Tcnicas en Biologa Molecular: Estudio de los genes y su expresin

Jos Manuel Lozano Moreno jmlozanom@unal.edu.co jotalozano@gmail.com Departamento de Farmacia Oficina 106

El dogma de la biologa molecular

Membrane Hybridization Assay (Ensayo de hibridizacin en membrana)

Double stranded DNA Melt Single-stranded DNA DNA binds to filter Filter Incubate with labeled DNA Hybridized complemetary DNAs Wash away labeled DNA that did not hybridize to DNA bound to filter Perform autoradiography

Identificacin de un clon especfico en una librera de fago por hibridizacin en membrana

Esther Lederberg, "Lysogenicity in Escherichia coli strain K-12, Microbial Genetics Bulletin, v.1, pp. 5-8 (Jan. 1950); seguido por "Lysogenicity in E. coli K-12", Genetics, v.36, p. 560 (1951) (abstract).

Diseo de sondas de oligonucletidos con base en secuencias parciales de protenas

Secuenciacin N-terminal: mtodo de Edman

El mtodo de degradacin de Edman comprende las etapas sucesivas siguientes (i) formacin de un derivado del extremo N de la protena por reaccin del grupo amino terminal libre con fenil isotiocianato (PITC), (ii) corte del aminocido modificado y (iii) anlisis por HPLC en fase reversa con deteccin UV a 270 nm.

Edman, P. Acta Chem. Scand. 1950, 4, 283.

Cromatografa de intercambio catinico

Identificacin del clon de inters mediante el uso de anticuerpos

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) -Inmunoensayo enzimatico en fase slida-

H2O2 H2O + O2 + TMB: 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

= 570 nm H3PO4 1M

= 450 nm

CHROMOSOME WALKING (Mapeo cromosmico)

vector pQE de Quiagen (Rotulado Histidina)

EcoR1

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Aplicaciones de la PCR (1)

ADN Genmico
Clonacin

Estudios de mutacin
muestra de paciente

Estudios Comparativos
Evolucin del genoma, clasificacin de cepas bacterianas

SNPs
Single nucleotide polymorphysms

PCR Cuantitativa
Identificacin de variacin en el nmero de copias

Secuenciacin

Aplicaciones de la PCR (2)

ARN/ ADNc

Differential Display RT-PCR

Anlisis de transcripcin Comparacin de los perfiles de expresin entre 2 estados: lnea celular estimulada con p.e.una hormona o un antigeno vs. no tratada

Aplicaciones de la PCR (3)

ADN Clonado
Insertos Pequeos Plsmidos Insertos Grandes BAC/ YAC

Amplificacin del Inserto completo

Anlisis del inserto producir material para microarreglos

Estructura Gnica
Determinar el tamao de los intrones y determinar los lmites de las secuencias intrnicas y exnicas basados en el conocimiento del mRNA.

Electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN de diferente tamao

Ethidium Bromide

Visualizacin de fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel

~20 kb

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) permite la separacin de molculas grandes de ADN

~20 kb 10 Mb

Separa molculas muy grandes de ADN Sonda especfica para cada cromosoma

Inmunoblot para identificar genes clonados especficos

Comparacin de los anlisis Southern, Northern y Western

Southern: ADN Northern: ARN Western: Protena

Secuenciacin de ADN: Mtodo de Maxam-Gilbert

G A + G C + T C

SCUENCIACIN AUTOMATIZADA

Determinacin de la diversidad de los anticuerpos

Deteccin de los reordenamientos de los genes de las Igs por hibridizacin (Southern blot )
ADN de Ig en clulas (embrionarias) no comprometidas,clulas no linfoides

ADN de Ig en clulas B comprometidas,de linaje linfoctico B

Tecnologa de anticuerpos recombinantes

Csar Milstein y Georges Khler

Produccin de anticuerpos recombinantes

Mtodos cromatogrficos y sus diferentes aplicaciones

El mtodo ms empleado para separar sustancias es la CROMATOGRAFA

La Cromatografa es controlada por dos fenmenos: - Reparto - Transferencia de Masa Existen mtodos absolutos de anlisis: Potenciometra

Etimologa: CROMATOGRAFA del griego cromos: color; graphos: escribir El botnico ruso Mikhail Tswett hacia 1903 inici la cromatografa en papel

Definiciones

La cromatografa es un proceso fsico en el cual los componentes de una mezcla se distribuyen diferencialmente en dos fases: -Un lecho o FASE ESTACIONARIA -Un percolador o FASE MOVIL -La Fase Estacionaria puede estar conformada por materiales derivados de Slica gel o Almina. -Esta puede encontrarse por ejemplo un soporte de slica gel enlazado a otra molcula (Fase enlazada) -La Fase Mvil arrastra a las molculas del analito a travs de la fase estacionaria

En este proceso de resolucin de una sustancia en funcin de las fases mvil y estacionaria se llevan a cabo procesos de equilibrio y de intercambio de masa constituyendo platos tericos A mayor nmero de equilibrios mayor separacin y eficiencia del proceso Hay sustancias que no interactan con estas fases Las velocidades en este proceso dependen de la CONSTANTE DE INTERACCION o COEFICIENTE DE REPARTO (K)

K = Concentracin de la sustancia en la Fase estacionaria = Cs Concentracin de la sustancia en la Fase Mvil Cm

Isoterma de Adsorcin

Cs

Cm

La separacin de los componentes de la muestra depender de la naturaleza de las Fases mvil y estacionaria as como de la sustancia misma y de otros factores como la temperatura

Clasificacin de la Cromatografa

Cromatografa Cromatografa Lquida

Cromatografa de Gases

Fase estacionaria

Fase mvil

Fase estacionaria

Fase mvil

Slida (G-S)

Lquida (G-L)

Gas

Slida (L-S)

Lquida (L-L)

Lquido

G = Gas; S = Slido; L = Lquido

Cromatografa Lquida

1. Cromatografa en papel

-Ascendente -Descendente -Circular

Clorofilas y Carotenoides (plantas) Mikhail Tswett inici la cromatografa en papel

2. Cromatografa planar

-Capa delgada o fina TLC -HPTLC

TLC. MATERIALES: Placas de silica gel de 5 x 20 cm Cmara desarrolladora con tapa Gua para marcar la placa FM: Sistema de Solvente (n-butanol: cido actico: agua) (4:1:5) Muestras de aminocidos patrn (individuales) Mezcla de aminocidos experimental Horno Ninhidrina en atomizador (revelador) Pipeteador de 2 l, con puntas Lpiz Regla (cm)

Rf = Distancia recorrida por la muestra Distancia del frente de solvente

TLC analtica

Ft Fraccin total P Patrn de diosgenina

TLC preparativa

Cromatograma de la fraccin de inters eluida por la columna obtenida mediante una tcnica preparativa

Column chromatography

HPTLC

Etapas involucradas en el mtodo

J Pharm Pharmaceut Sci (www.ualberta.ca/~csps) 5(1):19-23, 2002

An In Vitro Evaluation of Human DNA Topoisomerase I Inhibition by Peganum harmala L. Seeds Extract and Its -Carboline Alkaloids
Armin Madadkar Sobhani, Sultan-Ahmad Ebrahimi, Massoud Mahmoudian1
Department of Pharmacology, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Received September 13, 2001, Revised January 22, 2002, Accepted March 8, 2002

Se cuantifica midiendo el rea bajo la curva de cada pico correspondiente a cada componente

Figure 1: Chromatogram of HPTLC analysis of P. harmala seeds extract. Peak No. 1: harmaline, Peak No. 3: quinidine sulfate (internal standard), Peak No. 4: harmine. Horizontal axis is distance in millimeter. Vertical axis is fluorescence intensity expressed in an arbitrary unit.

3. Cromatografa en Columna

-Abierta (presin atmosfrica) -Aplicando vaco -Aplicando presin: -Rpida (Flash Chromatography) -Baja presin: LPLC -Presin media: MPLC -Alta presin: HPLC

HPLC:

high performance liquid chromatography (cromatografa liquida de alta eficiencia)

Fase Mvil

Dispositivo Formador de Gradientes Bombas (pistones) Inyector de la muestra (loop)

Columna

Control de temperatura Control de temperatura

Detector

Registrador

Procesador de datos

HPLC

A = Reservorios de los eluentes B = Vlvulas de mezcla electromgneticas con la bomba de pistn doble del movimiento C = Vlvula de descarga D = Regulador de presin E = Mezclador F = Inyector RHEODYNE G = Columna H = Unidad de HPLC I = Detector Arreglo de diodos o espectrometro UV J = Computador-Interface K = PC L = Graficador o impresora

Mecanismos de separacin

. Adsorcin - desorcin . Reparto (particin) . Pares inicos: uso de contraiones . Intercambio inico: aninica y catinica . Exclusin o filtracin en gel . Seleccin quiral . Afinidad

Clasificacin de la Cromatografa Lquida segn la polaridad de la Fase Mvil Cromatografa de fases enlazadas

Fase Normal: Fase estacionaria enlazada por grupos -NH2, -CN, fenil y otras molculas pequeas La fase mvil es menos polar que la fase estacionaria

Fase Invertida o fase Reversa: Fases enlazadas grupos metil (Me), dimetil (DM), octil (C8), octadecil (C18) La fase mvil es m polar que la fase estacionaria

Cromatografa de Gases

Fase Mvil

Sitio de Inyeccin

Columna

Detector

Registrador o Integrador

Horno

Agilent Technologies

Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico

Tiempo (t) o volumen (v)

Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico

tr tr

h tm Lnea base Tiempo (t) o volumen (v) Ancho de base

Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico

tr tr Wh Ancho a media altura h altura de pico

h/2

tm Lnea base Wb Ancho de base Tiempo (t) o volumen (v)

Terminologa

Fc: Flujo verdadero es el flujo o volumen de la fase mvil medida a la salida de la columna a la temperatura y presin de salida Fc = F x T1 T2 Temperatura de la columna Temperatura ambiente

Vr: Volumen de retencin, volumen de la fase mvil necesario para que un compuesto se resuelva Vr = tr x Fc Vm: Volumen muerto, volumen en el cual eluye el solvente o fase mvil Vm = tm x F Vr: Volumen de retencin corregido Vr = Vr - Vm

K: factor de capacidad, tiempo durante el cual cada compuesto es retenido K = tr / tm Normalmente entre 2 -10 : Factor de separacin o ndice de retencin relativa, describe la posicin relativa de un pico respecto a otro = tr(B) / tr(A) Si es igual a 1 entonces no hay separacin, esta debe ser mayor que 1 R: Resolucin, es la medida de la capacidad de separacin de dos picos. Es una medida de la eficiencia de la columna R = 2t / (Wb1 + Wb2) n: Nmero de platos tericos, indica el nmero de equilibrios o nmero de transferencias de masas n = 16 (tr / Wb)2, n = 5.54 (tr / Wb)2 H: Altura de platos tericos H=L/n (longitud de la columna)

(4 min) y tr1

(8 min) tr2

= tr2 / tr1 = 8 min/ 4 min =2 R = 2t / (Wb1 + Wb2) t Wb1 (3 min) Wb2 (4 min) R = 2 x (8 min 4 min) (3 min + 4 min) R = 1.14

tm

Velocidad de la carta = 0.5 cm / min R > 1.5 garantiza el 100% de separacin R = 1 indica separacin de un 90 %

Affinity Chromatography (AC)

Ion Exchange (IEX)

Ion Exchange (IEX)

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

Gel Filtration (GF) Chromatography

Reversed Phase Chromatography (RPC)

Chiral Chromatography

Bibliografa - Weaver R. (McGraw-Hill, 2002). 2nd issue. Molecular Biology 2nd ed . Baltimore D, Lodish H and Darnell J. Biologia Celular. y Molecular. Labor SA. Primera edicion. New York. 1986 Skoog DA, West DM, Anlisis Instrumental, Interamericana, 2a Ed, Mexico, 1986 Willard HH, Merrit LL, Dean JA, Mtodos Instrumentales de Anlisis, Ed Iberoamericana, 7a Ed, FA Settle, 1991 Ewing GW, Mtodos Instrumentales de Anlisis, McGraw-Hill, 4a Ed, Mexico, 1978 Journal of Chromatography, pISSN: 0021-9673, Elsevier, 2008
Rojas JH, de Nigrinis S, Guas para Laboratorio de Anlisis Instrumental Farmacutico, Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia