Sunteți pe pagina 1din 30

CLONAREA SI MANIPULAREA GENEI - Utilizarea altor organisme -

GURALIUC LENUA (cs. BRNZ) PNZARIU SANDAL-CRISTINA (cs. FECIORU) Biotehnologii microbiene i celulare

1. INTRODUCERE
1. Introducere: n capitolele anterioare au fost descrise tehnicile de manipulare a genomului E. coli. Cu toate acestea, este foarte probabil c va fi nevoie s lucrm i cu alte organisme, fie pentru a produce versiuni modificate genetic ale unor specii comerciale importante (ex.: culturi de plante), fie pentru a le imbunti caracteristicile. Se aplic aceleai principii ca i la E. coli, avnd nevoie de vectori corespunztori, un mijloc de a obine AND-ul n organism i modaliti de a selecta transformanii. Un organism care contine o gen derivat din alt parte este considerat a fi transgenic. Vom analiza vectorii i transformarea sistemelor disponibile pentru o serie de organisme, vom lua n considerare primele bacterii de la ciuperci, apoi plante (inclusiv alge) i animale.

2. BACTERIILE
2. Bacteriile: E. coli, analizat n detaliu n capitolele anterioare, face parte din grupul de bacterii Gram-negative, unul dintre multele grupuri de bacterii care conin membri i care sunt importante pentru clinic din motive economice, ecologice sau de natur biologic. 2.1. Vectorii: ADU-ul folosit la manipularea speciilor de interes ar putea fi ncadrat ntr-una din urmtoarele categorii: a. AND-UL non replicant - poate fi material liniar sau circular i care, dei are posibilitatea de a se reproduce in E. coli, nu se poate reproduce n alte gazde.

2.1. Vectorii
De aceea ar putea, prin urmare, s fie stabil meninut n specia int numai prin integrarea ntr-un alt replicon, cum ar fi un alt cromozom bacterian sau o plasmid. n cazul n care specia gazd are un sistem de recombinare activ omolog i ADN-ul de intrare conine secvena de omologare ntr-un loc n genomul gazd, introducerea lui ar putea fi posibil n locul respectiv. n caz contrar, introducerea poate avea loc n locuri aleatoare, ceea ce constituie un dezavantaj. b. Plasmid unic la speciile luate n studiu desigur E. coli nu este singura specie de bacterie care conine plasmide. i speciile inte pe care le-am putea folosi pot avea plasmide proprii ce se pot utiliza n procesul de manipulare genetic.

Cu toate acestea, este mai convenabil dac plasmida utilizat se poate reproduce n E. coli, precum i n speciile vizate. c. O gam larg de plasmide gazd : sunt multe plasmide gazd capabile s se reproduc ntr-un numr diferit de specii de bacterii. Se pot clasifica n grupuri de incompatibilitate pe baza faptului c prezena ntr-o celul a unei plasmide dintr-un grup inhib replicarea de plasmide diferite ale aceluiai grup, ca urmare a interferenei dintre procesele de replicare. Plasmidele difer i prin ct de uor pot fi transmise la alte bacterii. Unele sunt de la sine transmisibile, altele sunt n imposibilitatea de a-i conduce transferul propriu, putnd fi transferate n cazul n care funciile sunt furnizate de o alt Plasmid, spunndu-se despre ele c se mobilizeaz.

Restul nu pot fi mobilizate de ctre alte plasmide si se spune despre acestea ca sunt ne mobilizate. Din acest motiv este foarte probabil ca plasmida s se rspndeasca n populaii slbatice n caz de eliberare, lucru dorit mai puin din motive de siguran. d. Transport de vectori : acetia sunt construii n mod artificial pe baza hibrizilor ntre E. coli, plasmide i plasmide de la alte specii. Prin urmare, ei au posibilitatea de a reproduce i de a fi selectai n ambele specii. Sunt numii vectori de transfer deoarece acetia pot fi naveta de la o gazd la alta i, de eceea, sunt utilizai pe scar larg. n fapt, ei sunt plasmide a cror gam de gazd a fost extins artificial prin introducerea unei origini de replicare suplimentare. Unii vectori de transfer se pot reproduce n mai multe specii.

De exemplu, vectorii bazai pe plasmida pC194 de Staphylococcus aureus se pot reproduce n specii de Bacillus. De regul, iniierea construciei i verificarea de ctre o plasmid recombinant utiliznd un serviciu al unui vector de transfer, ar putea fi realizat prin utilizarea E. coli ca i gazd, urmat de transferul n speciile de interes. Vectorii de expresie urmeaz aceleai principii folosite la exprimarea n E. coli. Multe E. coli promontorii vor lucra n alte bacterii Gram-negative, dei pot fi utilizai promontorii puternici din speciile aflate n discuie. Unii promomtorii care acioneaz n E. coli, vor aciona n mai multe bacterii conexe la distan. De exemplu, PN25 promotor de E. coli bacteriofag T5, va aciona n Bacillus subtilis chiar dac acesta este o specie Gram-pozitiv i E. coli este Gram-negativ.

Bacteriile Gram-pozitive sunt deosebit de atractive ca i gazde pentru secreia de proteine exprimate n mediul de cretere, aa cum sunt capabile s fac acest lucru la rate ridicate. Un dezavantaj n utilizarea de specii de Bacillus ca i gazde pentru secreie l constituie producerea la niveluri ridicate de proteaze endogene. Dei gazdele cu niveluri reduse de proteaz sunt disponibile, ele nu sunt ntotdeauna satisfctoare, deoarece proteazele endogene pot pune mai puine probleme dect unele specii de Streptomyces.

2.2. INTRODUCEREA ADN-ULUI


2.2. Introducerea ADN-ului: Exist trei modaliti principale prin care ADN-ul poate fi introdus n celule bacteriene beneficiare. Acestea sunt: introducerea direct a ADN-ului gol n celule intacte; transformarea protoplatilor; metoda combinativ. a. Introducerea de ADN gol: Multe specii de bacterii pot fi induse n a primi ADN-ul gol prin tratamente adecvate, cum ar fi soluii reci de calciu sau electroporaie, utilizate cu E. coli.

Pentru o specie care nu a mai fost studiat anterior, se impune efectuarea unui studiu de eroare, n vederea optimizrii metodelor. Un numr de genuri importante, care includ speciile Gram pozitive Bacillus, Streptococcus i Streptomyces,prezint competen natural. Competena este, de obicei, reglementat i de cele mai multe ori determinat de excreia de cretere n mediul extracelular, proteine cu mas mic extracelular, denumite proteine de competen. Competena se dezvolt ca densitate celular (i concentraia de protein competent), apoi mediul se extinde. Cerinele de transformare a ADN-ului n mai multe dintre aceste specii sunt complexe.

De exemplu, cu Bacillus, plasmide care sunt capabile de transformare direct ntr-o gazd, n general, necesit secvene care sunt prezente pe gazda cromozom sau secvene care sunt de asemenea prezente deja pe o o plasmid n cadrul celulei, sau cel putin parial n cadrul secvenei duplicrii interne a plasmidei. Exist posibilitatea ca intrarea moleculei n celul s fie asociat cu tierea i degradarea unui singur fir. Regenerarea moleculei poate depinde de un dublu-catenar care poate fi replicat, apoi de un eveniment de recombinare intramolecular. Dac recombinarea are loc ntre ADN-ul de intrare i o secven n cromozomul gazd sau plasmida endogen, rezultatul este integrarea ADN-ului n cromozom sau plasmid.

Dac ADN-ul de intrare se recombin cu el nsui ntr-o reacie intramolecular, atunci rezultatul este recirculator. n plus, pentru unele specii, prezena uneo nucleoide specifice scurtsecvenial permite plasmidei absorbia acesteia. b. Transformarea protoplatilor: Pentru mai multe grupuri de bacterii, n special Bacillus Grampozitive i Streptomyces, exist constrngeri privind tipurile de plasmide care pot fi utilizate la trasformarea natural a protoplastilor (celule la care pereii au fost eliminai prin tratarea cu lizozim) poate fi exonerat de utilizarea n prezena unui tampon osmotic adecvat, pentru a opri liza celulelor i a polietilenglicolului. Unele protocoale utilizeaz ali reactivi, n plus fa de polietilenglicol, ca de exemplu celulele normale, apoi regenerate din protoplati prin transferul unui mediu adecvat.

c. Metoda combinat: n metoda combinat, dou celule devin din punct de vedere fizic legate printr-un tub proteic i ADN-ul este trecut direct de la o celul la alta. Acesta este modul n care plasmida F (pentru fertilitate), care constituie baza, este transferat de la o celul la alta. Factorul F codific toate funciile necesare pentru transferul su. Plasmida care urmeazs fie transferat (uneori numit plasmid marf) este de multe ori n imposibilitatea de a conduce transferul propriu. n schimb se bazeaz pe o plasmid conjugal, care este capabil s fac acest lucru i uneori unul sau mai multe plasmide helper ca Methylases, care codific aceste funcii i care va proteja gazda marf de la degradarea ei n viitor.

Plasmida de ajutor poate efectua, de asemenea, funcii necesare pentru transferul marfei. De obicei, transferul este realizat ntr-o mperechere triparental, format din urmtoarele trei componente E. coli care transport plasmida conjugal E. coli; transportul de marf i orice plasmid ajutor; destinatarul speciei de bacterie care urmeaz s fie manipulat. Combinarea ntre dou tulpini de E. coli plaseaz toate cele necesare ntr-o plasmid de celule E. coli i conjugarea cu bacteria beneficiar transfer marfa n speciile beneficiare. ntr-o mperechere biparental, este suficient s se introduc plasmida de interes n tulpina destinatar.

Dei E. coli poate fi combinat cu o gam larg de bacterii, inclusiv unele bacterii Gram-pozitive, i alte specii pot fi utilizate ca donator. n cazul n care aceleai specii pot fi folosite ca donator i primitor, transferul plasmidei poate fi mai eficient. Metoda combinat este adesea util n cazurile n care transformarea direct i transformarea protoplatilor au euat.

3. SACCHAROMYCES CEREVISIAE
2.3. : GAZDELE Se aplic aceleai considerente de proiectare a gazdelor n E. coli i la alte bacterii. Bacillus subtilis ofer, probabil, cea mai bun gam de tulpini gazd. Exist, de asemenea, mutaii de reducere endogen privind activitatea enzimei de activitate i restricia proteazei (care poate fi util atunci cnd exprim gene clonate). 3. SACCHAROMYCES CEREVISIAE: Ciupercile sunt un grup de organisme extrem de divers. Poate una dintre cele mai bine studiate este ciuperca Saccharomyces cereviae ascomycete (de asemenea cunoscut sub numele de drojdia de panificaie sau pur i simplu drojdie), astfel nct ne vom concentra pe aceasta.

Cu toate acestea, vectorii i sistemele de transformare au fost dezvoltai i pentru o serie de alte ciuperci, inclusiv ciupercile care sunt de interes special ca ageni patogeni pentru plante i animale. 3.1. Markerii: Unul dintre cei mai utilizai markeri este gena URA3. Aceasta codific decarboxilaza fosfat 5 orotina, o enzim de biosintez uracil. Achiziionarea de celule de ctre o gen URA3 anterior mutat anterior n acest loc, le permite s creasc n absena exogenului uracil. n tabelul 1 sunt prezentai markeri selectabili frecvent utilizai, inclusiv markeri nutriionali care pot fi selectai n mod similar.

3.1. MARKERII

amp R E.c. ori ARSI

tet R URA3

CEN4

Unii dintre ei, cum ar fi CAN1 sau URA 3, pot fi selectai, de exemplu putem selecta absena lor. Gena CAN1 codific o permisiune care determin adoptarea argininei canavanine toxice analogic i, n consecin, moartea celulelor. Celulele mutante gazd CAN1 sunt cele tezistente la canavanin, deoarece acestea nu au posibilitatea de a importa.

Tabelul 1-Markeri selectabili frecvent utilizai

Cu toate acestea, ntreruperea lanului SUP4, supresoare, determin producia de CAN1 funcionale n fundal (deoarece suprim mutaia CAN1) i, prin urmare, provoac moartea celulelor CAN1 n prezena cavaninelor. Celulele care conin SUP4 pot fi identificate, fr a le ucide, prin utilizarea de gazde, cu o mutaie ocru n ntreruperea lanului genei ADE2 pentru fosforibozil amino-imidazol carboxilaz, o component a biosintezei purinelor. Mutaia face celulele s acumuleze un pigment rou, n timp ce coloniile sunt de obicei de culoare ocru dac mutaia este suprimat de SUP4.

3.2. VECTORII PLASMID


Integrarea prin non-replicarea ADN-ului de intrare circular sau liniar n genomul de drojdie prin recombinare poate fi folosit pentru modificarea genetic stabil. Nevoia de integrare va face n mod clar recuperarea ADN-ului de intrare mult mai dificil dect n cazul n care un vector replicator este utilizat. Vectorii plasmid de replicare utilizai n mod obinuit n drojdia de bere pot fi mprii n dou categorii principale vectori plasmid ai drojdiei de bere centrometric (PCI) i vectori plasmid ai drojdiei episomali. Caracteristica distinct a plasmidei PCI este prezena unei secvene centrometrice cromozomiale, n acest caz, CEN4.

Muli dintre vectorii de drojdie se bazeaz pe pBR322 n acest fel, dar alte plasmide au fost utilizate asemenea, inclusiv speciile i PUC Bluescript. Exist, de asemenea, un marcator de selecie i o origine de replicare pentru drojdie, ARS1. Prezena unei secvene centromerice permite plasmidei care urmeaz s fie mprit de ctre axul aparatului de celule n acelai mod n care cromozomii endogene sunt mpartii. Dei acest lucru duce la o reducere semnificativ a numrului de copii pe celul, aceasta confer o stabilitate mult mai mare n timpul diviziunii celulare, permind plasmidei s fie meninut n absena seleciei. Vectori plasmide care au ARS, dar nu i o secven CEN sunt uneori numite YRp (drojdia de bere reproduce plasmide). Dei au copii mai mari dect vectori PCI, instabilitatea lor este un dezavantaj major.

Un exemplu de un vector Da este prezentat n figura 9.5. Cele mai multe dintre caracteristici sunt similare cu cele ale plasmidelor PCI, cu excepia absenei secvenei centromerice i nlocuirea acestuia cu o alta de origine replicatoare. 3.3 YACs YACs sunt vectori de clonare sofisticai care pot fi utilizai pentru nmulire de mare intindere ale ADN-ului. Acest lucru este foarte util, deoarece reduce numrul de recombinante necesare pentru a acoperi ntregul genom al unui organism. Scopul este de a construi un cromozom artificial, care poate fi meninut n drojdia de bere, dar care este cea mai mare parte compus din ADN strin.

Un exemplu de un vector Da este prezentat n figura 9.5. Cele mai multe dintre caracteristici sunt similare cu cele ale plasmidelor PCI, cu excepia absenei secvenei centromerice i nlocuirea acestuia cu o alta de origine replicatoare. 3.3 YACs YACs sunt vectori de clonare sofisticai care pot fi utilizai pentru nmulire de mare intindere ale ADN-ului. Acest lucru este foarte util, deoarece reduce numrul de recombinante necesare pentru a acoperi ntregul genom al unui organism. Scopul este de a construi un cromozom artificial, care poate fi meninut n drojdia de bere, dar care este cea mai mare parte compus din ADN strin.

3.4. Sisteme de expresie Un numr de promotori constitutivi sunt disponibili, de exemplu, de la gena GPD pentru glyceraldehyde-3-fosfat dehidrogenaza, TEF pentru traducerea factorului de alungire 1a, i CYC1 pentru o component a citocromului c oxidazei. Unii dintre cei mai utilizai promotori controlabili provenii de la gene pentru metabolismul galactozei, respectiv GAL1 i GAL10, codificai galactokinase i UDP-galactoza-4-epimerase. Cnd un tip proteine de tip slbatic de control sunt prezente, transcrierea GAL1 i GAL10 este crescut foarte mult n prezena galactozei. n prezena glucozei, transcrierea este bine reprimat. Exist dou variante de tergere a promotorului GAL1 Gall, desemnat i feminin care sunt mai puin puternice i, prin urmare, este mai puin probabil s duc la problemele cauzate de toxicitatea proteinelor strine.

Toi aceti promotori, mpreun cu secvene din amontele lor de control, pot fi folosii fie n vectori de expresie sau casete pentru introducerea n alte constructe. Toi aceti promotorii pot fi utilizai pentru a orienta sinteza, fie a proteinelo nemodificate sau a proteinelor de fuziune. Acesta din urm poate ncorpora oricare dintre produsele corespunztoare ale GAL1, GAL10 i aa mai departe, sau secvene, cum ar fi LacZ sau TrpE de la E. coli. Un avantaj n utilizarea de drojdie, mai degrab dect celulele procariote de exprimare a eucariote proteine ar fi c modificrile post-translationale de proteine, este puin probabil s aib loc n sistemele de procariote, dar ele pot face acest lucru n drojdie. Chiar i n drojdia de bere aceste modificri nu poate avea loc fiabil, i poate fi necesar s se foloseasc expresia n celule de insecte sau de mamifere.

9.3.5 Secretia de sisteme Secreia de proteine overexpressed de fuziune la un semnal de secreie poate fi util, deoarece ajut purificarea i permite proteinei produse a fi doar minim expus la proteaza intracelulara de drojdie. n plus, ar putea ajuta pentru a aduce glicozilare corecte i pot spori, de asemenea, plierea proteinei. O serie de semnale de secretie, att din drojdie i din alte organisme pot fi folosite. Feromonii de mperechere alfa-peptide i invertaza (produs al genei SUC2) sunt adesea folosii. mperecherea feromonilor este o peptida 13 reziduuri, secretat de celulele de mperechere tip alfa, care acioneaz pe un receptor de pe celulele de mperechere. Invertaza este secretat n scopul de a aduce defalcarea de zaharoz, glucoz i fructoz.

9.3.6 Sisteme de transformare Sunt frecvent utilizate trei moduri pentru introducerea de ADN exogen n Saccharomyces cerevisiae. a. Unul dintre cele mai simple i mai utilizate pe scar larg este tratamentul de celule cu acetat de litiu i polietilen glicol i o cldur oc, mpreun cu ADN-ul de transformare i suplimentare nespecifice denaturate "transportator" al ADN-ului (de exemplu, din timus de viel). Aceast metod este relativ rapid i simpl i poate oferi un randament de transfer de pn la 105 la 106 de colonii per micrograme de plasmid cu tulpini adecvate. b. O a doua abordare a introduce ADN exogen n Saccharomyces cerevisiae este transformarea protoplatilor (de asemenea, numit spheroplasts), care sunt obinui prin digestia peretelui celular cu enzime corespunztoare, n prezena unui tampon adecvat osmotic, cum ar fi soluie de sorbitol, pentru a preveni liza. Protoplatii sunt expui ADN-ului de transformare, n prezena de polietilenglicol i clorur de calciu.

Urmtorul pas este de a regenera celulele intacte de la protoplati.

Acest lucru este realizat prin imobilizarea protoplatilor ntr-un agar-agar adecvat, care este tamponat osmotic. nconjurarea protoplatilor cu un mediu solid permite pstrarea materialului peretelui celular n jurul valorii celulei n etapele timpurii i cele mai sensibile ale peretelui celulei de regenerare. Transformarea protoplatilor este consumatoare de timp mai mult dect transformarea cu acetat de litiu, dar cu unele tulpini se poate da un randament mai mare de transformare. Prin urmare este util cu tulpini care au o eficien de transformare altfel sczut, sau atunci cnd cantitatea de ADN este sczut.

c. O a treia metod de introducere a ADN-ului n Saccharomyces cerevisiae este electroporarea. Este raportat c aceast metod poate da chiar mai mare eficien dect transformarea protoplatilor, dei cifra real pare s varieze destul de mult i, probabil, depinde de tulpin utilizat. Un dezavantaj este faptul c numrul de transformanii obinui atinge un platou, cu sume relativ mici ale ADN-ului. Ca i n alte sisteme electroporatice, celulele sunt supuse pur i simplu la un puls de cmp electric. Nu este nevoie de a face protoplati pentru acest tratament, dei un tampon osmotic, cum ar fi sorbitol, este de multe ori inclus.

Alte metode mai puin utilizate pe scar larg de transformare a Saccharomyces cerevisiae includ bombardament de particule i de deteriorarea celulelor de agitaie, cu mrgele de sticl. Celulele E. coli trebuie s conin o plasmid care poate se poate reproduce n E. coli i n drojdia de bere (de exemplu, un vector de transfer) i o alt plasmid pentru a oferi funcii de mobilizare.

S-ar putea să vă placă și