SECUENCIACIN DE PROTENAS Y DETERMINACIN DE PESOS MOLECULARES Secuenciacin de protenas La secuenciacin de una cadena polipeptdica es imprescindible para comprender la base

estructural de la funcin de las protenas, ya que es precisamente la naturaleza de los aminocidos componentes la que determina la estructura tridimensional de las mismas y, consecuentemente, sus propiedades. El anlisis de la secuencia de una protena o cadena polipeptdica se lleva a cabo, por lo general, segn los pasos siguientes: Rotura de todos los puentes disulfuro: Cys-S-S-Cys. Separacin y purificacin de las cadenas polipeptdicas individuales, si la protena tuviera ms de una. Anlisis de la composicin de aminocidos. Identificacin de los aminocidos N-terminal y C-terminal. Fragmentacin de la cadena polipeptdica nativa por rotura, especifica o no especifica, en puntos internos, y posterior separacin y secuenciacin de los distintos fragmentos. Ordenacin de los fragmentos peptdicos pequeos y establecimiento de la secuencia del polipptido original. Localizacin de los puentes disulfuro tanto en como entre las cadenas polipeptdicas.

En estos estudios se utilizan bsicamente tcnicas cromatogrficas y electroforticas, as como la reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina. Rotura de puentes disulfuro Los puentes disulfuro, con frecuencia entrecruzados, deben romperse antes de proceder al anlisis de aminocidos de una protena. Para ello se reducen con un tiol y posteriormente se alquilan para impedir, por una parte, la reasociacin al azar de los distintos grupos -SH formados y, por otra, estabilizar los residuos de cistena durante la hidrlisis cida de las cadenas polipeptdicas. La rotura de dichos puentes procede as:

De esta forma el residuo de cistena queda alquilado, en forma de S-carboxi-metilcistena. Otros agentes utilizados en la alquilacin de grupos -SH son la iodoacetamida y la etilenimina. Otra forma de romper los puentes disulfuro intercatenarios consiste en la oxidacin con acido perfrmico, desarrollada por Sanger:
1

Una vez escindidas, las cadenas se separan por cromatografia de cambio inico, o electroforesis. En el caso de que una protena tuviera una sola cadena polipeptdica, pero existieran puentes disulfuro intracatenarios, habra que romperlos y alquilar las correspondientes cistenas, antes de proceder a la hidrlisis de dicha cadena. Separacin y purificacin de cadenas polipeptdicas Antes de analizar la secuencia de aminocidos de una protena se ha de determinar previamente el nmero de cadenas polipeptdicas que la integran. Si la unin entre las cadenas es covalente, se procede como hemos visto en el apartado anterior. Por otra parte, si las cadenas no estn unidas por enlaces covalentes, se pueden separar por tratamiento con cidos o bases, alta concentracin de sales, calor y agentes desnaturalizantes, altas concentraciones de urea o guanidina, etc. Determinacin de la composicin de aminocidos La composicin de aminocidos de una cadena polipeptdica se determina despus de hidrolizar totalmente los enlaces peptdicos. Esta hidrlisis normalmente se efecta en medio cido, con HCI 6 N, en una ampolla cerrada al vaco, y calentando a 110 C durante 24 h, como mnimo. Los aminocidos resultantes se separan y se miden cuantitativamente en un analizador automtico. EI tratamiento cido presenta diversos inconvenientes: Hidroliza totalmente la glutamina y asparraguina, a glutmico y asprtico, respectivamente, ms NH3, por lo que el Glu resultante indica (Glu + Gln) y el Asp indica (Asp + Asn) de la protena nativa. Si cuantificamos el amoniaco obtenido podemos deducir la cantidad original de glutamina y asparraguina. La serina y treonina se destruyen parcialmente durante la hidrlisis, por lo que se suelen realizar tres hidrolizados con HCI, 6 N, durante 24, 48 y 72 horas, determinndose el contenido de estos aminocidos por extrapolacin a tiempo cero. Tambin se destruyen por el tratamiento cido la cistena y el triptfano; por ello, la cistena se determina como cido cisteico, despus de oxidar la muestra con acido perfrmico, segn el mtodo descrito por Moore (l963). EI triptfano se determina espectrofotomtricamente, por el mtodo de Edelhoch (l967).

Identificacin de los aminocidos terminales EI aminocido N-terminal de una cadena polipeptdica, convencionalmente el primer aminoacido, se seala haciendo reaccionar la cadena polipeptdica con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (FDNB) o reactivo de Sanger. EI 2,4-dinitrofenil-derivado resultante se somete a la hidrlisis cida, en presencia de HCI 6N, durante la que se hidrolizan los enlaces peptdicos de la cadena, mientras que permanece intacto el enlace del primer aminocido con el grupo 2,4-dinitrofenilo. EI derivado correspondiente al primer aminocido, de color amarillo, se separa fcilmente del resto de los aminocidos del hidrolizado, y se identifica por cromatografa, utilizando como patrones los dinitrofenil-derivados sintticos de los diferentes aminocidos. Las reacciones qumicas mencionadas transcurren de la siguiente manera:
2

EI mtodo de Sanger, histricamente importante por el establecimiento de la secuencia de la insulina, est siendo sustituido por otros mtodos de marcado ms sensibles y eficaces. Uno de ellos es el que emplea cloruro de I-dimetil-amino-naftalen-5-sulfonilo o cloruro de dansilo, que es un reactivo fluorescente que permite detectar y medir pequeas cantidades del aminocido N-terminal. Se trata de un reactivo cien veces ms sensible que el FDNB, y las etapas bsicas de la obtencin del dansil-derivado del aminocido N-terminal de una cadena polipeptdica se indican a continuacin:

La degradacin de Edman es el mtodo ms utilizado actualmente para identificar el primer aminocido. Utiliza fenil-isotiocianato (reactivo de Edman) que al reaccionar con la cadena polipeptdica da el derivado feniltiohidantonico correspondiente al aminocido N-terminal de la cadena, el cual puede separarse e identificarse cromatogrficamente, dejando intacto el resto de la cadena polipeptdica. La reaccin procede as:

El polipptido resultante puede hacerse reaccionar de nuevo con el reactivo de Edman para identificar el siguiente aminocido, y as sucesivamente, con lo que se pueden identificar completamente secuencias de pequeos pptidos. En l967, P. Edman y G. Begg disearon un secuenciador de protenas, instrumento que realiza automticamente los distintos pasos de la degradacin de Edman y que puede secuenciar completamente, aminocido a aminocido, polipptidos de 30-40 residuos. Hay casos en que el aminocido N -terminal de una protena est situado en el interior de la molcula, o bien bloqueado por la unin covalente de otros grupos, con lo que resulta inaccesible a este tratamiento. La identificacin del aminoacido C-terminal de una cadena polipeptdica se lleva a cabo enzimticamente, usando carboxipeptidasas A o B, que catalizan la hidrlisis secuencial del aminocido final, que se separa del resto de la cadena y se identifica por cromatografa. La especificidad de estas enzimas est recogida en la tabla al final del tema. El aminocido C-terminal tambin se puede determinar por reduccin con borohidruro de litio al correspondiente aminoalcohol. Posteriormente se hidroliza la cadena polipeptdica, se separan los aminocidos por cromatografa, y el nico -aminoalcohol presente se debe al aminocido Cterminal. Otro mtodo para determinar el ltimo aminocido consiste en la hidrazinolisis de la cadena polipeptdica, que rompe todos los enlaces peptdicos, formndose las aminoacilhidrazidas correspondientes a todos los aminocidos, excepto del C-terminal, que se identifica fcilmente por cromatografa. Dicha reaccin procede as:

Fragmentacin de la cadena polipeptdica: separacin e identificacin de los fragmentos resultantes Una vez identificados los aminocidos terminales de una cadena se procede a su fragmentacin en trozos de diez a quince residuos, mediante el uso de distintos agentes enzimticos o qumicos, que rompen ms o menos especficamente los enlaces peptdicos. El tratamiento con bromuro de ciangeno, que rompe aquellos enlaces peptdicos en los que el grupo carbonilo procede de un residuo de metionina, es el procedimiento ms especfico de rotura interna de un pptido, y se desarrolla de la siguiente manera:

El reactivo rompe el enlace peptdico detrs del grupo carbonilo y convierte a la metionina en homosern-lactona. El siguiente tratamiento ms especifico es la digestin de la cadena polipeptdica con tripsina, que hidroliza los enlaces peptdicos en los que el grupo carbonilo procede de un aminocido bsico, como lisina o arginina. Una cadena polipeptdica con seis residuos de lisina o arginina producir siete fragmentos polipeptdicos, despus de su incubacin con tripsina. La especificidad de rotura de la tripsina se puede alterar por modificacin qumica del polipptido. Los residuos de lisina se pueden bloquear con anhdrido maleico, y esto hace que la tripsina rompa slo el enlace peptdico donde se encuentra una arginina. Efectuando el tratamiento de los residuos de cistena con etilenimina se obtiene aminoetilcistena, anlogo de lisina, y la tripsina rompe los enlaces peptdicos adyacentes al carbonilo de este
5

grupo amino-etilado. Estos tratamientos se pueden representar mediante las frmulas que pueden verse a continuacin:

Otras enzimas utilizadas en estos tratamientos, como quimotripsina, termolisina, pepsina, etc., son menos especificas en la rotura de los enlaces peptdicos internos, como se recoge en la tabla al final del tema. Los fragmentos resultantes se separan por cromatografa o electroforesis, determinndose la composicin de aminocidos de cada uno de ellos. Los pptidos de ms de treinta residuos se someten a un segundo tratamiento de rotura, separacin y anlisis de aminocidos. La separacin de los fragmentos peptdicos es el paso ms laborioso en la secuenciacin de una protena.
PROBLEMAS RESUELTOS

1.- Dedzcase la secuencia de aminocidos de una cadena polipeptdica, a partir de la siguiente informacin: a) La hidrlisis cida completa dio la siguiente composicin de aminocidos: 1 Pro, 2 Glu, 1 Asp, 1 Arg, 1 Ile, 1 Phe, 1 Trp. b) Por tratamiento con quimotripsina se produce Ile, un tripptido y un tetrapptido. c) El tripptido tiene carga neutra, a pH 7,5, y al tratado con cloruro de dansilo, seguido de hidrlisis cida, se aislaron el derivado danslico de Pro y cantidades equimoleculares de Glu y Trp. d) Al tratar el tetrapptido con tripsina se obtuvo Phe y un tripptido con carga negativa, a pH 7,5, que al ser tratado con fenilisotiocianato, seguido de hidrlisis cida, daba el derivado correspondiente del cido glutmico. Solucin: a) Se trata de un octapptido. b) Las nicas secuencias posibles compatibles con este apartado son: aa1-aa2-aa arom.-aa4-aa5-aa6-aa arom.-Ile

O bien aa1-aa2-aa3-aa arom.-aa4-aa5-aa arom.-Ile c) El primer aminocido (N-terminal) del tripptido es Pro. De acuerdo con 1, el ltimo aminocido (C-terminal) del tripptido es Trp, y el otro aminocido ser Gln, ya que, a pH7,5, la carga global del triptido es neutra. Luego tenemos: Pro-Gln-Trp d) En el tetrapptido, Phe debe aportar el grupo carboxilo terminal, ya que este aminocido se libera al tratarlo con tripsina, y Arg es el aminocido precedente dada la especificidad de la tripsina. Como la molcula tiene carga negativa, a pH 7,5, deben existir dos grupos cidos, adems de la Arg. El primer aminocido es el Glu, luego tenemos: Glu-Asp-Arg-Phe Como la quimotripsina no hidroliza el enlace peptdico con R x = aminocido aromtico si Rx + 1 = Pro, la secuencia final del octapptido ser, sin duda: Pro-Gln-Trp-Glu-Asp-Arg-Phe-Ile 2.- La hidrolisis parcial de una protena dio un cierto nmero de polipptidos. Se purific uno de ellos. Deducir la secuencia de aminocidos de este polipptido a partir de los siguientes datos: a) La hidrolisis acida total dio ala + arg + 2 ser + Iys + phe + met + trp + pro. b) EI tratamiento con fluordinitrobenceno (FDNB, reactivo de Sanger) seguido de hidrlisis cida total, dio dinitrofenilalanina (DNP-ala) y -dinitrofenillisina (-DNP-Iys) como nicos DNP-derivados. c) Ni la carboxipeptidasa A ni la B liberaron el aminoacido C-terminal. d) EI tratamiento con bromuro de ciangeno (CNBr) dio dos pptidos. Uno contena ser + trp + pro. EI otro contena todos los aminocidos restantes (incluyendo la segunda ser). e) EI tratamiento con quimotripsina dio tres pptidos. Uno contena solo ser + pro. Otro contena solo met + trp. EI tercero contena phe + Iys + ser + arg + ala. f) EI tratamiento con tripsina dio tres pptidos. Uno contena solo ala + arg. Otro solo Iys + ser. EI tercero contena phe + trp + met + ser + pro. Solucin (a) El FDNB reacciona con los grupos amino libres dando el derivado DNP-aminocido por hidrlisis. As, el aminoacido N-terminal es alanina. La lisina est en el interior de la cadena y tiene su grupo amino libre. Por tanto, el pptido es lineal, no circular. (b) La carboxipeptidasa A romper todos Ios aminocidos C-terminal excepto arginina, lisina y prolina. La carboxipeptidasa B romper solo cuando el C-terminal sea arginina o lisina. Ninguna de las dos actuar sobre el C-terminal si el penltimo aminocido es prolina. La falta de productos con ambas enzimas nos dice que la prolina es el ltimo o el penltimo residuo. Nota. Las carboxipeptidasas continuarn rompiendo los sucesivos aminoacidos C-terminal si es posible. Por tanto, lo que realmente analizamos es la identidad del aminocido que se libera ms rpidamente. (c) El bromuro de ciangeno rompe especficamente la unin del grupo carboxilo de los residuos de metionina. (La metionina se convierte en homoserina.) Los datos, por tanto, nos dicen que el tripptido liberado por el bromuro de ciangeno es el C-terminal (contiene prolina). As, los cuatro ltimos residuos incluyen a la metionina seguida de triptfano, serina y prolina (pero la secuencia de los tres ltimos no se conoce). (d) La quimotripsina rompe el grupo carboxilo de la fenilalanina, tirosina, triptfano y leucina, con tal de que el siguiente residuo (el del grupo amino) no sea prolina. La composicin de uno de los
7

dipeptidos de la quimotripsina confirma que el extremo C-terminal del pptido original es met-trp-serpro. El aminocido que precede a la metionina debe ser fenilalanina (el nico residuo que queda capaz de ser hidrolizado por la quimotripsina). As, la secuencia terminal es phe-met-trp-ser-pro. (e) La tripsina rompe el grupo carboxilo de la lisina y arginina con tal de que el siguiente aminocido (el que da el grupo amino) no sea prolina. Ya que la alanina es N-terminal, el principio de la secuencia debe ser ala-arg-ser-lys. La secuencia total ser: FDNB Tripsina Quimotripsina

ala---arg---ser---lys---Phe---met---trp---ser---pro CNBr REACTIVOS Y ENZIMAS MS CORRIENTES UTILIZADOS PARA ROTURA Y ANLISIS DE PPTIDOS
Reactivosyenzimas Sitiodeaccin Especificidad I.Generales HCl6N Ac.perfrmico Fluorodinitrobenceno (FDNB) Clorurodedansilo Enlacepeptdico SS R1 Todos Todos H2NR1 Alvaco,110C ProduceSO3H Coloramarillo Observaciones

R1

H2NR1 II.Roturaterminal

Fluorescente

DegradacindeEdman

LadoCdeR1

TodoslosAa

NoactasielNterminal esbloqueado Separa14Aa secuencialmente Separa14Aa secuencialmente Soloseusaenausenciade carboxipeptidasas

CarboxipeptidasaA

LadoNdeRn

Rn Arg,Lys,Pro

CarboxipeptidasaB

LadoNdeRn

Rn =Arg,Lys,AECys Rn1Pro

Hidrazinolisis

Enlacespeptdicos LiberaRn

Leucinaaminopeptidasa

R1

H2NR1 R2Pro III.Roturasinternas

AtaquemsrpidosiR1 = alquilooarilo

BrCN(Bromurode ciangeno) BrCNanhidro

LadoCdeRx

Rx =Met

Muyespecfico

LadoCdeRx

Rx =Met,Trp

Muyespecfico

Tripsina

LadoCdeRx

Rx =Lys,Arg Rx+1Pro

Muyespecfico

Tripsina(despusdel tratamientocon anhdridomaleico) Tripsina(despusdel tratamientocon etilenimina) Quimiotripsina

LadoCdeRx

Rx =Arg Rx+1Pro

Muyespecfico

LadoCdeRx

Rx =Lys,Arg,AECys Rx+1Pro

Muyespecfico

LadoCdeRx

Rx =Phe,Tyr,Trp,Leu Rx+1Pro

Avecesefectivo Rx=Asn,Met Muyespecfica

Fosfatasacida Papana

LadoCdeRx LadoCdeRx

Rx =Asp,Glu

Rx =Arg,Lys,Gly,Gln,His, NoactasobreRcidos Tyr,Ser,Ala Rx =Tyr,Phe,Trp,Leu Rx =Glu Rx =Arg Rx =Leu,Asp,Glu,Phe, Tyr,Trp AvecesRx=Ala AvecesRx=Asp Muyespecfica Pocoespecfica Rx1Pro

Subtilisina Proteasaestafiloccica Clostripana Pepsina

LadoCdeRx LadoCdeRx LadoCdeRx LadoNdeRx

Termolisina

LadoNdeRx

Rx =Leu,Ile,Phe,Tyr,Trp, Pocoespecfica Val

R1=Primeraminocido;Rn=ltimoaminocido;Rx=residuointermedio;AECys=Aminoetilcistena

PROBLEMAS NO RESUELTOS Secuenciacin de protenas 1. A partir del siguiente polipptido: Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-LysGly indquese: a) los pptidos que se obtendran al tratarlo con fosfatasa cida b) los productos que se obtendran al tratar los pptidos resultantes del apartado anterior con quimotripsina. 2. Determnese la secuencia de un pptido sabiendo que: a) Su reaccin con fenil-isotiocianato produce el derivado tiohidantonico de la Ala y un tetrapptido b) el tratamiento del tetrapptido anterior con tripsina produce dos dipptidos A y B c) Cuando el dipptido A se reduce con BH4Li y se hidroliza se obtiene el aminoalcohol derivado de un aminocido que da color amarillo al reaccionar con ninhidrina y glicina d) Al hidrolizar el dipptido B se obtienen cantidades equimoleculares de Val y Arg. Dato complementario: dado que an no se han realizado las prcticas, hay que aclarar que el aminocido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. 3. Dedzcase la secuencia de aminocidos de una cadena polipeptdica a partir de los siguientes datos: a) la hidrlisis cida completa produjo: 1 Ala, 1 Arg, 2 Ser, 1 Lys, 1 Phe, 1 Met, 1 Trp, 1 Pro b) el tratamiento con el reactivo de Sanger seguido de hidrlisis cida completa produjo dinitrofenil-alanina c) el tratamiento con BrCN produjo 2 pptidos, uno conteniendo Ser, Pro, Trp y el otro los dems aminocidos d) el tratamiento con quimotripsina dio 3 pptidos: un dipptido con Ser y Pro; un dipptido con Met y Trp; un pentapptido con
9

4.

5.

6.

7.

8.

Phe, Ser, Lys, Arg, Ala e) por digestin trptica se obtuvieron 3 pptidos: un dipptido con Ala y Arg; otro con Lys y Ser; y un pentapptido con Phe, Met, Ser, Pro, Trp. Deduzca la secuencia de aminocidos de un pptido a partir de los siguientes datos: a) Al tratarlo con carboxipeptidasa A se obtiene Val. b) Al tratarlo con fosfatasa cida se produce Glu, un hexapptido y un decapptido. c) El tratamiento con BrCN conlleva la obtencin de un dipptido Glu-Met, y un pptido de 15 aminocidos. d) Al someter el pptido de 15 aminocidos a digestin con quimotripsina se obtiene un residuo de Tyr, y tras tratamiento con etilenimina y digestin con tripsina se obtienen los pptidos: Ala-Leu-Pro-Gly-Gly-Gly-Arg; Asp-Cys; Tyr-Ser-His-Lys y Gly-Val. Un pentapptido que contiene cantidades equimoleculares de Met, Phe, Asp, Ser y Thr, se trat con BrCN liberndose Met. El tratamiento del pptido con quimotripsina rindi dos nuevos pptidos, uno claramente ms cido que el otro. El fragmento cido contena Met. El tratamiento del pptido original con carboxipeptidasa A dio rpidamente Ser, seguido de Thr. Dedzcase la secuencia de aminocidos del pptido original. Deduzca la secuencia de aminocidos de un pptido a partir de la siguiente informacin: a) Composicin: 1Phe:1Pro:1Glu:2Lys. b) El tratamiento con reactivo de Edman produce PTH-Glu. c) Ni la tripsina ni las carboxipepetidasas A y B liberan ningn pptido pequeo ni aminocido. Un pptido natural tratado con cloruro de dansilo y posterior hidrlisis rindi el derivado dansilado de la lys junto con una mezcla de aminocidos libres en la que se identificaron 3Ala:1Arg:1Met:2Phe:1Ser. El tratamiento con quimotripsina produjo Arg y 2 pptidos, denominados X e Y. El pptido X, al reaccionar con FDNP y posterior hidrlisis, produce DNPLys, y el tratamiento con BrCN produjo el pptido Z, que hidrolizado con tripsina rindi un tripptido cuyo N-terminal era la Ala. El pptido Y es un tripptido en el cual, mediante tratamiento con FDNP y posterior hidrlisis, se determin DNP-Ser. Deducir la secuencia del pptido original. Determnese la estructura de un pptido aislado del plasma bovino a partir de la siguiente informacin a) el peso molecular determinado por filtracin en gel es aproximadamente 1000 y contena cantidades equimoleculares de Tyr, Arg, Pro b) la quimotripsina no afect c) la hidrlisis trptica liber del pptido nicamente Tyr d) el tratamiento con el reactivo de Sanger produjo dinitrofenil-arginina. (PM Tyr = 181,2, Arg = 174,2, Pro = 115,1).

PROBLEMAS RESUELTOS Secuenciacin de protenas 1. A partir del siguiente polipptido: Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-LysGly indquese: a) los pptidos que se obtendran al tratarlo con fosfatasa cida b) los productos que se obtendran al tratar los pptidos resultantes del apartado anterior con quimotripsina. a) La fosfatasa cida rompe por el lado C de Rx, cuando Rx = Asp o Glu. Los pptidos resultantes de esta rotura, a partir del polipptido del problema, sern: Lugares de accin de la fosfatasa cida Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-Lys-Gly Fragmentos: Val-Phe-Cys-Glu

Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu

Ser-Tyr-Asp

Lys-Gly
10

b) La quimotripsina puede romper por el lado C de Rx, cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que Rx+1 Pro; por tanto, los productos de la rotura sern: Lugares de accin de la quimotripsina Val-Phe-Cys-Glu Fragmentos: Val-Phe Cys-Glu Phe-Pro-Thr -Trp Arg-Glu Ser-Tyr Asp Lys-Gly Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu Ser-Tyr-Asp Lys-Gly (no se rompe)

2. Determnese la secuencia de un pptido sabiendo que: a) Su reaccin con fenil-isotiocianato produce el derivado tiohidantonico de la Ala y un tetrapptido b) el tratamiento del tetrapptido anterior con tripsina produce dos dipptidos A y B c) Cuando el dipptido A se reduce con BH4Li y se hidroliza se obtiene el aminoalcohol derivado de un aminocido que da color amarillo al reaccionar con ninhidrina y glicina d) Al hidrolizar el dipptido B se obtienen cantidades equimoleculares de Val y Arg. Dato complementario: dado que an no se han realizado las prcticas, hay que aclarar que el aminocido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. Se trata de un pentapptido que tiene como aminocido N-terminal a la Ala, ya que el reactivo empleado (fenil isotiocianato) sirve para identificar aminocidos N-terminales: Ala La tripsina rompe por el lado C de Rx, cuando Rx = Lys, Arg o AECys. Como el tetrapptido contiene Arg, y se producen dos dipptidos por la accin de la tripsina, la Arg debe estar en la tercera posicin: Ala Arg

Dado que al hidrolizar el pptido B se obtiene Val y Arg, la valina debe ocupar el segundo lugar en el pptido: Ala Val Arg

El aminocido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. Dado que la tripsina no puede romper cuando Rx+1 = Pro, este aminocido deber estar situado en la ltima posicin, por lo que queda la cuarta para la Gly: Ala Val Arg Gly Pro

3. Dedzcase la secuencia de aminocidos de una cadena polipeptdica a partir de los siguientes datos: a) la hidrlisis cida completa produjo: 1 Ala, 1 Arg, 2 Ser, 1 Lys, 1 Phe, 1 Met, 1 Trp, 1 Pro b) el tratamiento con el reactivo de Sanger seguido de hidrlisis cida completa produjo dinitrofenil-alanina c) el tratamiento con BrCN produjo 2 pptidos, uno conteniendo Ser, Pro, Trp y el otro los dems aminocidos d) el tratamiento con quimotripsina dio 3 pptidos: un dipptido con Ser y Pro; un dipptido con Met y Trp; un pentapptido con
11

Phe, Ser, Lys, Arg, Ala e) por digestin trptica se obtuvieron 3 pptidos: un dipptido con Ala y Arg; otro con Lys y Ser; y un pentapptido con Phe, Met, Ser, Pro, Trp. Se trata de un nonapptido en el que el aminocido N-terminal es la alanina, ya que el reactivo de Sanger sirve para determinar los aminocidos N-terminales: Ala Puesto que el CNBr rompe por el lado C de la Met, y dada la composicin de los pptidos resultantes, la Met debe ocupar el sexto lugar: Ala Met

La quimotripsina puede romper por el lado C cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que Rx+1 Pro. Como el pentapptido tiene alanina, dicho pentapptido ocupar las primeras cinco posiciones de la cadena del nonapptido y deber acabar en Phe: Ala Phe Met

Uno de los dipptidos contine Met y Trp, luego dicho dipptido ir a continuacin del pentapptido y contendr Met y Trp, por ese orden: Ala Phe Met Trp

El tercer dipptido estar al final, y dado que la prolina no puede ir despus del Trp, ya que no habra podido actuar la quimotripsina, el orden sera Ser-Pro: Ala Phe Met Trp Ser Pro

La tripsina rompe cuando Rx = Lys, Arg o AECys y Rx+1 Pro, por lo que uno de los pptidos lleva Ala y Arg, luego el segundo aminocido es la Arg: Ala Arg Phe Met Trp Ser Pro

La otra rotura de la tripsina ser por la Lys; por tanto, el siguiente ptido tendr Ser y Lys, por ese orden. Por consiguiente, la secuencia del nonapptido ser: Ala Comprobacin: Reactivo de Sanger Ala Arg Tripsina Quimotripsina Arg Ser Lys Phe Met Trp Ser Pro

Ser

Lys

Phe

Met

Trp

Ser

Pro

12

Bromuro de ciangeno 4. Deduzca la secuencia de aminocidos de un pptido a partir de los siguientes datos: a) Al tratarlo con carboxipeptidasa A se obtiene Val. b) Al tratarlo con fosfatasa cida se produce Glu, un hexapptido y un decapptido. c) El tratamiento con BrCN conlleva la obtencin de un dipptido Glu-Met, y un pptido de 15 aminocidos. d) Al someter el pptido de 15 aminocidos a digestin con quimotripsina se obtiene un residuo de Tyr, y tras tratamiento con etilenimina y digestin con tripsina se obtienen los pptidos: Ala-Leu-Pro-Gly-Gly-Gly-Arg; Asp-Cys; Tyr-Ser-His-Lys y Gly-Val. Como se puede deducir fcilmente, el pptido tiene 17 aminocidos. De esos 17 aminocidos el ltimo es la valina (tramiento con carboxipeptidasa A), y el primero es Glu, ya que la fosfatasa cida rompe por el lado C de Rx, cuando Rx = Glu o Asp y para que libere solo Glu debe estar el primero: Glu Val

El CNBr rompe por la Met, luego el segundo es precisamente la Met al ir acompaado del Glu: Glu Met Val

del pptido de 15 y el tercero del de 17:

Al tratarlo con quimotripsina se desprende Tyr; Dado que la quimotripsina rompe por el lado C de Rx cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que Rx+1 Pro, quiere decir que la Tyr es el primer aminocido Glu Met Tyr Val

La tripsina puede romper por el lado C, cuando Rx = Lys o Arg, y si se trata previamente el pptido con etilenimina tambin podr romper por el sitio de la Cys (amino etilcistena o AECys). Por tanto, el primer pptido, del pptido mayor de 15 aminocidos, ser Tyr-Ser-His-Lys, ya que contiene a la Tyr, y el ltimo Gly-Val, por contener Val: Glu Met Tyr Ser His Lys Gly Val

Como el tratamiento con fosfatasa cida produce, adems de Glu, un hexapptido y un decapptido, y tiene que romper por Asp, la nica manera de combinar esto con los dos pptidos que quedan de la digestin trptica es la siguiente: Glu Met Tyr Ser His Lys Asp Cys Ala Leu Pro Gly Gly Gly Arg Gly Val Comprobacin: Fosfatasa Quimotripsina cida Glu Fosfatasa cida Carboxipeptidasa A

Met Tyr Ser His Lys Asp Cys Ala Leu Pro Gly Gly Gly Arg Gly Val CNBr Tripsina
13

5. Un pentapptido que contiene cantidades equimoleculares de Met, Phe, Asp, Ser y Thr, se trat con BrCN liberndose Met. El tratamiento del pptido con quimotripsina rindi dos nuevos pptidos, uno claramente ms cido que el otro. El fragmento cido contena Met. El tratamiento del pptido original con carboxipeptidasa A dio rpidamente Ser, seguido de Thr. Dedzcase la secuencia de aminocidos del pptido original. Como al tratar el pentapptido con CNBr se libera metionina, y dado que este reactivo corta por el lado C de la Met, esto quiere decir que el primer aminocido es la Met: Met El tratamiento con quimotripsina, que rompe por el lado C de la Phe, da dos pptidos.; el que contiene Met es el cido, luego este pptido tiene Met, Asp y Phe, por ese orden: Met Asp Phe

Como el tratamiento con carboxipeptidasa A produce primero Ser y luego Thr, la secuencia del pptido debe ser: Met Comprobacin: CNBr Met Quimotripsina Asp Phe Thr Ser Asp Phe Thr Ser

2 1 Carboxipeptidasa A 6. Dedzcase la secuencia de aminocidos de un pptido a partir de la siguiente informacin: d) Composicin: 1Phe:1Pro:1Glu:2Lys. e) El tratamiento con reactivo de Edman produce PTH-Glu. f) Ni la tripsina ni las carboxipepetidasas A y B liberan ningn pptido pequeo ni aminocido. Se trata de un pentapptido, y como el reactivo de Edman permite identificar el primer aminocido, este es el Glu: Glu Si ni la tripsina ni la carboxipeptidasa A pueden producir cortes, quiere decir que la prolina va en un lugar en el que puede estorbar la actuacin de ambas enzimas; es decir, en el lado amino del ltimo aminocido y en el lado carboxilo de la Lys. Adems, como hay dos Lys, una de ellas debe ser la ltima, ya que si fuesen juntas s se podra producir el corte por la tripsina. Luego la secuencia tiene que ser la siguiente: Glu Phe Lys Pro Lys

14

7. Un pptido natural tratado con cloruro de dansilo y posterior hidrlisis rindi el derivado dansilado de la Lys junto con una mezcla de aminocidos libres en la que se identificaron 3Ala:1Arg:1Met:2Phe:1Ser. El tratamiento con quimotripsina produjo Arg y 2 pptidos, denominados X e Y. El pptido X, al reaccionar con FDNP y posterior hidrlisis, produce DNPLys y el tratamiento con BrCN produjo el pptido Z, que hidrolizado con tripsina rindi un tripptido cuyo N-terminal era la Ala. El pptido Y es un tripptido en el cual, mediante tratamiento con FDNP y posterior hidrlisis, se determin DNP-Ser. Deducir la secuencia del pptido original. Se trata de un nonapptido en el que el primer aminocido es la Lys, ya que el cloruro de dansilo sirve para identificar aminocidos N-terminales: Lys Para que con el tratamiento con quimotripsina se libere Arg esta debe ocupar la posicin Rx+1 de un aminocido compatible con el corte, es decir, Phe y, adems ser el ltimo aminocido de la cadena: Lys Phe Arg

El pptido X es el que ocupa las primeras posiciones del nonapptido ya que lleva Lys, y debe acabar con Phe. Como el pptido Y es un tripptido, este debe estar al final, y puesto que el primer aminocido del tripptido es Ser (el FDNB reconoce los aminocidos N-terminales), y que en el punto de corte con el pptido X debe haber Phe, podemos deducir la siguiente secuencia: Lys Phe Ser Ala Phe Arg

Como el CNBr rompe por el lado C de la Met, la digestin trptica lo hace por el lado C de la Lys y el tripptido que queda empieza por Ala, podemos deducir que la secuencia final ser: Lys Ala Ala Met Phe Ser Ala Phe Arg

Comprobacin: Cloruro de dansilo Lys Ala Ala Pptido X Pptido X: Tripsina

Quimotripsina Met Phe Ser Ala Phe Arg

Pptido Y Pptido Y:

CNBr
15

Lys-Ala-Ala-Met-Phe FDNB

Ser-Ala-Phe-Arg FDNB

8. Determnese la estructura de un pptido aislado del plasma bovino a partir de la siguiente informacin a) el peso molecular determinado por filtracin en gel es aproximadamente 1000 y contena cantidades equimoleculares de Tyr, Arg, Pro b) la quimotripsina no afect c) la hidrlisis trptica liber del pptido nicamente Tyr d) el tratamiento con el reactivo de Sanger produjo dinitrofenil-arginina. (PM Tyr = 181,2, Arg = 174,2, Pro = 115,1). Si dividimos el peso molecular del pptido (1000) por la suma de los pesos moleculares de los tres aminocidos (460,5) nos d aproximadamente 2. Como hay cantidades equimoleculares de cada uno de ellos quiere decir que se trata de un hexapptido con dos representantes de cada aminocido (2 Arg, 2 Pro y 2 Tyr). Si la quimotripsina no afect quiere decir que la Tyr va seguida de Pro o que tiene una posicin final. Como hay dos Tyr una debe estar al principio o en medio de la cadena seguida de una prolina y la otra estar al final. Puesto que la hidrlisis trptica libera Tyr esta debe estar al final de la cadena, y como la tripsina rompe por Rx = Lys o Arg, siempre que Rx+1 Pro, la Tyr debe estar precedida por la Arg y la otra Arg debe estar al principio o en el interior de la cadena seguida por una Pro. Como el reactivo de Sanger detecta el aminocido N-terminal y este es Arg, podemos escribir la secuencia del hexapptido: Arg Pro Tyr Pro Arg Tyr

Comprobacin: Reactivo Quimotripsina de Sanger X Arg Pro Tyr Pro Arg X Tripsina Tripsina

Tyr

16