Sunteți pe pagina 1din 6

Metodemoderne- metode care folosesc un reactantimunotogic marcat 1.

Reaelia imunofluorescenfa de (RlF)


Fluorocromii: se leagdcovalentde proteine(imunoglobuline)= conjugat emit fluorescen{idacdse expun la razeIJV izotiocianatulde fluoresceinr(galben-verzui), rodamina(portocalie) nu sunt stabili in tirnp

1.1 Metoda directi Preparatul examinatse monteazd lamd. Se adaugdconjugatele. cazulin care de pe in se gdsesc corespunzitoare ag anticorpilormarca{i,se formeazdcomplexeleimune.prin spdlarese indep6rteazd conjugatele nelegate. Preparatul examineaz6lamicroscopulcu se Punctefluorescente fond intunecat:in preparatulexaminatau fost prezente pe ' fluorescen{d. antigenelecdutate (rezultat pozitiv). Absenlapunctelor fluorescente: preparatnu au fost prezenteantigenele in cdutate (rezultatnegativ).

anttgendin preparatulrnontatpe laml (preparathistologic

'I

saususpensie pe culturi de celule infectate) de

anticorpmarcatcu fluorocrom

1.2 Metoda indirecti Lapreparatul montat pe lamd se adaugdanticorpi specifici nemarcafi.. in cazul in care existl ag coresputtzitoare anticorpilor,se formeazdcomplexeleimune. Prin spalarese indepdrteazd nelegali.Se adaugd ac anticorpiantiglobulinici marcali cu fluorocrom. Dacb existdin preparatcomplexeimune, conjugatele vor legade imunoglobuline.Examinarea:la se fel ca la metodadirect6.

X
A

anticorp antiglobulindrnarcatcu fluorocrom

anticorp specificantigenuluicdutatin preparat

Obfinerea anticorpilor antiglobulini

1.3 Metoda de colorare a complementului

2. Metodaimunoperoxidazice flPO)
marcareenzimaticd- peroxidazd (descompune peroxidul); vizualizarease rcalizeazdprin addugarea substratului cromogen- rdzultd un precipitatmaroniu, insolubil, vizibil la microscopuloptic se realizeari la fel ca gi RIF avantaje: - preparatele fi pistrate in timp pot nu estenecesar microscopspecial

rt
$f-

antigendin preparatulmontatpe lami (preparathistologic saususpensie pe culturi de celule infectate) de

T
I

anticorpmarcatcu peroxidazd

{\

3' Metode imunoenzimatice(RlE, ELIS^A enzyme-linkedimmunosorbent assay)


Permit detectarea antigenelorlibere gi a anticorpilor.Esteposibil6 determinare cantitativd. La reacfii particip5: un reactantimunologic cunoscutata$at un suportsolid (pl6ci cu godeuri, lame, de baghete)- pot folosi antigene,anticorp! anticorpi monoclonali,proteinaA) Se un reactantimunologic marcatenzimatio- peroxidaza substratspecific (cromogenic).Seproduceo modificarede culoaredetectabill spectrofotometric (determinarecantitativl) substanfepentru stopareareacliei (ba7esau acizi putemici) Reaefiileau loc in aparateautomate, semiautomate. intre reacfii - spilare cu solulii tampon

L6

Detectarea antigenelor

Y
I

anticorpi specifici

a
I

anticorpi marcaf enzimatic i

I
fr
Detectarea anticorpilor

antigen? substratcromogen

stoparea reacfiei

?
t
*

anticorp antiglobulin ic marcat anticorp?

antigen cunoscut

gifi i r$*nsr pri* detectereft a*ipl$er Ixtacief,fi r$srgamt$ B.icru *nr*a. xmifl
Genomul conline secventespecifice pentnr fiecare microorganism, detectareaprezenfei acestoraintr-un produs patologic sauin culnrri celulare are valoare diagnostici.

1. Metode de hibridizare Principiu: fragmente monocatenarede oligonucleotide marcate (sonde), avdnd secven{i cunoscut6(caracteristici unui virus) sevor atasapebaza complementaritn$i de secvente complementaresituate pe acizii nucleici ale microorganismului de identificat. Etapede lucru: extragereaacizilornucleici denafirrareaacizilornucleici gi fixarea acestorape un suport hibridizare: adiugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substanle radioactive) qi atagarea acestorade secventeleomoloage eliminareasondelornefixate vintalizarcahibridizdi

Vizualizarea se face in func1iede tipul marcajului folosit.


TGC A

denaturare

t/r
________-_-+

1.1 Metoda Southern blot Se detecteazdsecventespecifice de nucleotizi de ADN. Etape: extragereaADN-ului denaturareaADN-ului - se oblin lanfirri monocatenare fragmentarealan$rrilor cu enzime de restric{ie (acesteaacfioneaziin locusuri determinate,rezult6nd fragmente de hmgime diferiti, caracteristice)

-10-

,.t#o:!

f - i :'i i. .

electroforetici a fuagmentelortn gel de agarozl (separarease face ln fimctie separarea de mdrimea fragmentelor)

transferareape membrani de nitrocelulozi * de ad6ugareasondelor mmcate cu substanleradioactive ata$area secvenple omoloage se indepErteazi sondelein exces' nelegate vizlttalizarcprin autoradiografie

Pe principiu similar se bazeazl metodele: 1.2 Northern blot - se detecteazdARN, estenecesari revers-transcriptaza proteine 13 Western blot - se detecteazd

2. Reac{ia in tanf a polimerazei

(PCR - polimerasechain reaction)

Se detecteazdsecvenlespecifice de acid nucleic dupd o prealabili amplificare' Etapele de lucru - detectareaADN-ului extragereaADN-ului amplificare: se realizeazdin aparahrlPCR qi conste din mai multe cicluri identice denaturare(900c) aliniereaprimerilor (500C)- 2 secvenfede oligonucleotide care se leagl prin complemenaritate pe cele doui catenela o anumiti distanli lntre ele' sinteza lan$rrilor complementare(700C ) - elongalie; estenecesari pr?Jzenta enzimei polimerazd (Taq) Si a nucleotidelor - se fomreazfl lanturile complementare astfel se dubleazi cantitateade'ADN de reluareaciclului de n ori - se obfn 2" copii ale secve'n1ei identificat

vizualizarea produgilor de amplificare produqii de amplificare ob{inu1ise separi electoforetic colorare cu bromuri de etidiu vizualizarecurazeIJV-prelucrare computerizati

Multiplex PCR - se amplifici mai multe gene odati Real time PCR RI-PCR - estenecesarerevers-transcriptaza

- 1l-