Definiie: enzimele sunt constitueni proteici (heteroproteici) ai celulelor vii (animale, vegetale sau microbiene), care catalizeaz reaciile

metabolice de catabolism sau anabolism (sunt responsabile de majoritatea reaciilor chimice dintr-un organism). PROPRIETATI GENERALE:

Biocatalizatori cu eficien maxim, n cantiti extrem de mici (10-6 sau chiar 109) catalizeaz reacii cu viteze foarte mari; Enzimele au specificitate de aciune (induc un anumit tip de reacii: oxidoreducere, hidroliza, sintez etc.) i de substrat (acioneaz numai asupra unui reactant sau grup de substane reactante); Condiiile n care se produc reaciile catalizate enzimatic sunt compatibile cu viaa (temperatur, presiune normal, pH neutru sau slab acid/alcalin); Intervin n mecanismele de coordonare, reglare i control a reaciilor metabolice celulare.

Toate procesele semnificative ale vieii sunt dependente de activitatea enzimatic (au rol de meninere a procesului vieii - folosite tot mai mult n diagnoz i terapeutic).

Componentele macromoleculare ale majoritii enzimelor sunt proteine.

A) Dup criteriul structural: Enzime de natur proteic (pepsina, tripsina, papaina etc); Enzime de natur heteroproteic, alctuite dintr-o poriune proteic i o component neproteic (denumit coenzim sau cofactor enzimatic care poate fi reprezentat de derivai ai hemului, ai unor vitamine din complexul B, nucleotide, ioni metalici). Cele dou componente separate sunt inactive din punct de vedere catalitic. In urma cuplarii lor rezulta complexul molecular apoenzim-coenzim (holoenzima), care manifest activitate catalitic.
B) Dup organizarea lor: Enzime monomerice - constituite dintr-un lan polipeptidic; Enzime oligomerice - alctuite din mai multe lanuri polipeptidice, care n urma disocierii sau asocierii devin catalitic active. Complexe multienzimatice - formate din enzime legate prin interaciuni necovalente, care particip la producerea unor secvene de reacii biochimice consecutive i nlnuite, unde produsul rezultat n reacia catalizat de prima enzim (I) devine substratul celei de a doua enzime (II), iar produsul rezultat din aceast reacie va reprezenta substratul enzimei III, i astfel pn la realizarea ntregului ir de reacii prin care este metabolizat un component biochimic.
SUBSTRAT A enzima I SUBSTRAT B enzima II SUBSTRAT C enzima lll etc.

In reaciile catalizate enzimatic, ntr-o faz iniial, enzima formeaz cu substratul un complex intermediar, instabil, care se transform rapid, rezultnd produsul de reacie i enzima care poate iniia o alt reacie. Unele enzime, ns, pot cataliza reacii n care interacioneaz mai multe substraturi. In aceast categorie se ncadreaz transferazele, care catalizeaz transferul unei grupri chimice de pe un substrat (donor), pe un alt substrat (acceptor).

Sunt urmtorii factori: concentraia enzimei, concentratia substratului, afinitatea enzimei fat de substrat, temperatur, pH, efectori (activatori sau inhibitori), radiaii, etc.
concentraia

enzimei - ntre anumite limite, viteza reaciilor catalizate enzimatic este direct proporional cu concentraia enzimei, dar la concentraii mari de enzim, viteza rmne constant;

concentraia substratului - creterea concentraiei de substrat, induce iniial, creterea rapid a vitezei de reacie, apoi aceast cretere este lent, iar la concentraii mari de substrat, viteza de reacie atinge valoarea maxim, rmnnd constant. Relaia dintre viteza de reacie catalizat enzimatic i concentraia substratului, este dat de ecuaia Michelis-Menten:
V= Vmax [S]

KM + [S] n care, V este viteza reaciei la un moment dat; VMAX este viteza maxim de reacie (la concentraii mari de substrat), cnd enzima este saturat de substrat; [S] este concentraia substratului, iar KM este constanta MichelisMenten, moli/l.

Graficul concentraiei substratului fa de viteza reaciei

Ecuaia Michelis-Menten se prezint grafic sub forma unei hiperbole din care se poale constata: - faza cnd viteza reaciei este dependent de concentraia substratului, - faza independent de concentraia substratului, cnd viteza devine maxim i enzima este saturat de substrat. - la 1/2 din viteza maxim, corespunde o anumit valoare a concentraiei substratului, denumit KM, sau constanta Michelis-Menten, exprimat n moli/l i care indic afinitatea enzimei fa de substrat. Cu ct KM are o valoare mai mic, cu att afinitatea enzimei fa de substrat este mai mare i invers, cu ct KM are o valoare mai mare cu att afinitatea enzimei fat de substrat este mai mic. afinitatea enzimei fa de substrat;

Temperatura - pn la 60- 80C, viteza reaciilor chimice crete direct proporional cu temperatura. Temperatura optim de aciune a enzimei este valoarea temperaturii la care viteza de reacie catalizate enzimatic, are valoare maxima. La valori superioare temperaturii optime de aciune a enzimei, viteza de reacie scade rapid, datorit denaturrii termice a enzimei. Temperatura optim a enzimelor este dependent de structura chimic a enzimei, a substratului i de concentraia lor n sistemul de reacie. Activitatea majoritii enzimelor scade la temperaturi de peste 50 - 60C, totui unele enzime i menin activitatea i la valori ale temperaturii peste 60C.
Ex: papaina este o proteaz vegetal activ la 80C; peroxidaza din hrean, rmne activ la peste 100C.

pH - ul mediului influeneaz activitatea enzimelor. Exist dou valori optime de pH:

- pH optim de activitate - Valoarea pH-ului la care activitatea enzimei este maxim - pH optim de stabilitate - Valoarea pH-ului la care enzima i pstreaz activitatea n cele mai bune condiii. Cei doi parametri pot avea valori apropiate, egale sau valori diferite.

efectori (activatori sau inhibitori). Efectorii sunt reprezentai de substane chimice din mediul n care se desfoar reacia i care influeneaz activitatea enzimei. Activatorii influeneaz pozitiv reacia, pe cnd inhibitorii o influeneaz negativ. Inhibiia enzimatic poate fi ireversibil, reversibil (competitiv i necompetitiv) i alosteric.

Nomenclatura enzimelor utilizeaz 2 tipuri de denumiri: - nume uzuale sau tradiionale care se bazeaz pe utilizarea denumirii substratului urmat de sufixul az i - nume sistemice (recomandate de Comisia de Enzime) formate din numele substratului (substraturilor), tipul de reacie catalizat, urmate de sufixul az i nsoite de un cod. Codul este format din 4 cifre care reprezint clasa, subclasa, sub-subclasa i numrul de ordine, urmate de iniialele EC (Enzyme Commission).

Clasificarea enzimelor n 6 clase

CLASA REACIILE CATALIZATE -catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular; -catalizeaz transferul diferitelor grupri chimice de la un substrat donator la un alt substrat acceptor; -catalizeaz scindarea hidrolitic a diferitelor substraturi, prin adiia apei la nivelul diferitelor grupri chimice; -catalizeaz scindarea unor substraturi, mecanisme diferite fa de hidroliz; prin

oxido-reductaze

transferaze

ENZIME

hidrolaze

liaze izomeraze

-catalizeaz rearanjri intramoleculare; sunt mai multe tipuri: racemaze, cis/trans izomeraze, enzime ce produc transformri aldoz/cetoz. -catalizeaz sinteza unor noi legturi prin unirea a doi compui ntr-unui singur, utiliznd ca surs energetic ATP-ul.

ligaze sau sintetaze

Nomenclatura enzimelor
EC nr.
1.1.3.4. 1.11.1.6. 2.1.1.6. 3.1.1.3. 3.2.1.1. 3.2.1.2. 3.2.1.3. 3.2.1.4. 3.2.1.20 3.2.1.21 3.2.1.23 3.2.1.26 3.4.4.1. 3.4.4.3. 3.4.4.4. 3.4.4.5. 3.4.4.10. 3.4.4.16 5.3.1.5.

Nume sistemice
-D-Glucoz: 02 oxidoreductaza H202:H202 oxidoreductaza S-Adenosil metionin: catechol O-metiltransferaza Glicerol ester hidrolaza a-1,4-Glucan glucanohidrolaza a-1,4-Glucan maltohidrolaza a-1,4-Glucan glucohidrolaza -1,4-Glucan 4-glucano-hidrolaza - D-Glucozid glucohidrolaza -D-Glucozid glucohidrolaza -D-Galactozid galacto-hidrolaza -D-Fructofuranozid-fructo-hidrolaza -

Nume uzuale
Glucozoxidaza notatina Catalaz Catecholmetil transferaza Lipaza a -Amilaza -Amilaza Glucoamilaza, aamiloglucozidaza Celulaza a-Glucozidaza -Glucozidaza -Galactozidaza, lactaza Invertaza Pepsina Rennina, labferment, chimozin Tripsina Chimotripsina Papaina Subtilpeptidaza A, subtilizina, proteaza

D-GIucozo-6-fosfatcetol izomeraza

Preparatele enzimatice libere Preparatele enzimatice libere (neimobilizate) sunt obinute din esuturi animale (organe: ficat, cord, creier, rinichi, pancreas sau mucoas stomacal sau intestinal), produse vegetale (semine, cereale, rdcini, frunze, coaj, sev sau latex) i microorganisme (bacterii, drojdii i mucegaiuri). Avantajele oferite de utilizarea preparatelor enzimatice de origine microbian, sunt urmtoarele: Intervalul ntre generaii este sczut, comparativ cu plantele sau animalele; Obinerea culturilor microbiene implic costuri reduse; Stimularea sintezei de enzime prin optimizarea condiiilor de cultivare; Posibiliti multiple de selecie a tulpinilor nalt productive.

Selecionarea tulpinilor microbiene pentru obinerea de preparate enzimatice urmrete o serie de criterii: Sa nu fie patogene; S sintetizeze cantiti mari din enzima sau complexul enzimatic urmrit; S nu sintetizeze antibiotice; S nu posede proprieti alergene; S nu manifeste exigene nutritive crescute (s se dezvolte pe medii uzuale).

Preparatele enzimatice brute sau parial purificate, sunt utilizate n industria alimentar ca atare, fiind introduse n mediile asupra crora vor aciona.
Activitatea

enzimatic poate fi oprit, n momentul dorit, prin diferite procedee: tratament termic, modificarea pH-uIui (acidifiere sau alcalinizare). Uneori enzimele pot rmne active n produsul finit.

Aceste preparate se obin prin fixarea unei enzime sau a unui complex enzimatic la un suport insolubil n ap, fr modificarea mecanismului, specificitii i condiiilor de aciune iniiale. Avantajele oferite de preparatele enzimatice imobilizate: economie de biocatalizatori; puritatea produilor de reacie; posibilitate de control a reaciei enzimatice; productivitate crescut ntr-un interval de timp scurt; acest lucru este foarte important n industria alimentar, cnd substraturile sunt perisabile sau labile din punct de vedere chimic. Procesul de imobilizare poate interesa numai enzim izolat sau ntreaga celul care sintetizeaz enzim sau numai organite celulare.

Majoritatea enzimelor utilizate la scar industrial, sunt de obicei enzime extracelulare sintetizate de microorganisme. Acest lucru rezid din simplitatea izolrii lor din mediul de fermentare. In plus, enzimele extracelulare sunt mai stabile la variaiile de mediu, comparativ cu cele intracelulare. Totui, peste 90% din enzimele produse de celule sunt intracelulare. Metodele de separare a acestor enzime sunt scumpe i laborioase. Din acest motiv, a fost imaginat metoda permeabilizrii celulelor ca surs de enzime. Permeabilizarea este o soluionare a difuziei substratului/ produilor de reacie prin nveliul celular.

Celulele permeabilizate pot fi utilizate sub form imobilizat, ca surs de enzime intracelulare care intervin n reacii simple ca hidroliza, oxidarea, izomerizarea, care nu necesit un sistem de regenerare de co-factor.

Utilizarea celulelor imobilizate sub form viabil sau neviabil, depinde de scopul urmrit.
Astfel, celulele permeabilizate de Kluyveromyces

fragilis, care sunt neviabile, transform lactoza din lapte n glucoza i galactoz, n timp ce celulele viabile (nepermeabilizate) transform lactoza n etanol i sunt utilizate pentru obinerea laptelui far glucide.

Enzim Inverlaza

Sursa Saccharomyces cerevisiae

Tehnica/suport nglobare n poliacrilamid, alginat

Invertaza
Inulinaza Catalaz Catalaz D-aminoacidoxidaza Penicilinacilaza Ureaz

Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces marxianus Saccharomyces cerevisiae Trigonopsis variabilis Trigonopsis variabilis Escherichia coli Celule ureolilicc

Adsorbie la fibre de bumbac, ln

Incorporare n gelatin nglobare n poliacrilamid nglobare n poliacrilamid nglobare n poliacrilamid, alginat, gelatin nglobare n poliacrilamid Aderare la fibre de bumbac

L-histidin amonio-liaz
Fumaraza Fumaraza Aspartaza Lactaza

Achrommobacter liquidium
mitocondrii hepatice Brevibacteriub flavus Escherichia coli Kluyveromyces fragilis

nglobare n poliacrilamid
nglobare n poliacrilamid nglobare n carrageenan nglobare n carrageenan Diferite suporturi

Suporturi utilizate pentru imobilizarea enzimelor: Suporturi de natur anorganic:

o o o o

Suporturi de natura organic: Celuloz i derivai celulozici; Amidon; Agaroz; Dextran; Colagen; Polimeri de acril-amid; de acid metacrilic; Rini formaldehidice etc.

Silicea coloidal; Caolinita; Perle de sticl cu porozitate controlat; Oxizi metalici: alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, crbune etc.

Procedeele de imobilizare sunt fizice i chimice: Procedeele fizice utilizeaz fore fizice pentru fixarea enzimei la suport:

ENZIMA

forte fizice

SUPORT

Forele de legare pot fi:

Procedee

chimice se bazeaz pe formarea unor legturi covalente sau parial covalente ntre enzima i un suport activat chimic, insolubil n ap.

interaciuni electrostatice, legturi ionice, legturi de hidrogen, interaciuni de tip protein-protein etc. Adsorbia pe suporturi insolubile n ap (crbune, clei, celuloz, rini schimbtoare de ioni: DEAE-celuloz, DEAE-Sephadex, sticl, amidon, colagen etc. Includere n structuri macromoleculare (formarea unor polimeri n prezena enzimei respective); Microcapsulare n membrane semipermeabile; Imobilizare n celule de ultrafiltrare.

ENZIMA legturi covalente/ SUPORT parial covalente Legarea covalent a enzimelor de suporturi insolubile, cu grupri reactive sau activate chimic; Copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv, Reticularea.

Metode fizice de imobilizare

Metode chimice de imobilizare

A. Adsorbia. B. Includere n membrane semipermeabile. C. Includere n celule de ultrafiltrare. D. Legare covalent la suportul insolubil. E. Copolimerizare. F. Reticulare.

1). Inglobarea (Includerea) Metoda de nglobare a fost utilizat mai ales pentru imobilizarea celulelor, dar nu i pentru enzime. Biocatalizatorii au fost nglobai n polimeri naturali ca agar, agaroz i gelatin prin polimerizare, iar n alginat i caragenan prin gelifiere (gelatinizare) ionotrop. Recent au fost folosite aa numitele hidrogeluri i polimerii hidrosolubili termoreactivi, ca hidrogelul de poli-albumin (etilen glicol). 2). Legarea covalent Legarea covalent reprezint o tehnic mult utilizat pentru imobilizarea enzimelor, dar nu i pentru celule. Prin aceast metod, enzimele sunt legate la suporturi prin intermediul unor grupri funcionale enzimatice, care nu sunt eseniale pentru activitatea catalitic a enzimei respective. Studii ample au fost efectuate asupra gruprilor funconale amino, carboxil i gruparea fenolic a tirozinei.

Cross - linking reprezint o alt metod de imobilizare a enzimelor prin intermediul unor ageni de cuplare homo sau heterobifuncionali ( ex. glutaraldehida care interacioneaz cu gruprile amino printr-o reacie bazic). Diferite enzime sau celule au fost imobilizate prin cross-linking n prezena unor proteine inerte ca gelatina, albumina i colagenul. Studii recente au demonstrat c albuul de ou (sub form de pudr, perle sau spum cu porii mari) reprezint un suport bun pentru imobilizarea enzimelor sau celulelor neviabile prin intermediul glutaraldehidei. Datorit coninutului n lizozim, suportul capt i proprieti bactericide, prevenind astfel contaminarea cu bacterii. 4). Adsorbtia Adsorbtia este probabil cea mai simpl metod de imobilizare. In cazul enzimelor imobilizate prin interaciuni ionice, adsorbtia i desorbia enzimei depind de bazicitatea schimbtorului de ioni. A fost imaginat o tehnic ce utilizeaz polietilenimina care confer caracter de policationi unor suporturi neutre pe baz de celuloz sau materiale anorganice. Enzime cu pH sczut ca invertaza, glucozoxidaza, ureaz, catalaz i altele au fost legate prin adsorbie urmat de cross-linking pe suport acoperit cu polietilenimina.

3). Legare ncruciat (cross-linking)

Enzimele co-imobilizate se obin prin legarea simultan Ia acelai suport sau prin nglobarea lor simultan n acelai suport. Adesea o celul microbian nu conine toate enzimele necesare unui proces. De exemplu, Saccharomyces cerevisiae, drojdie capabil de fermentaie alcoolic, nu poate utiliza lactoza sau amidonul, fiind lipsit de galactozidaz i amilaz. Pe lng ingineria genetic, o soluie n acest sens este reprezentat de imobilzarea enzimei (enzimelor) deficitar(e) la suprafaa celulei microbiene. Aceasta se poate realiza cu ajutorul concanavalinei A (Con A) sau cu polietilenimina, prin adsorbie urmat de cross-linking.

O aplicaie major a enzimelor imobilizate n industria alimentar este conversia siropului de glucoza n sirop de fructoz cu ajutorul glocozoizomerazei.

O aplicaie deosebit de important a biocatalizatorilor imobilizai, n industria laptelui, o constituie obinerea de lapte i zer far lactoza (hidrolizat cu ajutorul -galactozidazei). Aceast realizare are o semnificaie deosebit n ri ca India unde prevalenta intoleranei la lactoza este foarte ridicat.
Deja a fost comercializat lapte cu lactoza hidrolizat cu

ajutorul lactazei imobilizate. Procesul se bazeaz pe imobilizarea lactazei neutre obinut din drojdii (Kluyveromyces lactis) prin ncorporare n fibre sintetice. S-a obinut zer far lactoza (hidrolizat de lactaz de origine vegetal, imobilizat).

Preparate enzimatice cu glucozoxidaz imobilizat sunt utilizate pentru obinerea acidului gluconic, ndeprtarea oxigenului din buturi i ndeprtarea glucozei din ou, naintea deshidratrii pentru a preveni reacia Maillard. Unele studii au artat c glucoza poate fi ndeprtat din ou utiliznd glucozoxidaz i catalaz co-imobilizate fie pe textur de bumbac policationic sau pe spum de albu de ou. Un procedeu alternativ utilizeaz drojdii imobilizate pentru a ndeprta glucoza din melanjul de ou prin procese heterofermentative. O alta enzima care poate fi imobilizata este catalaza utilizat pentru descompunerea peroxidului de hidrogen, folosit n sterilizarea la rece a laptelui. Renina imobilizat sau alte proteaze pot fi folosite n procesul de coagulare continu a laptelui, pentru obinerea brnzeturilor.