de um biorreator. Figura 9. Sistema semi-contínuo de fermentação

Figura 9. Sistema semi-contínuo de fermentação

Figura 10. Cinética do processo semi-contínuo 2.2.6.1.4 Descontínuo alimentado (“fed batch”) É aquele no qual

Figura 10. Cinética do processo semi-contínuo

2.2.6.1.4 Descontínuo alimentado (“fed batch”)

É aquele no qual inicialmente se introduz o inoculo, ocupando uma fração do volume útil da ordem de 10 a 20%, iniciando-se então a alimentação com o meio de cultura, a uma vazão adequada, sem ocorrer a retirada de líquido processado (Figura 11 e 12). Essa operação prolonga-se até o preenchimento do volume útil do reator, quando então inicia-se a retirada do caldo processado para a recuperação do produto. Pode-se incluir a essas operações o reciclo de células a fim de se iniciar um novo período de alimentação. A alimentação pode ser constante ou intermitente, com vazões constantes ou não. Como também, pode-se variar a composição do meio de alimentação. O processo descontínuo alimentado pode ser dividido em dois grupos, baseados no fato de a adição de substrato ser ou não controlada por um mecanismo de retroalimentação.

ou não controlada por um mecanismo de retroalimentação. Figura 11. Sistema de fermentação descontínuo alimentado

Figura 11. Sistema de fermentação descontínuo alimentado

Figura 12. Cinética do processo descontínuo alimentado 2.2.6.1.5 Contínuo No processo contínuo (figura 13 e

Figura 12. Cinética do processo descontínuo alimentado

2.2.6.1.5

Contínuo

No processo contínuo (figura 13 e 14) procura-se estabelecer um fluxo contínuo de líquido através do reator, ou reatores dispostos em série. A operação de um sistema contínuo, constituído por vários reatores em série, no qual a alimentação de um dado reator da série é o efluente do reator anterior, visa o estabelecimento de diferentes condições nos vários biorreatores da série.

diferentes condições nos vários biorreatores da série. Figura 13. Esquema do processo contínuo F – vazão

Figura 13. Esquema do processo contínuo

F – vazão

S 0 – Concentração inicial de

substrato

X 0 – Concentração inicial de

células

P 0 – Concentração inicial de

produto

S – Concentração final de

substrato

X

– Concentração final de células

P

– Concentração final de

produtos

Figura 14. Cinética do processo contínuo 2.2.6.1.6 Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação

Figura 14. Cinética do processo contínuo

2.2.6.1.6 Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação ao processo descontínuo

As principais vantagens apresentadas pelo processo contínuo, em relação ao

são decorrentes da operação em estado estacionário,

descontínuo,

tradicional,

podendo-se destacar:

Aumento da produtividade do processo, em virtude de uma redução dos tempos mortos ou não produtivos;

Obtenção de caldo bioprocessado uniforme, o que facilita o projeto das operações unitárias de recuperação e purificação do produto de interesse (downstream);

Manutenção das células em um mesmo estado fisiológico;

Possibilidade de associação com outras operações contínuas na linha de produção;

Maior facilidade no emprego de controles avançados;

Menor necessidade de mão de obra.

Entretanto, ao lado das inúmeras vantagens apontadas, o processo contínuo

quais

apresenta

também

algumas

desvantagens

ou

problemas

práticos,

os

destacamos:

Maior investimento fixo na planta;

Possibilidade de ocorrência de mutação genética espontânea, resultando da seleção de mutantes menos produtivos;

Maior possibilidade de ocorrência de contaminação, por se tratar de um sistema essencialmente aberto, necessitando de manutenção

de condições de assepsia nos sistemas de alimentação e retirada de meio;

Dificuldade de manutenção de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazões, ou quando o caldo adquire comportamento pseudoplástico, como é o caso do cultivo de fungos filamentosos;

Dificuldade de operação em estado estacionário em determinadas situações (formação de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes de reator, ou ainda nos sistemas de entra e saída de líquido.

2.2.6.1.7 Definição dos parâmetros cinéticos

2.2.6.1.7.1 Definição das velocidades instantânea de crescimento ou de transformação Para definir as diferentes velocidades de reação que ocorrem em processos fermentativos em geral, considere um cultivo em batelada, uma forma simples de cultivo amplamente utilizada no laboratório e na indústria. Refere-se a um cultivo de células num tanque fechado com uma carga inicial de meio de cultura que é inoculada certa quantidade de microrganismos. Num processo em batelada é possível, a partir de amostras retiradas ao longo do cultivo, visualizar as cinéticas de crescimento celular, de consumo de substrato e de formação de produto a partir de perfis de concentração de células (X), substrato (S) e de produto (P). Balanços de massa para as células (X), substrato (S) e produto (P) nesse cultivo definem as velocidades instantâneas de crescimento celular (rx), de consumo de substrato (rs) e de formação de produto (rp) como sendo:

r x

r s

=

dX

dt

=

dS

dt

r P =

dP

dt

(1)

(2)

(3)

Ou seja, em cultivos em batelada é possível determinar tais velocidades instantâneas de reação a partir das tangentes (inclinações) das curvas num dado tempo de cultivo. É possível definir velocidades de reação (r x , r s e r p ) em diferentes formas de cultivo (descontínuos, contínuos e semicontínuos) a partir de balanços de massa específicos para cada um deles.

2.2.6.1.7.2 Velocidades Específicas de crescimento ou transformação

Devido ao fato da concentração celular variar durante um processo descontínuo (normalmente aumenta) e as células constituírem o “catalisador” das reações microbianas, logo o aumento da concentração celular acarreta também no aumento da concentração do complexo enzimático responsável pela transformação do substrato no produto sendo mais lógico analisar os valores das velocidades instantâneas em relação à concentração celular (X). Logo, torna-se necessário a definição das velocidades específicas de crescimento celular, consumo de substrato e de formação de produto, nas formas que seguem:

=

q S

1

X

=

dX

dt

1

X

dS

dt

q P =

1

dP

X

dt

(Também conhecida como S )

(Também conhecida como P )

2.2.6.1.7.3 Fatores de Conversão

(4)

(5)

(6)

Os coeficientes de rendimento são definidos com base no consumo de um material para a formação de outro em um intervalo de tempo para processos descontínuos ou em relação ao espaço (entrada e saída do reator) para processos contínuos, tratando-se de parâmetros relacionados com a estequiometria. Como exemplos de coeficientes de rendimento temos:

2.2.6.1.7.3.1

Coeficiente de rendimento celular (rendimento de substrato a células)

Y

X

/

S

=

X

X

O

S

O

S

(7)

Y X/S definido na equação acima é o coeficiente global de conversão de substrato em células, também conhecido como coeficiente de rendimento aparente ou observado. O valor deste parâmetro varia ao longo de um cultivo, alcançando o valor máximo durante a etapa de crescimento exponencial em cultivos descontínuos (batelada).

2.2.6.1.7.3.2

Coeficiente de rendimento de produto (rendimento de substrato a produto)

Y

P

/

S

=

P

P

O

S

O

S

(8)

Assim como para Y X/S , trata-se de um coeficiente global, variável durante o cultivo. Os coeficientes globais levam em consideração o consumo total de um material para a formação de um outro. Por exemplo, Y X/S indica a razão entre a quantidade de células formada e a quantidade total de substrato consumida num cultivo, podendo este substrato também ser utilizado para outros fins, tais como para a formação de produto e energia de manutenção celular. Para um determinado tempo t* o cálculo do coeficiente de rendimento celular e de produto instantâneos é realizado de acordo com as seguintes relações:

Y X

/

S

Y P S

/

=

dX

dS

=

dP

dS

Conforme

as

definições

de

velocidades

(eqs.

1,

2

e

3)

e

(9)

(10)

velocidades

específicas (eqs. 4, 5 e 6), resultam as seguintes relações:

Y

X

/ S

=

r

X

r S

Y

P

/

r P

S

=

r

S

X = S P = S
X
=
S
P
=
S

(11)

(12)

2.2.6.1.7.4 Determinação da velocidade de crescimento

Divisão celular

N°de células

N°de gerações

Genera lização

 

1

0

X 0 *2 0

 
 

2

1

X 0 *2 1

4

8

2

3

X 0 *2 2

X 0 *2 3

 

X 0 =número inicial de células; N=número de gerações

Então para N gerações temos:

X = X

0

* 2

N

X 0 *2 N

(19)

Se chamarmos de g o tempo de geração ou o tempo de duplicação de uma

população e t o tempo de crescimento, teremos:

N =

t

g

Então:

X

=

X

0

*

2

t g
t
g

aplicando Ln tem-se:

Ln

 X  t   g = Ln 2     X
X 
t
g
=
Ln 2
X
0

Ln

X

X

0

=

0 69

,

*

t

g

(20)

(21)

(22)

Se 0,69/g for constante, teremos uma reação de primeira ordem. Definindo como a velocidade específica de crescimento, temos:

=

0 69

,

g

Ln

X

X

0

=

* t

(23)

Esta relação pode ser demonstrada experimentalmente da seguinte maneira: a velocidade aumento da população será diretamente proporcional a esta população, ou seja:

dX

dt

proporcional a esta população, ou seja: d X dt Aumento da população = * X Quantidade

Aumento da população

=

* X
* X

Quantidade populacional

Então

a

constante

de

crescimento) será igual a:

proporcionalidade

=   1   *

X

dX

dt

Integrando, obtém-se:

Ln

X

X

0

=

* t

(velocidade

(24)

específica

(26)

(25)

de

Onde é a velocidade específica de crescimento, corresponde ao aumento da população por unidade de tempo e por unidade de população. A máxima inclinação, obtida na parte linear da curva, como ilustrado na Figura 15, é max , ou seja, a velocidade específica de crescimento máxima.

ln X

max Tempo Figura 15. Gráfico para obtenção de max
max
Tempo
Figura 15. Gráfico para obtenção de
max

2.2.6.1.7.5 Cinética de Crescimento de Monod

Se somente um substrato é limitante os outros em excesso, de forma que

somente a mudança da concentração do substrato limitante é relevante, a cinética de

crescimento varia tipicamente numa forma hiperbólica, como mostrado na figura

abaixo, onde S é o substrato limitante (normalmente fonte de carbono) e a

velocidade específica de crescimento (figura 16).

max max /2 k s S
max
max /2
k s
S

Figura 16. Cinética de crescimento de Monod

Monod expressou este tipo de curva numa forma idêntica à de Michaelis-

Menten para enzimas, ou seja:

=

max

S

k

s

+

S

onde

=

1

dX

X

dt

(27)

As mesmas considerações feitas para a equação de Michaelis-Menten são

válidas aqui:

S

S

>>

<<

k

S

k

S

=

máx

2

=

=

k

k

S

max

*

S

=

S

(S > 10 k s )

(S < 0,10 k s )

(28)

(29)

(30)

Onde k S pode ser tomado como o valor da concentração de substrato abaixo

da qual é linearmente dependente de S e acima da qual torna-se independente de

S.

A determinação de k S e max é melhor feita pela linearização da equação de

Monod. A equação de Lineweaver-Burk é um exemplo (consultar o capítulo 6 para

outros tipos de linearizações), como segue:

1

=

1

+

K

s

1

 

max

max

 

S

(31)

Assim, da figura 17 pode-se determinar as constantes k s e max pelos

coeficientes da reta.

1 K S max 1 max
1
K
S
max
1
max

Figura 17.Linearização da equação de Monod

1/S

2.2.6.1.7.6 Metabolismo endógeno

Em alguns casos, notadamente quando a taxa de diluição em fermentador

contínuo é muito baixa, verifica-se um desvio da equação de Monod, que se

transforma no seguinte:

=

S

max

k

s

+

S

- k e

(32)

onde k e é chamada de taxa de metabolismo endógeno, que significa que ocorrem

reações nas células de material intracelular. Por outro lado, k e pode ser também

encarado como taxa de morte, de forma que tenhamos:

obs

=

- k

d

(33)

Onde:

obs : velocidade específica de crescimento observada; : velocidade específica de crescimento segundo Monod; k d : coeficiente específico de morte.

Assim:

obs

=

S

max

k

s

+

S

- k

d

Ou ainda:

dX

dt

=

max

S

X

k

s

+

S

- k

d

X

(34)

(35)

2.2.6.1.7.7 Modelos de crescimento não estruturados

A tabela 3, 4 e 5 apresentam as referências e alguns modelos não-estruturados.

Tabela 3. Modelos cinéticos sem inibição e com um substrato limitante

Referência

Modelo Cinético

Monod

Teissier

Moser

Contois

Fugimoto

Powell

max

max

s

K S +

1

(

e

s

n

s

s

/ Ks

)

max

K

S

+ s

s

n

max

K S

x

s

+

s

max

(K S

+

K

D

)

+

s

Blackman

Dabes et al.

Kono Kono e Asai

 

=

1

s

para

max

 

2

K

e

=

1

 

max

 

s

=

K

+

K

S

 

max

r

x

=

X

s

<

2K

para s >

2K

Um grande número de modelos pode ser encontrado na literatura. Modelos de

crescimento podem ser muito restritos, representando um dado processo, com um

dado microrganismo, ou mesmo uma determinada fase de um processo fermentativo.

As tabelas abaixo trazem um resumo de alguns modelos de crescimento de

microrganismos.

Tabela 4. Modelos cinéticos com inibição pelo substrato

Referência

Modelo Cinético

 

Andrews

=

1

 

s

 

1

Noack

max

1

+

K

S

/

s

+

s

/

K

1S

 

max

K

S

+

s

1

+

s

/

K

1S

 

Webb

=

(

s1

+

 

s

/

'

S

K

)

 
 

max

s

+

K

S

+

s

2

/

'

S

K

 
 

=

1

Yano et al

max

1

K

/

 

j

(

s

/

K

 

)

j

 

+

S

s

+

1 S

Aiba et al

=

s

 

e

s

/

K

1 S

 

max

K

S

+

s

 

Teissier-Type

=

max

[

exp

(

s / K

1 S

)

exp

(

s / K

S

)]

=

s

 

e

117

,

com

 

=

força iônica

Webb

max

s

+

K

S

 

(

1

+

 
Webb max s + K S   ( 1 +   K ◊ 1S )  

K

1S

)

     

Tseng e

Waymann

Waymann e

Tseng

=

max

s

K

S

+

s

 

K

1 S

(

s

s

C

)

r =

k

cat

e

0

(

1

 

S

)[

1

+

 

(

1

S

)

/

K

'

S

+

S

/

K

P2

]

Siimer

a

+

b

S

+

c

2

S

 

Tabela 5.Modelos cinéticos para cinética com inibição pelo produto

Referência

Modelo Cinético

Dagley e Hinshelwood

Holzberg et al.

Ghose e Tyagi

Aiba e Shoda

Jerusalimsky e Neronova

Bazua e Wilke

Levenspiel

Hoppe e Hansford

(

s p

,

 

)

=

max

s

K

S

+

s

(1

k

p)

 

=

max

 

k

1

(

p

k

2

)

 

=

max

1

p

p

max

 

(

s

,

p

)

=

max

s

e

kp

 

K

S

+

s

(

s

p

)

=

s

K

1 P

 

,

 

max

K

S

+

s

K

1 P

+

p

max

=

 

0

k

1

(

p k

2

p

)

max

=

0

(

1

+

p
p

p

max

) 1 2

r

x

=

k

obs

 

s

x

com

k

obs

K

S

+

=

(

k 1

 

s

p

p

p

crit

) n

 

s

K

1P

 

=

max

K

S

+

s

 

K

1P

+

[Y

P

/

S

= max K S + s   K 1P + [ Y P / S (

(s

0

s)]

2.3

BIORREATORES

Os biorreatores ou reatores bioquímicos são o coração dos processos bioquímicos. São reatores onde uma dada reação bioquímica ocorre. Esta reação pode ser o resultado de crescimento de microrganismos ou uma reação catalisada por enzimas. No primeiro caso dizemos que o biorreator é um fermentador. O conceito de biorreatores pode ser também estendido para outros tipos de processos que envolvem microrganismos ou produtos de origem biológica como tanques para tratamento biológico de águas residuárias ou ainda colunas de purificação de bioprodutos (enzimas, vitaminas, aminoácidos, etc.). Os biorreatores podem ser divididos também nas formas clássicas dos reatores de mistura e tubulares. O estudo do comportamento, projeto e dimensionamento de cada biorreator é possível de ser efetuado pela combinação de conhecimentos de cinética das reações biológicas com balanços de energia e massa. Neste capítulo consideraremos inicialmente a forma simplificada dos reatores ideais, para melhor entendimento das características essenciais dos biorreatores, para, em seguida, estudarmos os desvios da idealidade nos reatores reais, como conseqüência dos desvios da hidrodinâmica dos sistemas.

2.3.1

Reatores Biológicos ideais

Dentro dos biorreatores reais estudaremos inicialmente os fermentadores do tipo reatores de mistura perfeita, nas suas diferentes formas de operação, tais como, reatores em batelada, batelada alimentada e contínuos. Em seguida, veremos os reatores tubulares e os enzimáticos.

2.3.2 Reatores de mistura

2.3.2.1 Reatores em Batelada Este processo constituiu-se basicamente de duas etapas: preparação do inóculo e a fermentação propriamente dita.

2.3.2.1.1 Preparo do inóculo

Inóculo (pé-de-cuba ou pé-de-fermentação) é o volume de uma suspensão de microrganismos capazes de garantir a fermentação de um dado mosto. O volume de inóculo pode variar segundo as condições de 0,5 a 50% da capacidade do tanque. A técnica de seu preparo compreende uma fase de laboratório e outra industrial, segundo o esquema abaixo, obedecendo a regra do volume crescente (figura 18) .

fase

laboratório

incubação incubação
incubação
incubação
cultura pura V 1 V 2 >V 1 V 3 > V 2

cultura pura

V 1

V 2 >V 1

V 3 > V 2

cultura pura V 1 V 2 >V 1 V 3 > V 2
pura V 1 V 2 >V 1 V 3 > V 2 V n Incubação V

V n

Incubação
Incubação
V 2 >V 1 V 3 > V 2 V n Incubação V 4 fase planta

V 4

fase

planta ind.

Figura 18.Técnica de preparo do inóculo

Existem, basicamente, três modos de operação de um sistema batelada:

processos em que a dorna recebe um inóculo;

processos com recirculação do microrganismo;

processo por meio de cortes.

No primeiro caso, o sistema oferece as melhores condições para uma boa fermentação, pois recebe o inóculo de células ativas e praticamente isenta de contaminantes. No segundo caso, algumas dornas são incubadas no início do processo. O meio, uma vez fermentado, é centrifugado obtendo-se assim uma suspensão de microrganismos de elevada concentração. A suspensão é tratada (ou não) com o objetivo de eliminar as células inativas e os microrganismos contaminantes. Esta suspensão é re-utilizada então como inóculo de outro fermentador. No terceiro caso, inocula-se uma dorna no início do processo e quando a fermentação atinge um estágio apropriado, passa-se parte do conteúdo para uma outra dorna e completa-se ambas as dornas com o meio fresco, a fermentar. A sucessão de cortes pode ocasionar perda de rendimento principalmente se o meio não é esterilizado. Este processo pode ser utilizado também na preparação do inóculo o que evita que o processo seja reiniciado repetidas vezes. Existem também processos mistos que associam dois dos processos citados.

2.3.2.1.2 Equações do reator em batelada

A forma matemática geral de balanço para reatores em batelada pode ser escrita da seguinte forma:

entrada - saída – consumo (ou crescimento) = acúmulo Balanço de células

dX

dt

= µX

=

µ max

SX

K

s

+

S

Balanço de substrato

dS

dt

=

1

µ

max

SX

Y

x s

K

s

+

S

(36)

(37)

Estas equações podem ser somadas, após a multiplicação da equação de S por Y x/s , e obteríamos a equação abaixo:

( ) d X + Y S x s
(
)
d X
+ Y
S
x s

dt

= 0

Ou seja, para X(0)=X 0 e S(0)=S 0 :

X + Y

x s

S = X

0

+ Y

x s

S

0

X

=

X

0

+

Y

x s

(S

0

S)

(38)

(39)

2.3.2.2 Reatores em batelada alimentada

A batelada alimentada é um tipo especial de processos em batelada onde o

substrato é alimentado constantemente, durante o processo fermentativo, de forma a

manter esta concentração constante, ou aproximadamente constante, resultando num

sistema com volume variável. A batelada alimentada é um processo de muito sucesso,

pois elimina a inibição pelo substrato, resultando em altas produtividades, geralmente

muito maiores que as obtidas na batelada simples. Os balanços são muito similares à

batelada simples, exceto pelo fato de que existe uma alimentação e, portanto o volume

do reator é variável.

Onde V é o volume do reator num tempo t e F é a vazão de alimentação, r s e r x

são as velocidades de consumo do substrato e de crescimento, respectivamente.

Sabendo-se que:

r

x =

µX

(40)

Como S é mantido constante pelo efeito da adição de substrato (na

concentração S * ), toma-se constante e igual a *. Assim, integrando-se a equação

acima de (XV) 0 a um (XV) genérico tem-se:

(

XV = XV

)

(

F S

a

S

*

)

=

0

e

*

µ t

1

Y

x s

*

µ X

0

V e

0

*

µ t

(41)

(42)

De onde tira-se a equação para F, que é a vazão de alimentação necessária

para manter S constante.

F

=

*

µ X

0

V e

0

*

µ t

Y

x s

(

S

a

S

*

)

(43)

A estimativa da variação do volume pode ser tirada da seguinte equação,

obtida da integração da equação acima ao se substituir F por dV/dt:

V

=

V

0

1 +

X

0

Y

x s

(

S

a

S

*

)

(

e

*

µ t

1

)

e a concentração da biomassa

X =

 

X

0

e

*

µ t

1 +

X

0

*

µ t

1

)

 

*

e

Y

x s

(

S

a

S

) (


(44)

(45)

2.3.2.3 Reatores de mistura contínuos

2.3.2.3.1

O Quimiostato: o reator de mistura ideal

O

uso de reatores contínuos começou na década de 50 com os trabalhos de

Monod. A descoberta de que as culturas de microrganismos podiam ser mantidas em

estado estacionário por longos períodos, em qualquer taxa de crescimento até max , foi um passo importante no entendimento da fisiologia e metabolismo dos microrganismos. A configuração típica de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19.

de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
de um reator de mistura contínuo é ilustrada na figura 19. F e X 0 S
F e X 0 S 0 V X S
F
e
X
0
S
0
V
X
S

Saída de gases

(O 2 , CO 2 )

e X 0 S 0 V X S Saída de gases (O 2 , CO 2
e X 0 S 0 V X S Saída de gases (O 2 , CO 2

Controle de pH

V X S Saída de gases (O 2 , CO 2 ) Controle de pH Reservatório
V X S Saída de gases (O 2 , CO 2 ) Controle de pH Reservatório

Reservatório de meio

F s

X

S

Reservatório de ácido ou base

de meio F s X S Reservatório de ácido ou base Reservatório de meio fermentado Entrada

Reservatório de meio fermentado

Entrada de ar estéril

Figura 19.Configuração típica de um reator de mistura contínuo.

Meio novo, normalmente estéril, é introduzido no reator e o volume é mantido constante para que a retirada de meio fermentado seja em igual taxa na qual é introduzido o meio novo. O nome “quimiostato” deriva das propriedades químicas do ambiente que são constantes quando o sistema funciona em regime permanente. Um outro sistema, conhecido como turbidiostato, é um quimiostato provido de uma célula fotoelétrica para regular a turbidez da cultura, ou seja, para aumentar a vazão de entrada do meio (F), quando a concentração celular ultrapassa o nível desejado.

O volume de líquido é mantido constante através de um controlador de nível. A

diferença básica existente entre o turbidiostato e o quimiostato, é que no primeiro a densidade da biomassa é fixada e a taxa de diluição ajusta-se ao regime estacionário

e no segundo a taxa de diluição é fixada e a concentração de biomassa ajusta-se ao regime estacionário. As equações de balanço podem ser escritas para as principais variáveis do processo:

2.3.2.3.1.1 Balanço de células

Células entrando – Células saindo + Células crescendo = Acúmulo de células

(

d XV

)

dt

=

F

O

X

O

FX

+

r V

x

(46)

Sabemos que r

x =

X

, F o =F, e que V é constante, portanto:

d

(

X

)

F

=

dt

V

.

X

0

F

V

.

X

+

.

X

Usualmente X 0 = 0, o que nos dá:

 

F

dX

1

dX

F

 

.

X

+

.

X

=

.

=

 

V

dt

X

dt

V

 

dX =

0 , logo:

Em regime permanente:

dt

=

F

V

(47)

(48)

(49)

Chamando V F de taxa de diluição D, que é o inverso do tempo de residência ( ),

temos:

= D =

1

(50)

Portanto, em regime estacionário, a taxa específica de crescimento será igual à taxa de diluição D.

2.3.2.3.1.2 Balanço do substrato

Substrato entrando – Substrato saindo – Substrato consumido = Acúmulo de substrato

F

V

.S 0

F

V

.S

1

. Y x s
.
Y
x s

.X

=

dS

dt

Em regime estacionário:

dS =

dt

0

(51)

F F 1 .S 0 .S . V V Y X S .X D(S S)
F
F
1
.S 0
.S
.
V
V
Y
X
S
.X
D(S
S)
====
0
Y
X
S
Como =D
X
=
Y
(S
S)
x s
0

.X

====

0

(52)

(53)

(54)

Considerações feitas para obtenção desta equação:

Y

x

s

independe de e D (o que nem sempre é verdadeiro);

X independe de todos os nutrientes, exceto o limitante;

é afetado somente pelo tipo de substrato.

Y

x

s

As duas últimas são relativamente corretas em certas condições (Temperatura,

pH, O 2 , constantes e excesso de todos os outros nutrientes).

Temos deduzidas as equações: = D

X

=

Y

x s

(S

0

S)

Já conhecemos a equação de Monod:

=

máx

S

K

S

+

S

(55)

(56)

Então podemos escrever para um quimiostato em regime permanente:

D

=

D

c

S

K

S

+

S

(57)

Onde D C é a taxa de diluição crítica que representa a máxima diluição em que

um quimiostato pode operar. Com algumas exceções, D C é geralmente igual a máx . A

equação acima fica:

S =

D.K

S

µ

max

D

Substituindo as equações temos:

X

=

Y

x s

(S

0

D.K

S

D

)

µ

max

(58)

(59)

Usando as equações acima, o comportamento teórico de um quimiostato pode

ser representado na figura 20, onde nas ordenadas tem-se os valores das variáveis X,

S e Pr em regime permanente e nas abscissas os valores da taxa de diluição D:

X S S X Pr Pr washout S D M D c D Figura 20.Variações
X
S
S
X
Pr
Pr
washout
S
D M
D c
D
Figura 20.Variações da taxa de diluição em função de X, S e P

O washout é o ponto onde a concentração de células atingirá zero, em regime

permanente, devido à taxa de alimentação ser superior a taxa de reprodução do microrganismo. Essa taxa de diluição é normalmente conhecida como diluição crítica

(D c ). Pode ser determinada aproximadamente pela relação:

D

c

=

max

S 0

K

s

+

S

0

(60)

2.3.2.3.1.3 Produtividade Um processo de fermentação é sempre avaliado pelo fator de conversão ou rendimento e pela produtividade média. A produtividade Pr é definida como:

Pr = D.X

onde

p

r

V M

=

3

L

. t

= produtividade volumétrica

(61)

A produtividade volumétrica faz referência à eficiência do processo ou equipamento

p

r

m M

=

t

= produtividade mássica

A produtividade mássica está relacionada à capacidade de produção da indústria.

Pr

=

D.Y

x s

S

0

K

S

D

máx

D

(62)

A variação de Pr em função de D está representada na figura anterior. A taxa

de diluição necessária para obtenção da produtividade máxima será a derivada

primeira da equação acima igualada a zero. Derivando obtém-se D M

D

M

=

máx

1

 

 

K 1   2 S    K + S S 0 
K
1
 
2
S
 
K
+ S
S
0
 

(63)

Então a produtividade máxima Pr M será:

Pr

M

=

D

M

.X

M

=