Nomenclatura

ionilor

fragment

pentru

determinarea

secvenei

aminoacizilor din peptide i proteine Secvena aminoacizilor din proteine i peptide poate fi determinat utiliznd cantiti infime de prob: 10-9-10-12g folosind fie un spectrometru ESIQTOF fie un CID-FAB-MS-MS. S presupunem c se opereaz n modul ion pozitiv. Deoarece secvena repetitiv din proteine este aceiasi NH-CH(R)-CO fragmentrile controlate n CID care au cea mai mare probabilitate s se produc pot s fie doar de urmatoarele tipuri: -scindarea legturii C C -scindarea legturii C-N - scindarea legturii N C

ceea ce conduce la obinerea a 6 fragmente crora li se atribuie prin convenie notaia an, bn, cn, atunci cnd sarcina pozitiv este pstrat pe fragmentul care conine acidul N-terminal i noaiile xn, yn i zn atunci cnd sarcina pozitiv este pstrat pe fragmentul care conine acidul C-terminal. Indicele n indic numrul de aminoacizi coninui n fragmentul respectiv. Indiferent unde s-a rupt molecula, fragmentele ncrcate electric rezultate pot fi reinute i supuse unei noi fragmentri astfel nct se poate realiza secvenializarea (determinarea locului de aezare al AA-cizilor n lanul polipeptidic) oricrei proteine. n figura 18 se va arta explicit modul de atribuire a notaiilor fragmentelor provenite de la secvenializarea unei proteine:

an
NH2 CH R C O NH CH R

bn
C O

cn
+
NH CH R COOH +H +

xn
+
H NH CH R C O N CH R C

n yn +

zn
CH R C O NH CH R C O OH

NH

n-1

n-1

an
H NH CH R

xn
NH CH R

C O

NH2 CH R

C O

NH

CH R

C O

OH

n-1

n-1

bn
+
H NH CH R C O NH CH R C O NH 3

yn
+
CH C O NH CH R C O OH

cn

n-1

n-1

zn

Figura. Nomenclatura scindrilor intr-o secven peptidic

Diferena de mas ntre doi ioni consecutivi supui fragmentrii permite aflarea identitii fragmentului pierdut i astfel determinarea secvenei. Exist dou excepii unde interpretarea spectrului poate crea confuzii: Ile cu Leu care sunt izomeri i Gln cu Lis care sunt izobari. Cnd exist astfel de situaii se apeleaz la izolarea fragmentelor i supunerea acestora unor fragmentri n condiii specifice care s individualizeze natura acestor aminoacizi.

Nomenclatura glicoconjugatilor

ionilor

fragment

pentru

determinarea

secvenei

Secvenializarea oligo, polizaharidelor, a glicoproteinelor si glicolipidelor este una dintre marile cuceriri ale ultimei decade. Varietatea naturii legturilor precum i a dificultii de ionizare a acestor molecule a fcut imposibil utilizarea lor n analiza spectrometric de mas sub forma nederivatizat (adic nemodificat la nivelul gruprilor hidroxilice) pn la apariia tehnicilor ESI, MALDI, Q i IT. Pe lng obinerea picului molecular M+ se obin de regul funcie de condiiile de lucru alese o serie de picuri care dein informaii foarte valoroase asupra modului cum unitile monozaharidice se leag n interiorul lanului polizaharidic. Mai mult chiar folosind variantele MS-MS sau ESI-QTOF-MS-MS sau MALDI-TOF-TOF se pot alege astfel de condiii n care unitile monozaharidice constituente ale lanului s fie ndeprtate pe rnd realizndu-se astfel determinarea secvenei polizaharidice. Fragmentele rezultate au fiecare semnificaia lor precis iar convenia de notare dupa Domon i Costello, azi unanim acceptat este prezentat n continuare. Orice polizaharid conine captul nereducator, respectiv captul reducator, care n unele situaii poate fi legat de o proteina sau un lipid. Partea neglucidic a lanului polizaharidic se numeste aglicon Lagturitle cele mai afectate de rupere (fragmentare) sunt legturile eterice dintre unitaile monozaharidice i de aceea sunt i cele mai frecvente. Fragmentele care rezult n urma scindrii acestor legturi se noteaza cu Z i Y dac conin captul reductor (respectiv agliconul) i cu B i C dac conin captul nereductor. Uneori fragmentarea lanului oligozaharidic nu are loc n dreptul legturilor eterice ntre unitile constituente ci chiar n interiorul heterociclului constituent al zaharului. n cazul n care fragmentul rmne ataat de specia ionizat care conine captul reductor (sau captul ce conine agliconul) el se noteaz cu X;

dac fragmentul rmne ataat de specia ionizat care conine captul nereducator el se noteaz cu A. Att n notaia lui A ct i a lui X apar indici superiori care indic n dreptul crei legturi din heterociclu are loc scindarea. De exemplu:
2,4

A2 aceast notaie

ne furnizeaz urmatoarea informaie: fragmentul respectiv aparine captului nereductor, la nivelul celui de-al doilea zahr s-au scindat legturile ntre atomii de carbon numerotai cu 2 i 4.

Y3 Z3
CH 2OH O OH OH OH OH O OH CH 2OH O

Y2 Z2
CH 2OH O O OH

Y1

Z1
CH 2OH O

Yo Zo

OH

OH

OH

B1 C1
Capatul nereducator

B2 C2

B3 C3

B4 C4
Capatul reducator

1,4X 3
CH2 OH O OH OH OH O O OH

2,5X 2
CH2 OH O O O OH OH CH2 OH O

1,5X 1

6
CH2 OH

4
O O

5
OH

1 2
OH

OH

O,2A

2,4A 2

2,5A 3

Figura. Nomenclatura scindrilor intr-o secven oligozaharidica

Oligo i polizaharidele pot fi fragmentate att n mod ion pozitiv ct i n mod ion negativ. n ambele situaii fragmentele rezultate pot aprea imbogite ca mas, observndu-se frecvent picuri care sunt cu 23 Da sau 39 Da (sau multiplii ai acestor valori) mai grele decat masa calculat teoretic. Acest fapt rezult din aceea c soluia care conine polizaharidul de ionizat conine ioni de Na sau de K care formeaz aduci cu gruprile hidroxilice; apar astfel n spectru picuri corespunzatoare ionilor mono, di sau polisodiai care se noteaz [M+ xNa]n+. n locul sodiului poate fi potasiul sau n unele cazuri ambii ioni. Frecvente sunt i pierderile unei sau mai multor molecule de ap: n acest caz picul apare srcit cu valoarea de 18 Da sau multiplii ai acesteia. Astfel de picuri se noteaza [M-pH2O]n+ Din analiza tuturor fragmentelor din spectrul de mas se pot deduce: - natura unitii glucidice constituente - tipul de legatura ntre unitile glucidice(1-4,1-3,1-6) - ordinea n care unitile glucidice se succed n lant. Nu se poate nca determina geometria legturii anomerice (alfa sau beta). n acest mod se pot secvenializa probe de oligo sau polizaharide care nu cantaresc mai mult de 9-10pg.