S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.

Biomed

201 3

METODE UJI ANTIMIKROBA OBAT HERBAL

I.

PENGERTIAN pertumbuhan khususnya atau membunuh mikroorganisme,

Antimikroba adalah senyawa yang dapat menghambat mikroorganisme mikroorganisme

yang merugikan manusia. Mikroorganisme adalah setiap

organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop yaitu protozoa, bakteri, jamur, dan virus adalah contoh dari mikroorganisme. Berdasarkan sifat toksisitas selektif , ada anti mikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba , dikenal sebagai aktifitas bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba , dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Seringkali, toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bukan absolut; ini berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi oleh inang, dapat merusak parasit. Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut: a. Mempunyai b. Tidak kemampuan untuk mematikan resistensi atau dari menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic) menimbulkan terjadinya mikroorganisme pathogen c. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada host, seperti reaksi alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan sebagainya d. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora usus atau flora kulit.

1 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

II.

MEKANISME

Keefektifan penghambatan merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu senyawa antimikroba pada obat herbal. Semakin kuat penghambatannya semakin efektif digunakan. Kerusakan yang ditimbulkan komponen antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik (kerusakan sementara yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang digunakan. Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikroba dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain: 1. Gangguan pada senyawa penyusun dinding sel, 2. Peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan kehilangan komponen penyusun sel, 3. Menginaktivasi enzim, dan 4. Destruksi atau kerusakan fungsi material genetik. 1. Menggangu pembentukan dinding sel Mekanisme ini disebabkan karena adanya akumulasi komponen lipofilat yang terdapat pada dinding atau membran sel sehingga menyebabkan perubahan komposisi penyusun dinding sel. Terjadinya akumulasi senyawa antimikroba dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi. Pada konsentrasi rendah molekul-molekul phenol yang terdapat pada minyak thyme kebanyakan berbentuk tak terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat mengikat daerah hidrofobik membran protein, dan dapat melarut baik pada fase lipid dari membran bakteri. Beberapa laporan juga meyebutkan bahwa efek penghambatan senyawa antimikroba lebih efektif terhadap bakteri Gram positif daripada dengan bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan perbedaan komponen penyusun dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Pada bakteri Gram posiitif 90 persen dinding selnya terdiri atas lapisan peptidoglikan, selebihnya adalah
2 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya mengandung 5-20 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipopolisakarida, dan lipoprotein. 2. Bereaksi dengan membran sel Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma, yang dapat mengakibatkan kebocoran materi intraseluler, seperti senyawa phenol dapat mengakibatkan lisis sel dan meyebabkan membran sel. 3. Menginaktivasi enzim Mekanisme yang terjadi menunjukkan bahwa kerja enzim akan terganggu dalam mempertahankan kelangsungan aktivitas mikroba, sehingga mengakibatkan enzim akan memerlukan energi dalam jumlah besar untuk mempertahankan kelangsungan aktivitasnya. Akibatknya energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan menjadi berkurang sehingga aktivitas mikroba menjadi terhambat atau jika kondisi ini berlangsung lama akan mengakibatkan pertumbuhan mikroba terhenti (inaktif). Efek senyawa antimikroba dapat menghambat kerja enzim jika mempunyai spesifitas yang sama antara ikatan komplek yang menyusun struktur enzim dengan komponen senyawa antimikroba. 4. Menginaktivasi fungsi material genetik Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (RNA dan DNA), menyebabkan terganggunya transfer informasi genetik yang selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak materi genetik sehingga terganggunya proses pembelahan sel untuk pembiakan III. KOMPONEN-KOMPONEN ANTIMIKROBA TUMBUHAN deaturasi protein, menghambat pembentukan protein sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada

3 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Komponen antimikroba adalah suatu komponen yang bersifat dapat menghambat pertumbuhan bakteri atau kapang (bakteristatik atau fungistatik) atau membunuh bakteri atau kapang (bakterisidal atau fungisidal). Zat aktif yang terkandung dalam berbagai jenis ekstrak tumbuhan diketahui dapat menghambat beberapa mikroba patogen maupun perusak makanan. Zat aktif tersebut dapat berasal dari bagian tumbuhan seperti biji, buah, rimpang, batang, daun, dan umbi. Komponen aktif yang terdapat pada bawang putih mempunyai efek penghambatan terhadap beberapa mikroba patogen seperti Staphylococcus aureus, E. coli, dan Bacillus cereus dan menghambat produksi toksin dari Clostridium botulinum tipe A dengan menurunkan produksi toksinnya sebanyak 3 log cycle. C. Botulinum adalah bakteri berspora yang dapat memproduksi toksin pada kondisi yang memungkinkan, dapat dihambat pertumbuhannya oleh minyak bunga dan biji pala, minyak daun salam, minyak lada hitam dan lada putih dengan konsentrasi 125 ppm. Laporan lain juga menyebutkan bahwa ekstrak minyak lada dapat menghambat pertumbuhan S. aureus, E. coli, dan Candida albicans. Komponen aktif yang terdapat pada minyak thyme diantaranya thymol, carvacrol, (ro)-cymene, dan (gamma)-terpiene diketahui mempunyai efek sebangai senyawa antimikroba terhadapa pertumbuhan bakteri. Bakteribakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya antara lain Salmonella sp., S. aureus, E. coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, dan B. cereus. Dari laporan tersebut dapat juga diperoleh informasi bahwa bakteri gram positif lebih sensitif dibanding dengan bakteri gram negatif. Efek penghambatan senyawa antimikroba dari rempah-rempah tidak hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi dapat juga menghambat pertumbuhan khamir seperti Candida albican dan Sacharomyces cerevisiae.
4 Amelia Febriani NPM. 1206179170

Komponen-komponen aktif pada minyak

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

thyme, minyak sage, minyak rosemary, minyak cumin, minyak caraway, dan minyak cengkeh dapat menghambat khamir dengan konsentrasi 0,52.0 (mg/mL). Bakteri dalam bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding dalam bentuk sporanya, hal ini dibuktikan oleh Ultee et al. (1998) yang meneliti efek penghambatan komponen carvacrol yang terdapat pada minyak thyme dan oregano terhadap pertumbuhan bakteri B. cereus. Pada konsentrasi 1,75 mmol/L bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding bentuk sporanya. Hal ini disebabkan struktur spora yang lebih komplek dibanding bentuk sel vegetatif, seperti adanya komponen asam dipikolinat yang dapat melindungi spora terhadap gangguan faktor lingkungan (suhu dan pH ekstrim). Lebih lanjut Ultee et al. (1998) menyebutkan bahwa pada konsentrasi 1.75 mmol/L dapat mneghambat kecepatan pertumbuhan B. cereus sehingga fase lag diperpanjang. Semakin lama fase lag maka aktivitas B. cereus sebagai penyebab kerusakan bahan pangan dapat dicegah. Komponen-komponen antimikroba yang terdapat pada minyak cengkeh, minyak kayu manis, minyak oregano, minyak thyme, minyak bawang putih, dan bawang merah dapat menghambat spesies kapang diantaranya adalah Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. versicolor, A. ochraceus, Candida sp., Crytococcus sp., Rhodotorulla sp., Torulopsis sp., dan Tricosporon sp. Kapang adalah mikroorganisme penyebab kerusakan bahan pangan terutama biji-bijian dan produk tepung-tepungan dengan kadar air rendah. Beberapa spesies kapang dapat menghasilkan toksin (mikotoksin) adalah Aspergillus sp., Penicllium sp., dan Fusarium sp., yang dapat menghasilkan aflatoksin, patulin, okratoksin, zearalenon, dan okratoksin. (bersambung).

5 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3
dalam

IV. UJI AKTIVITAS dan POTENSI ANTIMIKROBA Potensi antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau g/mg Prinsipnya yaitu membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji. Baku standar yang digunakan adalah zat/senyawa yg sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya. Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri (dilusi) dan metode difusi agar. Caranya sama dengan penentuan potensi antibiotika, tetapi hanya 1 dosis, umumnya 50%. Perbedaannya : uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahan Uji potensi antibiotika kekuatan bersifat suatu kuantitatif yang menghasilkan antibiotika prosentase antibiotika terhadap

pembanding dari jenis yang sama Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan bila terpenuhi tiga syarat, yaitu: a) Ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel mikroorganisme, b) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme dapat tumbuh saat tidak ada bahan antimikroba, dan c) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme (Hostettmann, 1991). Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja, cara kerja dan ditentukan pula oleh konsentrasi hambat minimum (KHM). Konsentrasi

6 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi minimum dari suatu zat yang mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme. Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara yaitu a) Cara cair

Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri atau jamur dengan pengenceran tertentu kemudian diinokulasikan biakan bakteri atau jamur dalam jumlah yang sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan atau kekeruhan pada tabung setelah diinkubasi. b) Cara padat Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan zat uji dengan berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri dapat digores lebih dari satu jenis mikroba untuk memperoleh nilai KHM. Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas antimikroba dimana masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode-metode yang digunakan antara lain metode difusi, metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun, perlu diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat pertama dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya. Preparasi sampel uji (ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi dengan bahan surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada metode difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair (dalam tabung). Dispersi air yang mengandung pendispersi dengan berat molekul (BM) yang tinggi (>100.000) harus dihindari dalam metode difusi
7 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam media agar 1% (Hostettmann, 1991).

V.

METODE UJI ANTIMIKROBA Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat macammacam metode uji antimikroba seperti berikut: 1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods) Prinsip metode difusi uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal pemberian kedaerah difusi. Metode difusi-agar cakram kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan untuk menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi. Dalam metode ini, ada beberapa cara yaitu cara Kirby Bauer, cara sumuran dan cara pour plate. 1) Metode Kirby-Bauer Untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih agar. mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media

8 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer : 1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai. Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris. Bakteri ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi pada suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan menumbuhkan bakteri pada media cair Natrium Klorida fisiologis dan diinkubasi pada suhu 370C

2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata Biarkan cawan selama 5 menit.

9 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan konsentrasi tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar.

4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.

10 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di sekitar cakram, lubang, atau cangkir agar yang tidak ditumbuhi miroba.

11 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong, kemudian bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik. Makin besar diameter hambatan pertumbuhan tersebut berarti aktivitas bahan yang diuji (obat herbal) terhadap mikroba makin baik.

12 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Tabel 1. Tabel Standar Sensitifitas Antibiotik Faktor yang mempengaruhi metode difusi agar (Kirby-Bauer): a. Ingredien / komposisi medium pertumbuhan -Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo adalah ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH) -NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin -KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau ampisilin

b. Pemilihan medium pertumbuhan

13 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3
mo

Pemilihan persiapan

medium medium

pertumbuhan; yg cocok bagi

dimana

diperlukan

pertumbuhan

demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada medium agar Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N c. Pengaruh pH Perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan jumlah molekul zat uji yang mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri. d. Ukuran inokulum Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media. Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar kandungan mikroorganismenya. Suatu Apabila inokulum dikatakan yg ideal rapat, apabila dapat kandungan mikroorganismenya homogen, misal 1-10% pertumbuhan menyebabkan terjadinya penumpukan pada tempat tertentu

14 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

e. Stabilitas mikroba uji Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya. f. Aktivitas antibiotika Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar larutan antibiotik yangg terjadi sebelum hambat harus minimum (KHM) dari antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi inkubasi dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam medium agar g. Waktu inkubasi Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara 18-24 jam Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat antimikroba suatu zat sehingga metode ini tidak menjamin diidentifikasinya bahan pembunuh antimikroba yang efektif untuk terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan adanya perbedaan kecepatan dengan keadaan difusi dari senyawa asalkan antimikroba yang ukuran Hal ini dipengaruhi berat molekulnya. Ukuran zona untuk suatu zat dapat dibandingkan inokulum, dan standar, lain perbenihan, seksama. diatur secara

memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat

15 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

minimum yang menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba. Pada untuk pengukuran menentukan standar tingkat seperti kepekaan, konsentrasi yaitu peka antimikroba (sensitive, berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa digunakan susceptible), cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan resisten (resistant.) Nilai kadar hambat minimum (KHM) berbanding terbalik secara proporsional (linear) dengan diameter zona hambat (Bauer et al., 1966)

2). Metode E- test Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi yang disebut E-test (Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik yang mengandung gradien konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak nilai konsentrasi yang memungkinkan secara langsung membaca konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan menunjukkan KHM untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik yang diujikan.

16 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test

Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like growth, non-mycelial growth) biasanya ditanam secara usapan atau gores-coret (agar surface streak) Penanaman jamur berfilamen yang tumbuh tidak merata pada media menggunakan teknik gores silang 3). Metode Ditch plate technique Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal) yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong pada media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kea rah parit yang berisi agen antimikroba 4). Metode Cup plate technique (Metode sumuran) Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba (obat herbal) yang akan diuji 5). Metode Gradient plate technique Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan di letakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya ditung di atasnya. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji
17 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

(maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari kosentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di bandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan

2.

Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods) Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa zat antimikroba secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal. Metode ini memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai daya antimikroba suatu zat . Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang menunjukkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh kejernihan media merupakan KHM. Data sifat kimia fisika dan data aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik dengan uji regresi liner dan non linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu inokulum terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution). 1). Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution) Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar hambat minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration atau kadar bunuh minimum, KBM). Cara kerja metode dilusi cair: 1. Buat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada medium cair yang di tambahkan dengan mikroba uji. Cara pengenceran dilakukan dalam tabung dengan mengencerkan
18 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3
dengan

bahan uji (obat herbal) dengan media cair menjadi kelipatan dua secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi kelipatan setengahnya 2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 36-37oC dan kemudian diamati hambatan pertumbuhan mikroba dengan membandingkan kekeruhan atau pertumbuhannya dengan kontrol yang mengandung media. 3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. 4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan pada mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 1824 jam. 5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM 2). Metode dilusi padat (solid dilution tes ) Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji. Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena sebagian besar jamur tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti ragi (yeast-like growth). Jamur yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al., 1966). 3. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)

19 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau senyawa yang belum diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi kontak menggunakan prinsip difusi senyawa yang terpisah dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK). Lempeng kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi dengan mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan, diinkubasi dan diamati, senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam lapisan agar dan menghambat pertumbuhan mikroba. Pada bioautografi langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada lempeng kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi mikroba dalam media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan waktu dan yang sesuai. dibiarkan Sedangkan mengeras. metode Lempeng bioautografi kromatografi pencelupan kemudian dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam media media diinkubasi dan daerah hambatannya diamati.

4. Metode metode lain Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas senyawa kemoterapi yaitu:
a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)

Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien yang sedang (bakteri) Pertumbuhan
20 Amelia Febriani NPM. 1206179170

menerima (turbiditas)

terapi antibiotik. pada serum dalam

Suspensi mikroba serum setelah pasien. inkubasi

kemudian

ditambahkan

mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

b. Metode otomatis (automated method).

Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang dapat mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan kepekaannya terhadap berbagai senyawa antimikroba. 5. Metode Gores Silang (Uji Antifungi) Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku untuk menguji aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur T. mentagrophytes (Anonim, 1993). Cara kerja metode gores silang: 1. Celupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan di atas lempeng agar yang telah digores dengan inokulum jamur.
2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.

3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur diukur sebagai zona hambat. 4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan untuk antijamur pembanding.

DAFTAR PUSTAKA Ultee A, Gorris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol toward the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol: 213-218 Corner, DE. 1995. Naturally occuring compounds in Antimicrobial in Food. Eds., by Davidson PM & Branen AL, Eds. Marcell Dekker, Inc., New York, pp. 441-468.

21 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

Palmer, SA., Stewart J., Fyfe, L. 1998. Antimikrobial properties of plant essential oils and essences againts five important food-borne pathogen. Letters Appl. Microbiol. 26: 118-122. Ting, EWT & Deibel, KE. 1992. Sensitivity of Listeria monocytogenes to spices at two temperature. J. Food Safety 12: 19-137. Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in Plant Biochemistry Vol 6 Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):4936. Rostinawati T, 2009. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Agar. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran , Jatinangor

22 Amelia Febriani NPM. 1206179170

S2 Herbal Medik. Tugas Metode Uji Obat Herbal Dosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

201 3

23 Amelia Febriani NPM. 1206179170