Pedro Soto Briones Matricula: 289705

Practica 1 PURIFICACION DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO INTRODUCCION
-Tiseluis y Kabat -actividad de anticuerpos principalmente presente en la fraccin gamma de las protenas del suero. Los anticuerpos pueden purificarse por mtodos especficos e inespecficos. Los mtodos especficos: se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antgenos. Las separaciones inespecficas: estn basadas en las propiedades fisicoqumicas de los anticuerpos. Uno de los mtodos inespecficos ms empleados de purificacin de gamma globulina es la precipitacin con sulfato de amonio a una concentracin final de 33%. La precipitacin de la gamma globulina por este mtodo se debe al fenmeno conocido como salting out, el cual consiste en que las molculas de agua que solvatan a la molcula anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que adems neutralizan los grupos cargados de la protena, con lo que se insobuliza y precipita. OBJETIVO El alumno ser capaz de purificar gamma globulina por precipitacin con sulfato de amonio a partir de un suero humano. La gamma globulina obtenida en esta prctica se utilizara posteriormente para inmunizar conejos.

Material por grupo 1 centrifuga clnica 20 L de solucin salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8. 5 mL de cloruro de bario al 10%. 10 mL de solucin de timerosal al 1%.

1 matraz Erlenmeyer de 2L. 1 agitador magntico.

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Material por equipo. 10 ml de suero 20 ml de sln. Saturada de sulfato de amonio. 5 ml de NaOH 2N. 50 mL de solucin salina al 0.85% (SS), pH 7.8. 10 mL de SSRB. Papel indicador de pH. 2 pipetas serolgicas de 5.0 mL. 2 pipetas Pasteur y bulbo de hule 1 vaso de precipitacin de 250 mL. Tubo para dilisis. 10 cm de hilo grueso. 4 aplicadores de madera. 2 tubos cnicos de 15 mL, graduados. 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm 4 tubos de ensaye de 15 X 125 mm 1 pipeta serolgica de 1.0 mL. 1 matraz Erlenmeyer de 25 mL 1 gradilla para tubos de ensaye de 15 mm de dimetro. Mtodo 1. 2. Ajustar a 7.8 el pH de la solucin saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un tubo cnico, medio volumen de la solucin saturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACION CONSTANTE. De esta forma, el sulfato que amonio queda a una saturacin final de 3%. Continuar con la agitacin durante 10 15 min despus de terminar la adicin del sulfato de amonio. Centrifugar los tubos, a temperatura ambiente, a 3,500 rpm durante 15 min. Disolver el sedimento en SS pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5. Repetir nuevamente los pasos 2, 3, y 4. Disolver en SSRB el sedimento original del suero. Dializar contra SSRB en frio (4C) y con agitacin, durante 3 -5 das, realizando dos cambios diarios de solucin de dilisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para saber si efectivamente se elimino al sulfato de bario al 5.0 mL de la solucin de dilisis se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. Las dilisis se considera completa si ya no se observa la formacin de un precipitado blanco de sulfato de bario.

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Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frio a 2,500 rpm durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado. Determinar la concentracin de protenas por colorimetra o espectrofotometra. Agregar a la preparacin de gamma globulina, timerosal hasta una concentracin final de 0.01%, y conservarla en refrigeracin o congelacin. Comprobar la pureza del producto por inmunoelectroforesis.

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Resultados y Conclusiones: Se inoculara un conejo con la gammaglobulina obtenida en la prctica. Nos servir para comprender como reaccionan algunos animales a la gama globulina, principalmente los anticuerpos en este caso del conejo.

REFERANCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Campbell, D.H.,; Garvey, J.S.; Cremmer, N.E. and Sussdorf, D.H. 1970. Methods Immunology. 2 ed. W.A. Benjamn, Inc Editores. New York. in

2. Kabat, E.A. y Mayer, M.M. 1068. Inmunoqumica Experimental. 1 ed. La Prensa Mdica Mexicana. Mxico.