MICROSCOPUL ELECTRONIC

Microscopul electronic permite studiul detaliilor structurilor, datorit puterii de rezoluie ce depete cu mult puterea de rezoluie a microscoapelor fotonice. Pentru obinerea imaginii utilizeaz fasciculul de electroni n locul fasciculului de lumin. Se stie ca puterea separatoare a intrumentelor optice este invers proportionala cu lungimea de unda a radiatiei utilizate. Microscoapele optice nu vor putea da imagini clare ale unor obiecte cu dimensiuni mai mici de circa 0,15 m. Puterea separatoare a putut fi sensibil marit cu ajutorul microscopului electronic, deorece lungimea de und a undei asociate electronului este mult mai mica dect a radiaiilor vizibile sau ultraviolete utilizate de microscopul optic. Microscoapele pot s mreasc doar structuri care sunt mai mari dect lungimea undelor (unda luminoas). Acestea pot obine mult mai mult putere de mrire dect microscoapele standard ce folosesc lumina solar pentru ca electronii au lungime de und asociat mai mic dect cea a luminii. Cea mai mare marire posibila este de 2.000x dect cea initial. Microscoapele electronice moderne pot ajunge la magnificari de aproximativ 1.000.000 x. Din punct de vedere constructiv, microscopul electronic are o structura mult mai complexa decat microscopul optic. Totusi, prtile principale ale microscopului electronic ndeplinesc aceleai funcii ca i lentilele microscopului optic. Ele sunt magnetice sau electrice, dupa cum devierea fasciculului de electroni are loc ntr-un cmp magnetic sau ntr-un cmp electric. In cazul microscopului electronic, electronii pe toata traiectoria lor de la sursa pn la imaginea final, se deplaseaza in vid. Pentru ca imaginea electronic s fie vizibil, este necesar ca aceasta s fie transformat ntr-una luminoas. n acest scop, n planul imaginii finale se afla un ecran fluorescent. Invenia microscopului electronic a fost posibil n urma unor studii experimentale i teoretice n fizic i inginerie. Principiul de funcionare se bazeaz pe postulatul fizicianului francez Louis Victor de Broglie (1924), denumit i natura de und a electronilor. De Broglie a stabilit c electronii au proprieti ondulatorii, adic le este asociat o und i din acest punct de vedere se aseamn cu fotonii. Aceast lungime de und a electronului se numete lungimea de und de Broglie i este dat de formula: = h / mV unde: = lungimea de und a electronului h = constanta lui Plank (6,54 x 10-27 erg/s) v = viteza electronului m = masa electronului. n 1926 Busch a adus date privind construcia primei lentile electromagnetice capabil s focalizeze sau s disperseze un fascicul de electroni. n 1927 ipoteza lui de Broglie a fost verificata experimental de catre fizicienii americani Clinton J. Davisson si Lester H. Germer i independent de ctre fizicianul englez George Paget Thomson, ei demonstrnd posibilitatea de difracie a electronilor i confirmnd astfel datele lui de Broglie, referitoare la valoarea lungimii de und a electronului.

Cercetrile ulterioare au dus la ideea utilizrii fasciculelor de electroni pentru a obine imagini ale obiectelor la rezoluii mai mari dect la microscopul cu lumin vizibil. n 1931 Ernst Ruska i Max Koll au construit primul microscop electronic cu lentile electromagnetice, iar n 1932 Brche i Johannson au construit primul microscop electronic cu lentile electrostatice. Microscopul electronic s-a perfecionat continuu, astfel c n 1939 E. Ruska, H. Ruska i Bodo Von Borries, de la firma Siemens-Halske Berlin, perfecionnd unele modele anterioare, au realizat primul microscop electronic de serie cu o putere de mrire de 40.000 x i o rezoluie de 25. Dup 1970 microscopul electronic a atins apogeul perfecionrii, respectiv rezoluia limit care poate s o furnizeze lungimea de und a electronilor. Cele mai perfecionate microscoape electronice, aflate n exploatare n diferite laboratoare, au rezoluii garantate de 2-3 (n condiii speciale atingnd 1,2 ) i puterea maxim de mrime pe placa fotografic de 800.000x. Prin acestea microscopul electronic permite cercettorului s observe structura intim a materiei, pe o vertical care pleac de la o celul i se apropie de atomul de hidrogen al crui diametru este de 1, fiind instrumentul fr de care n prezent nu se pot concepe noi progrese n biologia celular i molecular. Folosirea intensiv a microscopiei electronice n biologie i medicin a nceput abia dup anul 1950, primele succese mai importante n studiul celulelor fiind legate de numele lui George Emil Palade (n.1912), citolog american de origine romn, unul din fondatorii biologiei celulare, laureat al Premiului Nobel pentru Fiziologie i Medicin n 1974. Contribuia cea mai de seam a microscopiei electronice la progresul biologiei moleculare o reprezint vizualizarea genelor. Cu ajutorul microscopului electronic s-a putut ptrunde direct n procesele fundamentale ale materiei vii. Aplicarea microscopiei electronice la studiul diferitelor niveluri de organizare structural a materiei vii a devenit o practic obinuit n multe laboratoare de cercetare. Faptul c microscoapele electronice de nalt rezoluie sunt aparate extrem de scumpe face ca ele s nu fie accesibile pe scar larg. Clasificarea microscoapelor electronice Clasificarea microscoapelor electronice se face n raport de tipul de construcie i destinaia lor. n biologie celular se folosesc de regul urmtoarele dou tipuri de microscoape electronice (ME): a). microscoape electronice de transmisie sau de tip TEM (Transmission Electron Microscope), folosite pentru investigarea structurilor i ultrastructurilor celulare. Imaginea electrono-optic se obine n urma traversrii electronilor prin preparat, fiind o imagine n plan. b). microscoape electronice de baleiaj (scanning) sau de tip SEM (Scanning Electron Microscope) utilizate pentru explorarea tridimensional a suprafeelor celulare sau a suprafeelor organitelor citoplasmatice. Imaginea electrono-optic este rezultatul reflectrii electronilor de pe suprafaa preparatului pe ecranul fluorescent. Particularitile de construcie ale tuturor microscoapelor electronice nu difer principial unele de altele.

n toate, formarea imaginii unui preparat se bazeaz pe folosirea unei surse de electroni ca mijloc de iluminare a preparatului, care este dirijat ntr-un sistem de lentile electro-magnetice. Elementele constructive ale microscopului electronic de transmisie (TEM) Se deosebesc dou tipuri de TEM: - CTEM = microscoapele electronice de transmisie convenionale cu tensiuni de 20-125 Kv pentru accelerarea electronilor - HVEM = microscoape electronice de nalt voltaj, cu tensiuni de aproximativ 1000 Kv. Microscopul electronic de transmisie convenional (CTEM) Microscopul electronic se bazeaz pe devierea electronilor de ctre un cmp electromagnetic, utiliznd lentile electromagnetice n locul celor obinuite din sticl. Electronii emii de catod, traverseaz sistemele de lentile i preparatul, rezultnd o imagine final ce poate fi observat pe ecranul fluorescent. Pentru ca electronii s poat traversa preparatul este necesar o grosime suficient de mic a materialului biologic de studiat i totodat i o tensiune de accelerare a electronilor suficient de mare. Principalele elemente constructive ale microscopului electronic de transmisie sunt urmtoarele : A. Coloana microscopului - component principal a ME B. Dispozitivele anexe - sistemul electronic, panoul de comand i sistemul de vid A. Coloana microscopului sau sistemul optic este alctuit din: sistemul de iluminare n care intr tunul electronic i lentilele condensor, camera pentru preparat, sistemul pentru formarea imaginii, camera de observaie i camera fotografic. a). Sistemul de iluminare trebuie s asigure o bun strlucire a imaginii prin obinerea unui fascicul intens de electroni cu ajutorul tunului electronic. La rndul su tunul electronic este alctuit din catod (un filament de tungsten n diametru de 0,1-0,2 mm n form de V), cilindrul Wehnelt (care funcioneaz ca lentil electrostatic, avnd rolul de a focaliza fasciculul de electroni) i anodul (un disc metalic perforat n partea central, loc prin care electronii sunt dirijai n axul optic al microscopului). Anodul este legat la pmnt (are potenial 0). n momentul funcionrii ntre catod i anod se dezvolt o tensiune foarte nalt necesar accelerrii electronilor. Curentul de nalt frecven, pornit de la surs, nclzete filamentul de tungsten la o temperatur de 28000C, care determin emisia de electroni din filament. Datorit diferenei de potenial ntre catod i anod, fluxul de electroni este dirijat ctre anod. Pentru buna funcionare a tunului electronic sunt necesare urmtoarele dou condiii eseniale: Un grad nalt de vacuum (vid) la nivelul tunului Prevenirea microdescrcrilor electrice. Nivelul de vid este asigurat de dou pompe care la microscoapele moderne, ajunge pn la 10-5 Torr. Lentilele condensor 1 i 2 sunt componenete eseniale ale sistemului de iluminare. Lentila condensor 1 reduce spotul la ieirea din cilindrul Wehnelt, iar lentila condensor 2 l preia i l transfer pe preparat, iluminndu-l puternic.

b). Camera pentru preparat are form cilindric i face parte din coloana microscopului. Este alctuit din msua pentru preparat (mobil), inelul de rcire a preparatului i o lamp de iluminare a camerei. La exterior i lateral, pe camera preparatului este fixat mecanismul de previdare i de schimbare a preparatului, dispozitivul de anticontaminare i fereastra de observaie. c). Sistemul de formare a imaginii asigur obinerea unor imagini de foarte nalt calitate. Formare imaginii are loc n 3 trepte, folosindu-se 3 lentile: obiectiv, intermediar i proiector. d). Camera de observaie este situat la nivelul panoului de comand i este prevzut cu 1-3 ferestre de observaie (10x20 cm). Ea face legtura ntre lentila proiector i caseta fotografic, fiind dotat cu un binocular pentru observarea imaginii pe ecranul fluorescent. Ecranul fluorescent este alctuit dintr-o plac metalic, de form circular, acoperit cu o substan fluorescent (monocristale de sulfur de zinc sau cristeale de sulfur de zinc i sulfur de cadmiu). e). Camera fotografic este situat sub camera de observaie i realizez fotografierea, deplasarea plcilor expuse, imprimarea pe ele a numrului de ordine i a treptei de mrire, fiind comandat de un exponometru automat. B. Dispozitivele anexe a). Sistemul electronic, alctuit din dou blocuri tranzistorizate: unul furnizeaz tensiunea nalt, stabilizat, iar cellalt alimenteaz circuitele lentilelor i sistemul de vid. Voltajul nalt este generat de un circuit de nalt frecven (20 kHz). b). Sistemul de vid, alctuit din dou pompe rotative preliminare de vid cu ulei, o pomp de difuzie cu ulei, tubulatur i conducte, realizeaz un vid naintat, de ordinul a 10-4-10-6 Torr, care asigur deplasarea fasciculului de electroni de la tun la ecranul fluorescent. Drumul fasciculului de electroni prin microscopul electronic TEM: - fasciculul de electroni traverseaz preparatul i cu ajutorul sistemului de formare a imaginii pe ecranul fluorescent se obine imaginea preparatului supus examinrii care apoi poate fi fotografiat. Microscopul electronic de nalt voltaj (HVEM) Este un microscop cu putere de rezoluie mare i permite vizualizarea n profunzime a structurilor, oferind o imagine tridimensional a celulei. S-au putut studia infrastructura matricei citoplasmatice i sistemul tubular transvers n fibra muscular striat. Se deosebete de CTEM prin urmtoarele: - tubul accelerator este de dimensiuni mari, accelerarea electronilor fiind de 10 ori mai mare. - diferena de potenial ntre anod i catod este de aproximativ 1000 KV, ceea ce confer electronilor o energie suficient de mare pentru a traversa seciuni de civa micrometri sau chiar ntreaga celul - imaginea obinut este o radioscopie cu electroni ce evideniaz structura intern a celulei, fr a fi necesar secionarea ei sub 0,5 microni ca la CTEM - rezoluia i adncimea sunt la fel de bune pe toat grosimea preparatului.

Structurile cu densitate mare care disperseaz electronii apar de culoare neagr i sunt denumite electrono-dense, iar cele cu densitate mic ce permit trecerea nedeviat a electronilor sunt denumite electrono-clare. ntre aceste dou extreme exist o gam larg de structuri cu densiti diferite care dau diferite nuane de gri. Elemente constructive ale microscopului electronic de baleiaj (SEM) Acest tip de microscop ofer imagini tridimensionale ale suprafeelor probelor de studiat, dar nu poate furniza detalii morfo-structurale din interiorul preparatului. Difer de TEM prin faptul c fasciculul de electroni nu strbate preparatul, ci se reflect pe suprafaa lui. Constructiv, SEM mai prezint un sistem de detectori care colecteaz electronii secundari, reflectai de pe suprafaa preparatului i l prelucreaz, dup care electronii sunt proiectai pe un ecran, unde vor forma o imagine spaial a probei analizate. In raport de particularitile principiului de funcionare, microscoapele electronice de baleiaj sunt alctuite din urmtoarele 3 uniti funcionale distincte, legate ntre ele: a) Sistemul electrono-optic b) Sistemul de vid c) Sistemul de operare i afiaj a). Sistemul electrono-optic cuprinde coloana microscopului, camera pentru preparat i sistemul de detectori. n partea superioar a coloanei microscopului se gsete tunul electronic, tip triod cu termocatod cu tungsten. Tensiunea de accelerare aplicat la tun, n trepte, de la 1000 V n sus, n funcie de preparatul examinat, nu depete 60.000 V, iar fasciculul de electroni accelerai, la ieirea din cilindrul Wehnelt, are un diametru de 250.000500.000 . De aceea, pentru a putea fi folosit, fasciculul trebuie redus pn la diametrul de cel mult 100 . Reducerea diametrului se realizeaz cu ajutorul a dou lentile condensor. b). Sistemul de vid este asigurat de dou pompe rotative i o pomp de difuzie. Unele microscoape folosesc cte o singur pomp rotativ, avnd o putere de evacuare de 6 m3/h, respective 100 l/minut i cte o pomp de difuzie de 500 l/minut. c). Sistemul de operare i afiaj. Sistemul de alimentare este similar cu cel folosit la microscoapele TEM. Sistemul de afiaj reprezint partea care prelucreaz semnalele primite de la preparat, prin intermediul detectorilor de semnale i de redare a acestora sub form de imagine. Formarea imaginii se realizeaz cu ajutorul electronilor secundari sau reflectai, care apar n urma bombardrii preparatului biologic cu fasciculul primar de electroni. nregistrarea imaginii se face cu ajutorul unor aparate fotografice care utilizeaz film de 35 mm sau cu aparate de tip Polaroid. Aplicaii practice ale microscopiei de baleiaj Avnd n vedere particularitile constructive i funcionale ale microscoapelor de baleiaj, se pot obine nu numai date privind aspectul suprafeei unei structuri sau formei ei tridimensionale, ci i analiza unor propriti fizice i chimice ale preparatului.

n practica hematologic microscopia de baleiaj a devenit o metod de rutin n studierea aspectelor funcionale i a modificrilor suprafeei celulelor n condiii patologice. Practic microscopia de baleiaj ofer posibilitatea diferenierii proliferrilor limfocitare de tip T de cele de tip B, diferenierii histocitelor macrofage precum i a altor categorii de celule din seria mielomonocitar. De asemenea are numeroase aplicaii n biologia celular i molecular, patologie celular, oncologie, microbiologie, etc. Fotografierea n microscopia electronic Preparatele biologice folosite n microscopia electronic sunt deosebit de fine i supuse degradrii. De aceea pentru cercetarea imaginilor preparatului i interpretarea lor se efectueaz fotografii. Toate microscoapele electronice sunt prevzute cu dispozitive speciale de fotografiere, unele complet automatizate. De regul, o dat cu instalarea microscoapelor electronice se asigur i un laborator fotografic. Pentru fotografiere se folosesc plci fotografice, de obicei n casete de 24 buc. a 6,5/9 cm fiecare. Plcile sau filmele fotografice folosite current n microscopia electronic conin un strat de emulsie fotografic pentru imagini alb-negru. La nceputul anului 1983, un colectiv de specialiti romni din cadrul Institutului Pasteur din Bucureti ( dr. Nicolae Manolescu, dr. Dan Pltineanu i dr. Romulus Begnescu) a definitivat o tehnic inedit de transformare a imaginilor alb-negru, specifice microscopiei electronice de baleiaj, n imagini color, cu ajutorul unui aparat romnesc denumit Optimascop. Noua metod permite efectuarea de investigaii valoroase n domeniul citologiei i virusologiei. Pn n pezent au fost explorate cu succes detalii ale virusurilor, ale celulelor normale i canceroase, facilitnd diagnosticul n diferite afeciuni. n prezent microscoapele electronice sunt asistate de computer, vorbindu-se de microscopie electronic digital care permite efectuarea i stocarea a numeroase imagini, care ulterior pot fi prelucrate digital, de la reconstrucii 3D pn la imagini color. Microscopul electronic este folosit n diferite domenii de cercetare, dar una din utilizarile curente este in domeniul cercetarilor medicale i biologice. Substanele biologice, n general, nu pot fi studiate sub form vie, deoarece la o tensiune curent de 30-50.000 V, timpul de expunere a probelor biologice n vid este destul de lung, ceea ce conduce la distrugerea esuturilor vii. n 1962 a fost pus la punct un microscop electronic pentru cercetarile biologice pe viu. La acest microscop se foloseste o tensiune de 2.000.000 V, ceea ce conduce la micorarea sensibil a timpului de expunere i la o absorbie mult mai mic a fasciculului de electroni n proba biologic. Ulterior s-au construit i alte microscoape protonice i ionice care au condus la mriri de 10 -15 ori mai mari dect cele obinute cu microscopul electronic. Cu ajutorul microscopului ionic s-au obtinut fotografii clare ale pozitiilor atomilor n reteaua cristalin. Oamenii de tiin folosesc microscopul electronic n diferite domenii de cercertare incluznd medicina, biologia, chimia, metalurgia, entomologia (studiul insectelor), fizica, etc. nc din 1930 cand a fost folosit pentru prima dat microscopul electronic a revolutionat studiul structurilor microscopice i al suprafeelor.

Microscoapele electronice s-au dovedit a fi unelte puternice de cercetare pentru investigarea structurii principale a materiei n special n curtea medicinei, biologie si tiina materiei solide. Acestea au ajutat de exemplu pentru a descoperi natura structurii suprafetei a unei varieti de metale i confirmarea formei i comportamentului bacteriilor la fel i a celulelor animale i umane. Sunt importante n cercetarea efectelor variatelor manipulatii sau tratamente ale acestor variate tipuri de subiecte ale materiei. Oamenii de tiin si ziaritii adeseori adauga culoare naltei caliti a detaliului microscopului pentru a creste interesul, pentru a ajuta la imagine si pentru a sublinia ariile importante n care acesta i joac rolul su important, vital n domeniul vast al tiinei. Microscopul electronic a dat tiinei i mediului fotografic i video remarcabile imagini cum ar fi feele insectelor, formele organismelor microscopice i suprafaa structurii moleculelor ale noilor obiecte i alte substane. Tipuri de informaii care se pot obine prin microscopie electronic: Ultrastructura diferitelor tipuri de celule i a componentelor acestora n stare normal i patologic Structura i configuraia macromoleculelor proteice Procese de transcripie i translaie n codul genetic Alctuirea molecular a virusurilor i mecanismul infeciei virale Structura suprafeelor esuturilor, celulelor i biomoleculelor Configuraia molecular a acizilor nucleici i stabilizarea greutii lor moleculare Aciunea unor substane asupra structurilor (chimioterapie, pesticide) Localizarea reaciilor imunologice i a activitii enzimatice Analize de compoziie chimic Transportul ionic prin celule Procese de filtrare prin membrane Biosinteza de proteine i structuri Gradul de nrudire genetic dintre organisme.