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Microbiologa general

Objetivos:

Conocer el fundamento y la aplicacin de las pruebas bioqumicas secundarias, de tal manera que se pueda entender la lectura de los resultados arrojados por dichos ensayos.

Razonar la aplicacin de dichas pruebas y asimilar la dependencia que estas presentan en funcin del metabolismo bacteriano, ya que esto nos permitir comprender las capacidades que posee dicho organismo para obtener energa y nutrientes del medio, as como conocer algunos factores del crecimiento que este requiera.

Introduccin

La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de

cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.

En la actualidad existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, ya que se propone el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, simplificando la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, que permiten una total automatizacin.

Pruebas bioquimicas antes de la inoculacion Las imgenes antes mencionadas son de vital importancia, debido a que los cambios visibles, seran la pauta que nos permitira conocer si se es positivo o negativo el resultado obtenido y expresado por el organismo de estudio.

Fundamento e Interpretacion Urea: El sustrato urea es una diamina del acido carbonico. La urea es hidrolizada por una enzima especifica, la ureasa para dar dos moleculas de amoniaco. En solcuion la urea se hidroliza a carbunato de amonio como producto final H2N C=O + 2 H2O H2N urea ureasa CO2 +H2O + 2NH3 (NH4)2 CO3

carbonato de amonio

La ureasa es considerada encima constitutiva debido a que es sintetizada por ciertas bacterias sin tomar en consideracion la presencia o ausencia de su sustrato, la urea. La ureasa se clasifica como una amidasa ya que cataliza la hidrolicis de las amidas. En el caso de la ureasa el nitriogeno es disoseado como amoniaco, la ureasa actua en los componentes a nivel de los puentes C-N. El ph optimo para su actividad es de 7 Indicador rojo de fenol Es un medio lquido, modo de inoculacin agitacin Acido: pH 6.8 amarillo Alcalino: pH 8.4 rosado intenso

El indicador muestra la produccin de ureasa Interpretacin: positivo color rosa intenso en todo el caldo Negativo no existe cambio de coloracin anaranjado o amarillo Resultado: Negativo.

Citratos:

Es un medio de cultivo que contenga citrato como fuente de carbono, sales de amonio inorgnica como fuente de nitrgeno

La alcalinizacin del medio es debida a la formacin de amoniaco a partir de sales de amonio. La bacteria que utiliza el citrato como nica fuente de carbono pueden producir energa ya que no existe fermentacin o produccin de acido lctico.

El metabolismo del citrato involucra una condensacin de acetil coenzima A y oxalacetato para ingresar al ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato involucra un sistema enzimtico sin la participacin de la coenzima A, la citratosa (citrato oxalacetato liasa). El oxalacetato y acetato son intermediarios del metabolismo de citrato; sus productos dependen del pH del medio a pH alto (alcalino) se produce mas acetato y formato lo que disminuye la produccin de lactato y CO2. A pH arriba de 7 los productos son:

Citrato

CO2 + acido frmico + acido actico

Indicador: azul de bromotimol Medio solido

Modo de inocular: estriado en punta de flauta Acido: pH acido 6 amarillo Alcalino: pH 7.6 azul Interpretacin: positivo intenso color azul Negativo verde, ausencia de crecimiento Resultados prueba: Positivo

Malonatos:

El malonato es un inhibidor enzimtico. El acido malonico interfiere con la oxidacin del acido succnico a acido fumrico mediante la inhibicin de la accin cataltica de la enzima succinato de deshidrogenasa. El acido malonico inactiva la enzima mediante un proceso enzimtico denominado inhibicin competitiva, la succnico deshidrogenasa transfiere hidrogeno a un aceptor apropiado en la conversin de acido succnico a acido fumrico; esta reaccin puede ser inhibida por el acido malonico que compite por los sitios de la enzima. El acido maolico se une a la enzima y ocupa los sitios activos; asi la enzima no puede combinarse con su sustrato normal y bloquea la oxidacin del acido succnico.

Indicador: azul de bromotimol Medio: liquido Modo de inoculacin: Agitacin Acido: pH 6 amarillo Alcalino: pH 7.6 azul Interpretacin: positivo azul Negativo verde Resultado de la prueba: positivo

KIA: Cuando un microorganismo utiliza como fuente primaria de carbono a los azucares, se acidifica el medio (fermentacin), por que se forman cidos orgnicos, si no utilizan o no tienen en el medio hidratos de carbono utilizan protenas que alcalinizan el medio por la formacin de aminas. La glucosa se metaboliza mejor que la lactosa, por que la estructura molecular es ms sencilla. La fermentacin se puede llevar a cabo en aerobiosis (pico de flauta), as como en anaerobiosis.

La glucosa en el pico de flauta es metabolizado para producir acido pirvico, el cual es degradado en ciclo de Krebs y rendir CO2, H2O y energa. La glucosa en el fondo se encuentra en condiciones anaerobias, de forma que la glucosa se metaboliza por la va de Embden-Meyerhof, a ATP y acido pirvico convirtindose posteriormente en acido lctico, aldehdos, alcoholes, CO2, H2

indicador: rojo de fenol

Medio: solido Modo de inoculacin: por picadura y estria Acido: color amarillo Alcalino: rojo Sin inocular: a pH 7.4 anaranjado Resultado de la prueba: Acido/acido positivo, si fermento lactosa

Arginina:

El aminocido arginina es catabolizado por medio de dos sistemas; la arginina deshidrolasa y el sistema arginina descarboxilasa.

NH II CNH2 I NH I (CH2)3 I CN - NH2 I COOH I

CH2- NH2

(CH2)2 I descarboxilacion CH-NH2

L- arginina putrecina

La descarboxilacion de la arginina cambia para producir agmatina la cual es degradada por la agmatinasa, rompindola en dos compuestos, putrecina y urea, si la enzima ureasa esta presente la urea es catabolizada para dar amoniaco y CO2. El sistema arginina deshidrogenasa elimina el NH2 de la arginina por medio de una arginina deshidrolasa, arginina desiminasa, para producir circolina, amoniaco y fosfato inorgnico. Posteriormente la circolina se rompe fosforiliticamente en presencia de H3PO4 y de la enzima ornitina, para formar ornitina y carbinol fosfato. La degradacin de la arginin, la citrulina es una reaccin productora de energa importante de ATP

Indicador: purpura de bromocresol Medio: liquido Modo de inoculacin: por agitacin Acido: pH 5.2 amarillo Alcalino: pH 6.8 purpura Interpretacin: arginina positiva morado Arginina negativo amarillo Resultado de la prueba positivo

LIA:

Las descarboxilasas son enzimas que actan sobre el grupo carbonilo T. de los aminocidos para formar aminas mas CO2 y cada descarboxilasa acta sobre un aminocido especfico. Las descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas que se forman cuando un microorganismo es cultivado en un medio acido en presencia de un sustrato especfico y de los productos de descarboxilacion cambian el pH a lmites alcalinos. La descarboxilacion esta restringida a aminocidos que poseen por lo menos un grupo qumicamente activo distinto de una amina o grupo carboxilo y la degradacin de los aminocidos ocurre en anaerobiosis.

El aminocido lisina es descarboxilado para formar cadaverina y CO2 por la accin de la enzima especifica lisina descarboxilasa

NH2 I CH2 I (CH)3

NH2 I CH2 I

lisina descarboxilas I CH2 I -CO2

(CH2)3

+ CO2

CH2

I NH2 I COOH

I NH2

L-lisina cadaverina (diamina)

Detecta a los miembros de la familia de enterobacteriaceae ya que estos descarboxilan o desaminan a la lisina.

Indicador: purpura de bromocresol Medio: solido Modo de inoculacion: picadura y estria

Acido: pH 5.2 amarillo Alcalino: pH 6.8 purpura Interpretacin: pico de flauta y extremo inferior purpura (alcalino) positivo Resultado de la prueba positivo , sin presencia de de H2S ni desprendimiento de gases MIO: El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putrecina y CO2. Los productos de descarboxilacion cambian el pH a lmites alcalinos. Esta descarboxilacion ocurre en anaerobiosis, es por ello que a esta prueba se le agrega aceite mineral en la parte superior del medio. La descarboxilacion es irreversible, no oxidativa y por lo general requiere una coenzima comn.

NH2 I (CH2)3 I I

CH2 NH2

(CH2)2

CH- NH2 ornitina descarboxilasas CH2 NH2 I COOH -CO2

+ CO2

L- ornitina putrecina

La putrecina es estable cuando se produce en condiciones anaerobias. Al sellar los tubos, todo el oxigeno no ligado es consumido por el microorganismo durante la fase crecimiento inicial y se eleva el pH del medio durante la descarboxilacion a medida que se produce CO2. Ya que el pH puede controlarse, se le introduce el indicador de pH purpura de bromocresol.

Indicador: purpura de bromocresol Medio: semislido Modo de inoculacion: picadura Acido: pH 5.2 amarillo Alcalino: pH 6.8 purpura Interpretacin: positiva a ornitina, purpura , negativo a ornitina, amarillo Resultado de prueba: Motilidad (+) , Indol (-) , ornitina (+)

SIM: Esta prueba determina si enzimticamente se ha liberado acido sulfhdrico (H2S) g a patir de los aminocidos azufrados para producir una reaccin visible negra. Peptona, cistena, cistina, metionina, y tiosulfato son fuentes de azufre, sin embargo algunas bacterias utilizan diferentes compuestos o aminocidos azufrados para producir H2S. Un microorganismo productor de H2S cultivado en un medio orgnico como la peptona reduce el azufre por hidrogenacin produciendo H2S g

CH2-SH CH3 I CH-NH2 I I I + H2O cistena desulfhidrasa C=O + H2S + NH3

COOH COOH Cistena ac. Piruvico ac. Sulfhdrico amoniaco

Indicadores del H2S: * Citrato de amonio frrico * Tiosulfato de sodio

El tiosulfato es un intermediario en la reaccin de sulfato a H2S por las bacterias reductoras de sulfatos. La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio y un sulfato, para que esto suceda debe existir una fuente de H+ en el medio. Como es un proceso de respiracin anaerobia, donde el tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidacin de sustratos organicos. El Tiosulfato S2O3 reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es la fuente de azufre del microorganismo: 4H + 4 e + 3 S2O3 Tiosulfato Tiosulfato reductasa sulfito 2SO3 + 2H2S

sulfuro de hidrogeno gaseoso

De esta manera del H2S siendo un gas incoloro, necesita un segundo indicador para visualizar su produccin. El H2S reacciona con el citrato de amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metlico: H2S + iones frricos sulfuro ferroso (pp negro insoluble)

Indol:

La peptona de casena contiene al triptfano aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indlicos principales: indol, escatol, ac. Indolacetico. A las enzimas que participan el la produccin de indol se les denomina triptofanasa ya que tienen una actividad hidrolitica sobre el sustrato triptfano. La triptofanasa cataliza la reaccin de desaminacion atacando a la molcula del triptfano solo en su cadena lateral dejando al anillo aromtico intacto como indol:

CH2-CH-COOH I triptofanasa + NH L-triptofano NH2 CH3-C-COOH + NH3

desaminacion NH indol O Ac. Piruvico

Reactivo de lectura: * Kovac o Ehrlich Si esta presente el indol en el medio, este se combina con el reactivo produciendo color en la capa de alcohol. Esta reaccin ocurre por proceso de condensacin. Y esta coloracin se debe a la estructura pirrol presente en indol.

Medio: semislido Modo de inoculacin: por picadura Interpretacin: Sulfhdrico (pp negro insiluble positivo) sin cambio (negativo) Indol: anillo de color rojo (positivo), sin cambio (negativo) Motilidad: turbidez (positivo), solo sobre la lnea de siembra (negativo) Resultado de la prueba: S (-) , I (-), M (+)

Felinalanina

Determina la capacidad de un organismo de desaminar a la felinalanina gracias a la felinalaninadesaminasa, obtenindose Ac fenil piruvico por dicha actividad enzimtica obtenindose por consiguiente una acidez en el medio.

El a.a. aromatico felinalanina sufre una desaminacion oxidativa catalizado por una flavorproteina que produce en consecuencia Ac cetonico y Ac fenilpiruvico

RCHNH2COOH + O2 RCNHCOOH Aminocido enzima

RCOCOOH +NH3 +H2O

Indicador: Medio: solido Modo de inoculacion: picadura Lectura: Agregar sulfato frrico de amonio hasta obtener la coloracin Interpretacin: Positiva coloracin roja en el pico de la flauta Negativo: no hay cambio Resultado de prueba: negativa no presento cambio

Nitratos

Permite determinar la capacidad de un organismo de reducir los nitratos en nitritos o incluso hasta nitrgeno molecular.

La reaccin de nitratos a nitritos o en gas molecular de nitrgeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerobia, en las cuales un organismo obtiene oxigeno del nitrato, este proceso de respiracin anaerobia de oxidacin por la cual las sustancias inorgnicas, especialmente nitratos y sulfatos o raramente carbohidratos que seden oxigeno para ser empleado como aceptor de electrones.

Para realizar la lectura de esta prueba se realizan dos fases o etapas:

1.- se agrega de forma directa al tubo a-naftol y dimetil-a-metilamina, para asi obtener una coloracin rojiza que nos indicara la reduccin de nitratos a nitritos.

2.-en la fase dos se adiciona igual de forma directa Ac sulfamino, si al agregar este compuesto al medio y no existe un cambio el resultado es positivo a obtener nitrgeno molecular, pero sin embargo se obtiene un color rojo intenso, este no indica la existencia de nitritos sino de nitratos lo cual es un resultado negativo a la prueba

Medio: liquido Modo de inoculacion: agitacion Interpretacin: Fase 1: Positiva Rojo intenso (NO2) Negativo sin cambio

Fase 2: Positivo: sin cambio alguno (N2) Negativo: Rojo intenso (NO3)

Resultado de prueba: reduccin hasta N2

MR-VP

MR (Rojo de metilo)

Prueba multiple que comprueva la capacidad de dicho organismo de producir y mantener estable los productos terminales acidos de la fermentacion de la glucosa a tal grado de vencer la capacidad amortiguadora des sistema. Basandonos en el empleo de un indicador de pH se determina si la especie de estudio al fermentar a la glucosa lo realiza por la via de acidos mixtos dando como resultado el cambio de pH a un color rojo

2 glucosas +H2O 2 Ac. Lactico +Ac. Acetico + Alcohol etilico +2CO2 + 2H2

VP (Voger-Proskauer)

Determina la capacidad de algun organismo de producir un compuesto final neutro al realizar la fermentacon de la glucosa, la formacion de la glucosa presenta AC. Piruvico, intermediario clave

de la glucolisis, desde ests punto la bacteria puede seguir muchas vias y una de estas tantas en mediantes productos neutros (acetoina)

2 piruvato

acetoina + 2CO2

Para realizar la lectura se requiere de adicionar ciertos reactivos, que se agregan directamente al medio respetando el siguente orden:

1.- 0.6 ml a-naftol al 5% 2.- 0.2 ml de KOH al 40% 3.- agitar suavemente y dejar reposar por 10 min.

La reaccion positiva positiva generara la formacion de un aro color rojo violeta en la superficie indicando, lo cual nos indica la produccion de acetoina.

Indicador: rojo de metilo Buffer: fosfato de potasio Acido: pH 4.8 rojo Alcalino: pH 6.0 amarillo Medio: liquido Modo de inoculacion: agitacin Interpretacin de MR: Interpretacin de VP: Positivo rojo rosado en la superficie Negativo amarillo en la superficie

Resultado de prueba: MR (+) VP (-)

Al realizarse las pruebas anteriores, obtenemos resultados valiosos que como ya hemos mencionado nos permiten conocer secciones del metabolismo que presenta este organismo, sin embargo la informacin presente aun que es amplia, es muy ambigua y dispersa para poder determinar la cepa o especie con la cual se est trabajando, para poder realizar dicha especificacin se tendra que efectuar desde las pruebas bioqumicas primarias, como un sembrado en medio selectivos que nos indique ya una serie de restricciones que nos lleven a lo particular y as obtener la descripcin si no completa si correcta del organismo de inters.

Referencia

Barrow G.I. & Feltham R.K.A. Cowan and steels Manual for the Identification of Medical Bactera 3er edicion, Editorial Cambidge University, 2003

Mac Faddin Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica Editorial editorial medica panamericana.

Romero C. Ral, Microbiologa y Parasitologa Humana 3er edicin, Editorial editorial medica panamericana, Mxico, 2007, p

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