Comisia de Patologie Apicol

FARMACODINAMICA ACIDULUI OXALIC N COLONIA DE ALBINE MELIFERE

A. NANETTI , P. BARTOLOMEI , Stefania BELLATO , Maria De SALVIO , E. GATTAVECCHIA , R. GHINI
1 2 3 1 2 2 2 2

E.N.E.A. U.F.I.S. sede di Montecuccolino, Bologna, ITALIA, E-mail: istnapic@inapicoltura.org U.C.I. Scienze Chimiche Radiochimiche e Metallurgiche, Facolt di Farmacia, Universit di Bologna, ITALIA Tel.: +39 051 353103, E-mail: istnapic@inapicoltura.org 3 Istituto Nazionale di Apicoltura, Bologna, ITALIA, E-mail: istnapic@inapicoltura.org and ghini@biocfarm.unibo.it

Rezumat Farmacodinamica acidului oxalic (AO) administrat prin picurare a fost examinat cu ajutorul metodelor radiochimice. Un sirop 14 de zahr, coninnd AO marcat cu C, a fost picurat ntr-o colonie, potrivit dozei i tehnicii utilizate n general n practica apicol. n primele patru zile, contaminarea albinelor adulte a atins 118 /g, dar a sczut la mai puin de 1/10 respectiv 1/60 la una respectiv dou sptmni dup tratament. Pe parcursul lunilor urmtoare a fost nregistrat o nou scdere. Niveluri considerabil mai joase au fost msurate la puietul n vrst de 8-9 zile, care, n mod asemntor, a fost contaminat numai temporar. Radiografiile au scos n eviden prezena AO n organele abdominale interne ale albinelor adulte. n mierea proaspt recoltat, creterea OA a fost de 0,6 mg/kg sau mai puin. Aceasta reprezint numai o fracie mic din coninutul natural de AO al mierii. Markerul radioactiv a fost gsit i n ceara adunat din fagurii recent cldii, dar nu este clar dac se datora unei contaminri directe datorit reaciilor chimice ntre AO liber i cear, sau datorit prezenei metaboliilor produi de albine din AO absorbit. ntr-un al doilea experiment cu aceeai metod de administrare, au fost luate n considerare i alte matrice. Markerul radioactiv a fost prezent att n hemolimfa albinei adulte ct i n mostrele de CO2 prelevate din colonie. Acest fapt pare s confirme ipoteza metabolizrii AO de ctre albine. Cuvinte cheie: Varroa / reziduuri / acid oxalic / distribuie

Introducere Picurarea unei soluii de zahr, la care s-a adugat acid oxalic, n coloniile de albine (NANETTI i STRADI, 1997) este o metod de combatere a varroozei rspndit n multe ri europene. Au fost efectuate numeroase experimente pentru verificarea eficienei i tolerabilitii acestei metode n condiii tehnice i de mediu diferite, adeseori ducnd la metodologii locale (NANETTI, 2002). Totui, cunotinele noastre despre substana activ sunt departe de a fi complete, mai ales, n ceea ce privete efectul acidului oxalic n interiorul coloniilor de albine i asupra albinelor individuale. i tocmai nelegerea acestui fenomen, pe lng interesul pur academic, este crucial pentru nelegerea efectelor negative ale tratamentului i pentru mbuntirea metodelor de aplicare. Puinele date disponibile privind reziduurile din miere indic, de obicei, un risc redus n ce privete autenticitatea mierii dup tratament cu acid oxalic (MUTINELLI et al., 1997; DEL NOZAL, et al., 2000; BERNARDINI, i GARDI, 2001; BOGDANOV et al., 2002; NANETTI, et al., 2002). Tehnicile de analiz adoptate de obicei nu pot s deosebeasc ntre contaminarea cu acid oxalic de cel care exist n mod natural n miere, fapt care depinde, n mare msur de originea botanic a mierii (MUTINELLI et al., 1997; NANETTI et al., 2002). Lucrarea de fa constituie o contribuie la aceste cunotine. Pentru depirea problemei pe care o reprezint prezena natural a acestei substane n diferite matrice ale coloniei de albine, s-a studiat distribuia acidului oxalic prin administrarea de soluii titrate cu C14 i prin alte analize radiochimice. Material i metode Experimentul a constat din dou replicri, efectuate n sezonul de var din anii 1999 i 2002, n apropierea oraului Bologna (Italia) n timpul recoltrii de miere. A fost utilizat pe an cte o colonie adpostit ntr-un stup DB. n ambele colonii, albinele ocupau toi cei zece faguri disponibili, dintre care 6-7 conineau puiet. n 19 iulie 1999 respectiv 28 iulie 2002, coloniile au fost tratate cu acid oxalic conform metodei menionate mai sus, a picurrii. Au fost utilizate 50 respectiv 41 ml de soluie apoas, care coninea 4,2% acid oxalic i 60% zahr (greutate/volum), administrat cu ajutorul unei seringi. La soluii s-a adugat, n prealabil, acid oxalic cu C14 (Sigma N.31, 391-2), n cantiti corespunznd cu 12,1 MBq i 7,4 MBq. n cazul ambelor replicate, au fost prelevate mostre pre-tratament din matricele de mai jos. Mostrele post-tratament au fost, iniial, prelevate o dat (1999) sau de dou ori pe zi (7 AM i 8 PM n 2002), dar, mai trziu, ele au fost prelevate la intervale mai ndelungate. n 1999 au fost luate n considerare urmtoarele matrice: albine melifere adulte de pe fagurii laterali; puiet n vrst de 8-9 zile;

Comisia de Patologie Apicol

miere necpcit; cear, din pereii celulelor nou cldite (s-a folosit un fagure artificial). n 2002, au fost prelevate mostre de: albine melifere adulte de pe fagurii laterali; CO2 din aerul din interiorul coloniei; cear din fagurii nou cldii; miere proaspt, depozitat n faguri noi. Cu ajutorul pipetelor capilare Pasteur (FLURI et al., 1981) au fost prelevate n tuburi Eppendorf mostre de hemolimf toracic de la albine colectate n vara lui 2002. Aripile anterioare ale fiecrei albine au fost tiate i fixate pe portlamele, cu faa exterioar n sus, lsndu-le pe cele din dreapta aa cum erau i splndu-le pe cele din stnga cu ap distilat din abunden. Intestinele altor albine au fost extrase, extrgnd acul cu grij cu ajutorul unei pensete. Ulterior, acestea au fost montate pe portlamele i depozitate pn la utilizare la cca. 40C, pentru a obine o uscare nceat. Pentru ca matca s aib mai mult spaiu pentru pont, n 2002 n ziua a 5-a a experimentului un fagure de miere lateral a fost nlturat i nlocuit cu unul gol. naintea tratamentului, numai partea superioar a fagurelui nlocuit fusese umplut cu miere. Dup aceea, el a fost completat treptat, pn ctre centru, unde, n momentul nlturrii mai rmsese o zon de celule de miere necpcite. Pentru colectarea de mostre de CO2 din colonie, s-a montat un tub de plastic, al crui capt extern era astupat cu un dop, iar cellalt capt se afla n mijlocul cuibului de puiet. Au fost luate msuri de precauie pentru a evita intrarea accidental a albinelor i a picturilor de soluie n tub. Patru litri de aer extrai prin dopul exterior au fost lsai s barboteze lent ntr-un alt tub care coniea 5 ml de hidroxid de hiamin 10-X (1 M n metanol; catalog Packard nr. 6003005). Toate mostrele cu excepia aripilor, intestinelor i a fagurilor de miere au fost congelate (la cca. -25C), pn n momentul analizei. Au fost fcute auto-radiografii ale aripilor splate i nesplate, ale intestinelor uscate i fagurilor de miere nlturai n ziua a 5-a. Expunerea a durat 33 respectiv 23 de zile pentru primele trei matrice respectiv faguri. Pentru a intensifica aderarea la film, fagurele a fost culcat pe una din laturile sale. Scurgerea de miere a fost evitat prin efectuarea auto-radiografiei la cca. -25C. Mostrele au fost nvelite cu o pelicul de politen (cca. 10 m), pentru a se evita contactul direct cu emulsia fotosensibil. Au fost utilizate filme Kodak Biomax MR1, care au fost prelucrate potrivit indicaiilor productorului. Msurarea radioactivitii (instrumente i pregtirea mostrelor) Toate msurtorile radioactivitii au fost efectuate prin scintilaie lichid (LSC) ntr-un contor Quantulus 1220 (LKB, Suedia). S-au utilizat fiole de polietilen de 20 ml, acoperite de teflon. S-a folosit un amestec de scintilaie Ultima Gold (Packard Canberra, SUA). Cinci albine liofilizate au fost exact cntrite, mcinate i suspendate ntr-un anumit volum de acid oxalic rece. Suspensia a fost supus undelor sonore timp de 10 min., nclzit la 70-80C i centrifugat. Un mililitru de supernatant a fost adugat la 18 ml de amestec scintilant, care se afla ntr-o fiol de 20 ml. O alicot de miere, (cca. 0,2 g), a fost msurat exact, ntr-o fiol de scintilaie, fiind apoi diluat cu ap (cca. 1 ml) i adugat la 18 ml amestec de scintilaie. Cca. 0,1 g (msurat exact) de cear a fost dizolvat n 25 ml ciclohexan i supus unui tratament cu unde sonore. Un mililitru din soluie a fost adugat la 18 ml amestec de scintilaie ntr-o fiol de 20 ml. O mostr exact msurat de puiet n vrst de 8-9 zile a fost suspendat n 5 ml acid oxalic rece, tratat cu unde sonore timp de 10 min., nclzit timp de 10 min. la 60C i centrifugat. Trei picturi de acid tricloracetic au fost adugate pentru limpezirea soluiei. Dup o a doua centrifugare, 1 ml de supernatant a fost adugat la 18 ml amestec de scintilaie ntr-o fiol de 20 ml. O mostr cntrit de polen a fost suspendat n 5 ml acid oxalic rece, tratat cu unde sonore timp de 10 min., nclzit timp de alte 10 min. la 80C i centrifugat. Supernatantul a fost filtrat printr-un microfiltru de 0,1 m. Un mililitru din soluia rezultat a fost adugat la 18 ml amestec de scintilaie ntr-o fiol de 20 ml. O cantitate de 1 ml hidroxid de hiamin 10-X, colectat din capcana de CO2 mai sus descris, a fost adugat la 18 ml amestec de scintilaie ntr-o fiol de 20 ml. Hemolimfa a fost cntrit exact i transferat complet, n cantiti succesive de amestec de scintilaie pn la atingerea unui volum total de 3 ml. Transferul s-a efectuat ntr-o fiol de 20 ml, care coninea 16 ml de amestec de scintilaie.

Comisia de Patologie Apicol

Cromatografie TLC a cerii O mostr de cear, colectat n momentul maxim al radioactivitii, a fost dizolvat n ciclohexan i analizat prin TLC (silicagel, Merck). Dup eluare cu acetat de etil, a fost stabilit distribuia radioactivitii cu ajutorul unui radioscaner (scaner linear TLC, Berthold, Germania). Rezultate i discuii Albine melifere adulte i puietul Figura 1 ilustreaz c n 24 de ore dup tratamentul din 1999 a fost detectat o contaminare remarcabil a albinelor adulte. O zi mai trziu, vrful a atins un maxim de 118 g/g, n schimb n zilele a 7-a i a 11-a, au avut loc scderi remarcabile cnd au fost identificate coninuturi de 10,8 respectiv 2,0 g/g. Dac greutatea medie a unei albine (cca. 100 mg) este luat ca termen de referin, contaminarea cu acid oxalic s-a situat n jur de 12 g, 1 g respectiv 0,2 g. Alte scderi treptate au intervenit n cursul lunilor urmtoare.

Figura 1 - Contaminarea cu acid oxalic la albinele adulte i puietul de 8-9 zile -- albine adulte; -- puiet de 8-9 zile

O contaminare mai redus a fost constatat la larvele mai n vrst necpcite, valoarea maxim fiind de 60 g/g. Ca i la albinele adulte, vrful a fost nregistrat la 24 de ore dup tratament. Totui, scderea a nceput mult mai devreme, dac o comparm cu cea a albinelor, stabilizndu-se la niveluri mai joase. n cel de-al doilea replicat a putut fi demonstrat prezena acidului oxalic C14 n hemolimfa albinelor melifere. Valoarea cea mai ridicat (10 ng/mg) a fost nregistrat la 12 ore dup tratament, ns, ulterior a intervenit o scdere brusc de pn la o concentraie de 1,1 ng/mg n cea de-a 84-a or. Radioactivitatea a disprut aproape complet la aproximativ o lun dup tratament (Figura 2). Mici diferene, dac au existat, au fost evideniate n auto-radiografiile aripilor nesplate i ale aripilor din care acidul oxalic a fost nlturat printr-o splare riguroas. Ambele categorii au lsat pe film urme clare ale nervaturilor lor. Acest fapt indic o contaminare exterioar sczut a albinelor i o contaminare cu acid oxalic a hemolimfei care umple nervaturile aripilor. Ipoteza metabolizrii acidului oxalic de ctre albine este susinut de detectarea de CO2 radioactiv n aerul prelevat din interiorul coloniei (Fig. 2), al crui vrf de concentraie a fost mai ntrziat n comparaie cu cel nregistrat pentru hemolimf. A avut loc o scdere brusc, de ciclicitate zilnic, cu vrfuri pozitive la aerul prelevat seara i reduse la cel de diminea devreme. Dei nu exist nici o explicaie cert pentru acest fenomen, s-ar putea ca nivelul diferit de activitate a coloniei ziua i noaptea s fi avut vreo influen.

Comisia de Patologie Apicol

Figura 2 - Contaminarea cu acid oxalic n hemolimfa albinelor (stnga) i n CO2 (dreapta) -- hemolimf; -- CO2

Figura 3 reprezint distribuirea radioactivitii de-a lungul intestinelor albinelor. La 12 ore dup tratament tot tractul, ntre gua de miere i rect, a evideniat prezena marcatorului, dar ulterior prezena marcatorului radioactiv a fost depistat doar ocazional n interiorul guei de miere. n general, contaminarea s-a redus n timp; intestinele prelevate n zilele a 22-a i a 31-a nu erau contaminate cu cantiti detectabile.

Figura 3 - Radioactivitatea n intestinele albinelor melifere (zonele colorate)

Comisia de Patologie Apicol

Ceara i fagurii Figura 4 reprezint radioactivitatea detectat n mostrele de cear din 1999. n comaraie cu albinele adulte i cu puietul vrful este ntrziat cu o zi. n pofida proprietii hidrofile a acidului oxalic, prezena marcatorului radioactiv (C14) a fost detectat pe termen lung. Din analizele cromatografice TLC efectuate pentru unele din aceste mostre, reiese c fracia radioactiv a cerii ar putea fi format din mai mult dect un singur compus. De aici ar putea rezulta c dup tratament nu numai cristalele de acid oxalic ar putea ajunge pe faguri, ci i c acidul ar putea reaciona cu ceara i/sau c metaboliii acidului oxalic pot urma calea care duce la sinteza unui anumit compus al cerii n albinele care secret cear.

Figura 4 - Activitatea din ceara nou, colectat din fagurii deja existeni.

n mod logic, radioactivitatea din 2002 a fost detectat tot pe termen lung n mostrele de cear proaspt. n Fig. 5, toate semnalele nregistrate sunt convertite n concentraii ale acidului oxalic, dar i n acest caz, ar putea fi prezente cantiti necunoscute de compui provenii din reaciile chimice i/sau metabolizare, ceea ce poate duce la o apreciere mai mult sau mai puin corect a contaminrii. Ipoteza dup care albinele ar efectua metabolizarea acidului oxalic se bazeaz pe existena concomitent a vrfurilor nregistrate la cear i la CO2.

Figura 5 - Contaminarea cu acid oxalic a cerii (vezi textul) i a mierii - - cear din fagurii nou cldii; - - miere proaspt

Comisia de Patologie Apicol

Autoradiografia efectuat cu fagurele de miere (Fig. 6) arat c marcatorul radioactiv s-a mprtiat pe suprafaa fagurelui (un fagure necontaminat nu las nici o urm pe film). Zona nchis la culoare din partea de sus, se gsete n apropierea locului de administrare. n celulele de miere necpcite contaminarea pare mai ridicat pe marginile celulei dect n mierea nsi.

Figura 6 - Autoradiografia unui fagure de miere. Cele cteva puncte nchise la culoare provin de la unelte. Sgeile indic miere cpcit, miere necpcit, puiet de trntor

Reziduurile din miere Dup tratamentul din 1999, coninutul de acid oxalic al mierii necpcite, colectat din corpurile de miere, a crescut pn la 0,59 mg/kg, valoare atins n ziua a 4-a. ncepnd cu ziua a 8-a, contaminarea a fost sub 0,1 mg/kg. Mostrele prelevate din rezervele de miere n timpul toamnei urmtoare continuau s conin 0,07-0,1 mg/kg. Aceste valori sunt reduse n comparaie cu coninutul natural de acid oxalic al mierii, care se nscrie ntre 3 i 760 mg/kg n funcie de originea botanic (NANETTI et al., 2002) i se ncadreaz n gama natural de variabilitate. Cele de mai sus indic un risc redus de contaminare al mierii destinate extragerii. n 2002 mierea a fost colectat din fagurii cldii de albine n perioada dintre dou prelevri succesive de mostre, ceea ce a redus o posibil influen a unei mieri necontaminate deja existente. Astfel datele relevante devin reprezentative pentru transferul real de la albine la miere. n acest caz, nivelul maxim de 54,2 mg/kg a fost nregistrat la 12 ore dup tratament (Fig. 5), dar a urmat o scdere abrupt n primele 1-12 zile dup tratament, ducnd la valori variind ntre 6 i 13,8 mg/kg. nregistrrile ulterioare s-au situat sub 1 mg/kg. Mulumiri Autorii in s-i manifeste recunotina fa de Prof. Maria Adelaide VECCHI, de la Universitatea din Bologna, i Prof. Adriano PODEST, de la Universitatea din Pisa, pentru discuiile rodnice i sugestiile lor valoroase.
BIBLIOGRAFIE Bernardini M., Gardi T. (2001), Impatto degli interventi sanitari per il controllo dellacaro varroasulla qualit del miele e della cera. Apitalia 28(7-8): 21-24 Bogdanov S., Charrire J.D., Imdorf A, Kilchenmann V., Fluri P. (2002), Determination of residues in honey after repeated field trials with formic and oxalic acid. Apidologie 33(4): 399-409

Comisia de Patologie Apicol Del Nozal M.J., Bernal J.L., Diego J.C., Gmez L.A., Ruiz J.M., Highes M. (2000), Determination of oxalate, sulphate and nitrate in honey and honeydew by ion-chromatography. J. of Chromatography 881: 629-638 Fluri P., Sabatini A.G., Vecchi M.A., Wille H. (1981), Blood juvenile hormone, protein and vitellogenin titres in laying and non-laying queen honeybees. J. Apic. Res. 20(4): 221-225 Mutinelli F., Baggio A., Capolongo F., Piro R., Biasion L. (1997), Lacido ossalico nella lotta alla varroasi. Lape nostra amica (4): 4-7 Nanetti A. (2002), Oxalic acid treatments for varroa control (review). Symposium "Prevention of residues in honey", Celle (Germany), October 10-11, 2002 Nanetti A., Ghini S., Gattavecchia E., Bartolomei P., Marcazzan G.L., Massi S. (2002), Pharmacodynamics of oxalic acid and treatment residues in honey. Symposium "Prevention of residues in honey", Celle (Germany), October 10-11, 2002. Poster session Nanetti A., Stradi G. (1997), Oxalsure-Zuckerlsung zur Varroabekmfung. Allg. Dtsch. Imkerztg 31 (11): 9-11