ANALIZA CHIMIC A PLANTELOR

Extracia asistat de ultrasunete

Din punct de vedere fizic, sunetul este vibraie
mecanic care se transmite printr-un mediu sub
form de und

In funcie de frecven se clasific astfel:
infrasunet, frecvene mai mici de 20 Hz,
acustic, frecvene n domeniul 20 Hz i 20 kHz
ultrasunet, frecvene mai mari de 20 kHz
Efectul ultrasunetelor asupra unui fluid continuu l
reprezint presiunea excercitat:



P
a
=P
a, max
sin(2tft)



P
a,max
- presiunea maxim, f frecvena undei, t- durata




Consecine:



determin scderea distanei
dintre moleculele acestuia

pentru anumite valori ale
acestei presiuni, moleculele
se vor apropia la distane
mai mici dect distana
critic pentru meninerea
lichidului n stare intact i
va aprea fenomenul de
cavitaie

cavitaia - proces dinamic de
formare, dezvoltare i
implozie a unor bule sau
caviti umplute cu gaze i
vapori, numite bule
cavitaionale


Dimensiunea bulei este invers proporional cu
frecvena undei:
ultrasunetele de frecven joas (16 100 kHz)
genereaz bule cavitaionale mari

Ultrasunetele de frecven mare nu produc
fenomenul de cavitaie
Apariia i dezvoltarea bulelor cavitaionale necesit prezena
unor factori favorizani, numii germeni cavitaionali



Impuritile aflate n lichid precum i imperfeciunile de form ale
corpurilor solide care mrginesc sau vin n contact cu fluidul n
micare, favorizeaz reinerea unor volume microscopice de gaz
nedizolvat n lichid care constituie nucleele sau germenii de
cavitaie
Bulele cavitaionale sunt de
dou tipuri:

stabile
tranziente


Bulele cavitaionale stabile au
aproximativ dimensiunea de
echilibru i pot exista ca atare pe
parcursul a mai multe cicluri

Bulele cavitaionale tranziente pot
avea raze pn la de dou ori
mai mari dect raza iniial nainte
i sufer implozia
Photograph of a transient cloud of cavitation
bubbles generated acoustically
Temperatura i presiunea la care are loc implozia bulelor
cavitaionale sunt exprimate:

P
) ( P
T T
max
max
1
0

=
1
1

=
P
) ( P
P P
max
max
unde: T
0
temperatura camerei, - este raportul cldurilor specifice ale gazului i amestecului gaz-
vapori, P presiunea n bula cavitaional corespunztoare dimensiunii maxime a acesteia; aceast
presiune este presupus a fi egal cu presiunea de vapori a lichidului, P

. Pentru gaze monoatomice,

are valoarea 1.67 iar pentru gaze biatomice, are valoarea 1.40

Temperaturile i
presiunile locale pot
atinge valori de mii
de K i respectiv,
sute de atmosfere
cavitation bubble implosion
Efectele de tip mecanic care apar ca urmare a
propagrii ultrasunetelor sunt:


formarea de microfluxuri - care const ntr-o circulaie
independent de timp a lichidului, care se produce n imediata
vecintate a bulelor aflate n micare, sub aciunea presiunii
oscilante exercitate de ultrasunet



formarea de microjeturi bulele cavitaionale odat formate n
zonele de presiune sczut sunt preluate de ctre curentul de
lichid i transportate n regiuni cu presiuni mai ridicate unde are
loc implozia bulelor cu apariia unui microjet de lichid care
circul cu vitez foarte mare 100 - 1000 m/s
A water vapor bubble reveals a water jet toward the surface during
the collapse, which produces an intensive acoustic signal
Extracia speciilor din
probele de plante se
produce datorit








valorilor extrem de mari ale
presiunii i vitezelor generate n
lichidul nconjurtor bulei n timpul
imploziei

undelor de oc emise n urma
imploziei

impactului microjeturilor lichide
care strbat interiorul bulei
Cavitation bubble collapse and plant material releasing:
example of extraction of essential oil from basil
Optimizarea condiiilor de extracie asistat de
ultrasunete:

raportul prob-solvent
tip solvent
frecvena undei
durata extraciei


Metode de extracie asistat de ultrasunete
cuplate cu alte metode
On-line coupled dynamic ultrasound-assisted
extraction (DUAE)

Cuplare on-line cu HPLC




ultrasound-assisted liquid-phase microextraction (ULPME)

ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction
(UDLLME)

ultrasound-assisted headspace liquid-phase
microextraction (UAHS-LPME)

Extracia asistat de microunde

Microunde:
unde electromagnetice cu frecvene
n domeniul 300MHz-300GHz,
poziionate ntre razele X i cele
infraroii n spectrul electromagnetic

Microundele sunt utilizate n dou
direcii:
comunicaii
surs de energie







Spre deosebire de procesul de nclzire convenional care este
dependent de fenomenul de conducie-convecie i care este
nsoit de pierderea unei pri din cldur spre mediul ambient,
n cazul nclzirii sub aciunea microundelor, procesul este
direcionat i selectiv i nu este nsoit de pierdere de cldur




permite reducerea timpului de extracie n comparaie cu
metodele convenionale de nclzire (mai puin de 30 min)
Principiul nclzirii cu microunde are la baz
impactul direct al microundei cu materialele
polare/ solvent i este guvernat de dou fenomene:

conducia ionic
rotaia dipolilor

fenomene care de obicei se produc simultan
Conducia ionic se refer
la migrarea ionilor sub
aciunea cmpului electric
variabil, component a
oricrei radiaii
electromagnetice; soluia
se se opune migrrii ionilor
ceea ce genereaz frecri,
care, n ultim instan
nclzesc soluia


Rotaia dipolilor se refer la
realinierea dipolilor
moleculari n cmpul
electric variabil, care se
petrece cu absorbie de
energie
Inclzirea se produce numai la frecvena de 2450MHz

Componenta electric a undei variaz de 4.9x10
4
ori/s

In aceste condiii, dipolii moleculelor nu se vor putea alinia cu
cmpul electric i vor cpta o micare de vibraie care genereaz
cldur

Numai un material polar sau cu dipol moment
permanent se va nclzi sub aciunea
microundelor
Eficiena nclzirii este dependent de factorul de disipare
(tan )msur a capacitii solventului de a absorbi energia
microundelor i de a o transmite sub form de cldur soluiei:


tgo=c/c

unde: - pierderea dielectric - msur a conversiei energiei
microundelor n cldur
- constanta dielectric - msur a polarizabilitii
unui solvent n cmp electric


Mecanismul extraciei din probe de plante




sub aciunea microundelor, microumiditatea din celulele plantei
se evapor presiune enorm asupra pereilor celuleirupere
constituienii celulei curg n solvent

Dispozitive:

cu vas nchis (closed-
vessel)
cu vas deschis (open-
vessel)


Componente:

generator de microunde
- magnetron
sistem de focalizare al undei
aplicator locul unde se
plaseaz proba
sistem de direcionare al
undei- asigur propagarea
undei numai n direcia
nainte
Parametrii care influeneaz extraca:

tipul solventului
durata extraciei
volumul solventului
temperatura energia undei
matricea probei



Avantaje:

o durata: 15-30 min
o volume mici de extractant: 10 30 mL
Metode de analiz
Metode standardizate
DETERMINAREA CONTINUTULUI DE MATERIE
USCATA

Metoda gravimetric determinarea procentului de materie uscat
din plante pe baza pierderii apei libere prin inclzire la 105
0
C, timp de
2 ore

Coninutul de materie uscat este folosit pentru corecia coninutului
celorlalte elemente prin raportare la mas uscat absolut

Metoda nu permite ndeprtarea apei legate chimic

Reproductibilitate: 7%

Observaie
Prin uscarea probelor la 105
0
C, o parte din compuii C, N i S se pot
pierde prin volatilizare
DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL:
AZOT KJEHLDAL-MICROKJEHLDAL
Metoda Kjeldahl determinarea cantitativ a amoniului din plante pe
baza oxidrii pe cale umed a materiei organice i folosirea unui
catalizator pentru dizolvare

Determinare:
distilare n acid boric i titrare
spectrofotometrie de absorbie molecular n UV-Vis
poteniometrie cu electrod ion selectiv
conductivitate

Metoda nu permite recuperarea cantitativ a N din compui organici
heterociclici ( acid nicotinic) sau din forme oxidate

Metoda se folosete att pentru determinarea continutului de azot n
plante ct i pentru estimarea necesarului de fertilizator

Limit de detecie: 0.05%N

Reproductibilitate: 4%
AZOTATUL EXTRACTIBIL
METODA CU ELECTROD ION SELECTIV
Metod semicantitativ determinarea concentraiei de azotat-
azot din plante, bazat pe extracia n soluie de sulfat de
aluminiu urmat de determinare poteniometric cu electrod
azotat selectiv

Determinare:
poteniometrie direct

Determinarea este sensibil la variaii ale forei ionice

Interfereni: Cl
-
, sulfat

Limit de detecie: 200mg/kg (prob uscat)

Reproductibilitate: 18%.
DETERMINAREA SULFULUI TOTAL
Metoda implic:
descompunerea compuilor organici i conversia
sulfului anorganic n sulfat
determinarea sulfatului

Determinare
a) cromatografie ionic
b) indirect prin ICP-AES
c) reducere cu acid iodhidric urmat de determinare
spectrofotometric cu o soluie de Bi(NO
3
)
2
5H
2
O n
gelatin
d) determinare pe baz de precipitare ca sulfat de bariu
KITURI SI PROCEDEE PENTRU TESTARE
CONTINUTULUI IN NUTRIENTI
Kiturile sunt destinate utilizrii n analiza pe teren i furnizeaz
rezultatul n timp real

Kiturile pot fi folosite pentru urmtoarele elemente: N, P, K sau
pentru testarea acelor parametrii pentru care detecia i
determinarea necesit doar un singur reactiv sau o combinaie
de reactivi

Detecie:
colorimetric: comparaie vizual sau fotometrie
titrimetric: pe baz de numrarea picturilor de
reactiv titrant necesare atingerii punctului de
echivalen sau folosind un dispozitiv calibrat:
biuret, sering
poteniometrie,
conductibilitate
bazate pe reacii enzimatice
Determinarea B, Mo i Se
Micronutrienii B i Mo i elementul Se, sunt mai greu de determinat
din probe plante datorit coninutului redus al acestora: <0.1 mg/kg
pentru Mo i Se i >10mg/kg B.

Determinarea B
titrimetrie
spectrofotometrie de absorbie molecular n UV-Vis
folosind unul dintre urmtorii reactivi: cucurmin,
quinalizarin, azomethin-H
ICP-AES

Observaii:
Metoda spectrofotometric cu azomethin-H este superioar
celorlalte metode spectrofotometrice deoarece nu necesit
utilizarea de acizi concentrai. Complexul colorat este stabil
timp de 4 ore.
ICP-AES prezint sensibilitate i precizie foarte bune pentru
determinarea B la nivelul de concentraie din plante, ntr-un
interval care acoper deficiena pn la intoxicaia cu B.
Determinarea Mo

Concentraia Mo n plante este de regul 1mg/kg

Determinare:
1. colorimetrie: cu ditiol, folosete un
compusul toluen-3,4-zinc ditiol cu care Mo formeaz un
complex colorat a crui absorban se msoar 680nm.
Metoda este adecvat determinrii Mo din plante ntr-un
interval larg de concentraii. Metoda este adecvat
determinrii att a concentraiilor joase (<0.1mg/kg), ct a
celor corespunztoare intoxicrii plantei cu Mo.

2. GF-AAS, se utilizeaz pentru deteminarea
Mo n domeniul 0-1mg

3. FAAS


Determinarea Se

Deficiena n Se este mai frecvent ntlnit dect intoxicarea cu
Selimita de detecie n domeniul microcantitilor

Determinare:
cromatografie de gaze
spectrofotometrie
generare de hidrur urmat de AAS cu atomizare
electrotermic

Metoda cu generare de hidrur de seleniu (H
2
Se) este poate
cea mai mult utilizat datorit preciziei, rapiditii i
sensibilitii


Limit de determinare: 0.02mg/kg
DETERMINAREA ARSENULUI SI MERCURULUI
Determinarea As

As in plante: 0.02-7 mgAs/kg

Metode pentru distrugerea materiei organice:
dizolvare cu amestec HNO
3
-HClO
4
dezagragare cu fondant alcalin
extracie asistat de microunde

Determinare:
HG-AAS cu generare de arsin (AsH
3
)
colorimetrie cu: dietilditiocarbamatul de argint sau albastrul
de molibden
GF-AAS - afectat de interfereni
ICP-AES

Limita de detecie As: 1-2 mgAs/kg
Determinarea Hg

Hg n plante: 30-700gHg/kg

Preparea probei:

conversia Hg din prob n Hg(II) prin oxidare n mediu
acid cu un amestec HNO
3
-H
2
SO
4
-V
2
O
5
reducerea Hg(II) la vapori de Hg
0
cu SnCl
2
sau SnSO
4

sau NaBH
4



Determinare:
FAAS


Limita de detecie: 0.2-0.3 ng/ml
DETERMINAREA Cd, Cr, Co, Pb, Ni
Cd, Co, Cr, Pb i Ni se gsesc n concentraii relativ joase: <10
mg/kg


Preparare prob:
combustia la temperatur nalt este preferat
datorit volumului final mic al soluiei care se
supune analizei
extracia asistat de microunde

Determinare:
FAAS
ICP-AES
DETERMINAREA COMPUSILOR CU POTENTIAL
TERAPEUTIC SI A ANTIOXIDANTILOR


Compui cu potenial terapeutic:

flavonoide
fitoestrogeni
fitosteroli
carotenoide



Antioxidanii: molecule care pot reaciona cu radicalii liberi i
sunt capabile s inhibe sau s termine reaciile care conduc la
radicali liberi

Radicalii liberi sunt atomi sau grupuri de atomi cu reactivitate
nalt care au un electron nemperecheat pe ultimul nivel
electronic; ei au tendina de accepta electroni de la molecule
stabile

Corpul uman nu produce antioxidani
Antioxidani din plante
Preparare prob
extracie la rece

extracie cu refluxare folosind sisteme de solveni la cald

extracia asistat de ultrasunete sau microunde

extracia cu fluide supercritice
Separare i identificare
Metode cromatografice: TLC, HPLC, GC, LC

Spectrofotometrie de absorbie molecular n UV-Vis pe
baza spectrelor de absorbie ale plantelor n soluii diluate

Spectrometrie IR

MS

RMN

Tehnici cuplate
HPLC
GC-MS
RMN
Vis-RMN-FTIR
Evaluarea activitii antioxidante teste in vitro

ORAC
un generator de radical liber de tip peroxil este adugat
fluoresceinei
se nregistreaz variaia fluorescenei n funcie de timp
se calculeaz aria de sub curbele obinute n prezena, i
respectiv n absena antioxidantului i sunt comparate cu
curbe standard generate folosind antioxidantul, un derivat de
vitamina E solubil n ap, cunoscut sub denumirea de
TROLOX



TRAP- metoda se bazeaz pe msurarea scderii
fluorescenei R-ficoeritrinei n reacie controlat de peroxidare.
Valorile TRAP sunt calculate din mrimea deplasrii de faz
datorate anitoxidantului prin comparaie cu TROLOX.


TEAC- se bazeaz pe msurarea scderii intensitii culorii
la adaugarea unui antioxidant, cromoforului albastru-verde
ABTS+ ( radical liber care nu se gsete n organismul
omului). Antioxidantul reduce radicalul la ABTS, determinnd
decolorarea soluiei acestuia.
DPPH se bazeaz pe msurarea spectrofotometric a abilitii
antioxidantului de a reduce radicalul DPPH, care de asemenea,
nu segsete n organismul uman


PSC se bazeaz pe msurarea inhibrii oxidrii
diclorofluoresceinei de ctre antioxidani care reacionez cu
radicalii peroxil generai prin degradarea termic a 2,2-
azobis(amidinopropan)-ului

TOSC- se bazeaz pe reacia dintre radicalii peroxil i acidul -
keto--metiolbutiric din care rezult etilen care este msurat
prin cromatografie de gaze

FRAP- se bazeaz pe msurarea spectrofotometric a abilitii
antioxidanilor de a reduce ionul feric din complexul pe care
acesta l formeaz n mediu acid cu TPTZ ( clorur de 2,3,5-
trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacuclopenta-1,4-dien). Reducerea
este monitorizat la 593 nm


Testul Folin Cioclteu pentru compuii fenolici se bazeaz pe
msurarea modificrii culorii n urma reducerii unor oxizi
metalici de ctre antioxidanii fenolici: acidul galic i catechin,
cu formarea unei soluii albastre care are un maxim de
absorbie la 764 nm. Se traseaz o curb de etalonare folosind
soluii cu concentraie cunoscut de acid galic, concentraia de
compui fenolici fiind exprimat n echivalent de acid galic
Alte metode utilizate pentru evaluarea activitii antioxidante totale
sunt:


voltametria
biamperometria
biosenzorii amperometrici
RES
metoda bazat pe cultura de celule, considerat mult mai
relevant din punct de vedere biologic dect testele chimice
DPPH
TPC-total phenolic compounds-Folin Cioclteu
Voltametrie ciclic
TEAC-trolox equivalent antioxidant capacity
Amperometrie
Biosenzori
amperometrici