COURS DE MICROBIOLOGIE DE MONSIEUR LACROIX

Objectifs : Passer en revue la diversit du monde bactrien. Le point le plus intressant tant la diversit des mtabolismes qui peuvent expliquer ladaptation de la bactrie tous les milieux. Le chapitre sur ladaptation au stress est trs important malgr le peu dheures qui y seront consacres. La classification ne sera pas aborde selon la dmarche classique : genre, espce, ... Elle le sera selon les pathologies et les caractres biochimiques. Sil reste du temps, le rle des bactries sera abord (ex. : la flore intestinale). A. INTRODUCTION 1. Prambule a. Comment dfinir la microbiologie ? Dfinition : La microbiologie correspond ltude des organismes trop petits pour tre vus lil nu donc leur taille est infrieure 1 mm. Selon cette dfinition, appartiennent la microbiologie les organismes suivants : - les bactries - les virus - les algues unicellulaires - les champignons (= moisissures) - les protozoaires Les algues filamenteuses font aussi parties de cette catgorie mme si elles sont plus grosses . La dfinition est donc largie. La microbiologie se dfini galement par les techniques utilises pour ltude des microorganismes. La premire tape tant lisolement (microorganismes en culture pure). La deuxime tape correspond la multiplication de cette culture pure dans des milieux nutritifs striles. Il a fallu mettre au point les milieux de culture, les techniques de strilisation, les moyens striles de manipulation ... 1

2. Historique de la microbiologie a. Mise en vidence des microorganismes Les microorganismes interviennent leur de la fermentation par ex. : le pain, la bire ... Ils se trouvent lorigine et la fin du cycle alimentaire et ils sont indispensables pour le bon droulement du cycle du carbone, du soufre.. Il a fallu mettre en place des techniques pour tudier et comprendre les maladies (rappel : 1% des bactries sont pathognes). Mais avant de les tudier, il fallait les voir !!! Lucrce (- 50 avant J.C) avait suppos que des microorganismes taient lorigine des maladies. Fascatoro (+ 1500) fait la mme observation, cette ide va rester dans les esprits mais il faut la dmontrer. Il se pose alors un problme technologique qui dbouchera sur linvention du microscope. Robert Hooke (+ 1665) voit le premier microorganisme mais ce nest pas une bactrie, ce sont des champignons (du genre Fucor qui se dveloppent sur du vieux pain moisi). Il trouve le nom de cellule. Lobservation de la premire bactrie date de 1676 et est due un nerlandais nomm Antonie Van Leewenhoek. Il observera galement les premiers protozoaires. Mais pour lui la fabrication de microscopes relve juste de la passion. Il apportera un grand perfectionnement car les bactries sont vraiment petites (taille 1 2 m). Il russira mme observer le dplacement des bactries. Il enverra le rsultat de ses expriences Hooke qui essaie de reproduire les expriences d Antonie . Il russira lanne suivante ce qui lui ouvrira les portes de lacadmie des sciences de Grande Bretagne. La polmique sur la gnration spontane est relance. b. La gnration spontane Avant, on pensait que les maladies taient le rsultat du drglement des humeurs et que le pain moisissait tout seul ! Quant la viande, on pensait que les asticots venaient tout seul. 2

Redi (+ 1650) que larrive des asticots sur la viande nest pas due la gnration spontane. GAZE PAPIER

Asticots aprs qques jours

RIEN mais la surface de la gaze, les mouches ont pondu des oeufs

Redi montre que la thorie de la gnration spontane est fausse pour les macroorganismes. Mais cela relance la polmique pour les microorganismes. Les prcurseurs Les expriences qui suivent sont inspires de celles de Redi. Spallanzini (+ 1780) observe que des microorganismes se dveloppent dans un bouillon de viande laiss de ct quelques jours. Il pense que les microorganismes viennent de partout.

EAU + VIANDE

Le col est ensuite scell puis le ballon est mis bouillir pendant dheure. Le bouillon ne va pas se troubler car il y a eu strilisation grce lbullition. Mais ce nest toujours pas la fin de la gnration spontane car selon les dtracteurs, lair emprisonn entre le col et la surface du liquide aurait t modifi par lbullition. Nicolas Appert (+ 1795) participe un concours organiser par larme pour garder les aliments plusieurs semaines voir plusieurs annes (intrt lors du ravitaillement des troupes). Il pense que la pourriture se produit cause de ferments. Il inventera grce ses travaux la premire conserve. 3

Bouchon de lige + colle de poisson

Ebullition pendant 1H

Les microorganismes sont partout mais il est possible de les dtruire en passant par lbullition. Pasteur connat les travaux de Spallanzani et de Appert. La fin de la gnration spontane : Pasteur Il a fait passer en force de lair travers un coton, dans ce dernier il a pu observer des microorganismes. Si on plonge le coton dans de leau strile, le milieu se trouble. Il a procd dautres expriences avec des ballons col sinueux. Ebullition pendant 1H

Les ballons sont ensuite mis au repos pendant 15 jours, la fin de cette priode il ny a pas de contamination. Si on casse le col, il y a rapidement contamination. Pasteur dtient la preuve que les microorganismes viennent de lextrieur. LA GENERATION SPONTANEE NEXISTE PAS !!! Cela permet dobtenir des milieux pour la multiplication aprs obtention dune culture pure.

c. Les relations maladies / microorganismes Les maladies ont fait progresser la microbiologie. Les prcurseurs Cest la fin du 19me sicle quapparat la relation maladie / microorganismes. 1835 : Bassi dmontre que la maladie du ver soie est due un champignon. 1845 : Berkeley dmontre que la maladie de la pomme de terre est due elle aussi un champignon. Robert Koch a tudi la maladie du charbon qui touche beaucoup plus les animaux que lHomme. Il a men lexprience suivante : Une souris meurt de la maladie du charbon, il injecte un morceau de cette souris une souris saine. La seconde meurt galement de la maladie du charbon. Il en rcupre la rate qui broie dans du srum de buf strile. Les bactries prsentes dans la rate se sont multiplies. Si on injecte ce srum de buf contamin par une souris saine, celle-ci tombe malade et meurt des suites de la maladie du charbon. Le postulat de Koch - Le microorganisme doit tre prsent dans chaque maladie mais absent des organismes sains. - Le microorganisme suspect doit tre isol en culture pure. - La mme maladie doit se dvelopper quand le microorganisme en culture pure est inocul un organisme sain. - Le mme microorganisme doit tre isol du nouvel hte malade. Pasteur a dmontr la mme chose mais de plus il dmontre pourquoi la maladie du charbon revient. Lorsque le btail meurt, on lenterre dans les prs. Le nouveau cheptel broute lherbe de ces prs. Les spores de la bactrie responsable de la maladie du charbon sont transports par les vers de terre qui les dposent sur lherbe. Le nouveau troupeau meurt de la maladie du charbon suite lingestion de lherbe contamine. Ultrieurement les animaux seront brls. Pasteur fait de la prvention. Dans un milieu liquide peuvent se retrouver 5, 6 ... 10 espces diffrentes de microorganismes. Les milieux liquides ne permettent donc pas lisolement. Il a donc ncessit de milieux solides pour cette tape de ltude. Les innovations techniques 5

Le premier essai de milieu solide sera ralis sur tranches de pomme de terre strilises. Mais ce milieu est friable et pas toujours suffisant nutritivement parlant. Il faut donc glifier les milieux liquides. - 1re ide : glification par la glatine mais la glatine fond pour une temprature suprieure 28C et les bactries la consomment. La plupart des bactries pathognes intressantes poussent 37C. La glatine nest donc pas le glifiant appropri. - 2me ide qui sera dfinitive : lAgar. Cest Fannie Hesse qui en a suggr lutilisation. LAgar a pour proprit de ne pas fondre en dessous de 100 C et les bactries ne consomment pas ce polysaccharide. Ptri inventera la bote qui porte son nom. Elle sera premirement en verre puis en plastique. 3. Les domaines de la microbiologie a. Lindustrie Pasteur a t appel par un industriel qui fabriquait de lthanol par fermentation du sucre. Sa production dthanol diminuait au profit de lacide lactique. Pasteur montre que les levures utilises taient contamines par une bactrie qui dans des conditions danarobiose avait pris le dessus. Il a procd un risolement et une purification de la levure. b. Lagroalimentaire Lister (il donnera son nom une espce bactrienne : Listeria) isole les ferments lactiques qui permettent la production de yaourt. c. Les autres apports de la microbiologie Les enzymes de restriction ADN support des gnes Dcouverte dantibiotiques Amlioration des souches pour la production de bire, vin, yaourts... Clonage

Il est important de noter quun tiers des prix Nobel sont dcerns des microbiologistes.

B. LA CELLULE BACTERIENNE 1. Les structures obligatoires a. Lenveloppe La membrane cellulaire Elle est uniquement constitue de phospholipides donc jamais de triglycrides ni de cholestrol. Les phospholipides forment malgr tout une bicouche lipidique correcte. Elle est galement forme dune quantit importante de protines qui permettent le transport de molcules nutritives et la scrtion des toxiques. Autour de la membrane cellulaire se trouve la chane de transporteurs dlectrons ncessaire la fabrication dnergie grande diffrence avec les eucaryotes. La machinerie de scrtion des protines se trouve dans la membrane cellulaire grande diffrence avec les eucaryotes. Il nexiste donc pas dautres membranes lintrieur de la cellule. Le systme protique est plus complexe que celui dune cellule eucaryote. Chez la majorit des bactries, il y a une seconde membrane au dessus de la membrane cellulaire. La membrane externe Cest une bicouche lipidique contenant des phospholipides mais aussi le lipopolysaccharide (LPS). Ce dernier se dcompose comme suit : - la partie lipidique se trouve dans la membrane - la partie saccharidique vers lextrieur

saccharide

LPS
lipide

lipopeptides

La membrane externe est plus rigide que la membrane cellulaire, elle assure donc un rle de protection contre les agressions extrieures. 7

Il ne fait pas oublier les protines prsentes dans la membrane externe pour le transport. Le priplasme Il correspond lespace entre les deux membranes qui forme un compartiment aqueux. Il abrite des protines de transport et la dgradation intermdiaire de mtabolites rentrs. Ces mtabolites permettent la rsistance certains antibiotiques. Le peptidoglycane Il est aussi appel murine et tient le rle de paroi. Il forme un rseau, une maille protgeant la bactrie contre lclatement dans les milieux hypotoniques. Il est constitu dun enchanement de glycanes relis par des ponts peptidiques. Le peptidoglycane peut prendre des formes diffrentes qui expliquent les diffrentes morphologies bactriennes. Les bactries avec deux membranes (membrane cellulaire + membrane externe) sont appeles Gram ngatif (rappel : rose). Les bactries sans membrane externe sont appeles Gram positif (rappel : violet). Attention, elles possdent tout de mme un peptidoglycane trs pais alors que celui des Gram est fin. Le LPS est absent mais on note la prsence dacides lipotechoques et techoques. b. Le cytoplasme Le nuclotide La bactrie possde un chromosome unique, circulaire et compact comme chez les eucaryotes une diffrence prs, ce ne sont pas les histones qui assurent la condensation de lADN mais des protines spcifiques. Le chromosome baigne directement dans le cytoplasme. Le nuclotide correspond au chromosome + les protines de condensation. A la diffrence des eucaryotes, lARNm des bactries ne subit pas de maturation. LARN et la protine sont simultanment fabriqus grce cette tape manquante. Il y a donc couplage transcription / traduction. Autour se trouvent toutes les enzymes. On peut noter labsence de rseaux de filaments mais le chromosome serait reli la membrane cellulaire et donc les deux cellules filles auraient la moiti du chromosome. 8

Les ribosomes se retrouvent libres dans le cytoplasme et associs la membrane cellulaire. 70 s (Swedberg qui correspond au coefficient de sdimentation) qui se spare en 30 et 50 s alors que chez les eucaryotes la taille du ribosome est de 80 s qui donne 40 / 60 quand il est spar. 2. Les structures facultatives a. Les structures externes Elles concernent aussi bien les bactries Gram + et Gram -. Les structures externes sont au-del de la membrane externe (G-) ou du peptidoglycane (G+). La couche S Elle se situe par-dessus la membrane externe. La couche S sert de protection et est constitue de la polymrisation dune protine unique. La capsule Sil y a prsence dune couche S, la capsule se trouve au dessus de cette couche S. Elle est plus paisse que la couche S, cest une protection supplmentaire. Elle est constitue dun enchanement de polysaccharides. Pour chaque espce, la capsule est de structure saccharidique diffrente. La capsule ne protge pas de la mme faon les organismes pathognes et ceux vivant dans le milieu extrieur. Pour les pathognes, elle assure une protection contre les dfenses de lorganisme et vite la phagocytose par les macrophages. Dans le milieu extrieur, elle permet de rsister la dessiccation et de rsister aux temps de scheresse. Elle ralentit la pntration des dtergents et freine lentre des bactriophages. Les fibrilles et pilis Ce sont des appendices qui dpassent de la cellule. Lancrage soit partir de la membrane externe soit partir de la membrane cellulaire. Ils sont constitus dune protine unique polymrise. Ils ont une fonction dadhsion, de reconnaissance : ex. dans des tissus animaux sur lesquels la bactrie doit se fixer. Les pilis sexuels permettent la reconnaissance entre bactries qui permet de transfrer du matriel gntique dune bactrie une autre. Cela explique la dissmination de la rsistance aux antibiotiques. 9

 Les flagelles Cest un organe locomoteur. Le flagelle est constitu dun disque de protine dans la membrane cellulaire et dun dans la membrane externe. Une protine est associe lensemble dans le priplasme et dans le cytoplasme. La partie du flagelle dpassant de la cellule est constitue dune protine polymrise. Le flagelle tourne et propulse la bactrie. b. Les structures internes Le plasmide Il possde des fonctions diverses. La possession dun plasmide signifie pour la bactrie lacquisition de fonctions supplmentaires (ex. les gnes confrant la rsistance certains antibiotiques). Il peut coder pour : - la synthse de protine toxique pour les autres bactries qui confre un avantage pour la comptition vis--vis de la nourriture - certaines bactries pathognes, le plasmide regroupe tout ou partie des gnes de virulence Dfinition du plasmide : lment dADN extra chromosomique facultatif rplication autonome. 3. Les diffrences entre bactries et eucaryotes Absents chez les bactries : noyau, introns, nuclole, mitochondrie, chloroplaste, cholestrol, triglycrides, rticulum endoplasmique, appareil de Golgi, lysosomes, proxysomes. Prsents chez les bactries : peptidoglycane, mtabolisme extrmement diversifi. La miose est absente de chez la bactrie car il ny a pas de reproduction sexue. La mitose nexiste pas non plus mais la bactrie se divise quand mme. Chez les bactries, tout se fait en continu mais le contrle reste strict. Quand une cellule fille vient de se sparer, elle rplique son ADN en mme temps que tout. Une fois que sa taille a doubl, elle se divise. Le temps de gnration est beaucoup plus court (en grande majorit).

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C. INFLUENCE DE LENVIRONNEMENT 1. La morphologie Elle relve de lvolution long terme. Une fois adapte, la morphologie ne change pas. Parfois le milieu peut varier. Ladaptation court terme se fait par rgulation de lexpression gntique. Lorsque les conditions varient, il y a essai dadaptation pour ne pas disparatre. Les bactries sont capables de vivre dans des conditions hostiles, elles sont alors appeles extrmophiles. a. La taille Il existe un panel de taille : la plus petite mesurant 0,2 m et la plus grande 1 mm. La taille moyenne qui correspond la grande majorit des bactries est de 1 3 m. b. Les formes cellulaires Les diffrentes formes sont classes en 2 catgories, elles mme classes en plusieurs sous catgories. - Coques : diplo, ttrade, chanette, grappe - Btonnets / Bacilles : isol, paire, chanette, virgule (vibrion), Y, filament et hyphe (ex. Streptomyces), spirale (ex. Treponema, Spiroplasma), spirilles flexibles, spirochtes rigides. Bourgeon + hyphe (ex. Hyphomicrobium), pdoncule non vivant (ex. Galionella), bactrie carre de Walsby (lac trs sal). c. Les formes coloniales

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Les bactries ne sont pas entasses les unes sur les autres dans une colonie. 2. Les paramtres physico-chimiques a. La temprature Les tempratures cardinales Vitesse de croissance

Min

Optimale

Max

TC

On obtient globalement toujours la mme courbe. Les bactries sont dpendantes de la temprature extrieure. Avec une augmentation de la temprature de 10C, on double la vitesse de fonctionnement des enzymes. En thorie, cest vrai ! Mais dans la pratique, lorsque TC max est dpasse, les protines sont dnatures. Les lipides prsents dans les membranes vont se liqufier. A TC min, les enzymes ne sont pas dnatures mais elles sont figes. Les lipides sont aussi figs donc les changes avec le milieu extrieur sont impossibles. Les bactries ne sont pas dtruites quelques degrs en dessous de la TC min. La gamme de temprature stend en gnral sur environ 30C.

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 Les psychrophiles Min = -5C bactries dans la glace, aux ples mais majoritairement Max = +20C dans les mers (vivent 5C). Opt = +15C Les bactries ne se trouvent pas forcment leur optimum. Les psychrotropes Min = 0C systmes de rfrigration (nouveaux biotopes pour elles) Max = +35C intoxications alimentaires Opt = +25C Les msophiles Min = +15C Max = +45C Opt = +25C bactries pathognes des mammifres bactries commensales et symbiotiques

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 Les thermophiles Min = +45C Max = +80C Opt = +65C Les compostes, fumier ; bactries participant la dgradation des vgtaux conduite deau chaude

Les hyperthermophiles Min = +65C Max = +105C Opt = +95C bactries rare en terme de nombre despces milieu hydrothermal profond, volcans en activit

Thermus aquaticus possde une ADN Polymrase thermorsistante, celle-ci est utilise en PCR. b. La pression Elle est de plus de 250 atm dans les ocans, les bactries vivant dans ces conditions sont les hyperthermophiles. Les psychrophiles supportent aussi de fortes pressions. Les bactries supportant de fortes pressions sont appeles des barophiles. La majorit des bactries vivent une pression atmosphrique normale d1 atm. c. Loxygne LO2 est le meilleur accepteur terminal dlectrons dans le monde vivant.

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 Les arobies strictes (AS) Les anarobies facultatives (AAF) Sil ny a pas doxygne, les bactries AAF sont capables dutiliser dautres accepteurs dlectrons. Les arotolrantes (AA) Elles ne sont pas capables dutiliser loxygne comme accepteur mais sa prsence ne les drange pas. Les anarobies strictes (AAS) Elles sont dtruites par la prsence dO2 gazeux. Les microarophiles Elles sont dtruites sil y a 21% dO2 et aussi si 0% dO2. Elles ont besoin pour crotre de 2 10 % dO2. La toxicit de loxygne Cest une molcule hautement toxique mais pas en elle-mme, lO2 est stable. En prsence dautres molcules, les drivs de lO2 sont toxiques car instables comme les radicaux libres qui se complexent dautres molcules. Elles sattaquent aux macromolcules de la cellule. Tous les tres arobies ont mis au point un systme pour dtoxiquer lO2 toxique. Il existe 2 drivs importants de lO2 : - O2 + e- O2-. Radical superoxyde + O2 . + e + 2H H2O2 peroxyde dhydrogne - OH. Radical hydroxyle Dgradation du O2-. 2O2-. + 2H+ O2 (gazeux) + H2O2 superoxyde dismutase 2H2O2 Catalase 2H2O + O2 (gazeux) 2H2O + NAD+ Peroxydase 15

Ou H2O2 + NADH + H+

d. Le pH Les acidophiles pH : 1 5,5 dveloppement dans lacide sulfurique

Les neutrophiles pH : 5,5 8 Les alcalophiles pH : 8 10 e. Lactivit de leau Elle traduit la quantit dlments dissouts dans leau. Lactivit de leau pure est gale 1. Plus il y a dlments dissouts plus lactivit de leau chute. Lactivit de leau de mer est de 0,98. La majorit des bactries se dveloppe entre 1 0,98. Plus on baisse lactivit de leau, moins il y a despces qui survivent. Ex. conservation des aliments par la salaison. 3. La nutrition a. Varit des sources nutritives Nimporte quelle source carbone qui existe sur Terre convient lensemble des bactries. Il peut exister 100 sources de carbone diffrentes pour une seule espce. Des gnes sont induits selon la prsence de la source de carbone. Il existe dautres extrmes, par exemple 1,2 ou 3 sources de carbone pour une espce. Certains parasites des mammifres ne consomment que les acides gras des htes contamins. Certaines bactries sont capables de dgrader le caoutchouc. Depuis une centaine dannes, lHomme a invent des molcules qui nexistent pas dans la Nature. Les bactries ont russi parfois sy adapter. b. Les sources de carbone, dnergie et dlectrons * Carbone : - autotrophes : CO2 - htrotrophes : molcules organiques rduites

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* Energie : - phototrophes : lumire - chimiotrophes : molcules rduites organiques ou inorganiques * Electrons : - lithotrophes : molcules inorganiques rduites - organotrophes : molcules organiques rduites c. Les 4 types nutritionnels * Autotrophes photolithotrophes CO2, lumire, molcules inorganiques rduites (H2O, H2S, H2, S ...) * Autotrophes chimiolithotrophes CO2, molcules inorganiques rduites * Htrotrophes photorganotrophes Molcules organiques rduites, lumire * Htrotrophes chimioorganotrophes Molcules organiques rduites D. ADAPTATION AUX STRESS ET FORMES DE VIE 1. Oxydatif, radioactif Oxydatif : radicaux libres de lO2. Stress physique ou chimique qui endommage le matriel gntique. Stress de temprature. 2. Losmorgulation a. Dfinition La cellule baigne dans un milieu osmolarit constante chez les eucaryotes. Losmolarit a un rapport avec lactivit de leau. Dfinition : pression osmotique (varie en fonction des molcules qui sont dissoutes) dune solution une temprature particulire. Calcul : Sommes des concentrations des soluts osmotiquement actifs dans la solution ; unit : osM Ex. saccharose 0,5 M 0,5 osM NaCl (Na+ + Cl-) 0,5 M 1 osM Attention, il ne faut pas confondre osmolarit et force ionique.

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b. Rle de losmolarit Cest un lment fondamental. Une cellule bactrienne en croissance dans un milieu favorable va faire rentrer dans ions mais galement entrer de leau qui participe aussi laccroissement de la cellule. Le pourcentage deau lintrieur de la cellule reste constant. Le dveloppement nest correct que dans des milieux hypotoniques. Le cytoplasme doit rester hypertonique quel que soit losmolarit du milieu extrieur. Le diffrentiel entre lextrieur et la bactrie est de 3 10 atm. La bactrie nclate pas grce au peptidoglycane. Eau pure : 0,1 atm Eau de mer : 28 atm La bactrie est capable de rsister une pression de 100 atm. Pour fabriquer des milieux de diffrentes osmolarits, on utilise le NaCl. c. Losmotolrance Les non-halophiles Ce sont les organismes qui rsistent le moins aux hautes concentrations en NaCl. [NaCl] max = 1,4 M Optimum = 0,2 0,3 M Les halotolrants [NaCl] max = 2,6 M Optimum = 0,5 0,7 M eau de mer Les halophiles extrmophiles Optimum = 2,6 5 M

Les bactries telluriques voient varier les conditions dosmolarit par la mtorologie. En effet, sil pleut abondamment losmolarit va baisser alors que si le temps est la scheresse losmolarit va augmenter. Les bactries vivent dans plusieurs milieux diffrents et peuvent donc sadapter en faisant des cycles. Ex. E.coli vit dans 2 types denvironnements Eau presque pure tube digestif (milieu de haute osmolarit) On boit leau 18

d. Laugmentation de losmolarit Les effets sur la bactrie

Ex. Bactrie G+ osM H2O

La perte deau signifie que le contenu cytoplasmique sera plus concentr et que son volume va diminuer augmentation interne de losM. Cette situation nest plus favorable la croissance. Laugmentation de losM entrane une rduction du mtabolisme, la rduction ou larrt de la synthse des acides nucliques et des protines ce qui entrane la rduction ou larrt de la croissance et de la division cellulaire. La respiration est dfaillante. La rponse primaire Lobjectif est de retrouver la turgescence normale (regagner leau perdue !) en accumulant lintrieur du cytoplasme une certaine quantit dions. a ne sera pas le Na+ car il est toxique, on lui prfrera lion K+ mais jusqu une concentration de 0,5 M car sinon il devient lui aussi toxique. Un ion contraire est galement accumul, il sagit dun acide amin, en gnral le glutamate. 2 fonctions acides. Au pH physiologique de la cellule, il y a au moins une fonction COOH COO-. Llectroneutralit est respecte. Dans un grand nombre de cas, la rponse primaire est sufisante. La rponse secondaire Elle achve ce que lion K+ avait commenc. Elle consiste en laccumulation dans le cytoplasme de grandes quantits de molcules (rle analogue celui du K+). Ces molcules sont appels des osmoprotecteurs (ou soluts compatibles) et comportent des caractristiques particulires. Ils sont accumulables massivement sans causer de tort la cellule et possdent une grande solubilit (au moins 600 g/L). Ce sont principalement des acides amins (proline ++++), des drivs dacides amins (driv trimthyl : la btane), des monosaccharides et des disaccharides et exceptionnellement de lure. La glycine btane est le meilleur osmoprotecteur connu. (Rappel de la formule de la glycine H2N CH2 COO-)

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CH3 CH3 CH3

+ N CH2 COO-

Formule de la glycine btane

Elle est soit synthtise, soit accumule partir du milieu extrieur grce aux transporteurs. Le meilleur osmoprotecteur dorigine disaccharidique est le trhalose (sucre non-rducteur, glucose 1,1 glucose). La btane est le produit de dgradation des protines. Elle est prsente dans le milieu extrieur grce aux urines des mammifres. En fonction des transporteurs, diffrentes molcules seront transportes.

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e. La baisse de losmolarit Les effets sur la bactrie

H2O osM

Il y a accumulation de leau dans le cytoplasme qui entrane la dilution du contenu cytoplasmique et laccroissement du cytoplasme. La baisse de losM a les mmes effets que sa hausse. La rponse primaire Il faut faire sortir de leau. 1er systme : aquaporine : leau diffuse librement travers les membranes physiologiques normalement. Mais pour une expulsion, des protines de transport spcifiques permettent dexpulser leau. 2me systme : canaux meccano sensibles qui permettent lexpulsion dions, de petits peptides et deau. 3me systme : efflux spcifique qui correspond lexpulsion des osmoprotecteurs qui aveux eux entraneront de leau. La rponse secondaire Les canaux meccano sensibles font perdre les ions ncessaires et indispensables au mtabolisme. Donc la rponse secondaire consiste en la recapture de ces ions. f. La rgulation des systmes dosmorgulation et la perception de losmolarit Il est important aussi de percevoir lamplitude du changement dosM. Habituellement une molcule correspond un rcepteur modulateur. Mais losM ne correspond pas une molcule unique. Les variations dosM ne sont pas repres par une molcule. - Cytoplasme : interactions entre les protines et lADN varient sil y a modification de la concentration du contenu cytoplasmique. La variation de la compaction de lADN rgule certains gnes de losM.

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- Membrane : membrane distendue ou comprime (variation de llasticit de la membrane active les canaux meccano sensibles) de +/7%. g. Losmorgulation dans la pathogense E. coli non pathogne est diffrente de lE.coli pathogne. Certaines souches infectent le tractus urinaire. Ces souches possdent une surexpression des transporteurs dosmoprotecteurs. Elles peuvent donc bien sadapter lurine. Glycine btane se trouve dans lurine !!! S.aureus provoque des endocardites. Si on dtruit le systme dosmoprotection on diminue la virulence de cette bactrie pathogne. Chez L.monocytogenes, linactivation des gnes du transport de la glycine btane fait baisser la virulence. h. Losmorgulation dans lindustrie Elle permet de synthtiser de la btane en grande quantit. Une bactrie dans un milieu de haute osM sans osmoprotecteurs va accumuler des btanes. Aprs centrifugation des bactries, on les rcupre. On les soumet un plongeon brutal dans un milieu de basse osM ce qui a pour effet dactiver les efflux spcifiques et le relargage des btanes. Les bactries subissent des cycles alternant haute et basse osM. 3. Les formes de vie a. Le plancton et les colonies Les bactries libres dans un milieu libre entranent le trouble de ce milieu. Les bactries se trouvent sous forme planctonique. Avantage : les bactries sont directement au contact du milieu et donc des lments nutritifs. La croissance est plus rapide. La protection est assure par leur enveloppe. Elles restent tout de mme sensibles aux antibiotiques et aux dtergents. Les bactries fournissent une excellente source de nourriture pour les eucaryotes volus et les protozoaires. Les bactries ne peuvent rsister la prdation. b. Les biofilms Cest la forme de vie prdominante. Cette structure est labore par les bactries pour assurer leur protection. La rsistance aux antibiotiques est accrue ainsi quaux rayonnements ionisants. 22

Cette structure empche galement la prdation. Inconvnient : la disponibilit des nutriments est rduite. La croissance des bactries est lente. Llaboration dun biofilm se droule en plusieurs tapes. Les biofilms ncessitent la prsence dun substrat solide. Les surfaces varient selon les bactries : caillou au fond de leau ; tissu humain, animal ou vgtal si la bactrie est pathogne ; verre, plastique ; intrieur des cathters ...

1 : fixation grce des structures (pili, fibrilles ...) ou grce des protines dadhsion. Etape rversible. 2 : multiplication et synthse / scrtion de polysaccharides qui vont entourer la petite colonie. La gangue visqueuse constitue la principale protection. 3 : rpartition dans tout le biofilm. Ici, il ny a quune seule espce mais il existe des biofilms constitus de bactries qui travaillet en synergie et sincrustent dans dautres microorganismes. Les canaux lintrieur du biofilm permettent la circulation des nutriments, la protection en est un peu diminue. Laccumulation des bactries dans le biofilm conduit une saturation. 4 : destruction partielle du biofilm pour liminer lexcdant, puis reconstruction du biofilm. Dgradation une certaine concentration en bactries. c. Les capteurs de quorum Ils permettent aux bactries dvaluer leur nombre, de savoir si elles sont au dessus ou en dessous de la concentration de dsagrgation. La connaissance est apporte par lintermdiaire dune molcule chimique. Celle-ci est produite et scrte de manire constante. Le nombre de bactries augmente, la concentration de molcule dans le milieu extrieur augmente. La concentration en molcule signale que la 23

concentration en bactries est arrive au point ncessaire pour le processus de dsagrgation. En dessous dune certaine concentration, la molcule nest pas reconnue. A une certaine concentration, la bactrie aura les rcepteurs de cette molcule et exprimera les gnes pour synthtiser les enzymes qui dgraderont la paroi du biofilm. E. LES METABOLISMES 1. La fourniture dnergie a. Rappels Les sources dnergie Soleil, molcules organiques ou inorganiques rduites Les donneurs dlectrons Molcules organiques ou inorganiques associes de la lumire ou une molcule chimique (idem que pour lnergie). Les accepteurs dlectrons Selon leurs natures, ils conditionnent la voie pour le mtabolisme. - respiration arobie : accepteur dlectrons = O2 - respiration anarobie : NO3 nitrates, SO4 drivs sulfurs, Fe3+ ions molcules inorganiques / fumarate, TMAO molcules organiques Production leve de molcules dATP mais les accepteurs sont varis donc les rendements sont diffrents. - fermentation : alcoolique ou lactique. Les donneurs dlectrons sont uniquement des molcules organiques. Le rendement nergtique est ridicule (5 8 infrieur). Le plus important, cest la nature de la molcule qui accepte les lectrons. Pour la respiration, elle est exogne alors quelle est endogne (molcule synthtise par la cellule) lors de la fermentation. La molcule endogne correspond au substrat qui au cours de sa dgradation pour fabriquer de lnergie va fournir un intermdiaire qui servira daccepteur dlectrons. Les sources de carbone Photosynthse ou CO2

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 Loxydo-rduction

Donneurs de- molcules rduites/accepteurs de- molcules oxydes e- cds Les lectrons sautent de molcule en molcule. Plus il y a de diffrence de potentiel doxydo-rduction, plus les lectrons sauteront longtemps plus ils pourront fournir dnergie.

Les bactries se caractrisent par leur catabolisme. Lanabolisme est quivalent chez les bactries et les eucaryotes.

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b. La production dnergie : les diffrents cas Molcules organiques rduites Oxydation Respiration Fermentation Molcules inorganiques rduites Oxydation Respiration Production dnergie NAD+ NADH + H+ Rgnration constante de NADH Accumulation du NAD+ Molcules organiques/inorganiques Photosynthse Production dnergie NAD+ NADH + H+ Accumulation du NAD+ Rgnration constant du NADH

Production dnergie Accumulation NADH + H+ Rgnration constante du pool de NAD+ NADH + H+ NAD+ Rle principal de la respiration et de la fermentation

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c. Loxydation de molcules organiques La glycolyse Les bactries peuvent se passer dune partie de la glycolyse. Les deux parties sont indpendantes : - molcules en C6 : partie haute qui consomme de lnergie - partie basse qui permet la production dnergie

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 La voie des pentoses

Cest la voie utilise dans les vois anaboliques. La Glycraldhyde-3-P (G3P) peut entrer dans la partie basse de la glycolyse. Bilan de production : 1 ATP.

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 La voie KDPG

Bilan de production : 1 ATP. 1 NAD+ dpens dans le cycle KDPG, 1 NAD+ dpens dans la partie basse de la glycolyse.

29

 Le bilan La voie des pentoses et la voie KDPG permettent lentre dans la partie basse de la glycolyse qui produit de lnergie. Glycolyse 2 G3P Pentoses G3P

2 Pyruvates Energie : 2 ATP formes Co-facteurs : 2 NADH.H+

1 Pyruvate Energie : 1 ATP forme Co-facteurs : 3 NAD(P)H.H+ KDPG

G3P Pyruvate Pyruvate

Energie : 1 ATP forme Co-facteurs : 2 NAD(P)H.H+ Le pyruvate est li la rgnration du co-facteur. Pour les respirations, la NADH est utilis au dbut de la chane dlectrons. Le gradient lectrochimique de protons permet la production dATP (34/36 ATP). Entre le glucose et le pyruvate, la diffrence doxydo-rduction est faible donc la fermentation produit peu dnergie.

30

 Les fermentations Homolactique Glucose C6 2 ATP, 2 NADH.H+

2 Pyruvates C3
NADH + H+

Stock de NAD+ rgnr Bilan net 2 ATP

NAD+

2 Lactates

C3

Les bactries sont capables de crotre mais leur croissance est lente.

31

 Htrolactique

Xylulose 5P

C5

driv de la voie des pentoses

AcetylP
ADP ATP

C2
Pi

CoASH

G3P C3 2 ATP 1 NADH.H+

Actate C2
NADH + H+

ActylCoA C2 Pyruvate
CoASH

C3

NAD+

EtOH C2

Lactate

C3

Bilan net 1-2 ATP Grande partie du NAD+ rgnr

Bilan net 1 ATP car 1 ATP utilis dans la voie des pentoses

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 La fermentation des acides mixtes Glucose

2 NADH.H+

C6
2 ATP

NADH.H+ NAD+

2 Pyruvates C3
CoASH Pi CoASH

CO2 + H2

HCOOH ac. formique

Lactate C3

ActylCoA
NADH.H+ NAD+

C2
CoASH

ActylP C2
ADP

Actaldhyde C2
NADH.H+

ATP

NAD+

Actate C2 2,5 ATP produites 2 NAD+ rgnrs Dans le meilleur des cas

EtOH

C2

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 La fermentation butanediolique Glucose

2 NADH.H+

C6

2 ATP

2 Pyruvates C3

CO2 C1

Actolactate

C5

CO2

C1

Actone

C4
NADH.H+

NAD+

2,3 butanediol

C4

Si lon ne regarde que la voie nergtique, le NADH.H+ saccumule mais, il existe des interconnexions avec dautres chanes qui rgnrent le NADH.H+. Dautres bactries nont pas besoin de sucre mais dacides amins quelles trouvent partir de la dgradation des protines.

34

 La fermentation de Stickland Alanine

H2O

C3

NAD+

NH3

NADH.H+

Pyruvate C3
CoASH H2O CO2 NADH.H+ NAD+

ActylCoA C2
Pi

CoASH

ActylP C2
ADP

ATP

Actate Equivalente la glycolyse 2 NADH.H+ rgnrer 1 ATP produite

C2

2 Glycines C2
2 NADH.H+

2 NAD+

2NH3

2 Actates C2 Bilan final : 1 ATP produite 35

 La rtrogradation malolactique Le malate ou acide malique possde deux fonctions acides. Il se trouve en abondance dans les vgtaux donc en abondance dans le raisin. Les armes qui sont des drivs phnoliques sont sensibles lacidit. Une grande quantit de malate est convertie en lactate. On relve le pH pour empcher la dgradation des drivs phnoliques. Malate C4 H+ COOCHOH CHOH CH2 H+
-

Lactate C3 +

CO2(g) C1

COO-

CO2(g)

CH3

COO

Il y a intervention de diffrents composs membranaires.

Milieu extrieur

Malate (2-) Lactate (1-) + + + + H H H H H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

ATPase

Transporteur / Echangeur
Membrane cellulaire

- - - - - - - - - - - - - - - - - - ATP Malate (2-) ADP H+ Lactate (1-)

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 La respiration On rencontre la mme problmatique que pour la fermentation. Il y a ncessit de rgnrer le NADH.H+ et de recycler le pyruvate. Le cycle de Krebs 4 NADH.H+ par cycle de Krebs. 2 cycles car il y a production de 2 pyruvates donc 8 NADH.H+ + les 2 NADH.H+ de la glycolyse 10 NADH.H+ rgnrer.

Priplasme

2H+ H+ H+ H+

2H+ H+

2H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ ATPase
Membrane cellulaire

accepteur NADH.H+ ATP

Cytoplasme

ADP Pi

Protines FAD, NAD, FMN et Coenzyme Q permettent de capturer des protons et des lectrons. Les Cytochromes et les protines centre Fe/S permettent de ne fixer que des lectrons. Ces deux groupes diffrents vont se retrouver en alternance dans la chane dlectrons. La respiration arobie NADH + H+ O2 + 2e- + 2H+ O2 + NADH.H+ NAD+ + 2H+ + 2eH2O NAD+ + H2O

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o E.coli haut pourcentage dO2 (NADH) FD : flavoprotine Q : Coenzyme Q NB : Cyt O possde une faible affinit pour lO2. 2H+
Priplasme

2H+
QH2

Pompe H+

2eFD Fe/S

2e2e2eQ1

2e-

t b
X2

Cyt b 562

Cyt O
X2

2eFADH2 FAD+ 2H+ 2H+ + O2 H2O

NAD+

NADH.H+

Cytoplasme

o E.coli bas pourcentage dO2 (NADH) NB : Le Cyt d possde une forte affinit pour lO2.

Cyt b 558

Cyt b 595

Cyt d

Partie idem que la figure prcdente

2e-

2e-

X2

X2

X2 2e-

2H+ + O2

H2O

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o Paracoccus (NADH/O2)

Cyt C X2

2e

Cyt b X2

Cyt C X2 Fe/S

Cyt a 2e

Cyt a3 X2 2e-

X2

2H+ + O2 o Paracoccus (CH3OH/O2) O2 CH3OH 2e

Priplasme

H2O

HCHO
-

CO2 + H2O

2H+ CytC X2 CytC X2

Membrane cellulaire

Cyt a X2

Cyt a3 X2

Cytoplasme

O2 + 2H+

2e-

H2O

CH3OH O2 + 2e- + 2H+ CH3OH + O2

HCHO + 2e- + 2H+ H2O HCHO (formol) + H2O

Effet Pasteur : la fermentation produit moins dnergie que la respiration, on peut le visualiser par un dosage des sucres. 39

 La respiration anarobie o TMAO + 2H+ 2eCyt C X2 E.coli (NADH/TMAO TriMthylAmineOxyde) TMA + H2O
Priplasme

Membrane cellulaire

Cytoplasme

NADH.H+ TMAO + 2e- + 2H+ NADH. H+ + TMAO o

NAD+ + 2e- + 2H+ TMA + H2O NAD+ + TMA + H2O Paracoccus (NO3/N2)

E.coli est une bactrie assez adaptable car elle est capable elle aussi dutiliser le NO3.

40

Bilan : NO3NADH.H+ NO3- + 2e- + 2H+ NADH.H+ + NO31/ 2 NADH.H+

3 +

NO2NAD+ + 2e- + 2H+ NO2- + H2O NO2- + NAD+ + H2O 2 NAD+ + 4e- + 4H+ Nar 2 NO2- (nitrite)+ 2H2O 2 NO (oxyde nitrique) + 4H2O

2/ 2 NO (nitrate) + 4e + 4H Nar : nitrate rductase 3/ 2NO2- + 4H+ + 4eNir : nitrite rductase

Nir

Loxyde nitrique est un puissant bactricide et un vasodilatateur donc il entrane une hypotension. Il est synthtis par les macrophages en cas de septicmie. Au cours dun choc septique, lhypotension gnre peut engendrer la mort. Nor + 4/ 2 NO + 2e + 2H N2O (oxyde nitreux) + H2O Nor : oxyde nitrique rductase Nos 5/ N2O + 2H + 2e Nos : oxyde nitreux rductase 2 NADH.H+ + 2 NO3- + 8 H+ + 8 eo NO3NADH.H+ Fumarate + 2H+ + 2eNADH.H+ + Fumarate
+ -

N2 (gazeux) + H2O 2 NAD+ + N2 (gazeux) + 6 H2O

Cas du fumarate NO2NAD+ + 2e- + 2H+ Succinate NAD+ + Succinate

41

Cas du sulfate Le sulfate ne peut tre utilis comme accepteur dlectrons, il faut activer la molcule do le besoin dnergie. APS : Adnosine PhosphoSulfate DSH : Dshydrognase
8H+

Hydrognase

8e-

Complexe cytochrome

Lactate DSH

SO42ATP APS

ADP

ATP

4 Lactates

Pyruvate + 4H2

2e

AMP 6e
-

SO32-

8H+

H2S

42

Bilan, rsum Oxydation de molcules organiques Glycolyse, voie des pentoses, KDPG Respiration Pyruvate Krebs Arobie CH3OH/O2 Fermentation ATP NAD+ rgnr Respiration Arobie Anarobie ATP NAD+ Anarobie Lactate /SO42-

43

d. Loxydation de molcules inorganiques Introduction et problmes Peu de bactries sont capables de coloniser des endroits invraisemblables. Le problme pour les molcules inorganiques est diffrent de celui des molcules organiques. Lentre se fait directement dans la chane des lectrons donc il ny a pas de NAD+ rgnrer. Le problme se pose au niveau de la synthse des molcules carbones. Exemple avec les htrotrophes qui utilisent le CO2. Le problme se pose pour le donneur dhydrogne : solution NADH.H+. Mais on ne fabrique pas le NADH.H+, il va falloir trouver un moyen de le faire. La respiration arobie Hydrogne / O2

H2 est le meilleur donneur dlectrons. Hydrognase H2 NAD+ + 2H+ + 2eNADH.H+ O2 + 2H+ + 2eH2 + O2 2H+ + 2eNADH + H+ NAD+ + 2H+ + 2eH2O H2O

Soit hydrognase NAD+ soit hydrognase CoQ (CoQ CoQH2). Cette dernire ne permet pas la fabrication de NADH.H+. Drivs azots / O2

Nitrite (NO2-) ou directement lammoniaque (NH3) NO2- + H2O O2 + 2H+ + 2eNO2- + O2 NH3 + 2H2O O2 + 7H+ + 6eNH3 + O2 NO3- + 2H+ + 2eH2O NO3NO2- + 7H+ + 6e3H2O + H+ NO2- + H+ + H2O Acide nitreux 44

Le flux inverse dlectrons : la remonte des lectrons va coter de lnergie mais cest le prix payer pour synthtiser du NADH.H+. Malgr tout le bilan nergtique est positif. Drivs soufrs / O2

Lhydrogne sulfur est prsent naturellement dans le milieu. H2S O2 + 2H+ + 2eH2S + O2 S + 2H+ + 2eH2O S + H2O

Il y a possibilit dutiliser le soufre directement. S + 4H2O O2 + 8H+ + 6eS + O2 + H2O SO42- + 8H+ + 6e3H2O + 2H+ SO42- + 2H+ Acide sulfurique

Pour les sulfites, il y a gnration dnergie sans passer par la respiration. 2 SO32- + 2 AMP 2 APS + 2 Pi 2 ADP SO32- + H2O O2 + 2H+ + 2eSO32- + O2 APS 2 ADP + 2 SO42AMP + ATP SO42- + 2H+ + 2eH2O SO42-

45

Fer / O2

Le fer est mal plac comme donneur dlectrons car il est juste au dessus de lO2 (dans la tour des lectrons) qui est un accepteur. Le rendement est faible mais dans un environnement spcifique la solution est trouve dans le flux inverse dlectrons. Raction spontane dans le milieu extrieur : FeS2 + 3,5 O2 + H2O Fe2+ + 2H+ + 2ePyrite de fer fer ferreux Ractions se droulant dans la bactrie : 2 Fe2+ + 2H+ 2 Fe3+ + 2H+ + 2e O2 + 2H+ + 2eH2O 2 Fe2+ + O2 + 2H+ Raction spontane : FeS2 + 14 Fe3+ + 8 H2O 2 Fe3+ + H2O 15 Fe2+ + 2 SO42- + 16H+

Cette dernire reaction emballe le systme grce aux 16H+ et aux 15 Fe2+ ncessaires la raction effectue par la bactrie. Si le pH est suprieur 5 le fer ferreux et ferrique prcipitent. Les bactries utilisant le fer comme donneur dlectrons se dveloppent un pH de 1 pour maintenir solubles les subtrats. La respiration anarobie Hydrogne / sulfate Hydrognase 4 H2 2eSO42ATP PPi APS AMP SO328H+ + 8e6e- + 8H+ 3H2O + H2S

Drivs soufrs / drivs azots 3H2S 4 NO3- + 3S + 6H+ + 6e3H2S + 4 NO33S + 6H+ + 6e2N2 (gazeux) + 3 SO422N2 (gazeux) + 3 SO4246

e. La photosynthse Oxygnique (cyanobactries)

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 Anoxygnique

Cas de la bactriohodopsine A partir dune seule protine et de la lumire du soleil, on peut fabriquer de lnergie. La protine en question est membranaire, son tat stable est modifi par lapport de lumire.

H+

H+ Etat stable Etat exit Retour tat stable ADP H+ ATP

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f. Bilan, rsum Oxydation de molcules inorganiques Respiration Arobie Anarobie Oxygnique ATP NADPH2 NADH.H+ Photosynthse Anoxygnique

ATP Production de NADH.H+ g. Rle de lnergie

Pourquoi les bactries ont-elles dvelopp autant de systmes ? Lnergie sert tre utilise rapidement et sert la synthse des lments de base ncessaires la croissance de la cellule. Chez le bactrie : Prcurseur E Prcurseur E Nuclotides E Acide amin E ARNt E Polymrisation Protine

Beaucoup dexemples sont possibles. Lnergie intervient dans le cycle de Krebs, dans la glycolyse On assiste un enchevtrement des mtabolismes (plan Prison Break !!!) 12 mtabolites sont indispensables pour la synthse de toutes les molcules de la cellule. Quelque soit lorganisme, il faut alimenter le cycle de Krebs et la voie des pentoses partir du CO2 et du NADH.H+.

49

2. Les voies dassimilation du carbone a. Le cycle de Calvin Il charge toutes les voies cites prcdemment donc cest un cycle trs coteux en nergie.

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b. Le cycle de Krebs lenvers

c. Les ractions anaplrotiques ATP Pyruvate + CO2 + H2O ADP + Pi Oxaloactate

Loxaloactate fait parti des 12 molcules prcurseurs.

51

d. Le shunt glyoxilique Il faut viter de perdre du CO2. La bactrie est capable de pousser sur de lacide actique.

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3. Les voies dassimilation de lazote a. Lassimilation de lammoniaque Soit partir dun intermdiaire acide soit directement partir dun acide amin. NADH.H+ NAD+ Pyruvate + NH3 ATP -ctoglutarate + NH3 Glutamine + -ctoglutarate ADP Glutamine + H2O 2 Glutamates Alanine + H2O

Avec les deux premires ractions, on peut faire tous les acides amins. Transaminases Alanine (ou glutamate) -ctoacide R C COOH || O

Pyruvate (ou -ctoglutarate)

Acide amin

R CH COOH | NH2

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b. Lassimilation du nitrate NADPH2 NO3NADP+ NO2- Nitrate rductase

H2O NO23H+ + 2e[NOH] 2H+ + 2eNH2OH 2H+ + 2eH2O NH3 H2O NH2OH Hydroxylamine [NOH] Nitroxyle peu stable

c. Lassimilation de lazote molculaire N2+Nitrognase Enzyme.N---N 2H++2eEnzyme.NH=NH 2H++2eEnzyme + 2NH3 Cette chane de ractions ncessite 16 ATP. Enzyme.NH2-NH2 2H++2e-

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4. Les voies dassimilation du soufre a. Lassimilation de lhydrogne sulfur / assimilation du sulfate PPi : Pyrophosphate ATP SO42PPi APS ATP ADP NADPH2 PAPS PAP NADP+ SO328H++6e-

H2S + 3H2O H2S + Srine H2O Ou Actyl-srine + H2S Actate + Cystine Cystine

5. Les voies dassimilation du phosphore a. Assimilation par lATP ADP + Pi Cest la voie la plus utilise. ATP

b. Lassimilation par phosphorylation au niveau du substrat Glycraldhyde-3P Pi 1,3 di-P-glycrate

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F. LA CLASSIFICATION 1. La notion despce chez les bactries a. Dfinition et problmes

Il y a 7 niveaux : Domaine, Phylum, Classe, Ordre, Famille, Genre, Espce. Chez les bactries, il ny a pas de reproduction sexue donc il existe un continum volutif des espces o doit on placer lespce ?? Espce : une espce de bactrie est dfinie par un ensemble dorganismes prsentant une similarit de plus de 70% de leur ADN. Genre : un genre de bactrie est dfini par un ensemble dorganismes prsentant une similarit de plus de 25% de leur ADN. c. Les souches Souche : deux organismes qui sont trop proches pour tre considrs comme deux espces diffrentes mais qui prsentent un certain nombre de diffrences. Biovar : 2 biovars sont deux souches avec des caractres biochimiques ou physiologiques diffrents. Exemple : E.coli la plupart sont Lac+ mais quelques unes sont Lac-. La diffrence est trop faible pour crer deux espces diffrentes dans la classification. Srovar : 2 srovars sont deux souches avec des caractres antigniques diffrents. 56

Pathovar : 2 pathovars sont deux souches avec des spcificits dhtes diffrentes. Exemple : Pseudomonas syringae qui est un phytopathogne pv. Synragae pv. tomato Gnovar : 2 gnovars sont deux souches avec des squences ADN diffrentes. 2. Les mthodes danalyses a. Les chronomtres molculaires Un chronomtre molculaire doit tre le reflet de lvolution de lorganisme considr. On prendra toujours une protine ou de lADN (par nimporte quel gne ni nimporte quelle protine). Ce choix influe sur larbre phylogntique. Critres : - une molcule qui est distribue dune manire universelle chez tous les organismes tudis - la molcule doit avoir une fonction identique chez tous les organismes tests - les molcules vont tre compares les unes aux autres, les squences vont tre alignes. Pour que lalignement soit significatif, il faut quil y ait peu de diffrences (grande conservation au cours de lvolution). La (les) molcule(s) que lon va choisir doit reflter les vnements volutifs gnraux de lorganisme test. Un gne doit reprsenter tous les autres. Exemple : E.coli 4200 gnes : 1 doit reprsenter les 4199 autres ! Plus la distance phylognique sera importante, plus la vitesse de changement des squences du chronomtre doit tre faible. Trop de changements brouillent le signal volutif. Les molcules forte pression de slection sont les gnes ou protines essentiels (tellement essentiel quen cas dabsence, on observe la disparition de lorganisme).

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LARN ribosomique est le meilleur chronomtre molculaire qui possde une structuration prcise (changement = changement de la fonction du ribosome = pas de traduction = pas de vie). b. Les mthodes de classification et didentification Dnaturation thermique de lADN On extrait lADN de lorganisme puis on le chauffe petit petit pour le dnaturer. Cette dnaturation est suivie par spectrophotomtrie = 260 nm.

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A C+G 100%
Simple brin

A+T 0%
Double brin

70

TM

100

TC

A+T > C+G TM bas C+G > A+T TM plus haut On analyse les gnomes de manire globale. Chromatographie LADN est hydrolys afin dobtenir une solution contenant les 4 bases (A, T, C et G). Cet hydrolysat est analys en HPLC : mission de 4 pics dont la hauteur est proportionnelle la quantit du composant associ au pic. Hybridation ADN/ADN On a besoin dune membrane de nylon ainsi que de lADN de deux organismes bactriens diffrents.

ADN bactrie 1

ADN bactrie 2

Sen vont au lavage Le marquage de lADN de la bactrie 2 est effectu au phosphore 32. 59

LADN de la bactrie 1 est fix de faon covalente la membrane de nylon, il ne peut donc pas se renaturer avec lui-mme. LADN de la bactrie 2 est mis en solution de faon limitante. La membrane y est plonge. On abaisse la temprature pour permettre dventuelles hybridations. Si la distance phylognique entre les deux bactries le permet, on observe une hybridation htrospcifique. On procde un lavage pour liminer lADN de la bactrie 2 non fix. On remonte la temprature et on mesure le relargage progressif de lADN de la bactrie 2 (extinction de la radioactivit). Exemples : Besoin de beaucoup de chauffage car hybridation stable

Besoin de peu de chauffage Squence Cette mthode correspond au squenage systmatique du gnome. Lorganisation gnrale des gnomes des espces peut informer sur lvolution. On compare le plus de gnes possibles entre eux. Rybotypage Il permet avec le typage multilocus de dterminer si le nouvel isolat appartient une nouvelle espce. On sintresse ici au gne codant pour le 16S, que lon amplifie par PCR. Les fragments vont subir une digestion enzymatique par des endonuclases de restriction (reconnat un point particulier de lADN) qui reconnat un pool de 6 nuclotides. Afin de visualiser les coupures , on fait migrer lensemble par lectrophorse. NB : le profil obtenu pour une espce donne sera toujours le mme.

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 Typage multilocus (MLST) On analyse 6 ou 7 gnes diffrents avec la mthode utilise ci-dessus. Le nombre de gnes augmente la fiabilit de la mesure.

Analyse des acides gras (FAME) Chez les bactries, la composition en acides gras est htrogne : C14 C18, double liaison, cycles, branches, additions de groupements (tel que lhydroxyle (OH)). Le profil en acides gras dune espce de bactrie donne sera toujours le mme. La mthode se droule comme suit : 61

- extraction des acides gras - mthylation (ajout dun CH3 du ct acide) qui rend les acides gras volatils - analyse en CPG

3. Les arbres phylogniques a. Diffrents arbres

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b. Le problme des transferts horizontaux Les transferts horizontaux correspondent la transmission de gne dune espce une autre, dun phylum un phylum, dun domaine vers un autre domaine. Certaines espces vont avoir acquis des gnes supplmentaires au cours de lvolution ce qui cre un brouillage du signal volutif. La rvlation de ces transferts ne peut se faire quaprs squenage dorganismes entiers. 4. Manuel de Bergey Il est bas sur la phylognie du 16S. 5. Des bactries pathognes a. Introduction : les tapes dune infection Problmatique : Comment fait la bactrie pour russir une infection ? 1re tape : maintenir un rservoir : un endroit pour survivre ou vivre entre deux infections 2me tape : tre transport vers son hte 3me tape : adhsion et reconnaissance, dbut de colonisation 4me tape : multiplication dans lhte (entre les cellules ou dans les cellules), chapper aux dfenses de lhte, la bactrie possde la capacit de nuire son hte 5me tape : quitter lhte une fois dtruit ou quand on ne peut plus sy multiplier Les rservoirs sont soit lenvironnement, soit lhte dfinitif soit des htes intermdiaires. Il faut savoir que des animaux qui hbergent la bactrie peuvent ne pas y tre sensible. Ils la transfrent juste vers son hte dfnitif. Adhsion, colonisation : il faut se fixer, les tapes primaires sont importantes. Si lorganisme est dcouvert trop tt, il sera limin par les dfenses immunitaires. Il y a comptition pour les sites de fixation et pour les nutriments entre les bactries pathognes et les bactries rsidentes. A la diffrence que les bactries pathognes possdent des facteurs de virulence ! La sortie de lhte signifie le succs de linfection !!! 64

b. La peste : Proteobacteria ()Yersinia pestis 1re pandmie : la Peste de Justinien pidmie : atteinte simultane dun grand nombre dindividus dun pays ou dune rgion par une maladie contagieuse pandmie : pidmie qui atteint les populations dune zone gographique trs tendue, c'est--dire un ou plusieurs continents. Premire vague : 541-544 environ 100 millions de morts (mais plus proche de 30 millions) Certains historiens pensent que cette pandmie entrana la chute de lempire romain. Larrive se fait par la Mer Rouge. 2me pandmie : la Peste mdivale Elle atteindra mme les pays nordiques. Dbut 1347 : la Crime est colonise par les gnois qui sont alors assigs par les mongoles qui amnent avec eux la Peste. ( guerre bactriologique avant lheure, les mongoles balancent des cadavres infects par-dessus les murailles). Fin : 1721 On notera une rapparition 2 ou 3 fois par sicle. 1/3 de la population europenne est dcime (44 millions de morts). En France : la guerre de 100 ans + la famine augmentent le nombre de rats (qui est lhte intermdiaire de la bactrie responsable de la Peste). La Peste est perue comme une maldiction divine par certains. Encore selon certains historiens, elle serait lorigine de la chute du systme fodal. 3me pandmie : la Peste moderne 1855 : dbut 1894 : Hong Kong 1899 : San Francisco 1900 : Rio de Janeiro 23 millions de morts La Peste : problme de sant actuel 2000 nouveaux cas / an On observe des cas de Peste en 2005 ! Yersinia pestis est une bactrie trs fragile en dehors de son hte. Son hte intermdiaire tant des rongeurs, elle peut se maintenir dans le temps car les rongeurs ne sont pas prts de disparatre de la surface du globe. 65 transport par bateaux

Yersin va Hong Kong en 1894, il sintresse la Peste. Il isolera la bactrie en culture pure. Les organismes attaqus par la Peste sont : le rat, la souris (principales cibles) et lHomme (cible accessoire). Il existe une trentaine despces de puces qui transmettent la maladie. Peste noire Puce non bloque (normale) : sang dans lintestion Puce bloque (porteuse) : la bactrie forme un biofilm dans lestomac et lintestin do le nom de bloque (sang bloqu dans lsophage). Quand la puce pique, du sang peut ressortir de lsophage de la puce et emporter au passage des Yersinia. Seules 80 bactries ingres entranent le dveloppement de la maladie. La puce meurt de faim en 2 jours.

Les bactries vont se diriger vers les ganglions lymphatiques, se multiplient et rentrent dans les cellules ganglionnaires pour se nourrir du contenu cellulaire. Lorsque ce dernier est puis, la cellule est lyse ce qui entrane la libration dans le milieu extra cellulaire. 66

Le ganglion lymphatique devient un ensemble de cellules procaryotes !! Les ganglions gonflent do le nom de peste bubonique. Peste noire car ncroses de couleur noire. Le bubon ne contient plus dlments nutritifs. Linvasion du sang entrane une septicmie (mort en 24 48h) En tout, la maladie durera 7 8 jours. Peste pulmonaire Cette forme de la maladie correspond la contamination de proche en proche. Cette version est plus rapide que la prcdente. Les arosols mis atteignent les poumons de lhte suivant circulation sanguine septicmie mort en 24 48h c. La tuberculose : Mycobacterium tuberculosis

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Le principe est diffrent de celui de la Peste. Cette bactrie prend son temps compare Yersinia pestis. Elle double son nombre en 10h car elle possde une paroi cireuse (protection de beaucoup dlments / entre difficile pour les lments nutritifs). Les dfenses naturelles de cette bactrie sont trs efficaces. Un macrophage phagocyte les bactries dans les poumons. Mais elle possde un systme qui fait quelle nest pas dtruite par la phagocytose. Elle dtruit la membrane de phagocytose puis se dveloppe dans le cytoplasme. Le macrophage envoie des signaux qui font affluer dautres macrophages ce qui a pour consquence daugmenter le nombre de bactries ! Les bactries sentourent dune couche de dbris cellulaires de macrophages, plus du collagne synthtis par lhte tubercule. Lensemble des bactries peut entrer en dormance. On peut rester porteur sain longtemps. Aprs ractivation du tubercule, les poumons sont envahis puis les bactries passent dans la circulation sanguine invasion dautres organes vitaux dont le cerveau. d. Lulcre : Helicobacter pylori Proteobacteria () Cest une des bactries responsables de lulcre de lestomac. Le pH est proche de 1, les bactries doivent aller au contact des cellules de la muqueuse qui produisent lHCl. Helicobater pylori possde une urase : O || NH2 C NH2 CO2 + 2 NH3 Lammoniaque remonte le pH donc la bactrie peut supporter lenvironnement stomacal, elle senfoui au plus profond de la muqueuse. Aprs traitement aux antiobiotiques, la gurison est immdiate. e. La shigellose Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteria sont des protobactries. Les Shigella sont proches d E.coli. Elles possdent un gros plasmide contenant tous les gnes de virulence. La cible est lintestin grle. Les cellules M ne sont pas des cellules phagocytaires, shigelle utilise un assemblage de protines (seringue) qui permet dinjecter des protines qui vont dtourner les fonctions de la cellule cible. 68

La bactrie recrute lactine qui va transformer la cellule M en cellule phagocytaire . Quand la cellule M est dtruite, les shigelles vont se retrouver dans la face interne et vont alors viter les dfenses des macrophages. Puis elles passent par les faces basales et latrales. Une fois dans les cellules, elle passe dune cellule une autre sans lyser la cellule dont elle vient de se nourrir. Le passage de cellule en cellule se fait en se projetant violemment contre la membrane en recrutant lactine qui jouera le rle de ressort. 6-7 jours plus tard, la gurison se fait toute seule dans le meilleur des cas. Malgr tout, on observe 400 000 morts par an de shigelloses. Aprs auto-gurison, lindividu reste porteur sain pendant au moins un an. Shigella scrte aussi des neurotoxines. Samonella utilisent aussi un principe de seringue similaire celui des Shigella. La seringue d E.coli ressemble un pidestal mais ne permet pas lentre dans la cellule. G. ROLE DES BACTERIES 1. La flore intestinale On dnombre 1014 bactries dans le corps humain. Les procaryotes sont 10 fois plus nombreux que nos propres cellules ! Il y a plus de 400 espces diffrentes : 99% sont anarobies strictes et 50% sont non cultivables (observables par PCR). Chaque individu possde une flore diffrente. Il existe deux types de flore : - autochtone : flore rsidente qui sest fixe - allochtone : flore de passage La flore intestinale est lie son hte : en fonction de lalimentation, de notre propre gntique. Exemple : - 2 jumeaux monozygotes : flores quasiment identiques - 2 jumeaux dizygotes : flores totalement diffrentes La symbiose ncessite des fixations par des protines et des polysaccharides qui sont diffrents pour tous ! Estomac : 15 20 min, < 103 bactries / g de contenu, bactries allochtones

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Intestin grle : - duodnum : 103 bactries / g, enzymes pancratiques et bile crent une environnement peu favorable - jejunum : 104 106 bactries / g - ileum : 106 108 bactries / g Colon : 24 72h donc les bactries peuvent se fixer, 109 1011 bactries / g Lintrt des bactries de la flore intestinale rside dans leurs fonctions mtaboliques : fermentation de rsidus non digestibles, fermentation de dchets produits. Les bactries produisent des acides gras courte chane qui sont rassimilables et des vitamines rabsorbables travers les muqueuses. Les bactries favorisent le taux de renouvellement de la muqueuse du colon et le dveloppement du systme immunitaire local qui se met en veille. Elles constituent une barrire contre limplantation dune flore bactrienne pathogne. Les principaux genres bactriens de la flore intestinale sont : - Clostridium : anarobie stricte, Gram +, rgime carn - Bacteroides - Lactobacillus et Bifidobacterium sont minoritaires La flore intestinale est dfinitive lge de 20 ans. Les antibiotiques naffectent presque pas la flore sauf si la prise est trs longue. Aprs leur arrte, la flore revient lidentique. Dans le ventre de la mre, le tube digestif est arobie. La flore du nouveaun est dorigine maternelle : si laccouchement se fait par la voie basse, il y a contamination par la flore vaginale et intestinale de la mre. 1re tape : rentre le tube digestif anarobie. Les bactries de lenvironnement (Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas ) deviennent autochtones pendant quelques jours, jusqu ce que le tube digestif devienne anarobie. Les bactries anarobies strictes sont plus adaptes. Les premires sont Lactobacillus, Bifidobacterium car pendant les premires semaines de la vie, lestomac est peu acide. Elles ont donc pu passer. Puis quand lalimentation varie, Clostridium et Bacteroides deviennent majoritaires.

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