Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

Cuprins

1. Norme de protecie a muncii. Dotri minimale ale laboratorului de microbiologie: utilizarea corect i circuitul probelor

2. Recoltarea i manipularea probelor biologice i patologice (snge, urina, materii fecale, LCR, exsudat) n vederea diagnosticului de laborator

3. Metodele de distrugere a organismelor patogene. Dezinfecia. Sterilizarea. Controlul sterilizrii

4. Examenul microscopic direct al preparatelor native i colorate. Tehnica realizrii i colorrii frotiurilor. Coloraii uzuale 5. Metode de izolare i cultivare a bacteriilor. Medii de cultur uzuale.

6. Antibiograma difuzimetric: tehnica de realizare i interpretare.

7. Determinarea CMI. Criterii de decizie asupra necesitii efecturii antibiogramei

8. Identificare fungilor patogeni cu implicaii n patologia dentar

9. Diagnostic serologic (depistarea i dozarea Ac) depistarea Ag microbiene. Metode specifice de identificare a microflorei dentare 10. Protozoologie: Reprezentani (Rhizopoda, Flagelata, Sporozoa, Infuzoria); tehnici de laborator de evideniere 11. Examenul coproparazitologic. Helmintologie Plathelminthes

12. Helmintologie Nemathelminthes.

13. Cultivarea virusurilor. Metode de laborator n diagnosticul n infeciilor virale

14. Evaluare final (lucrri practice)

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

LP2.

NORME DE PROTECIE A MUNCII. DOTRILE MINIMALE ALE LABORATOARELOR DE MICROBIOLOGIE : UTILIZAREA CORECT I CIRCUITUL PROBELOR

(ORDIN nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcionarea laboratoarelor de analize medicale. EMITENT: MINISTERUL SANATATII PUBLICE PUBLICAT N: MONITORUL OFICIAL nr. 617 din 6 septembrie 2007)

1. Hot de siguran biologic

2. Lamp UV

3. Balan 4. Termostat (cu temperatur reglabil)

5. Microscop binocular

6. Lup de laborator

7. Frigider

8. Congelator (prevzut cu ncuietoare)

9. Baie de ap cu temperatur reglabil

10. pH-metru sau indicator pH

11. Bec de gaz

12. Etuv

13. Autoclav

14. Anse bacteriologice

15. Pipete automate

16. Termometre

17. Instalaie de ap purificat*)

18. Sistem de etalonare a inoculului pentru antibiogram.

Laboratoare de analize medicale care efectueaz culturi pentru diagnosticul tuberculozei i/sau micobacteriozelor:

1. Hot de siguran biologic i protecie suplimentar

2. Autoclav de laborator vertical, cu accesorii (electric sau cu gaz)

3. Balan semianalitic (sensibilitate 1 mg)

4. Balan pentru echilibrat tuburi de centrifug

5. Dulapuri termostat sau camer-termostat cu capacitate de 6-8 mc (20.000-30.000 culturi/an)

6. Centrifug cu accesorii (reglare automat a vitezei, cronometru, dispozitiv de securitate mpotriva demarajului intempestiv i protecie pentru evitarea formrii de aerosoli n laborator)

7. Instalaie de ap purificat*)

8. Etuv

9. Frigider-dulap pentru medii de cultur

10. Frigider pentru prelevate

11. pH-metru

12. Sticlrie specific de laborator

13. Anse bacteriologice

14. Bec de gaz

15. Ceas de laborator

16. Couri pentru pstrarea eprubetelor cu medii

17. Usctor pentru lame, cu termostat.

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

LP 3

RECOLTAREA I MANIPULAREA PROBELOR BIOLOGICE I PATOLOGICE ( SNGE, URINA, MATERII FECALE, LCR, EXSUDAT) N VEDEREA DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR

Informaii generale

Recoltarea i transportul produselor patologice, etape ale diagnosticului microbiologic, sunt efectuate de catre medicul clinician i/sau asistent. Rezultatele investigaiilor microbiologice depind n mare masur de calitatea recoltrii.

Ghidul trebuie cunoscut si respectat de intreg personalul deoarece rezultatul primit de la laborator reflect calitatea recoltarii. In plus, la recoltare se va ine cont i de urmtoarele aspecte: recoltarea se face dupa o prealabil pregatire a pacientului; pacientul trebuie s fie informat n legatu cu analiza ce urmeaza a se face i cu modul corect de recoltare; - recipientele pentru recoltare sunt sterile, de unic folosinta i adaptate investigaiei;

se recolteaz produsul patologic naintea administrarii antibioticului;

se recolteaz din zone i n momentul n care este cel mai probabil a gsi bacteria care a produs infecia;

- probele trimise la laborator trebuie s reprezinte realul produs patologic (ex.: sputa, nu saliva etc); se recolteaz o cantitate suficient de produs patologic;

n seciile din spital suprafaa pe care sunt puse recipientele cu produse patologice va fi total separat de masa de tratament;

este obligatorie prezenta n locurile de recoltare a containerelor cu perei rigizi pentru

depozitarea temporar a deeurilor nepatoare; - exteriorul recipientului trebuie dezinfectat dac a fost contaminat n timpul recoltrii; se noteaz pe recipient numele pacientului i proveniena sa, tipul produsului patologic, data i ora recoltrii;

fiecare produs patologic va fi insoit de un buletin ce conine informaii despre proba recoltat i pacient (vezi cererea de analize pentru microbiologie);

- transportul se face cat mai repede la laborator pentru a preveni degradarea produsului patologic; - se vor folosi medii de transport care asigura o bun supravieuire a bacteriilor.

Mai jos sunt sintetizate modul de recoltare si transport al celor mai frecvente produse patologice, in functie de situsul anatomic. 1. Abces deschis:

mod de recoltare - dezinfectati cu alcool etilic 70% sau betadina. Daca este necesar, irigai leziunea cu o soluie salin non-inhibitorie. Aspirai cu o seringa steril (de preferat) sau profund din leziune cu un tampon steril. cantitate - > 1 ml sau 2 tampoane din acelai loc.

transport - < 2 ore.

observaii - se recomand recoltarea cu seringa steril prin aspiraie sau biopsie. Dac se recolteaz cu tamponul, este obligatorie recoltarea a dou tampoane din profunzimea leziunii (1 tampon pentru nsmanare i 1 tampon pentru frotiul Gram). Se va folosi mediul de transport Stuart

sau Amies. Sistemul anaerob de transport este obligatoriu pentru a asigura supravietuirea bacteriilor anaerobe implicate n procesul infectios. Aceleai recomandri la recoltare se aplic pentru: vezicule, pustule, plgi, furuncule, arsuri, ulcere de decubit, fistule etc. 2. Abces nchis:

mod de recoltare - aspirai cu o seringa sterila. Transferai imediat tot materialul intr-un sistem anaerob.

cantitate - > 1 ml.

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

transport - < 2 ore, sistem anaerob de transport.

observaii - n caz de gangren se recolteaza i hemocultura n acelai timp.

3. Cavitate bucal:

mod de recoltare - curatai cu grij marginea gingiei i suprafaa dintelui, pentru a ndeprta saliva i resturile alimentare. Folosii un scaler periodontal i indeprtai secreia din leziuni. Transferai aseptic ntr-un sistem anaerob de transport.

transport - sistem anaerob de transport < 2 ore.

observaii - leziunile periodontale trebuie procesate numai n laboratoarele dotate pentru izolarea si identificarea agentilor specifici.

4. Exsudat nazal:- mod de recoltare - umeziti tamponul in ser fiziologic steril. Inserati 2 cm si rotiti tamponul.

cantitate - un tampon pentru fiecare nara.

transport - < 2 ore.

observatii - exsudatul nazal este recomandat in principal pentru depistarea purtatorilor de

Stafilococcus aureus. 5. Exsudat faringian:

- mod de recoltare - deprimati baza limbii cu un apasator steril. Stergeti cu tamponul ferm, dar nu brutal, amigdalele si peretele posterior al farigelui - zone inflamate, ulcerate, depozite purulente.

cantitate - un tampon.

transport - < 2 ore. observatii - recoltarea se face inainte de ingestia alimentelor sau toaleta cavitatii bucale. Se evita atingerea tamponului de baza limbii sau palatul moale. Se va preciza in biletul de trimitere suspiciunea clinica de candidoza. Se recolteaza doua tampoane de la nivelul depozitului pseudomembranos. Se va preciza in biletul de trimitere suspicinea clinica de angina si stomatita Vincent. Se vor recolta doua tampoane din acelasi loc. Se va preciza in biletul de trimitere daca identificarea S.aureus este in scop epidemiologic (purtator). 6. LCR:

mod de recoltare - dezinfectati cu betadina, 3 badijonari succesive; respectati timpul de actiune al antisepticului.

transport - < 15 minute.

observatii - se recolteaza concomitent si hemocultura. 7. Materii fecale - Coprocultura:

- mod de recoltare - coprorecoltor cu mediul de transport CARY BLAIR. cantitate - 5-10 g.

transport - < 1 ora (daca nu se recolteaza in recipient cu mediul Cary Blair).

observatii - recoltarea se face inaintea inceperii tratamentului cu antibiotice. Din scaunul proaspat emis se recolteaza portiuni cu mucus, sange. Cand acestea lipsesc, se recolteaza boluri fecale din trei locuri diferite. Prelevare cu sonda Nelaton: se adapteaza o seriga cu care se fac 1-2 aspiratii. Tampon rectal: tamponul se umezeste in solutie salina izotona (nu geluri lubrifiante!), se introduce prin sfincterul anal 1,5 cm prin rotire lenta. Mentionati suspiciunea clinica pentru care solicitati coprocultura. 8. Ochi - conjunctiva:

- mod de recoltare - cate un tampon separat pentru fiecare ochi. Tamponul este umezit in ser fiziologic steril. Rotiti tamponul si insamantati-l direct pe mediile de cultura. - transport - insamantare directa pe mediile de cultura (chocolate, gelozasange), frotiuri pentru examenul microscopic direct. Placile insamantate se trimit la laborator < 15 min. - observatii - se recolteaza inainte de: toaleta fetei, terapie antimicrobiana topica sau sistemica. Se recolteaza de la nivelul ambelor conjunctive. Ochiul neinfectat serveste drept control. Insamantarea se face imediat, majoritatea germenilor avand viabilitate redusa.

9. Ochi - cornee:

- mod de recoltare - raclat din mai multe arii ale ulcerului cornean. Solutie anestezic local.

- transport - nsamnare direct pe mediile de culturi (BHI, chocolate), frotiuri pentru examenul

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

microscopic direct. Placile nsamantate se trimit la laborator < 15 min. 10. Sange - hemocultura:

mod de recoltare - dezinfectati locul venopunctiei cu betadina, 3 badijonari succesive, concentric, din centru spre periferie. Permiteti antisepticului sa actioneze. Nu palpai locul venopunctiei. Indeprtai iodul cu alcool 70%.

transport - flacoane pentru sistemul automat (ex.: BactAlert). Dezinfectai capacele de cauciuc cu alcool 70%. Inoculai fiecare flacon fr a depasi semnul de pe eticheta. Transportati imediat.

observatii - Sepsis acut: 3 seturi, 3 venopunctii separate, la interval de 10 minute, inainte de a incepe antibioticoterapia. Endocardita acuta: 3 seturi, 3 venopunctii separate in primele 1-2 ore de evolutie; incepeti terapia. Endocardita subacuta: 3 seturi, 3 venopunctii separate la interval de 15 minute in prima zi. Daca rezultatul la 24 ore este negativ, recoltati inca trei seturi. Endocardita n timpul tratamentului cu antibiotice: 3 seturi, 3 venopunctii separate, zilnic, 3 zile succesiv. Se

recolteaza imediat inaintea inceperii urmatoarei doze de antibiotic. Nu se recolteaza cand concentratia serica a antibioticului este maxima.Febra de origine necunoscuta: 2-3 seturi, venopunctii separate la cel putin o ora interval. Daca rezultatul la 24-36 ore este negativ, se repeta recoltarea. NU SE RECOLTEAZA DE LA NIVELUL CATETERULUI !!! 11. Sputa: - mod de recoltare - se va efectua periajul dinilor, cltirea energic a gurii i gargar cu ap. Pacientul tueste i expectoreaz ntr-un recipient steril (cu gatul larg si cu un capac care se inchide ermetic).

cantitate - > 3 mL.

transport - < 2 ore. observatii - se recolteaza sputa sub directa indrumare a asistentei. Se explica pacientului diferenta dintre a expectora si a scuipa. Sputa se recolteaz dimineaa cnd pacientul face toaleta bronhiilor. 12. Secreie traheal:

mod de recoltare - secretie aspirat n recipient steril.

cantitate - > 3 mL. transport - < 2 ore.

observatii - se aspira cu ajutorul unei sonde de unica folosinta, atraumatic, aseptic. Se va efectua preoxigenarea bolnavului cu fracie inspiratorie Fi O2 = 1, timp de trei minute. 13. Ureche - secreie otica interna:

- mod de recoltare - timpan perforat: se colecteaza fluidul cu un tampon flexibil cu ajutorul unui speculum auditiv. - cantitate - tampon cu mediu de transport sau sistem anaerob. Obligatoriu se recolteaza dou tampoane din acelasi loc. transport - < 2 ore.

observatii - in cazul secretiei aspirate sau biopsiei se foloseste sistemul de transport anaerob. Culturile de la nivel nazofaringian sau exsudat faringian nu sunt predictive pentru agenii etiologici n otita medie. 14. Ureche - secretie otica externa:

mod de recoltare- cu un tampon umezit se cur conductul auditiv extern. Cu un al II-lea tampon se recolteaz prin rotire ferm.

cantitate - obligatoriu se recolteaza 2 tampoane.

transport- < 2 ore.

observaii - pentru secreia otic extern se va efectua rotirea riguroas a tamponului. 15. Urina - urocultura:

mod de recoltare - toaleta locala riguroas cu apa i sapun. Splai minile. Recoltai din jetul mijlociu, fr intreruperea fluxului. Nu contaminai recipientul.

transport - recipient steril cu gtul larg (exclus eprubete), se transporta n < 2 ore.

observaii - prima urina de dimineata sau la cel putin 4 ore de la ultima miciune; naintea nceperii tratamentului cu antibiotice. In cazul urmririi eficienei tratamentului cu antibiotice, recoltarea se

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

repet dupa 48-96 ore. Dat fiind intermitena n eliminare, se recomand 3 recoltari succesive. Controlul se va efectua dupa 3-5 zile de la ntreruperea tratamentului. 16. Urina - cateter vezical:

- mod de recoltare - dezinfectati cu alcool 70% capatul distal al cateterului. Recoltati cu ac si seringa sterile. cantitate - 5 mL.

transport - < 1 ore (urocultor steril).

observaii - mentinerea sistemului de drenaj n circuit nchis. Nu se desface jonctiunea cateter - tub drenaj pentru recoltare. Nu se colecteaz din sacul colector pentru urocultur. Din sering se trece urina n urocultor n condiii aseptice. 17. Tract genital feminin - vaginite:

mod de recoltare - secretia acumulata n fundul de sac vaginal posterior este detasat cu ajutorul unei valve.

cantitate - 3 tampoane i 2 lame.

transport - < 2 ore.

observaii - in cazul suspiciunii infectiei cu Trichomonas vaginalis, un tampon se imerseaz n tub steril cu 1 ml soluie salin izoton (37C), pentru examen microscopic (preparat proaspat ntre lam-lamel). 18. Tract genital feminin - endocervicite:

- mod de recoltare - stergei suprafata exocolului cu 2-3 comprese sterile pentru a indeparta secretiile stagnante. Recoltati prin rotirea usoara a 2 tampoane introduse succesiv in endocol.

cantitate - un tampon si 2 lame - sistem anaerob de transport.

transport - < 2 ore.

observatii - tamponul cu mediul de transport se foloseste pentru insamantare. Lamelele se folosesc pentru examenul microscopic colorat.

19. Tract genital feminin - bartolinite:

mod de recoltare - prelevati secretia purulenta de la nivelul orificiului conductului glandular.

cantitate - > 1 mL.

transport - sistem anaerob.

20. Tract genital feminin - endometrite:

mod de recoltare - badijonati cu alcool iodat exocolul si canalul cervical; introduceti un cateter; aspirati lichidul endometrial. observatii - puroiul aspirat prin punctie (abces) se insamanteaza pe medii aerobe si anaerobe.

21. Tract genital masculin - uretra:

mod de recoltare - prelevati pe tampon scurgerea uretrala spontana sau provocata. Prelevati intrauretral cu tamponul: introduceti bland tamponul, rotiti-l, lasati-l doua secunde si retrageti-l.

cantitate - tampon cu mediu de transport - doua lame pentru examenul microscopic.

transport - < 2 ore.

observaii - examinarea uretrei i prelevarea probelor se fac la cel puin dou ore dup miciune. Pacienii cu scurgere discret vor reduce lichidele pan n ziua urmatoare i prelevarea se face inainte de miciunea matinal. In cazul suspiciunii infeciei cu Trichomonas vaginalis, prelevarea se va face naintea miciunii matinale; tamponul se imerseaz n tub steril cu 1 ml soluie salin izoton (37C), pentru examen microscopic fr ntrziere. Probele destinate cultivrii gonococilor se nsamanteaz imediat pe medii speciale, la 37C. 22. Tract genital masculin - prostata:

recoltati secretie pe tampon sau in recipient steril.

cantitate - tampon cu mediu de transport - doua lame pentru examenul microscopic.

transport - < 2 ore.

observatii - sunt relevante probele obtinute imediat inainte si dupa masajul prostatic. Transportul probelor

Timpul de transfer al probelor catre laborator poate fi: - scurt, cand locul de recoltare/clinica este in acelasi loc cu laboratorul;

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

- mediu, cand locul de recoltare/clinica este in aceeasi localitate cu laboratorul, dar nu in acelasi loc; - lung (24 ore sau mai mult), cand locul de recoltare/clinica este in alta localitate decat laboratorul si se trimit probele prin posta sau curieri. Aceasta situatie se intalneste mai des in cazul trimiterii probelor pacientilor de la studiile clinice, cand toate probele se colecteaza intr-un laborator de la pacientii situati in centre diferite, localizate geografic diferit. Exista mai multe tipuri de transport al probelor, in functie de natura produsului si de stabilitatea analitilor care trebuie testati: - transport in conditii ambientale; - transport la rece (probe refrigerate); - transport in gheata carbonica (probe congelate).

Stocarea probelor in laborator

Dupa incheierea procesului analitic, o parte din probe vor fi pastrate o anumita perioada de timp, in conditii bine stabilite, astfel incat sa permita confirmarea rezultatelor, verificarea identitatii probelor sau efectuarea unor teste suplimentare. Reguli generale:

procedura de stocare a probelor trebuie s in cont de stabilitatea analiilor;

probele trebuie intotdeauna s fie pstrate n tuburi nchise (pentru a evita evaporarea acestora);

probele pot fi arhivate in frigidere in tuburile primare, cu conditia ca acestea sa contina gel separator; in congelatoare probele sunt pastrate de obicei in tuburi secundare; este posibila arhivarea si in tuburile primare care contin gel, daca producatorul specifica acest lucru; se va evita pe cat posibil stocarea sangelui integral; oricum sangele integral destinat obtinerii serului/plasmei nu trebuie pastrat in frigider; intervalul de pastrare a probelor este cu atat mai mare cu cat temperatura de arhivare este mai scazuta (exceptii: probele pentru electroforeza lipoproteinelor si determinarea de apolipoproteine A1 si B nu trebuie pastrate la congelator);

dupa decongelare proba trebuie omogenizata prin miscari de inversiune a tubului, fara a se produce spuma; evitati decongelarea recongelarea.

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

LP3

Metodele de distrugere a organismelor patogene. Dezinfecia. Sterilizarea. Controlul sterilizrii

Factorii fizici, chimici i biologici acioneaz asupra microorganismelor n functie de:

caracterul speciei,

compoziia chimic i faza de dezvoltare (vrsta culturii),

structura microorganismului (form vegetativ, sporulat sau capsul),

densitatea suspensiei bacteriene.

Efectul aciunii acestor factori este determinat de: concentraia i timpul de expunere ;

concentratia ionilor de H (pH); fenomenul de absorbie sau adsorbie. Efectul poate fi: stimulator,

oprirea multiplicrii (bacteriostatic),

distrugerea bacteriilor (bactericid).

Decontaminarea microbian este sterilizarea prin cldur umed, prin cldur uscat sau radiaii. Dezinfecia este distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu n mod necesar i a sporilor. Sterilizarea este distrugerea sau ndeprtarea tuturor microbilor inclusiv a sporilor.

STERILIZAREA n laboratorul de microbiologie sterilizarea se obtine prin urmtorii ageni: Cldur uscat

- nclzire la rou, - flambarea, incinerarea, - aer cald.

Cldur umed peste 1000C (autoclavare), sub 1000C (pasteurizare, tindalizarea);

Filtrare.

Radiatii ultraviolete. Radiatiile gamma i X. Microunde.

Sterilizarea prin cldur uscat

nclzirea la rou - este indicat pentru firul drept , ansa i spatula de nsmanare. Flambarea - este nfierbntarea obiectului de sterilizat prin trecerea repetat prin flacr, timp de cteva secunde i se recomand pentru: capilarele pipetelor Pasteur, gura eprubetelor i a flacoanelor.

Incinerarea - este arderea cu reducere la cenu. n laboratorul de microbiologie este indicat pentru material din plastic, reziduuri organice solide, gunoiul, cadavrele i carcasele animalelor de experien. Aceast metod pune probleme de control al polurii mediului i siguranei microbiologice. Sterilizarea prin aer cald Etuva (poupinelul)

Este o incint cilindric sau paralelipipedic cu perei dubli din tabl, termoizolani.

Rezistena electric i un termostat permit mentinerea constant a temperaturii selectate,

uniformizat n incinta de sterilizare printr-un sistem de ventilatie. Obiectele de sterilizat se aeaz pe rafturi din sit metalic. Procedur:

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

Se aeaz obiectele pentru sterilizare pe rafturi, fr a umple incinta, pn la refuz, se las mici spaii ntre ambalaje, pentru circulatia nestingherit a aerului cald.

Se nchide ua aparatului, se deschid orificiile de ventilaie i se conecteaz aparatul la reeaua electric. Etuvele mari au ventilator cu palete, care pornete odat cu rezistenta electric. Se monitorizeaz timpul de sterilizare din momentul cnd temperatura arat 160180C, care este de o or. Se scot obiectele sterilizate numai dup rcirea aparatutui.

Indicatii: -obiecte de laborator din sticl (eprubete), flacoane, pipete, plci Petri;

obiecte din portelan (mojare, pistile),

seringi Louer din sticl,

instrumentar chirurgical,

substante grase, pulberi.

Contraindicatii:

soluii apoase,

obiecte din cauciuc sau garnituri din cauciuc,

seringi din sticl cu metal,

testuri i vat din bumbac sau fibr sintetic,

materiale contaminate din laborator.

 Sterilizarea prin cldur umed Sterilizarea la peste 300C Se utilizeaz autoclave n care vaporii de ap saturai realizeaz:

115C corespunde la 0,5 atm

121C corespunde la 1 atm l34C corespunde la 2 atm Autoclavul

Este un cazan cu perei rezisteni n care, dup nchiderea etan cu un capac masiv , presat cu buloane sau un sistem cabeston, vaporii de ap se comprim la presiunea necesar sterilizrii. Acestea pot fi verticale sau orizontale i sunt indicate pentru sterilizarea soluiilor i materialelor contaminate din laborator. Se mai sterilizeaz sticlrie pentru culturi de celul i aparatele de fitrare.

Vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ptrund n camera de sterilizare de jos n sus prin suportul de tabl perforat pe care se aeaz obiectele de sterilizat.Un manometru controleaz presiunea din interiorul cazanului. Un robinet de vapori, aflat n partea superioar a autoclavului, pune in legtur cazanul cu exteriorul. Al doilea robinet, aflat la partea inferioar, permite evacuarea apei din cazan. O supap de siguran evacueaz vaporii cnd presiunea lor depete limita de securitate. Cazanul este cuprins ntr-un manon de tabl groas, care la partea inferioar formeaz un loco pentru adaptarea sursei de cldur, sau poate fi conectat la o surs de curent

Procedura

l. Se toarn ap n cazan prin incinta de sterilizare, pn la 2-3 cm sub nivelul suportului. 2. Se aeaz pe suport obiectele de sterilizat, n ambalajul lor.

Ambalajele sunt: flacoane, eprubete, couri pentru eprubete, flacoane mici, cutii, casolete, hrtie pentru mpachetarea unor obiecte, gleti sau saci termorezisteni, pentru materialul de laborator contaminat.

Se introduc flacoanele cu capacul seminurubat cutiile ntredeschise, casoletele cu orificiile deschise, gleile fr capac. 3. Se nchide etan capacul strngnd buloanele diametral opus in cruce, nti cu mna, apoi complet cu prghie. 4. Se conecteaz la sursa de cldur.

5. Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului.

6. O dat cu vaporii de ap, prin robinetul deschis, se evacueaz i aerul din incinta de sterilizare, asigurnd o convectie puternic: vaporii in contact cu obiectele reci cedeaz cldura i se condenseaz presiunea lor tinde s scad i atrage alt cantitate de vapori care transporta i cedeaz cldura .a.m.d.

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

Aerul este complet evacuat din incinta de sterilizare, cnd nceteaz s mai barboteze apa.

7. nchide robinetul de evacuare a aerului.

8. Cnd presiunea ajunge la valoarea aleas se regleaz sursa de cldur pentru a menine presiunea pe toat durata sterilizrii.

9. Se ntrerupe sursa de cldur i las aparatul s se rceasc pn cnd manometrul indic zero atmosfere. Numai n acest moment deschide lent robinetul de vapori, apoi cazanul.

10. Nu se deschide autoclavul ct timp presiunea este peste cea atmosferic pentru c lichidele fierbinti vor fierbe exploziv i se pot sparge facoanele. 11. Las materialele pentru uscare n autoclavul deschis, cnd materialele ajung sub 80C pot fi scoase. Aceasta dureaz n functie de volumul ambalajelor i vscozitatea solutiilor. Flacoanele mari cu mediu agarizat pot necesita i cteva ore.

Dezavantaje n ambalaje pot persista pungi de aer, cantitatea mare de condens n timpul sterilizrii, uscarea dificil dup sterilizare impune o serie de precauii (evitarea contactului cu obiecte ambalate n hrtie cu suprafee nesterile, pn la perfecta uscare a ambalajului).

Pasteurizarea Este o metod de sterilizare parial, prin care se distrug numai formele vegetative, deoarece utilizeaz temperaturi puin ridicate i de scurt durat: - 650C pentru 30 min, - 80-900C pentru 1-2 min, - 91-950C pentru cteva secunde. Scderea temperaturii se face brusc. Acest procedeu se folosete la sterilizarea laptelui, unde distruge formele vegetative fr a provoca alterarea vitaminelor, a enzimelor, a proteinelor.

Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este nclzirea la temperaturi de sub 100C.

Principiu: n medii ce permit germinarea sporilor, nclzirile repetate omoar att formele

vegetative existente iniial ct i pe cele germinate din spori n intervalele dintre nclziri. Indicaii: sterilizarea unor medii de cultur, alimente. Necesar: autoclav pentru tindalizare la sub 100C, n vapori flueni (autoclav cu robinetul pentru vapori deschis);

boia de ap sau nisip pentru tindalizri sub 1000C.

Procedur: Substantele de sterilizat in volume mai mici de 1 litru, se menin 30-60 min la 80-90C, 3-8 zile consecutiv, la temperatura impus de compozitia lor. n intervalele dintre nclziri, recipientele se in la temperatura camerei pentru germinarea sporilor.

Filtrarea este trecerea unui fluid printr-un corp poros. Filtrele cu poroziti convenabile pot debarasa de microorganisme fluidul filtrat, acestea fiind reinute mecanic i electrostatic n porii filtrului. Se recomand pentru sterilizarea aerului, a unor medii de cultur sau reactivi care nu suport nclzire. Filtrele clasice sunt sub forma unor - lumnri goale pe dinuntru i nchise la capt (bujii filtrante), confecionate din porelan (filtre Chamberland), sau pmnt de infuzorii (filtre Berkefeld)

plcile filtrante din azbest impregnat cu caolin (filtre Seitz)

sticl poroas (filtre Schott)

membrane filtrante din acetat de celuloz cu porozitti ntre 1 i 0,025 m. O membran cu porozitatea de 0.22 pm reine toate bacteriile. Aceste membrane sunt fixate pe un suport perforat din otel inoxidabil i montate in partea

superioar i inferioar a unei plnii adaptate la sistemul de filtrare negativ i pozitiv. Membrana mpreun cu plnia montate la recipientul de colectare a fluidului filtrat sunt sterilizate n prealabil ln autoclav. Filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filtres) sunt folosite pentru sterilizarea aerului din boxele de siguran antiepidemic, a celor cu aer laminar etc. Sterilizarea prin radiaii ultraviolete (UV)

10

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

Se mai numesc i lmpi germicide sunt tuburi din sticl special n care descrcrile electrice ntr-o atmosfer cu vapori de mercur, la joas presiune; genereaz radiaii UV. Cantitate de ozon produs de lmpile germicide din spitale i laboratoare nu depete concentraia periculoas de o parte la 10 milioane i scade progresiv cu vrsta lmpii. Viaa de funcionare a lmpilor germicide uzuale este de 100 ore, dar scade dup aprinderi frecvente.Cnd intensitatea radiatiei UV produse scade sub 60% din cea nominal, dup i din timpul prevzut, lmpile trebuie schimbate.

Lmpi germicide. Sunt preferate lmpile speciale cu catod rece care au o via mai lung. Pentru a menine efectul germicid maximal, lmpile trebuie periodic curate prin tergere cu o crp moale umezit n alcool, amoniac i ap.

Aceste lmpi se recomand pentru:

reducerea ncrcturii microbiene a spaiilor de lucru,

bariere protectoare ntre aria cu animale inoculate, boxele de necropsie i persoanele din laborator sau animalele sntoase,

laboratoarele care nu au hote le pot folosi pentru repartizarea mediilor de cultur, manipulrii aseptice, suprafee din laborator, nu n timpul lucrului.

Radiaiile gamma i X. Sunt radiaii ionizante foarte eficiente pentru sterilizare; trebuie s fie folosite cu prudent pentru c pot distruge i celulele umane. Aceste radiaii genereaz radicali liberi, care reactioneaz chimic cu proteinele i acizii nucleici provocnd moartea bacteriei.

Microundele se utilizeaz pentru resterilizarea mediilor de cultur care au fost depozitate timp ndelungat; sterilizarea rezult mai degrab din cldura produs de microunde, dect ca un efect direct al lor.

Ultrasunetele sunt bactericide prin fenomenul de cavitaie pe care l produc la trecerea prin apa extra- i intracelular, determind dezagregarea structurii bacteriene. Controlul eficienei sterilizrii

Se face prin indicatori: fizici (manometre, termometre), chimici i biologici. Indicatori chimici pentru sterilizarea prin cldur

Se folosesc substane chimice al cror punct de fuziune este cunoscut la care aspectul substanei se schimb exemplu: floare de sulf 115C, tiouree 180C, acid benzoic 121-122C.

Indicatori biologici

Fire de bumbac impregnate cu spori de Bacillus stearotermophilus (pentru etuve) sau fiole cu suspensie B. stearotermophilus (pentru autoclave) au o mai mare fidelitate. Dup sterilizare se testeaz viabilitatea sporilor prin nsmnarea lor n medii adecvate. Testul Bowie & Dick indic puterea de penetrare a aburului n timpul procesului de sterilizare. Conform legislaiei n vigoare acest test este obligatoriu pentru autoclave, nainte de efecturarea primei sterilizri. Utilizare: zilnic dac se sterilizeaza doar textile; cel puin o dat pe sptamn dac se sterilizeaz i instrumentar; dup fiecare reparaie a sterilizatorului. Indicatorul din mijlocul pachetului trebuie sa vireze uniform si pe toata suprafaa schimbndu-i culoarea. Se realizeaz un ciclu de sterilizare complet (cu pre- i postvacuumare) la temperatura de 134C, timp de 3,5 min. Dac penetrarea aburului nu a fost uniform, au existat pungi de aer, culoarea benzilor este neuniform (apar pete mai clare), n aceast situaie, sterilizarea nu a fost eficient, autoclavul nu trebuie utilizat i se apeleaz la tehnician pentru verificare. La sfritul ciclului complet de sterilizare se extrage din pachet testul i se interpreteaz rezultatul. Dac ciclul a fost eficient (absena aerului rezidual sau a pungilor de aer), schimbarea culorii modelului geometric imprimat este uniform. DEZINFECIA

Este procedeul prin care se distrug microorganismele patogene, fr a fi necesar distrugerea germenilor saprofii. n laboratorul de microbiologie sunt folosite substane chimice pentru dezinfecia: minilor, duumelelor, meselor, cutilor de animale i a unor produse patologice (sputa, fecale).

Aceste substane se numesc: - dezinfectante, dac din cauza efectelor iritante sau toxice se pot aplica numai pe suprafee inerte

11

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

- antiseptice, dac toxicitatea este mai redus, permite aplicarea lor pe tegumente, unele mucoase sau plgi. Uneori aceeai substan (cloramina B) n soluii diluate este antiseptic, iar n soluii concentrate este dezinfectant.

Cele mai sensibile la substanele dezinfectante sunt:

organismele sub form vegetativ (bacterii, fungi, protozoare);

virusurile cu nveli lipidic;

Relativ rezistente sunt: micobacteriile, virusurile nude. Rezistente sunt: endosporii bacterieni, sporii fugici. Un dezinfectant trebuie s ndeplinensc urmtoarele condiii: s actioneze asupra unui numr ct mai mare de ageni patogeni; s produc inactivitatea ireversibil a germenilor ntr-un timp ct mai scurt i s acioneze ct mai independent de condiiile de mediu; s fie ct mai stabil, s-i pstreze calitile ct mai mult timp n condiii obinuite; s fie uor de manipulat, ieftin, s nu fie inflamabil sau explozibil.

n laboratorul de microbiologie se folosesc:

Formolul(soluie de aldehid formic 40 % n ap). Este toxic asupra bacteriilor (formevegetative i spori), a virusurilor; se folosete sub form de: vapori (dezinfectia camerelor), lichid (prin stropire, pulverizare cu vermorelul) sau prin mbibare (o parte formol comercia140% i H2O). Alcoolul etilic. Alcoolul dublu rafinat (960alcoolice) are o aciune dezinfectant slab,coaguleaz rapid albuminele din mediu care formeaz astfel un strat protector pentru bacterii. Alcoolul de 70 acionenz mai lent, mai profund i se folosete pentru dezinfecia: minilor, instrumentelor. El poate fi obtinut din 100 ml alcool de 96o i 400 ml AD.

Fenolul n stare pur sunt cristale incolore care devin roietice n contact cu aerul, din cauza oxidrii. Se pstreaz n vase brune n concentratie de 3-5 %, omoar microbii n 36-60 min. Puterea dezinfectant a unor substane chimice se exprim n comparatie cu cea a fenolului, stabilinduse indicele fenolic". Amestecul sulfocromic trebuie s fie nelipsit de pe masa de laborator, pentru sterilizarea pipetelor, lamelor contaminate.dup utilizare amestecul se oxideaz, din rou-portocaliu, devine verde, n acest caz trebuie schimbat.

 Sublimatul (bicromura de mercur) este o sare slab, cristalin, incolor are putere bactericid n solutie de 1% este bactericid n 1-10 min, iar n sol. 1/500, omoar formele sporulate n 45-60 min, nu altereaz tegumentele i mobilierul, nu este toxic pentru om i animale.

Varul cloros este o pulbere grunjoas alb, cu miros puternic de clor. Cnd este proaspt conine 25% clor. Se adaug 200-400g var n fiecare kg de sput sau fecale. Se poate obtine laptele de var sol. 10%, se folosete pentru dezinfecia sputei, cuti de animale, etc.

Cloramina este o pulbere fin, cristalin, alb, uor glbuie cu miros de clor activ. n concentratie de 0,1-5%, distruge sporii, iar 5-10 % pentru distrugerea bacilului Koch. Apa oxigenat (H2O2) sau peroxidul de hidrogen are putere bactericid prin eliberarea de O 2, se utilizeaz n concentratia de 3%.

Bazele tari ca hidroxidul de sodiu 2-4%, omoar bacteriile, virusurile

Spunurile sunt sruri de sodiu ale unor acizi grai, ele acioneaz prin emulsionarea grsimilor i ndeprtarea mecanic a murdriei. Detergenii au actiune bactericid i de emulsionare, se folosesc pentru materialele de laborator, nlocuind spunul. o anionici dau prin disociere, anioni organici toxici, activi mai ales pe bacterii Gram pozitive, pentru splarea: instrumentarului, a aparaturii, pardoselelor, mobilierului, testurilor. o cationici au aciune antiseptic mai puternic dect a celor anionici, ex. bromocetul, dezinfectant in sol. 1% i antiseptic n sol. 1 . o amfolitici se folosesc n sol. apoas 1% , pentru dezinfecia instrumentarului de laborator, a mobilierului.

12

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

LP 4

Examenul microscopic direct al preparatelor native i colorate. Tehnica realizrii i colorrii frotiurilor. Coloraii uzuale

I. Examenul preparatelor native

Preparatele native (umede, necolorate) se pot face dintr-o cultura microbiana sau direct din produs. Ele sunt examinate, de regul, ntre lama i lamel. Se ia cu ansa sau cu o pipeta Pasteur o picatura din cultura lichida sau din cultura suspensionata in solutie salina fiziologica si se depune pe o lama curata si degresata, peste care se pune o lamela curata.

Pentru examinare se plaseaza preparatul nativ pe platina microscopului, se centreaza lumina, se inchide mult diafragma, se coboara condensatorul si se aduce in dreptul preparatului un obiectiv uscat. Se apropie mult de preparat lentila frontala a obiectivului cu ajutorul macrovizei, dupa care se ridica treptat obiectivul pana la aparitia imaginii, care este pusa la punct cu ajutorul vizei micrometrice.

Pe preparatele native sunt evidentiate existenta, forma si mobilitatea microorganismelor (care nu trebuie confundata, insa, cu miscarile browniene). Dupa examinare, preparatele care contin germeni vii trebuie puse intr-un cristalizator cu amestec sulfocromic. Preparatele native pot fi examinate si pe fond intunecat, precum si prin procedeul contrastului de faza. II. Examenul preparatelor colorate

Preparatele colorate prezinta avantajul ca sunt sterilizate prin fixare, sunt usor de manipulat si de examinat si pot fi pastrate mult timp. Aceste preparate permit diferentierea bacteriilor dupa afinitatea lor pentru anumiti coloranti si pot evidentia unele elemente structurale (cili, capsula, spori, granulatii, etc.) prin coloratii speciale.

Examinarea preparatelor colorate se face astfel: se centreaza lumina, se ridica condensatorul, se lasa diafragma deschisa si se pune o picatura de ulei de cedru pe frotiu.

Cu ajutorul macrovizei se coboara tubul optic si se introduce lentila frontala a imersiei in ulei de cedru pana in imediata apropiere a frotiului. Punerea la punct se face cu ajutorul vizei micrometrice, iar deplasarea lamei pentru schimbarea campurilor microscopice se obtine cu ajutorul carului mobil. Dupa examinare se ridica obiectivul, se sterge uleiul de cedru de pe imersie si se scoate lama de pe platina microscopului.

Colorani i metode de colorare

Colorantii folositi in mod curent in bacteriologie sunt substante organice, de obicei colorate,

usor solubile, de cele mai multe ori sintetice, avand proprietatea de a colora diferite substraturi chimice. Pentru a fi colorate, bacteriile sunt, in prealabil, supuse unor operatii pregatitoare. Pregatirea frotiului. Frotiul se prepara prin etalarea produsului de examinat pe o lama curata

si perfect degresata, astfel inacat germenii sa formeze un strat subtire, uniform. Etalarea culturii sau a produsului se realizeaza cu ajutorul unei anse de platina sau al unei pipete Pasteur. Se ia o picatura din cultura lichida si se intinde circular pe lama. Cand cultura este pe mediu solid, se racleaza cu ansa sterilizata si racita o prtiune din cultura si se depune pe o lama de sticla, pe care, in prealabil, sa pus o picatura de solutie salina fiziologica, dupa care se omogenizeaza si se raspandeste uniform pe o suprafata circulara.

Frotiul astfel confectionat este lasat sa se usuce la temperatura camerei. Fixarea frotiului. Dupa uscare, frotiul este supus operatiei de fixare prin caldura sau prin lichide fixatoare, cum sunt: alcoolul metilic, alcoolul etilic, alcoolul-eter, etc. Pentru fixare prin caldura se trece lama de 2-3 ori cu fata opusa frotiului, prin flacara unui bec de gaz. Incalzirea se face la 60 - 70oC (lama este suportata pe dosul mainii). Prin fixare bacteriile sunt omorate, evitandu-

13

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

se astfel pericolul infectarii. In plus, se mareste aderenta preparatului de lama, iar afinitatea sa pentru colorant creste. O fixare corecta nu trebuie sa produca modificari ale formei si ale structurii microorganismului supus acestei operatii.

Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite substante chimice, numite mordani (de exemplu, solutia Lugol), in scopul de a intensifica activitatea coloranilor. Mordantii, prin afinitatea puternica pe care o au atat fata de colorant, cat si fata de substratul supus colorarii, faciliteaza si intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la obtinerea unei coloratii mai intense si de o calitate mai buna. Pentru colorantii bazici se folosesc mordanti acizi (acid tanic, acid picric, etc.) iar pentru colorantii acizi se folosesc mordanti bazici (sulfat de fier, alaun, etc.)

Prepararea unor coloranti folositi in bacteriologie

Colorantii sunt preparati si pastrati in laborator sub forma de solutii alcoolice saturate, cunoscute si sub numele de solutii-mama. Aceste solutii se prepara prin mojararea unei cantitati de 10-15 gr. colorant cu 100 ml alcool de 96o; pentru solutia saturata de violet de gentiana sunt suficiente numai 6-8 gr. colorant. Dupa preparare, solutiile saturate sunt tinute 2-7 zile la termostat la 37oC si agitate de mai multe ori pe zi. Dupa filtrare prin hartie de filtru, solutiile se pastreaza la loc intunecos in flacoane de sticla de culoare inchisa cu dop rodat. In aceste conditii, colorantii pot fi pastrati timp indelungat.

Pentru colorarea germenilor se folosesc solutii apoase de colorant. Acestea se prepara dintro solutie alcoolica saturata, care este diluata in proportie de 1/10 in apa fenolata 2%.

Solutiile apoase pot fi preparate si direct din substanta colorata astfel: 1 gr. de colorant (cristale) este majorat si dizolvat in 10 ml alcool. Se adauga apoi 2 ml fenol si o parte din apa distilata. Dupa ce se amesteca bine, se terc intr-un flacon de sticla in care se adauga si restul de apa distilata pana la 100 ml. Solutia astfel preparata se mentine 24h la termostat, la 37oC, apoi se filtreaza prin hartie de filtru si se transvazeaza intr-o sticla picatoare, fiind buna de folosit. Solutiile apoase de colorant nu pot fi pastrate un timp prea indelungat, deoarece se degradeaza.

In coloratiile obisnuite se mai folosesc si alte solutii, ca Solutia Lugol (1 gr. iod, 2 gr. iodura de potasiu si 300 ml apa distilata) si solutia de alcool-acetona (3 parti alcool de 96o si o parte acetona). Coloratiile pot fi simple, diferentiale si speciale. Coloratiile simple

Coloratia cu albastru de metilen. Frotiul uscat si fixat apoi la flacara este acoperit cu o solutie de albastru de metil timp de 1-2 minute. Se spala dupa aceea frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.

Prin aceasta metoda, toate elementele din campul microsopic apar colorate in albastru. Este o coloratie rapida, care pune in evidenta forma, gruparea si, eventual, raporturile germenilor cu leucocitele sau cu alte elemente prezente in frotiu.

Coloratia cu fucsina fenicata Ziehl diluata 1/10 se efectueaza in acelasi mod ca si cea cu albastru de metilen. Elementele din frotiu apar colorate in rosu. Coloratiile diferentiale

Coloratia Gram. Este o coloratie foarte utilizata in bacteriologie, deoarece imparte bacteriile in doua mari categorii: bacterii Gram-pozitive si bacterii Gram-negative.

Tehnica coloratiei este urmatoarea:

frotiul uscat este fixat prin caldura;

se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.;

se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.; se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva

secunde; se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30

sec. pana la 1 min; se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet; dupa uscare se examineaza la

microscop cu obiectivul cu imersie.

14

Diana Gheteu - Virusologie, microbiologie, parazitologie Lucrari practice

Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gramnegative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu.

Coloratia Ziehl-Nielsen se aplica in cazurile mycobacteriilor care au in compozitia peretelui celular acid micolic si le confera impermeabilitate la colorantii folositi in tehnica gram. Pentru acesti germeni numiti acid-alcool rezistenti (AAL) se foloseste aceasta tehnica speciala. Tehnica folosita pentru coloratie: frotiul uscat se fixeaza la flacara;

se acopera lama cu fucsina fenicata Ziehl si timp de 10 min se incalzeste intermitent, cu

ajutorul unei lampi de alcool sau cu flacara unui bec Bunsen pana la emiterea de vapori, fara a se ajunge la fierbere; fucsina evaporata prin incalzire se inlocuieste imediat; se indeparteaza colorantul, se spala frotiul cu apa de robinet si se decoloreaza cu acid azotic diluat 1/3 sau acid sulfuric diluat 1/4; se indeparteaza acidul si se spala lama cu apa de robinet, dupa care se decoloreaza frotiul cu alcool de 96o;

se indeparteaza alcoolul si se spala frotiul din nou, cu apa de robinet, dupa care se recoloreaza cu o solutie apoasa de albastru de metilen 1% timp de 1min.;

se spala frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie. Coloratii speciale Metode de punere in evidenta a capsulei bacteriene

Metoda Burri. Pe o lama perfect curata se pun o picatura din suspensia de bacterii capsulate si o picatura de tus de China. Dupa ce se omogenizeaza, se face un frotiu prin etalarea amestecului cu o alta lama.

o Se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Pe fondul negru al preparatului, bacteriile impreuna cu capsulele lor apar incolore. o Coloratia Loeffler cu albastru de metilen se efectueaza cu o solutie invechita de albastru de

metilen Loeffler. Prin aceasta coloratie corpul bacterian se coloreaza in albastru, iar capsula, in roz.

o Coloratia pentru cilii bacterieni. Cilii nu pot fi vazuti la microscopul optic pe preparatele native sau pe frotiurile cu coloratii obisnuite. Pentru a fi pusi in evidenta se folosesc metode speciale de coloratie Metoda Zettnow. Coloratia dupa aceasta metoda se desfasoara astfel: se prepara o suspensie diluata de germeni in apa distilata, astfel incat sa se obtina pe frotiu celule izolate; din aceasta se iau 2-3 picaturi cu o pipeta Pasteur si se depun pe o lamela degresata si flambata; se lasa frotiul sa se usuce, dupa care se fixeaza cu formol diluat 1/10, timp de 10 min.;

se pune lamela in apa distilata timp de 3 min dupa care se introduce intr-o solutie de tanin si de tartrat dublu de stibiu si potasiu, incalzita la 60-70oC, timp de 10 min.; se scoate lamela cu o pensa si se clateste bine in apa distilata;

se acopera frotiul cu o solutie de sulfat de argint si amoniac care se prepara in momentul folosirii si se incalzeste usor la flacara, timp de 30 - 60 sec.;

se spala frotiul cu apa distilata, se usuca si se monteaza in ulei de cedru, prin aplicarea lamelei cu frotiul in jos pe o lama foarte curata, dupa care poate fi examinata la microscop. Metode de colorare a sporilor Metoda Gray modificata. Se fac frotiuri care se lasa sa se usuce si se fixeaza prin caldura. Se acopera lama cu o solutie apoasa de verde malahit 5% si se incalzeste de trei ori pana apar vapori. Dupa fiecare incalzire se indeparteaza colorantul si se inlocuieste cu altul proaspat. Se spala apoi frotiul cu apa si se acopera cu o solutie de fucsina diluata 1/10, timp de 1-2 min. Se indeparteaza colorantul, se spala lama cu apa, se lasa sa se usuce si s examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie. Sporii apar colorati in verde-albastrui, iar corpul bacterian apare colorat in violaceu.

15

PDF to Word